Augalų genomika ir biotechnologijamolbio.vdu.lt/medziaga/augal-genomic_0703.pdf · 2011-04-18 · prasideda ląstelės ciklas ir tęsiasi per mitozę vėl iki G1 fazės. Nesidalijančios

Naujausių mokslinių pasiekimų ir naujausių mokslinių tyrimo metodų augalų genetikos ir biotechnologijos srityje mokslinė studija

Augalų genomika ir biotechnologija

Rengė : doc. dr. S. Kuusienė

KAUNAS, 2007

1. Turinys

1. Turinys ...................................................................................................................1

2. Įvadas .....................................................................................................................3

3. Augalinės ląstelės struktūra ir ląstelės ciklas.........................................................4

4. Augalo ląstelės totipotentiškumas..........................................................................9

5. Veiksniai, reguliuojantys augalų somatinę embriogenezę ir organogenezę ........11

6. Haploidų gavimo metodai ir jų panaudojimas selekcijoje...................................13

7. Pagrindiniai transgeninių augalų kūrimo metodai ...............................................19

8. Genetiškai modifikuotų augalų biocheminis ir citogenetinis įvertinimas............29

9. Molekuliniai žymenys medžių genetinės įvairovės ir tapatumo įvertinimui .......34

10. Praktiniai darbai ...............................................................................................38

2

2. Įvadas Gyvojoje gamtoje visas gyvybės formas ( prokariotines ir eukariotines) vienija jų

struktūrininis vienetas - ląstelė. Mokslas, visapusiškai nagrinėjantis ląstelės veiklą ,

vadinamas ląstelės biologija, kurios pradžia laikoma 1665 metai, kai R. Hukas,

sukonstravęs šviesinį mikroskopą kamštyje įžiūrėjo mažas ertmes. Tas ertmes

pavadino cellulae. Iš šio termino kilo šiuolaikinis angliškas ląstelės pavadinimas (

angl.k. – cell). Vėliau R. Hukas stebėjo ir gyvų augalų audinių pjūvius ir pamatė, kad

jos pripildytos „ sulčių“. Po dviejų šimtmečių mikslininkai M.J. Šleidanas ir Švanas

suformulavo organizmų struktūros ląstelinę teoriją, kuri pagrindė ,kad gyvieji

organizmai sudaryti iš ląstelių ir jų gyvybinės veiklos produktų.

Skiriamos dviejų tipų ląstelės - prokariotinės ir eukariotinės.Pagrindinis jų

skiriamasis bruožas susijęs su branduoliu. Eukariotinių organizmų ląstelės sandara

yra sudėtingesnė, nes turi tipišką branduolį, su membraniniu apvalkalėliu ir yra

ląstelės procesų programos ir valdymo centras. Prokariotinių ląstelių branduolys

neturi apvalkalėlio. Todėl laikoma , kad prokariotinės ląstelės neturi tipiško

branduolio, otik jo ekvivalentą, kuris vadinamas nukleoidu.

Augalinės ląstelės struktūra susijusi su augalinio organizmogyvenimo ir mitybos

būdu. Per evoliuciją susiformavo kai kurie specifiniai augalinių ląstelių strukrūros

ypatumai: tvirta polisacharidinė sienelė; plastidinė sistema; stambi centrinė vakuolė .

Augalai yra didelis ekonominis sektorius, veikiantis daugelį kitų sektorių: maisto,

tekstilės, chemijos, energijos, sveikatos, medicinos ir kt. Todėl augalų savybių

gerinimas yra svarbus ir aktualus. Prieš 30 metų mokslininkai išmoko karpyti ir

perkelti DNR segmentus, klonuoti izoliuotus genus. Manipuliacijos su DNR leido

sparčiai vystyti naujus metodus ir augalų tyrimuose.

Šio modulio tikslas - suteikti magistrantams integruotas teorines žinias apie eukariotinių ir

prokariotinių organizmų genomus, geno klonavimo ir rekombinantinės DNR kūrimo

pagrindus, augalų DNR ir RNR tyrimo metodus, modelinių augalų in vitro kultūras, augalų

biotechnologijos metodus, bei išlavinti gebėjimą atlikti augalų transformaciją, identifikavimą

integruoto geno ir įvertinti transgeninių augalų panaudojimo perspektyvas.

3

3. Augalinės ląstelės struktūra ir ląstelės ciklas

Augalo ląstelės savo struktūra iš esmės yra panašios į kitas eukariotines, t.y. turinčias

branduolį, ląsteles. Be branduolio, visoms eukariotinėms ląstelėms būdinga plazminė

membrana bei įvairių eukariotinių organizmų ląstelėse analogiškas funkcijas

atliekančios organelės: endoplazminis tinklas, Goldžio kompleksas, mitochondrijos,

mikrovamzdeliai, peroksisomos. Tačiau augalinių ląstelių struktūra turi ir nemažai

savitų bruožų, kuriais skiriasi nuo kitų eukariotinių ląstelių struktūros. Tik augalų

ląstelėms yra būdinga tvirta celiuliozinė sienelė, kuri ne tik suteikia ląstelėms tvirtumą

bei formą, tačiau taip pat apsaugo nuo ligas sukeliančių mikroorganizmų. Celiuliozės

gijos augalinės ląstelės sienelėje išsidėsto tam tikrame užpilde, kurį sudaro kiti

polisacharidai: hemiceliuliozė ir pektinai. Hemiceliulioze vadinami šakotos struktūros

polisacharidai, kurie jungia ir sutvirtina vienas su kitomis celiuliozės gijas. Celiuliozė

sutinkama visose augalų ląstelėse, tuo tarpu medienoje, be celiuliozės, yra daug kito

polimero – lignino, taip pat čia kaupiasi netirpūs mineralinių medžiagų kristalai.

Augalų ląstelių sienelėje yra angelių, pro kurias praeina savitos augalo ląstelių

jungtys, vadinamos plazmodezmomis. Jų vietose dviejų ląstelių plazminės

membranos jungiasi, o per plazmodezmą į kitą ląstelę prasikiša endoplazminio tinklo

išaugos – desmovamzdeliai. Pro juos iš vienos ląstelės į kitą gali patekti netirpios

medžiagos, tuo tarpu tirpios difunduoja pro plazmodezmos tarpą. Dažniausiai augalų

ląstelės turi apie 1000 tokių tiesioginio sąlyčio su kitomis ląstelėmis vietų.

Augalo augimui svarbus ląstelių sienelės tamprumas. Ypač dideliu tamprumu sienelė

pasižymi intensyviai augančiose augalo dalyse, šaknų ir ūglių meristemoje, kadangi

pirminė augančios ląstelės sienelė yra plona ir gali lengvai temptis. Ji susidaro tarp

dviejų dukterinių ląstelių dalijantis motininei ląstelei. Ląstelei nustojus augti, jos

pirminės sienelės išorė ima trauktis pirmuoju antrinės sienelės sluoksniu. Ląstelei

visai nustojus augti, šis sluoksnis iš vidaus pildomas kitu, kitaip orientuotų celiuliozės

skaidulų sluoksniu, o vėliau – dar kitaip išsidėsčiusiomis skaidulomis (kiekvieno

sluoksnio celiuliozės skaidulos lygiagrečios). Be to, pamažu antrinė sienelė

mineralizuojasi dėl susikaupusių kalio druskų ir visai sukietėja.

Daugeliui augalų ląstelių būdinga stambi centrinė vakuolė, kuri užima didžiąją dalį

subrendusios ląstelės tūrio. Čia saugomos maisto medžiagos, kaupiami medžiagų

apykaitos produktai, vyksta medžiagų hidrolizė (pastarąją funkciją gyvūnų ląstelėse

atlieka lizosomos, tuo tarpu augalinėms ląstelėms šios organelės nebūdingos).

4

Vakuolės palaiko augalų ląstelių stangrumą bei yra svarbios jų augimui. Augalų

ląstelės gali pasižymėti labai greitu tįstamuoju augimu, kurį lemia ląstelės sienelės

tempimas dėl vakuolę patenkančio vandens spaudimo.

Savitos augalinių ląstelių organelės yra plastidės. Tai dviejų membranų apvalkalą

turinčios organelės, išsidėstę citoplazmoje. Funkciniu požiūriu svarbiausios plastidės

yra chloroplastai, kurie lapų ląstelėse išsidėsto aplink centrinę vakuolę.

Chloroplastuose vyksta fotosintezė, taigi šios organelės suteikia augalams gebėjimą

Saulės energiją paversti chemine energija, kuri fotosintezės tamsos reakcijų metu

naudojama sacharidų sintezei.

1 pav. Tipiška augalo ląstelė. Iš: V. Mildažienė ir kt. Ląstelės biologija.

Augalų, kaip ir kitų eukariotų, ląstelės cikle skiriami du pagrindiniai etapai – interfazė

ir M fazė. Interfazė skirstoma į tris fazes: G1, S ir G2. G1 fazėje ląstelė auga, vyksta

medžiagų apykaita, dvigubėja organelės. S fazėje vyksta DNR replikacija, dvigubėja

genetinė medžiaga. G2 fazėje ląstelė auga ir ruošiasi mitozei. M fazėje ląstelėje vyksta

esminiai įvykiai: kinta chromatino tankis, persitvarko ląstelės griaučiai, chromosomes

juda vidurio plokštumos link, o vėliau link ląstelės polių, dalijasi branduolys bei visa

ląstelė. Šie procesai užtikrina tikslų genetinės medžiagos, kurios kiekis padvigubėjo S

fazės metu, padalijimą į dvi lygias dalis, atitenkančias dukterinėms ląstelėms. M fazę

sudaro du nuoseklūs procesai: mitozė ir citokinezė. Mitozės metu pasidalija

branduolys ir jame esanti DNR. Citokinezė yra ląstelės pasidalijimas į dvi dalis,

užbaigiantis genetinės medžiagos paskirstymą tarp dviejų naujų ląstelių. Ląstelės

ciklo vyksmas augaluose šiek tiek skiriasi nuo kitų eukariotų, pvz. mielių ir žinduolių

(2 pav.). Pastarosiose ląstelėse yra tarsi tam tikras atskaitos taškas G1 fazėje, nuo kurio

5

prasideda ląstelės ciklas ir tęsiasi per mitozę vėl iki G1 fazės. Nesidalijančios mielių ar

žinduolių ląstelės pasilieka G1 fazėje (tokia ląstelių būsena dar vadinama G0 faze).

