FFI0776 FFI0776 Modelageme Modelageme EngenhariadeProteínas EngenhariadeProteínas Prof. Rafael V. C. Guido Prof. Rafael V. C. Guido Prof.RafaelV.C.Guido Prof.RafaelV.C.Guido [email protected][email protected]Aula02 Aula02 Bacharelado em Ciências Físicas e Biomoleculares Bacharelado em Ciências Físicas e Biomoleculares BachareladoemCiênciasFísicaseBiomoleculares BachareladoemCiênciasFísicaseBiomoleculares InstitutodeFísicadeSãoCarlos InstitutodeFísicadeSãoCarlos USP USP Objetivos Objetivos • Obtençãoedeterminaçãoestruturaldeproteínas – CristalografiaderaiosX(Xtal) – RessonânciaMagnéticaNuclear(RMN) – Crio microscopia Eletrônica (Cryo EM) – CriomicroscopiaEletrônica(Cryo EM) Ob ã d i ã Ob ã d i ã Obtençãoedeterminação Obtençãoedeterminação estrutural de proteínas estrutural de proteínas estruturaldeproteínas estruturaldeproteínas BiologiaMolecular BiologiaMolecular– Obtençãodeproteínas Obtençãodeproteínas ABiologiaMolecularéoestudodaBiologiaemnívelmolecular,comespecialfoco no estudo da estrutura e função do material genético e seus produtos de expressão noestudodaestruturaefunçãodomaterialgenéticoeseusprodutosdeexpressão(proteínas). Estratégias: l –clonagem – expressão
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Prof. Rafael V. C. GuidoProf. Rafael V. C. GuidoProf.�Rafael�V.�C.�GuidoProf.�Rafael�V.�C.�[email protected]@ifsc.usp.br
Aula�02Aula�02Bacharelado em Ciências Físicas e BiomolecularesBacharelado em Ciências Físicas e BiomolecularesBacharelado�em�Ciências�Físicas�e�BiomolecularesBacharelado�em�Ciências�Físicas�e�Biomoleculares
Ob ã d i ãOb ã d i ãObtenção�e�determinação�Obtenção�e�determinação�estrutural de proteínasestrutural de proteínasestrutural�de�proteínasestrutural�de�proteínas
A�Biologia�Molecular�é�o�estudo�da�Biologia�em�nível�molecular,�com�especial�foco�no estudo da estrutura e função do material genético e seus produtos de expressãono�estudo�da�estrutura�e�função�do�material�genético�e�seus�produtos�de�expressão�(proteínas).
Estratégias:l– clonagem
– expressão
Purificação�de�proteínasPurificação�de�proteínasA�purificação�de�proteínas�é�uma�série�de�processos�que�têm�em�vista�o�isolamento�de�um único tipo de proteínas de uma mistura complexa A purificação de proteínas éum�único�tipo�de�proteínas�de�uma�mistura�complexa.�A�purificação�de�proteínas�é�vital�para�a�caracterização�da�função,�estrutura�e�interações�da�proteínas�de�interesse.�O�material�inicial�é�normalmente�um�tecido�biológico�ou�uma�cultura�microbiana�(nativa�ou�recombinante).�
Os passos de separação exploram as diferenças no Estratégias:�(pureza�>�97%)Os�passos�de�separação�exploram�as�diferenças�no�tamanho�da�proteína,�as�propriedades�físico�químicas�(hidrofobicidade,�estado�de�
g (p )– Ensaios�Enzimáticos;– Determinação�Estrutural
protonação)�e�afinidade�de�ligação.ç
Cinética�EnzimáticaCinética�Enzimática
A�cinética�enzimática�estuda�as�reações�químicas�catalisadas�pelas�enzimas,�em�ti l l id d d ã O t d d i éti d i itparticular,�a�velocidade�de�reação.�O�estudo�da�cinética�de�uma�enzima�permite�
elucidar�os�detalhes�do�mecanismo�catalítico,�função�no�metabolismo,�modulação�da�atividade�na�célula.�Além�disso,�fornece�as�bases�para�os�estudos�de�inibição�por��, p ç pmoléculas�bioativas�(e.g.,�fármacos�e�agroquímicos).
Experimentos�de�triagem�de�cristalização�empregam tipicamente uma buscaempregam�tipicamente�uma�busca�convencional�de�múltiplos�parâmetros�de�protocolos�nas�técnicas�de�gota�suspensa�(difusão�de�vapor),�com�otimização�via�utilização�de�aditivos�que�são�rotineiramente realizados em umarotineiramente�realizados�em�uma�câmara�termoestável��a�4�ou�18ºC
Estratégias:T i ( l ã f i l)– Triagem�(solução�fatorial)
– Otimização�da�condição
CristalCristalUm�cristal�é�um�sólido�no�qual�os�constituintes�(e.g.,�átomos,�moléculas�ou�íons) estão organizados num padrão tridimensional bem definido que se repete
Ressonância�magnética�nuclear�é�uma�gtécnica�que�permite�determinar�propriedades�de�uma�substância�através�da�correlação�entre�a�energia�absorvida�contra�a�frequência,�na�faixa�d h t (MH )de�megahertz�(MHz)�
Características:Determinação de proteínas em– Determinação�de�proteínas�em�solução
– Indicação da dinâmica da proteínaIndicação�da�dinâmica�da�proteína�(e.g.,�mudanças�conformacionais,�enovelamento,�interações)
• Isótopos estáveis mais utilizados:Isótopos estáveis�mais�utilizados:• 13C
15N• 15N�• 2H�(deutério)
RMN�RMN�–– EtapasEtapas
1. Produção da Proteína Marcada com Isótopos1. Produção�da�Proteína�Marcada�com�Isótopos2. Coleta�de�Dados�
Assinalamento dos valores de ressonância– Assinalamento�dos�valores�de�ressonância�(e.g.,�1H,�13C,�15N)Informação espacial sobre os átomos próximos (< 5 Å)– Informação�espacial�sobre�os�átomos�próximos�(<�5�Å)�(e.g.,�1H–1H�NOE;�1H–15N�HSQC,�TROSY)
– Assinalamento de sequências específicas– Assinalamento�de�sequências�específicas3. Refinamento�das�soluções
Cál l d E– Cálculo�das�Estruturas– Obtenção�de�Modelos�Múltiplos