Tuo tarpu augalų ląstelės gali pasilikti tiek G1, tiek G2 fazėse. Netgi pilnai

diferencijavusios ląstelės gali būti G2 fazėje. Augalinės ląstelės geba vykdyti

diferenciacijos ar dediferenciacijos procesus būdamos tiek G1, tiek G2 fazėse. Taigi,

augalinė ląstelė, perėjusi per S fazę (su padvigubėjusiu DNR kiekiu) nebūtinai pereina

į M fazę.

2 pav. Ląstelės ciklas mielėse ir pas žinduolius (A) bei augaluose (B). Mielių ir žinduolių ląstelėse G1/S perėjimas yra reguliuojamas kontrolės punktu, vadinamu pradžios ar pabaigos tašku. Augaluose toks taškas dar neatrastas. Praeidamos pro pradžios/pabaigos tašką, mileių ar žinduolių ląstelės paprastai pereina visą ląstelės ciklą. Priešingai, augalų ląstelės gali būti sulaikomos G1 ar G2 fazėje. Be to, jos gali diferencijuoti ar dediferencijuoti arba iš G1 arba iš G2 (pagal Ferreir et al., 1994) Iš: L.M. Srivastava. Plant growth and development: hormones and enviroment.

Augalinių ląstelių bioreguliacija

Augalinių ląstelių veiklos reguliavime labai svarbų vaidmenį atlieka fitohormonai.

Fitohormonai, arba augalų augimo reguliatoriai, yra nedideliais kiekiais augaluose

aptinkamos cheminės medžiagos, kontroliuojančios augalo augimą ir vystymąsi.

Augimo reguliatoriai akivaizdžiai dalyvauja daugelyje fiziologinių procesų. Jie veikia

augalo vystymąsi kontroliuodami specifines biochemines reakcijas. Fitohormonų

koncentracijos augaluose paprastai esti labai mažos. Kitaip nei gyvūnų hormonų,

augalų hormonų sintezė dažnai nėra lokalizuota viename specifiniame audinyje, bet

gali vykti įvairiuose audiniuose. Be to, augalų augimo reguliatorius gamina ne tik

patys augalai, bet ir kai kurios bakterijų bei grybų rūšys. Dažnai ryšiai tarp augalų ir

6

mikroorganizmų esti tokie glaudūs, jog pastarųjų išskiriami augimo reguliatoriai turi

didelę svarbą ne tik augalams, bet per augalo metabolinius procesus ir patiems

mikroorganizmams. Nors augalų hormonai gali būti pernešami ir veikti nuo išskyrimo

vietos nutolusius audinius, bet dažnai jų veikimas pasireiškia ir ten, kur jie

sintetinami. Taip pat augalų hormonai nėra tokie specifiški kaip gyvūnų hormonai.

Vienas ir tas pats fitohormonas gali veikti įvairius fiziologinius procesus. Nors dažnai

įvairių fitohormonų rūšių (citokininų, auksinų, giberelinų bei kitų) poveikis gali būti

labai panašus, tačiau kiekvienas hormonas turi tik jam būdingas savybes, išreikštas

tam tikrų biocheminių reakcijų valdomų ląstelės virsmų kontrole. Panašaus ar

pastebimai priešingo įvairių klasių fitohormonų poveikio priežastis yra ta, jog vieni

fitohormonai gali veikti kitų augimo reguliatorių (priklausančių tai pačiai ar

skirtingoms fitohormonų klasėms) sintezę ar skaidymą, taip pat gali įvairiai persipinti

skirtingų fitohormonų kontroliuojami biomolekulių metabolizmo ar tam tikrų procesų

reguliavimo keliai augalo ląstelėje. Fitohormonų poveikis taip pat stipriai priklauso

nuo audinio – taikinio jautrumo. Tam tikrame audinyje ląstelės gali neatpažinti

hormoninio signalo arba nepajėgti duoti pageidaujamo atsako.

Fitohormonų poveikis dažniausiai susijęs su tam tikros signalų kaskados aktyvavimu.

Hormonas jungiasi su receptoriumi, tai pakeičia (susilpnina ar sustiprina) receptoriaus

sąveiką su kitomis molekulėmis, atitinkamai kinta šių molekulių geba sudaryti kitas

sąveikas, moduliuoti dar kitų molekulių veiklą ir taip toliau. Paprastai tokia signalų

kaskada būna nukreipta į atitinkamą reguliacinį baltymą, taigi dėl hormonų poveikio

reguliacinio baltymo veikla gali būti skatinama arba slopinama. Savo ruožtu toks

baltymas gali dalyvauti genų veiklos reguliavime ir atitinkamai skatinti ar slopinti kitų

baltymų sintezę (pavyzdžiui, per transkripcijos kontrolę). Pavyzdžiui, fitohormonas

giberelinas, kuris, kaip žinoma, skatina krakmolą skaidančio fermento α-amilazės

sintezę dygstančiose sėklose, jungiasi su plazminėje membranoje esančiais

receptoriais. Šie receptoriai susiję su G-baltymais, per kuriuos nuosekliai aktyvuojami

kiti procesai: didėja viduląstelinio Ca2+ koncentracija, mažėja viduląstelinis pH,

didėja kalmodulino bei ciklinio GMP koncentracijos. Šie pokyčiai skatina baltymą

GAMYB koduojančio geno ekspresiją. Savo ruožtu šis baltymas valdo α-amilazės

geno transkripciją. Panašiu būdu fitohormonai geba reguliuoti daugelį svarbių procesų

augalinėje ląstelėje, įskaitant fotosintezę (citokininai skatina kai kurių fotosintezės

reakcijas katalizuojančių fermentų sintezę), ląstelių dalijimąsi bei augimą. Nustatyta,

kad citokininai bei auksinai atlieka svarbų vaidmenį augalinės ląstelės ciklo valdyme.

7

Šie fitohormonai ląstelės ciklo valdyme dalyvauja keisdami reguliacinių baltymų

kiekį. Svarbiausi visų eukariotinių ląstelių ciklą kontroliuojantys baltymai – tai

ciklinai ir nuo ciklinų priklausomos kinazės arba Cdk (angl. cyclin-dependent kinase).

Cdk yra kitus baltymus fosforilinantys fermentai, tačiau jie pasižymi fermentiniu

aktyvumu tik tada, kai sudaro kompleksą su atitinkamu ciklinu. Cdk kiekis ląstelėje

yra maždaug pastovus, tuo tarpu įvairių ciklinų kiekiai labai svyruoja skirtingose

ląstelės ciklo fazėse (ląstelės ciklo valdymo schema pavaizduota 3 pav.). Per

pastaruosius baltymus citokininai dalyvauja augalo ląstelės perėjimo į S ir M fazes

reguliavime. Perėjimui iš G1 į S fazę citokininai reikšmingi tuo, jog padidina ciklino

D3 kiekį. Naudojant citokininų biosintezės inhibitorių lovastatiną įrodyta, jog

citokininai būtini augalo ląstelės perėjimui į M fazę. Lovastatinas sustabdo mitozę,

bet pridėtas zeatinas atstato normalų ląstelių dalijimąsi. Toks perėjimo iš G2 į M fazę

reguliavimas greičiausiai susijęs su nuo ciklino priklausančios kinazės aktyvacija. Į

tabako audinių kultūrą pridėtas auksinas padidina nuo ciklino priklausančios kinazės

kiekį, o pridėtas citokininas lemia šio fermento aktyvumą, kadangi pastarasis

hormonas reguliuoja ląstelės ciklą valdančio baltyminio komplekso (Cdk-ciklinas)

reguliacinių subvienetų, t.y. ciklinų, kiekį.

3 pav. Ląstelės ciklo valdymas. MPF – ląstelės dalijimąsi skatinantis veiksnys (angl.

mitosis-promoting factor), t.y. Cdk-ciklino kompleksas. Iš: V. Mildažienė ir kt. Ląstelės biologija.

8

Savitais mechanizmais augalų augimą reguliuoja auksinas ir giberelinas. Auksinas

jungiasi su receptoriais ir aktyvuoja nuo ATP priklausomą protonų siurblį. Kai

vandenilio jonai išsiurbiami iš ląstelės, jos sienelė rūgštėja ir nutrūksta vandeniliniai

ryšiai tarp celiuliozės gijų. Aktyvuoti fermentai toliau ardo ląstelės sienelę.

Elektrocheminis gradientas, kurį sukūrė protonų siurblys, verčia tirpias medžiagas

skverbtis į ląstelės vidų, o paskui jas veikiamas osmoso skverbiasi ir vanduo. Slėgiui

veikiant sieneles, jos išsiplečia ir ląstelės pailgėja. Toks auksino valdomas ilgėjimas

būdingas jaunesnėms ląstelėms. Giberelino skatinamas augalo stiebo ilgėjimas

paaiškinamas tuo, jog giberelino indukuotoje signalinių molekulių kaskadoje yra

molekulių, kurios jungiasi su reguliaciniais baltymais GAI/RGA. Šie baltymai

augalinės ląstelės branduolyje rišasi su DNR ir stabdo už augalo tįstamąjį augimą

atsakingų genų transkripciją. Kai toks baltymas susijungia su giberelino indukuota

molekule, jis praranda gebėjimą rištis su DNR ir nebegali slopinti augalo augimo.

4. Augalo ląstelės totipotentiškumas Suvokimą apie tokius procesus, kaip ląstelių diferenciacija, organogenezė ir somatinė

embriogenezė, labai išplėtė audinių kultūrų naudojimas tyrimuose. Augalų gebą

regeneruoti in vitro lemia somatinių augalų ląstelių totipotentiškumas.

Totipotentiškumas – tai somatinių augalų ląstelių savybė, atspindinti jų sugebėjimą

elgtis kaip zigotai ar meristemos pirminėms ląstelėms, reguliuojant ir išreiškiant

genetinę bei epigenetinę informaciją, kuri reikalinga atskirų augalo organų ar viso

organizmo vystymuisi. Tačiau ne kiekviena eksplanto ar kaliaus audinio ląstelė geba

duoti pradžią naujam organui ar organizmui. Tik dalis ląstelių yra potencialiai

pajėgios pereiti naują morfogenetinio vystymosi kelią. Tam jos turi būti aktyvuojamos

kompleksiniais signalais.

Ypač akivaizdžiai augalo ląstelės totipotentiškumą atskleidžia sėkmingi augalų

regeneracijos iš kaliaus bandymai. Gamtoje kalius sutinkamas kaip augalų žaizdas

padengiantis parenchiminis audinys. In vitro kultūroje susidaręs kalius yra vertinga

medžiaga tiriant organizmo vystymąsi. Kaliaus indukcijai audinių kultūroje paprastai

imamas kelių milimetrų dydžio augančio stiebo ar gemalo gabalėlis ir sodinamas

steriliomis sąlygomis ant maitinamosios terpės, turinčios reikiamų makro ir

mikroelementų, fitohormonų, vitaminų bei angliavandenių. Iš tokio audinio pradeda

formuotis nediferencijuotų ląstelių grupė – kalius. Išauga ląstelių masė, panaši į

9

bakterijų koloniją. Kalius gali ilgai augti ir daugintis ant maitinamosios terpės, jei ji

kas keletą savaičių keičiama nauja. Kalių, kaip purią ląstelių masę, galima skaidyti ir

išskirstyti į daugelį dalių. Dažniausiai kaliaus ląstelės išlaiko tos rūšies augalui

būdingus požymius bei savybes. Tačiau tai priklauso nuo kaliaus amžiaus, terpės

sudėties ir kitų veiksnių.

Augalų audinių kultūrose pastebimas žymus polimorfizmas tarp kaliaus ląstelių.

Skiriamos meristeminės, parenchiminės, vakuolizuotos kaliaus ląstelės, taip pat kai

kurios kitos specializuotų ląstelių rūšys, pavyzdžiui, protrachėjiniai elementai.

Meristeminis aktyvumas paprastai koncentruojasi dviejuose kaliaus kultūros

regionuose. Pirmoji meristeminė sritis aptinkama kaliaus pakraštyje. Čia ląstelės gali

formuoti ūglio užuomazgą arba somatinį gemalą. Antrojoje vidinėje kaliaus srityje

formuojami žiedo pavidalo meristeminiai centrai., kurie paprastai išsivysto į šaknį

arba formuoja trachėjinius elementus. Norint atgaminti augalus iš kaliaus ląstelių, jos

persodinamos į kitokios sudėties maitinamąsias terpes, kurios sužadina jų

diferenciaciją ir organų susidarymą. Šie procesai labai priklauso nuo fitohormonų

balanso terpėje. Kai terpėje daugiau auksinų, formuojasi šaknelės, o esant daugiau

citokininų – viršūnių stiebeliai. Būtent šios dvi fitohormonų klasės (auksinai ir

citokininai) laikomos svarbiausiomis augalų regeneracijos tyrimams audinių

kultūroje. Kiti fitohormonai (giberelinai, etilenas, abscisinė rūgštis, poliaminai,

jazmonatai) naudojami rečiau.

4 pav. Maumedžio kalius su regeneruojančiu ūgliu

10

5. Veiksniai, reguliuojantys medžių somatinę

embriogenezę ir organogenezę Medžio augimas – tai negrįžtamas tūrio ir masės didėjimas, susijęs su naujų

struktūrinių vienetų susidarymu. Daugialąsčio organizmo augimo procesai susideda iš

ląstelių, audinių ir atskirų organų augimo procesų. Taigi augimas yra integralinis

daugiaetapis procesas, kurio metu vyksta ne tik tūrio ir masės pokyčiai, bet ir ląstelių

bei audinių diferenciacija, besitęsianti per visą medžio gyvenimą ir lemianti jo

produktyvumą. Pirminiai augalo augimo metu yra endogeniniai augimo procesai –

naujų struktūrų atsiradimo, tarpusavio sąveikos ir išsidiferencijavimo mechanizmai.

Svarbus ir kitas etapas – ląstelių masės susigrupavimas į audinius, audinių tarpusavio

sąveika ir integracija į augalo organų sistemą, sudarančią augantį augalo organizmą.

Tai vadinama augalo morfogeneze. Morfogenezei būdingi augimo koordinacijos ir

poliarizacijos virsmai, už kurių pobūdį ir kinetiką yra atsakingos augimo reguliavimo

sistemos.

Morfogenezės pradžia yra aktyvus lokalizuotas ląstelių dalijimasis, susidarant arba

meristemoidui, arba embriogeninei ląstelių grupei (somatiniam pirminiam gemalui).

Yra keletas svarbiausių faktorių, atliekančių lemiamą vaidmenį kontroliuojant ląstelės

vystymosi procesus. Tai ląstelės tinkamumas, ląstelės pozicija audinyje, ląstelės

dalijimasis ir poliariškumo išlaikymas, išoriniai bei vidiniai stimulai. Ląstelės

tinkamumas vystymuisi reiškia ląstelės gebą atpažinti hormoninius ar kitus signalus,

paleidžiančius tam tikrą vystymosi metabolinį kelią. Tai viena iš pačių svarbiausių

morfogenezės sąlygų. Indukcija yra procesas, kurio metu vystymosi signalai veikia

tinkamas ląsteles, kad būtų pakeista jų būsena. Indukcijos rezultatas yra

determinuotos ląstelių populiacijos susidarymas, priklausomas nuo atitinkamos

vystymosi programos, kurią lemia savita genų raiška.

Daugialąsčio augalo besidalijančios, tįstančios ir užbaigusios vidinės diferenciacijos

procesus ląstelės yra sugrupuotos į atskiras augimo zonas: meristeminę, tįsimo ir

diferencijuotų ląstelių. Atskirų augimo fazių ląstelės turi morfologinių, anatominių ir

metabolinių skirtumų. Nors nėra visiškai išaiškinta, kokie reguliaciniai procesai yra

atsakingi už ląstelių perėjimą iš vienos augimo fazės į kitą, tačiau manoma, kad

lemiamą vaidmenį čia turėtų vaidinti hormoninė augimo reguliavimo sistema.

Skiriami du pagrindiniai morfogenezės keliai: organogenezė ir somatinė

embriogenezė. Organogenezė ir somatinė embriogenezė turi bendrų bruožų

11

fiziologiniame, biocheminiame bei struktūriniame lygmenyse. Abu šie keliai yra

organizmo vystymosi de novo procesai, vedantys į augalo regeneraciją.

Organogenezė – tai procesas, kurio metu ląstelės ir audiniai kinta, kaip galutinį

rezultatą formuodami unipoliarinę struktūrą, būtent, ūglio, šaknies ar žiedo

užuomazgą, kurios indų sistema dažniausiai susijusi su motininiais audiniais. Tipišku

atveju, organogenezė prasideda mažų pirminių ląstelių grupių, vadinamų

meristemoidais, susidarymu. Organogenetinį vystymąsi pajėgios pradėti pradinio

eksplanto ląstelės į meristemoidą gali virsti daugiau ar mažiau tiesiogiai arba

netiesiogiai, kai tarpinis etapas yra kaliaus susidarymas. Toliau meristemoidai vystosi

į ūglio, šaknies ar žiedo viršūnines meristemas. Dažniausiai miško medžių rūšių

regeneracija audinių kultūrose vyksta organogenezės keliu. Organogenezės kontrolei

labai svarbūs yra fitohormonai. Susidariusių meristemoidų tolesnį vystymąsi viena ar

kita kryptimi gali nukreipti išorinis aprūpinimas fitohormonais arba T-DNR genų

įterpimas, kurie koduotų auksinų arba citokininų sintezėje dalyvaujančius fermentus.

Savo ruožtu citokininai ir auksinai veikia kitų genų raišką.

Somatinė embriogenezė yra kompleksinis procesas, kurio metu atitinkamos

diploidinės ląstelės išreiškia savo totipotentiškumą, duodamos pradžią somatiniam

embrionui. Didesnę galimybę pradėti somatinę embriogenezę turi jaunesnės, mažiau

diferencijuotos ląstelės. Ypač dažnai somatinės embriogenezės indukcijai naudojamas

embriogeninis kalius, t.y. kalius, susidaręs ant zigotinių embrionų (tokio kaliaus

išauginimui audinių kultūroje paprastai naudojamas sintetinis auksinas 2,4-

dichlorfenoksiacto rūgštis bei citokininas benzilaminopurinas). Nustatyta keletas

auksino indukuojamų genų, kurie svarbūs ląstelėms pereinant į embriogeninį

vystymąsi (pvz. skatina ląstelių dalijimąsi). Spygliuočių medžių embriogeninio

kaliaus subrandinimui beveik visada naudojama abscisinė rūgštis. Somatinis

embrionas – tai organizuota bipoliarinė struktūra, turinti ūglio – šaknies ašį bei uždarą

nepriklausomą indų sistemą, jungiančią ūglio ir šaknies meristemas. Somatinis

embrionas nuosekliai vystosi į augalą, pereidamas embrioniniam vystymuisi būdingas

stadijas nuo globulės iki skilčialapio. Svarbiausi embriogenezės vyksmai yra

poliariškumo išlaikymas, kontroliuojamas ląstelės dalijimasis, ląstelės augimo

kontrolė, meristemos formavimasis ir audinių diferenciacija, šakojimasis. Šie procesai

būdingi tiek gemalo, tiek ir suaugusio augalo vystymuisi.

12

6. Haploidų gavimo metodai ir jų panaudojimas

selekcijoje Haploidas (gr. haploos - paprastas, eidos - pavidalas) - organizmas (šiuo atveju,

augalas), turintis haploidinį (gametinį) chromosomų skaičių somatinėse ląstelėse.

Pastaruoju metu haploidiniai augalai vis plačiau naudojami praktinėse augalų

selekcijos programose bei fundamentaliuosiuose mokslo tyrimuose dvigubų haploidų

linijoms gauti. Dvigubu haploidu vadinamas organizmas, kuris gaunamas iš haploido,

poliploidizacijos metodais pervedant jį į diploidinį lygį. Reikia pažymėti, kad

terminas ,dihaploidas' naudojamas kiek kitokiu aspektu nei terminas ,dvigubas

haploidas'. ,Dihaploidu' vadinamas diploidas gautas iš autotetraploido haploidijos

būdu ir nėra tas pats kas ,dvigubas haploidas' gautas iš diploido. Patogiausia pradine

medžiaga haploidiniams organizmams gauti laikomos gametos. Būtent todėl ir

išskiriami du pagrindiniai augalų haploidizacijos būdai: iš vyriško ir iš moteriško

gametofito. Pirmu atveju, vyksta androgenezė (gr. andros - vyras, genesis - gimimas,

kilmė) -mikrosporų regeneracija į haploidinį sporofitą, tuo tarpu antru - partenogenezė

(gr. parthenos -nekalta mergina, genesis - gimimas, kilmė) - haploidų vystymasis iš

neapvaisintų gemalinio maišelio ląstelių, dažniausiai, kiaušialąstės.

Abu procesai aptinkami ir gamtoje, tačiau paprastai haploidiniai augalai nesusilaukia

palikuonių, kadangi nesuformuoja sėklų arba jos būna sterilios. Partenogeniniai

haploidai gamtoje sutinkami dažniau nei androgeniniai. Pirmuosius spontaninius

haploidus, kurie buvo partenogeniniai, 1922 m. aptiko ir aprašė A.F. Blakeslee.

Paprastai jie išsivysto iš vienos iš sinergidžią kartu su normaliu gemalu. Susidaro

'dvyniai', kurių vienas - diploidas, o kitas -haploidas. Androgenezė taip pat gali vykti

natūraliai, kada mikrospora ar dulkiadaigio branduolys be apvaisinimo vystosi

gemaliniame maišelyje ar net šalia jo. Androgeninius haploidus 1941 m. pirmasis

aptiko bulgarų genetikas D. Kostoff. Blakeslee ir Kostoff įrodė, kad tiek

partenogeniniai, tiek androgeniniai haploidai gali atsirasti spontaniškai, tačiau labai

retai (10~6-10"3). Praktiniams selekcijos tikslams šis haploidizacijos dažnis yra per

mažas.

1966 m. S.Guha ir S.C.Maheshvvari pavyko gauti pirmuosius indukuotus haploidus.

Jie paskelbė apie haploidinių durnaropių in vitro regeneraciją iš jaunų dulkinių. Nuo to

laiko haploidiniai augalai gauti daugiau nei 90 rūšių, priklausančių 35 gentims.

13

Šiuo metu žinomi įvairūs haploidizacijos būdai (5 pav.), tačiau visi jie gali būti

suskirstyti į dvi grupes: in vitro partenogenezė bei in vitro androgenezė.

5 pav. Augalų haploidų gavimo būdų schema

In vitro partenogenezė

Sporofitinis megagametofitas diferencijuojąs! į gemalinį maišelį, kurio viduje yra

kiaušialąstė, sinergidės ir antipodės. Šios haploidinės ląstelės gali sudaryti gemalą ar

kalių in vitro. Nors ir atlikti bandymai su daugeliu augalų rūšių, siekiant indukuoti

kiaušialąstės augimą mitybinėje terpėje, daugumoje atvejų vystymasis sustodavo

kaliaus stadijoje. Vis tik metodas yra labai svarbus tiems augalams, kuriems dulkinių

kultūra nebuvo sėkminga.

Pseudogamija (gr. pseudo - netikras, gamos - vedybos) - gemalo susiformavimas be

vyriškosios ir moteriškosios gametos susiliejimo, stimuliuojančiai veikiant

dulkiadaigio turiniui, gali būti panaudojama haploidinių augalų indukcijai.

Pseudogamijai sukelti naudojamos chemiškai paveiktos (toluidino mėliu) ar

apšvitintos (100 krad) žiedadulkės. Apdulkinus augalą tokiomis žiedadulkėmis,

pavyko iššaukti neapvaisintos kiaušialąstės vystymąsį. Tačiau dėl mažo efektyvumo,

šis metodas nesulaukė platesnio pripažinimo.

14

In vitro androgenezė Augalo gyvenimo cikle diploidai, sporas auginanti generacija (sporofitas), keičiasi su

haploidais, gametas auginančia generacija (gametofitas). Augalo žieduose yra

vyriškos ir moteriškos struktūros, tokios kaip dulkinės ir piestelės, kuriuose

atitinkamai susidaro vyriškas ar moteriškas gametofitas. Gametofitų funkcija yra

sudaryti vyriškas ar moteriškas gametų ląsteles, kurios dalyvauja apsivaisinime.

Vyriškas žydinčių augalų gametofitas yra žiedadulkė. Mikrosporogenezė prasideda

mejoze ir baigiasi formuojantis haploidinėms mikrosporoms. Mikrogametogenezės

metu vienląstelinė mikrospora dalijasi nesimetriškai, ko rezultate gaunamos jaunos

žiedadulkės su vegetatyvinėmis bei generatyvinėmis ląstelėmis, kurios

diferencijuojasi į subrendusias, bi- ar triląstelines žiedadulkes (6 pav.).

6 pav. Mikrosporos vystymasis ( pagal Батыгина Т.Б. и др., 1994)

Nors galutinis mikrosporos vystymosi tikslas yra diferencijuotis į subrendusią

žiedadulkę ir apvaisinti, bet mikrosporos ar jaunos žiedadulkės gali diferencijuotis į

subrendusią žiedadulkę (vyriškas gametofitas) ar streso poveikyje pakartotinai dalintis

ir sudaryti embrioidą (sporofitą) . Guha ir Maheshwari (1964) tyrė Datura innoxia

vyriško gametofito vystymąsi dulkinių kultūroje ir pastebėjo kad vietoje to, kad

sudarytų žiedadulkes, sudarė embrionus. Tai buvo pirmasis įtarimas, kad embrionai

gali vystytis iš nesubrendusių žiedadulkių - mikrosporų. Pradedant šiuo atradimu

15

atsirado didelis susidomėjimas dulkinių kultūra, kurioje regeneruoja haploidiniai ar

spontaniniai dihaploidiniai augalai.

Subrendusi žiedadulkė

Biląstelinė žiedadulkė

Vienląstelinė mikrospora

brendimas brendimas

Būsena A

Būsena C2 Būsena C1

Turtinga terpėTemperatūrinis

šokas, badavimas

Embrioidas

Būsena D

Totipotentinė (embriogeninė)

mikrospora

Būsena B

GAMETOFITINIS KELIAS

SPOROFITINIS KELIAS

7 pav. Stresas - mikrosporų

embriogenezės priežastis

Pirmą kartą vyriškos generatyvinės ląstelės totipotentiškumą pademonstravo Guha ir

Maheshwari (1964) su Datura innoxia. Mikrosporų, esančių dulkinėse ar izoliuotų

mikrosporų embriogenezę indukuoja skirtingi stresai, kurie verčia vyriškąją

gametofitinę ląstelę (nesubrendusią žiedadulkę) vystytis į sporofitą (embrioidą).

Izoliuotos mikrosporos yra nepriklausomos nuo dulkinės sienelės audinių, tai leidžia

tirti skirtingų veiksnių poveikį tiesiogiai generatyvinei ląstelei (7 pav.).. Mikrosporas

galima izoliuoti dideliais kiekiais ir regeneruoti haploidinius augalus. Sėkmingiausi

rezultatai gauti su kultūriniais augalais, bet pavieniai darbai paskelbti iš sumedėjusių

augalų atliktų tyrimų.

Tolimieji kryžminimai ir chromosomų eliminacija Tarprūšinė hibridizacija (tolimieji kryžminimai) gali būti sėkmingai panaudota tiek

fundamentaliuosiuose augalų genetikos tyrimuose, tiek praktinės augalų selekcijos

programose. Šis metodas ypatingai sėkmingas javams, kur gali būti išnaudotas dviem

būdais. Visų pirma, kariotipiškai stabilūs kryžminimai, kurių pasėkoje gaunami

hibridiniai augalai. Jie gali būti panaudoti javų genų rinkino praturtinimui iš

giminingų laukinių ar kultūrinių rūšių. Taip pat pradinės medžiagos genetiniams

tyrimams sukūrimui. Antru atveju, kariotipiškai nestabilūs hibridai, kuriuose vienas iš

tėvinių genomų prarandamas besivystant, gali būti panaudojami haploidų gavimui.

Vieni geriausių tokio chromosomų eliminavimo pavyzdžių yra miežių (Hordeum

16

vulgare L.) ir kviečių (Triticum aestivum L.) haploidų gavimas kryžminant su Hordeum

bulbosum L..

Iš pradžių manyta, kad efektyvūs tik tokie tolimieji kryžminimai, kurių tėvinės formos

yra gana giminingos. Vėlesni tyrimai parodė, kad net tokios tolimos rūšys kaip

kviečiai ir kukurūzai gali būti sėkmingai naudojamos kviečių haploidams gauti. 1984

m. Zenktler ir Nitsche buvo pirmieji, kurie pastebėjo gemalų užuomazgas kviečių

kukurūzų kryžminimuose. Šis pasiekimas sukėlė mokslo visuomenės susidomėjimą,

tačiau rezultatai buvo įvertinti skeptiškai, nes jiems pagrįsti buvo naudojami gana

stori (apie 10 um) pjūviai šviesos mikroskopijai. Vis tik neilgai trukus buvo gauti

tikslesni įrodymai. 1986 m. Laurie ir Bennett kviečių veislę ,Chinese Spring'

apdulkino kukurūzų veislės ,Seneca 60' žiedadulkėmis. Dvi-tris dienas prieš žydėjimą

iš kviečių žiedų pincetu buvo pašalintos dulkinės, kad išvengti savidulkos. Mezginės

buvo fiksuojamos 1-6 dienas po apdulkinimo ir vėliau analizuojamos šviesiniu

mikroskopu. Gauti rezultatai pirmą kartą parodė, kad kviečių x kukurūzų

kryžminimuose gaunama hibridinė zigota su pilnais abiejų tėvų chromosomų

haploidiniais rinkiniais, t.y. hibridinė zigota turėjo 21 kviečių ir 10 kukurūzų

chromosomų. Dar daugiau, šie tyrimai taip pat parodė, kad kukurūzų chromosomos

yra greitai eliminuojamos iš hibridinės zigotos. Paprastai eliminacija įvyksta per tris

pirmuosius zigotos dalinimusis. Vėliau paaiškėjo, kad kukurūzų chromosomos yra

eliminuojamos dėl jų nesugebėjimo prisijungti prie dalinimosi verpstės mikrosiūlų ir

tokiu būdu nėra transportuojamos į ląstelės dalinimosi polius.

Haploidų reikšmė augalų selekcijoje

Haploidiniai augalai yra labai vertinga genetinė medžiaga, praktiškai panaudojama

selekcijoje. Haploidų panaudojimas leidžia tirti perskilimą gametos lygyje ir tuo pat

metu pasiekti homozigotinę būseną jau F1 generacijoje. Recesyvinių mutacijų

pasireiškimas galimas haploidinėje fazėje, tiesiog gametofito lygyje arba

haploidiniuose sporofituose, gautuose iš paveiktų mutagenais mikrosporų. Ryšium su

tuo, kad haploiduose nėra gametų atrankos, turinčių šį mutantinį alelį, mutacijos tipą

galima nustatyti pagal segregacijos dažnumą haplofazėje.

Čeizas įvedė sąvoką “analitinė selekcija” poliploidų selekcijos metodui, kuris

pagrįstas galimybe paversti juos dihaploidais. Tam tikrame ploidiškumo lygyje

vykdomas kryžminimas ir atranka, po to iš geriausių rekombinantinių genotipų vėl

17

sintezuojama pradinė poliploidinė būsena. Taikant žiedadulkių kultūrą “analitinė

selekcija” perkeliama į monoploidų lygį, o tai leidžia gauti pilnas homozigotas.

Gavimas haploidinių augalų, kurie turi tik po vieną iš kiekvienos poros homologinių

chromosomų, leidžia atrasti vertingų rekombinantų ir mutantų jau pirmoje

generacijoje. Tokių augalų genotipas atsispindi ir fenotipe. Haploiduose pasireiškia

visi recesyvinai genai, kas leidžia pagreitinti selekcinį procesą. Efektyvumas

selekcijos haploidų palyginus su diploidais padidėja 2 kartus, kur n – poros

nepriklausomų rekombinacinių alelių tėvinių augalų. Kryžminant diploidinius

organizmus, kurie skiriasi 2 genų poromis, homozigota F1 kartoje gali pasireikšti tik

iš 1/16 heterozigotų, o pas diploidizuotus monoploidus ji bus pas ketvirtį individų .

Pastaruoju metu yra sukurta daugiau kaip 200 veislių įvairių rūšių augalų haploidų

pagrindu (1 lentelė).

1 lentelė. Įvairių augalų veislės, sukurtos, naudojant haploidijos technologijas (1990 – 2004). (Paimta iš: http://www.scri.sari.ac.uk/assoc/COST851/Default.htm).

Augalas Šalis Veislių skaičius,

vnt.

Procentais nuo bendro

skaičiaus Šparagas Italija, Kanada, Prancūzija 7 2,5

Miežiai

(vasariniai)

Australija, Kanada, Čekija, Vokietija,

Danija, Prancūzija, Lenkija, Vengrija,

Švedija, Rusija, Austrija, Olandija,

Anglija, Ispanija, Belgija, Japonija,

Naujoji Zelandija, Šveicarija,

Norvegija, Ukraina

141 49,8

Miežiai

(žieminiai)

Suomija, Anglija, Prancūzija 9 3,2

Baklažanas Ispanija 5 1,8

Melionas Ispanija 9 3,2

Paprika Ispanija 7 2,5

Rapsai Kanada, Danija, Prancūzija, Vokietija,

Švedija, Anglija, Australija

52 18,3

Ryžiai Kinija, Vengrija 10 3,5

Pašarinė ropė Norvegija 1 0,3

18

Augalas Šalis Veislių skaičius,

vnt.

Procentais nuo bendro

skaičiaus Kviečiai Brazilija, Kanada, Kinija, Prancūzija,

Vokietija, Vengrija, Švedija, Anglija

30 10,6

Kvietrugiai Australija, Prancūzija 3 1,1

Bendras veislių skaičius 283

7. Pagrindiniai transgeninių medžių kūrimo metodai

Medžių genetinės transformacijos tikslai

Augalų genetinė inžinerija pastebimai vystėsi nuo pat pirmųjų transformuotų augalų

sukūrimo praėjusio amžiaus 9-ojo dešimtmečio pradžioje. Molekulinės technologijos

buvo pritaikytos daugeliui rūšių, gauta didelė išaugintų transgeninių augalų, taip pat ir

sumedėjusių rūšių, įvairovė. Genetinės transformacijos esmė yra naujų genų įvedimas

į ląstelę-taikinį, tokiu būdu genetinė miško medžių transformacija suteikia galimybę

sukurti medžius, pasižyminčius naujomis, tai rūšiai įprastai nebūdingomis savybėmis.

Vykdant miško medžių genetinę transformaciją siekiama padidinti jų augimo greitį,

ūkiškai naudinga linkme keisti kamieno pavidalą, pagal atitinkamus poreikius

modifikuoti ligniną, padidinti atsparumą herbicidams, ligoms, kenkėjams (pirmiausia

vabzdžiams), sutrumpinti medžio brandos laikotarpį (pagreitinti žydėjimą). Taip pat

medžių transformacija atitinkamai sukonstruotais genais leidžia nustatyti tiriamų

medžių genų transkripcijos ypatumus.Genų įvedimui į augalinę ląstelę gali būti

naudojami įvairūs metodai, kuriuos toliau ir aptarsime.

Genetinė transformacija Agrobacterium pagalba

Dažniausiai augalų genetinė transformacija vykdoma bakterijos Agrobacterium

pagalba. Agrobacterium tumefaciens turi taip vadinamą Ti plazmidę, kurios sudėtyje

yra T-DNR sritis. Šioje srityje yra genai, atsakingi už fitohormonų auksino bei

citokinino sintezę, taip pat genai, kurie lemia augalui neįprastų aminorūgščių opinų

bei fosforilintų cukraus darinių agrocinopinų sintezę, kuriuos bakterija gali naudoti

kaip energijos šaltinį. T-DNR yra perkeliama į augalo genomą, Minėtus

fitohormonus bei metabolitus tada sintetina užkrėstos augalo ląstelės. Infekcijos

vietoje susidaro gumbeliai (dėl fitohormonų poveikio), bakterijoms maisto medžiagas

19

teikia augalas-šeimininkas, dargi tokiu pavidalu, kad jų negali panaudoti kitų rūšių

bakterijos. Agrobacterium savybė integruoti tam tikrą savo DNR dalį į augalo ląstelės

genomą buvo panaudota augalų genų inžinerijoje. Tam reikalingi genai yra Ti

plazmidėje. Dalis Ti plazmidėje esančių genų koduoja receptorius, kurie padeda

bakterijai nustatyti pažeistą vietą augalo audinyje. Pavyzdžiui, pažeistas augalo

audinys išskiria fenolinius junginius, tokius kaip acetosyringonas, kurio netgi labai

nedideles koncentracijas geba užfiksuoti Agrobacterium cheminiai receptoriai. Pro

pažeidimo vietą bakterijos lengvai įsiskverbia į augalo audinį. Minėtas fenolinis

junginys acetosyringonas toliau atlieka svarbų vaidmenį infekcijos eigoje. Kai šio

junginio koncentracija tampa didesnė nei reikalinga Agrobacterium chemotaksiui

sukelti, yra aktyvuojami šios bakterijos virulentiškumo (vir) genai, kurie toliau

koordinuoja infekcijos procesą. Sintetinami atitinkami fermentai, pvz. permeazės,

kurios įterpiamos į bakterijos membraną, kad vėliau tarnautų infekuoto augalo

gaminamų junginių (opinų) įsisavinimui. vir genai yra atsakingi taip pat už

restrikcijos fermento endonukleazės sintezę. Būtent šis fermentas iškerpa tam tikrą Ti

plazminės dalį, vadinamą T-DNR. Bakterija išskiria iškirptąją T-DNR, ši genetinė

medžiaga pereina į augalo ląstelę ir integruojasi į augalinės ląstelės chromosomą (tuo

tarpu likusi Ti plazmidės dalis lieka bakterijos ląstelėje). Natūraliai dėl T-DNR

integracijos augalo ląstelės pradeda gausiai sintetinti fitohormonus (citokininą bei

auksiną), dėl to infekuotosios ląstelės sparčiai dalijasi, sutrinka įprastinis augalinio

audinio vystymasis, susidaro gumbai. Tokios ląstelės gamina bei išskiria metabolitus,

kuriuos Agrobacterium panaudoja kaip maisto šaltinį. Tačiau genų inžinerijos

metodais galima pašalinti tą T-DNR dalį, kurioje yra genai, atsakingi už fitohormonų

bei Agrobacterium mitybai reikalingų metabolitų produkciją, ir jos vietoje įterpti

norimą geną. Svarbu palikti tik nedidelę T-DNR dalį, būtent jos kraštinius 25 bazių

fragmentus iš abiejų pusių, kurie būtini augalinės ląstelės transformacijai. Taip pat

naujai sukonstruota T-DNR privalo turėti restrikcijos saitą – specifinę nukleotidų

seką, kurią galėtų atpažinti restrikcijos fermentas DNR iškirpimui iš Ti plazmidės.

Ruošiantis perkelti genetinę medžiagą į augalo ląstelę Agrobacterium pagalba,

galimos kelios strategijos. Viena iš galimybių yra in vitro manipuliuoti su plazmide,

turinčia nedidelį segmentą iš T-DNR (kad būtų atitinkamas homologijos regionas tarp

šios plazmidės ir Ti plazmidės). Konstruojant tokią plazmidę į ją įterpiamas genas,

kurį norima perkelti į augalo ląstelę. Plazmidė sukonstruojama E. coli bakterijoje,

kadangi su šia bakterija žymiai paprasčiau atlikti įvairias manipuliacijas in vitro.

20

Sukonstruota plazmidė perkeliama iš E. coli į Agrobacterium tumefaciens su Ti

plazmide, iš kurios pašalinti už fitohormonų sintezę atsakingi genai. Sukonstruotoji

plazmidė homologinės rekombinacijos būdu įsiterpia į Agrobacterium T-DNR. Kai

pastaroji bakterija infekuoja augalą, T-DNR su intarpu yra perkeliama į chromosomą

augalo ląstelės branduolyje. Kitas būdas vadinamas dvigubo vektoriaus strategija.

Šiuo atveju sukonstruojama plazmidė, turinti kairįjį ir dešinįjį T-DNR kraštus. Tarp jų

įterpiamas genas, kurį norima perkelti į augalo ląstelę. Tokia plazmidė

transformuojama į E. coli. Tada transformuotos E.coli kultūra sumaišoma su A.

tumefaciens linija, turinčia plazmidę su vir genais. Vykstant konjugacijai tarp dviejų

skirtingų rūšių bakterijų sukonstruotoji plazmidė perkeliama į Agrobacterium. Šios

bakterijos plazmidėje buvę vir genai lemia tai, kad augalo audinys yra infekuojamas ir

tai, kad tarp dešiniojo ir kairiojo T-DNR pakraščių buvęs DNR fragmentas iš

sukonstruotosios plazmidės (atpažįstama kairiojo T-DNR pakraščio seka) įterpiamas į

augalinės ląstelės chromosomą. Atitinkamai augalų transformacijoje gali būti

panaudota ir kita Agrobacterium rūšis – Agrobacterium rhizogenes. Aprašytoji lemia

gumbelių susidarymą ant įvairių augalo dalių, tuo tarpu A. rhizogenes taikinys yra

pažeistos augalų šaknys ir ši bakterija savo ruožtu skatina šakniaplaukių susidarymą.

Infekcijos mechanizmas analogiškas A. tumefaciens infekcijai. A. rhizogenes turi Ri

plazmidę, kurios funkcija atitinka Ti plazmidės funkciją, taigi į augalo ląstelės

chromosomą gali būti integruota A. rhizogenes T-DNR. Ši Agrobacterium rūšis

augalų genetinėje transformacijoje naudojama rečiau, tačiau kartais augalų audinių

kultūroje naudojama kitam tikslui – paskatinti pridėtinių šaknų formavimąsi. Tiek A.

tumefaciens, tiek A. rhizogenes atveju bakterijų geba infekuoti augalo ląsteles gali

smarkiai skirtis tarp įvairių tos pačios rūšies bakterijų linijų.

Nors šiaip transformacija naudojant Agrobacterium sistemą pasižymi palyginus

aukštu efektyvumu, esama ir tam tikrų sunkumų, kurie riboja tokios sistemos taikymą

miško medžių genetinei transformacijai. Augalų transformacija Agrobacterium

pagalba reikalauja efektyvios tos augalų rūšies dauginimo in vitro sąlygomis sistemos.

Kai pažeistas augalo audinys yra transformuojamas Agrobacterium, reikia, jog iš šio

audinio, būtent iš transformuotų ląstelių, išsivystytų nauji augalai. Šito tikėtis leidžia

aukščiau minėta svarbi augalinių ląstelių savybė – totipotentiškumas, t.y. somatinių

ląstelių geba išauginti naują organizmą. Somatinės embriogenezės ar organogenezės

keliu iš transformuotos ląstelės išsivystęs augalas tada turėtų perkeltojo geno

lemiamas savybes bei galėtų perduoti jas palikuonims. Tačiau miško medžių atveju

21

tik nedaugeliui rūšių yra sukurta tokia efektyvi mikrovegetatyvinio dauginimo

sistema. Svarbiausia miško kultūra, tinkančia genetinei transformacijai, išlieka

drebulė, taip pat ir kai kurios kitos tuopų (Populus) rūšys. Tačiau kai kurie bandymai,

atlikti su įvairiomis spygliuočių medžių rūšimis, patvirtino ir sunkiau regeneruojančių

audinių kultūroje rūšių transformacijos galimybę. Geri rezultatai gauti

transformuojant Agrobacterium tumefaciens pagalba hibridinį maumedį. Kaip

augalinė medžiaga čia buvo naudota maumedžio embrioninė masė (ant zigotinių

embrionų susidaręs embriogeninis kalius). Atlikus transformavimo procedūrą pavyko

gauti somatinius embrionus, kurie vėliau išsivystė į augaliukus, ir kurių molekulinis

tyrimas patvirtino transformacijos sėkmę. Taigi maumedžiai buvo pirmieji

spygliuočiai, kuriems atlikta sėkminga transformacijos procedūra. Bandant įvairius

transformacijos būdus, pati efektyviausia pasirodė transformacijos Agrobacterium

tumefaciens pagalba sistema. Tačiau daugeliui miško medžių rūšių šią sistemą sunku

pritaikyti dėl jų menkos regeneracijos audinių kultūroje. Tai įgalina ieškoti genetinės

transformacijos galimybių apeinant audinių kultūros stadiją. Vienas iš galimų būdų

yra transformacija in planta, išbandyta su žoliniais augalais (vaireniu). Šiuo atveju

Agrobacterium, nešančia atitinkamą geną-žymenį, buvo užkrėstos dygstančios sėklos

ir transformacijos lygis patikrintas tarp išsivysčiusių augalų, taip pat tarp jų

palikuonių. Panaši metodika galėtų būti pritaikyta toms medžių rūšims, kurias sunku

dauginti audinių kultūroje. Atitinkamai būtų galima mėginti

užkrėsti ir transformuoti in planta žydinčius medžių ūglius,

o transformacijos lygį patikrinti tarp gautų palikuonių.

8 pav. Transformacijos Agrobacterium tumefaciens pagalba pavyzdys: į augalą įvedamas atsparumą vabzdžiams lemiantis genas. Iš: National 4-H Council. Fields of genes: making sense of biotechnology in agriculture.

Tam tikrų privalumų turi sumedėjusių rūšių transformacija

Agrobacterium rhizogenes, lyginant su A. tumefaciens.

Medžių transformacijos efektyvumą A. tumefaciens riboja

tai, kad dauguma sumedėjusių augalų rūšių pasižymi

nedideliu imlumu pastarosios bakterijų rūšies sukeliamai infekcijai, nedideliu

transgeninių ląstelių regeneracijos potencialu bei pernelyg dideliu jautrumu

cheminėms medžiagoms, naudojamoms transformuotų ląstelių selekcijai. Tuo tarpu

22

didelė dviskilčių augalų, o taip pat ir plikasėklių, įvairovė pasižymi imlumu A.

rhizogenes sukeliamai infekcijai. A. rhizogenes plačiai naudojama įvairių vaismedžių

bei miško medžių šaknijimosi pagerinimui. Šiuo atžvilgiu pastaroji Agrobacterium

rūšis pasirodė efektyvi dirbant su kriaušėmis, obelimis, vyšniomis, alyvmedžiais,

lazdynais, migdolais, kaštainiais, pušimis, maumedžiais, eukaliptais. Regeneravusius

transgeninius medžius pavyko gauti iš netikrosios akacijos, europinio maumedžio,

obelies, hibridinės tuopos, vynuogės šakniaplaukių. Ypač greita transformacija gauta

dirbant su netikrąja akacija: šakniaplaukiai susidarė per savaitę po infekcijos, o per

keturias savaites iš jų regeneravo ūgliai. Susidarę šakniaplaukiai gali greitai augti, ilgą

laiką būti kultivuojami bei spontaniškai regeneruoti ūglius. Taigi Agrobacterium

rhizogenes tarpininkaujama transformacija turi keletą privalumų: galima tiesioginė

(vizuali) šakniaplaukių atranka, nenaudojant ūglių regeneraciją inhibuojančių

chemikalų, taip pat galima išlaikyti stabilią šakniaplaukių kultūrą bei gauti

spontanišką ūglių regeneraciją. Siekiant gauti vienodo genotipo transformuotus

augalus tai yra patikimiau nei augalų regeneracija iš kaliaus, kadangi ilgai auginant

kaliaus kultūrą galimos ląstelių mutacijos, dėl ko toje pačioje kaliaus kultūroje

susiklosto tam tikra genetinė įvairovė. Tačiau A. rhizogenes panaudojimo galimybę

miško medžių transformacijoje riboja tai, kad šios bakterijos T-DNR sudėtyje yra rol

genai, kurie, infekcijos metu perkelti drauge su pageidaujamu genu, lemia išsigimusį

medžio fenotipą. Šiaip rol genai iš A. rhizogenes dažnai naudojami transformacijos

bandymuose, kadangi ženkliai pakitęs besivystančio augalo fenotipas yra geras

sėkmingos transformacijos indikatorius. Pavyzdžiui, rolC genas pakeičia

transformuotų drebulių augimą, lapų spalvą bei dydį.

Atliekant medžių transformaciją Agrobacterium pagalba, reikia turėti omenyje, kad

perkelta T-DNR gali integruotis į bet kurią chromosomą augalo genome. Tai gali būti

vienetinė insercija vienoje chromosomoje, keletas perneštos į augalinę ląstelę DNR

vienetinių insercijų skirtingose chromosomose ar keletas perkelto geno kopijų toje

pačioje chromosomoje. Taigi sunku iš anksto nuspėti, kiek rekombinantinio geno

kopijų po genetinės transformacijos bus integruota pirminių transformantų genome.

Kopijų skaičius gali būti skirtingas skirtinguose transformantuose. Taip pat negalima

iš anksto numatyti, kuriame chromosomos regione (heterochromatine ar

euchromatine) integruosis perkeliamas genas, tuo tarpu nuo integracijos vietos stipriai

priklauso perkelto geno ekspresija. Jei T-DNR į augalo ląstelės chromosomą įsiterpia

šalia kartotinių sekų arba heterochromatino (paprastai tai būna metilintos sekos), tai

23

perkeltas genas greičiausiai bus inaktyvuotas, jo ekspresija nevyks. Iš kitos pusės, kai

perkeliamas genas įsiterpia į intensyviai transkribuojamą euchromatino regioną, tai

tada jo ekspresiją veikia reguliacinės ląstelės-šeimininkės genų sekos. Taigi T-DNR

integracijos vieta bei tokių T-DNR intarpų skaičius neišvengiamai veikia šios DNR

sudėtyje perkelto geno ekspresiją. Vis dėlto transformacija Agrobacterium pagalba

sukuria mažesnę įvairovę pernešamos DNR įsiterpimo į augalinės ląstelės genomą

atžvilgiu nei kai kurie kiti metodai. Pavyzdžiui, apšaudymo dalelėmis atveju (šis

metodas aprašytas žemiau) regeneravusių transformuotų somatinių embrionų (įvairių

spygliuočių medžių rūšių) genome gali būti aptinkama nuo vienos iki daugiau kaip

šimto to paties integruoto geno kopijų, tuo tarpu Agrobacterium pagalba

transformuotos drebulės regenerantuose perkelto geno kopijų skaičius svyruoja nuo

vienos iki keleto. Geriausias variantas yra tuo atveju, kai į augalo ląstelės genomą

įsiterpia viena T-DNR kopija tokioje chromosomos vietoje, kur gali vykti normali

integruoto geno ekspresija. Perkelto geno ekspresijos reguliavimas savo ruožtu

priklauso ne vien nuo ląstelės-šeimininkės reguliacinių sekų, kurios gali veikti jo

raišką (tai vadinama trans reguliavimu), bet ir nuo atitinkamų sekų, esančių to paties

geno konstrukcijoje (cis reguliavimas). Konstruojant geną, kurį norima perkelti į

augalo ląstelę, parenkamas atitinkamas promotorius to geno transkripcijos valdymui.

Miško medžių genetinės transformacijos atveju čia reikia išspręsti specifines

problemas. Medžiai gyvena daugelį metų, tad ir promotorius perkeliamam genui turi

būti parinktas toks, kad galėtų užtikrinti stabilią ilgalaikę integruoto geno ekspresiją.

Kiti metodai, taikomi augalų genetinėje transformacijoje

Kiti pagrindiniai augalų genetinės transformacijos būdai yra susiję su tiesioginiu

svetimos genetinės medžiagos įvedimu į augalo ląstelę. Vienas iš tokių būdų yra

vadinamas balistiniu metodu arba dalelių bombardavimu. Tai gana įprastas metodas

augalų transformacijoje, ypač toms jų rūšims, kurios yra atsparios Agrobacterium

infekcijai. Šio metodo principas (6 pav.) paprastas: perkeliama DNR (paprastai

plazmidė) prilipdoma prie mikroskopinių metalo (aukso arba volframo) dalelių,

vadinamų mikrodalelėmis. Tada tokios mikrodalelės, padengtos DNR, yra iššaunamos

į augalo audinį, kurį norima transformuoti. Dalelių svoris, dydis ir greitis parenkamas

kaip tik toks, kad jos prasiskverbtų pro augalo ląstelės sienelę ir įstrigtų ląstelėje, jos

neužmušdamos. Dalis į ląstelę patekusios plazmidinės DNR atsiskiria nuo

mikrodalelių ir gali judėti į branduolį bei ten integruotis į augalinės ląstelės genomą.

24

Tokiu atveju perneštieji genai bus ekspresuojami. Tokios transformacijos sėkmė

dažniausiai patikrinama sekant geno-žymens ekspresiją. Paprasčiausia čia naudoti β-

gliukuronidazės (GUS) geną su stipriu, nespecifiniu promotoriumi. Po tam tikro laiko,

per kurį jau gali pasireikšti geno ekspresija, GUS aktyvumas gali būti lengvai

nustatytas inkubuojant audinį su GUS substratu X-Gluc (5-bromo-4 chloro-3-indolil-

β-D-gliukuronidas); reakcijos produktas pasižymi charakteringa mėlyna spalva. Tada

transformacijos efektyvumas nustatomas tiesiog suskaičiuojant mėlynas dėmes ant

mikrodalelėmis apšaudyto audinio. Paprastai šis efektyvumas nėra didelis, kadangi

svetima DNR dažniausiai nesiintegruoja į augalinės ląstelės genomą (vieną iš

chromosomų) ir nesireplikuoja. Daug tyrimų atliekama norint padidinti šio genetinės

transformacijos metodo efektyvumą. Ieškoma optimalaus dalelių dydžio bei greičio,

DNR ir aukso arba volframo koncentracijų, buferio, kuriame DNR rištųsi su

mikrodalelėmis, DNR formos (linijinė ar žiedinė) ir kitų parametrų. Be to, svarbu ne

tik tai, kad perkeliama DNR integruotųsi į ląstelės genomą, tačiau taip pat reikia, kad

pati augalo ląstelė būtų pajėgi duoti pradžią naujam augalui, t.y. regeneruoti.

Nustatyta, jog sumedėjusiuose augaluose tokiai transformacijai yra tinkamiausi šie

audiniai: embriogeninis kalius, nesubrendę zigotiniai bei somatiniai gemalai,

embrioninės meristemos. Minėti audiniai transformacijai tinkamiausi būtent dėl

aukšto regeneracijos potencialo.

9 pav. Augalo transformacija dalelių

bombardavimo metodu.

Elektroporacija yra ląstelių veikimas aukštos įtampos elektros lauku. Padidinamas

membranų pralaidumas ir tokiu būdu į ląstelę gali patekti į terpę pridėtos medžiagos,

taip pat ir DNR. Kaip ir dalelių bombardavimo atveju, nėra aišku, ar į ląstelę patekusi

DNR judės į branduolį, integruosis į ląstelės genomą ir bus ekspresuojama. Iš pradžių

25

manyta, jog elektroporacijos metodas dėl augalų ląstelės sienelės nepralaidumo bus

tinkamas tik protoplastams (augalinėms ląstelėms, kurių sienelė pašalinta mechaniškai

arba fermentų pagalba). Tačiau kai kurių augalų rūšių embrioninės bei kaliaus ląstelės

buvo sėkmingai transformuotos elektroporacijos metodu. Transformacijos

elektroporacijos metodu efektyvumas padidėja, kai dirbama su tokiomis augalų

ląstelėmis, kurių sienelė yra dalinai ištirpinta arba mechaniškai pažeista. Vis dėlto pati

transformacija šiuo metodu efektyviausa, kai dirbama su protoplastais. Tačiau

protoplastai pernelyg jautrūs aplinkai, didelė jų dalis žūva, be to, iš jų ypač sunku

regeneruoti naujus augalus. Taigi elektroporacija kol kas nėra itin efektyvus metodas

siekiant transformuoti augalines ląsteles.

Mikroinjekcijų metodu ląstelės transformuojamos įvedant į jas ypač plonus švirkštus

ir suleidžiant svetimą genetinę medžiagą. Šis metodas gali būti ypatingai efektyvus,

kai DNR įterpiama tiesiai į ląstelės branduolį. Iš pradžių šis metodas taikytas gyvūnų

ląstelėms, pavyzdžiui, atliekant DNR injekcijas į žinduolių zigotas galima sukurti

transgeninius gyvūnus. Augaluose sėkmingas mikroinjekcijų panaudojimas

dažniausiai apsiriboja protoplastų transformacija, nors kai kuriais atvejais įmanoma

atlikti tokias DNR injekcijas netgi į ūglio meristemos ląsteles. Yra aprašytas aukštu

efektyvumu pasižymintis DNR įleidimo į augalinės ląstelės branduolį ar chloroplastus

būdas naudojant vadinamąjį galinstano išsiplėtimo švirkštą: labai mažo diametro

stiklinis kapiliaras yra užpildomas DNR bei skystų metalų lydiniu galinstanu, į kurio

sudėtį įeina galis, indis ir alavas. Kapiliaro galiukas įterpiamas į ląstelę ir stiklinis

vamzdelis kaitinamas karštu oru. Kaitinamas metalų lydinys išsiplečia, taip

išstumdamas DNR į ląstelę. Tokia metodika gali būti sėkmingai pritaikoma lengvai iš

protoplastų regeneruojantiems žoliniams augalams, taip pat – laisvai gyvenančių

žemesniųjų augalų zigotų transformacijai. Tačiau, kaip ir elektroporacijos atveju,

sunki sumedėjusių augalų regeneracija iš protoplastų neleidžia plačiau taikyti

mikroinjekcijų metodo miško medžių genetinėje transformacijoje.

Tiesioginio genetinės medžiagos pasisavinimo metodai susiję su pastebėjimu, kad

visos gyvos ląstelės geba “susirinkti” DNR molekules iš jas supančios aplinkos. Tokiu

būdu į ląstelę patekusi DNR gali būti įterpta į branduolio genomą ir ekspresuojama.

Šis procesas yra analogiškas bakterijų transfekcijai, lyginant su pastarosiomis,

eukariotinėse ląstelėse jis sutinkamas rečiau, tačiau vis dėlto jo dažnis nėra mažas.

Pirmieji tiesioginio DNR įsisavinimo bandymai augalų tarpe buvo atlikti su įvairių

augalų sėklomis bei daigais. Kai kuriais atvejais taip pat naudotos žiedadulkės bei

26

kultūroje užaugintos ląstelės. DNR pasisavinimas bei integracija buvo sekama

naudojant autoradiografiją arba centrifugavimą cezio chlorido gradiente, vėliau

sukurti patikimesni metodai specifinių genų buvimui bei ekspresijai nustatyti.

Didesnio tiesioginio DNR pasisavinimo efektyvumo galima siekti įvairiais būdais.

DNR sąveika su ląstelės membrana tirpale gali būti sustiprinta naudojant polietileno

glikolį. Galima nusodinti DNR ant ląstelės paviršiaus kalcio fosfatu arba stroncio

fosfatu, formuoti DNR kompleksus su dekstranu arba katijonais, paveikti ląstelę

osmotiniu šoku arba dimetilsulfoksidu. Taip pat išorinė DNR gali būti patalpinta į

dirbtines fosfolipidų pūsleles, vadinamas liposomomis, kurios suliejamos su ląstelės

plazmine membrana. Liposomų naudojimo privalumai yra šie: genetinė medžiaga

apsaugoma nuo degradacijos nukleazėmis, DNR lengviau patenka į ląstelę, taip pat

liposomose į ląstelę gali patekti didelės plazmidės, dideli DNR kiekiai ir daugybiniai

genai (daugiau kaip 10000 plazmidžių vienai ląstelei), be to, liposomos nepasižymi

toksiniu poveikiu. Tačiau visa ši su tiesioginio DNR pasisavinimo pagerinimu susijusi

metodika daug dažniau naudojama transformuojant žinduolių ląsteles, tuo tarpu

augalų genetinėje transformacijoje tai atliekama palyginti retai. Problema išlieka ta

pati: tvirta augalinės ląstelės sienelė trukdo efektyviam genetinės medžiagos

pasisavinimui iš aplinkos, o regeneracijos iš protoplastų galimybės ribotos. Iš dalies

šią problemą gali padėti išspręsti paprasta, bet efektyvi tiesioginio DNR pasisavinimo

technologijos modifikacija: augalinių ląstelių maišymas drauge su silikono karbido

skaidulomis. Silikono karbidas yra ypač kieta medžiaga, kuri gali būti apdorota taip,

kad suformuotų ilgus spyglio pavidalo kristalus. Kai augalinės ląstelės sūkuriniu

judėjimu sumaišomos drauge su tokiais kristalais, silikono karbido skaidulos perveria

ląsteles, tuo būdu atverdamos mažas poras ląstelės sienelėje bei membranoje, pro

kurias į ląstelę gali nesunkiai patekti DNR. Tada transformuotos ląstelės toliau gali

būti kultivuojamos ant atrankinės terpės. Ši metodika sėkmingai naudojama

transformuojant įvairias augalų rūšis, taip pat ir medžius, pavyzdžiui, silikono karbido

skaidulų panaudojimas padidino amerikinio kaštainio transformacijos Agrobacterium

tumefaciens pagalba efektyvumą.

Svetimos DNR patekimas į branduolį nėra vienintelis augalinių ląstelių genetinės

transformacijos kelias. Savitą genomą turi ir augalų ląstelių plastidės, ir šių ląstelių

genetinės transformacijos eigoje galimas tikslingas svetimos genetinės medžiagos

nukreipimas į chloroplastus. Chloroplastai turi savo žiedinę DNR, kuri koduoja dalį

šiose plastidėse sutinkamų baltymų (kai kurie jų ypač svarbūs fotosintezei) bei jų

27

sintezei reikalingas RNR. Chloroplastų genetinė transformacija gali padėti išvengti

kai kurių su branduolio genomo transformacija susijusių problemų. Transformavus

branduolio genomą, perkelto geno ekspresija dažniausiai vyksta sąlyginai žemu lygiu,

be to, gali vykti nepageidautinas šio geno plitimas tarp laukinio tipo augalų drauge su

transformuoto augalo sėklomis, o ypač – su jo žiedadulkėmis. Tuo tarpu chloroplastai

pasižymi geba sukaupti labai dideles atskirų baltymų koncentracijas. Į chloroplastų

genomą integruotas svetimas tai augalų rūšiai genas neturi tiek daug galimybių plisti

aplinkoje, kadangi daugumos augalų rūšių žiedadulkės neturi plastidžių. Du

dažniausiai naudojami būdai chloroplastų transformacijai yra dalelių bombardavimas

ir polietileno glikoliu sustiprintas DNR pasisavinimas. Chloroplastų transformacijos

galimybę turėtų žymiai padidinti mikroinjekcijų technologijos vystymas, kai svetima

DNR į ląstelę perkeliama naudojant galinstano išsiplėtimo švirkštą. Perkeltų genų

raiška chloroplastuose gali būti reguliuojama plastidėms specifiniais promotoriais.

DNR į branduolį ar kitas ląstelės organeles gali būti nukreipiama suliejant ją su

atitinkamomis peptidinėmis sekomis, kurios tarnauja kaip viduląstelinio transporto

signalai, arba tiesiogiai įliejama į paskirties vietą mikroinjekcijos metu.

Kita problema yra ta, kad pernešta DNR į ląstelės-šeimininkės genomą integruojasi

nespecifiškai. Kaip minėta, geno įsiterpimas į netranskribuojamą chromosomos vietą

praktiškai reiškia nesėkmingą tos ląstelės transformaciją. Apskritai, yra du būdai, kaip

perkeliamas genas gali integruotis į ląstelės-šeimininkės genomą. Tai homologinė

rekombinacija ir nehomologinė rekombinacija. Homologinė rekombinacija vyksta

tarp panašių sekų ląstelės genome ir perkeliamoje genetinėje medžiagoje. Šiuo atveju

ląstelės-šeimininkės genai pakeičiami tais, kurie pernešami su svetima DNR. Tuo

tarpu nehomologinės rekombinacijos atveju pernešama DNR tiesiog atsitiktinai

įsiterpia bet kurioje ląstelės genomo vietoje, nepriklausomai nuo panašumo į ląstelės-

šeimininkės DNR sekas. Nehomologinės rekombinacijos metu ląstelė savo genų

dažniausiai nepraranda. Homologinė rekombinacija yra dažnai pasitaikantis ir netgi

vyraujantis rekombinacijos kelias bakterijų ir žemesniųjų eukariotų tarpe. Šis

reiškinys siūlo įvairialypes galimybes genų inžinerijai: perkeltų genų ekspresija gali

būti reguliuojama vietiniais ląstelės promotoriais, defektyvūs genai pakeisti

veikliomis sekomis arba, atvirkščiai, veiklūs genai išmušti pakeičiant juos

mutavusiomis neveikliomis sekomis, gali būti sustiprinta svetimų genų raiška,

sumažintas ko-supresijos dažnis, kai įvedamos daugybinės homologinių genų sekos.

Taip pat homologinė rekombinacija labai pasitarnauja funkcinėje genomikoje, t.y.

28

tiriant atskirų genų funkcijas. Tačiau aukštesniuosiuose eukariotuose homologinė

rekombinacija yra labai retas įvykis. Dirbant su aukštesniaisiais augalais dar nedaug

yra sukaupta eksperimentinės patirties tikslingam genų įterpimui į atitinkamas vietas

augalų chromosomose. Bandant tikslingai įterpti homologinius genus į modelinio

augalo vairenio genomą nustatyta, kad homologinė rekombinacija tarp perkeliamos

DNR ir ląstelės šeimininkės genomo vyko tik 1/2500 dažniu iš visų transformacijos

atvejų. Tuo tarpu tiriant kitų augalų rūšių transformacijos ypatumus homologinės

rekombinacijos atvejų apskritai nenustatyta. Tačiau pora žemesniųjų augalų rūšių iš

žaliųjų dumblių bei samanų buvo sėkmingai transformuotos homologinės

rekombinacijos būdu, t.y. perkeliama genetinė medžiaga įsiterpė būtent į atitinkamą

chromosomos vietą, pakeisdama homologinę ląstelės-šeimininkės DNR. Kadangi

minėtų augalų genomas haploidinis, galima spėti, jog haploidinėje būsenoje augalų

genomas yra labiau linkęs į homologinę rekombinaciją nei diploidinėje. Tačiau šį

spėjimą sunku patikrinti, nes apskritai trūksta pranešimų apie sėkmingą aukštesniųjų

augalų haploidinių audinių transformaciją. Tad kol kas metodikos tikslingam genų

įterpimui į atitinkamas vietas augalų chromosomose sukūrimas lieka vienu iš

svarbiausių augalų biotechnologijos uždavinių.

8. Genetiškai modifikuotų medžių biocheminis ir

citogenetinis įvertinimas Pirmieji augalų transformacijos bandymai buvo atliekami su genais-žymenimis, o

toliau genetinės augalų modifikacijos pradėtos sieti su ūkiniu požiūriu svarbiais

genais. Tačiau ir vykdant augalų transformaciją su komerciškai naudingais genais

svarbiu etapu išlieka transformacijos sėkmės įvertinimas. Dirbant su miško medžiais

ypač svarbu atitinkamų žymenų pagalba įvertinti, ar transformacija buvo sėkminga, ar

ne, kadangi medžiai bręsta ne vienerius metus ir įvestojo geno pasireiškimas fenotipe

kartais gali būti pastebėtas tik po labai ilgo laiko. Tuo tarpu genetinių žymenų

panaudojimas leidžia netrukus po transformacijos nustatyti būtent iš transformuotų

ląstelių regeneravusius augalus. Augalų ląstelėms tirti naudojami tiek bakterinės, tiek

augalinės kilmės genetiniai žymenys, kurie gali būti suskirstyti į dvi grupes. Tai

atrankos žymenys bei patikros žymenys. Atrankos žymenimis vadinami tokie

žymenys, kurie leidžia atrinkti transformuotas ląsteles ar audinių eksplantus pagal jų

sugebėjimą augti ant terpės su antibiotiku ar herbicidu. Dažniausiai naudojami

29

atrankos žymenys yra kanamicinas ir higromicinas. Be to, kad padeda atrinkti

augalus-transformantus, tokie žymenys leidžia sekti svetimos kilmės geno

paveldėjimą atskiroje augalų populiacijoje.

Patikros žymenys yra genai, koduojantys produktus, kurių fermentinis aktyvumas gali

būti lengvai įvertintas. Tai leidžia ne tik nustatyti augalus-transformantus, bet taip pat

ir įvertinti svetimo geno ekspresijos lygį transgeniniame audinyje. Tokie žymenys

kaip β-gliukuronidazė (GUS), liuciferazė ar β-galaktozidazė leidžia histocheminių

dažų ar fluorimetrinio tyrimo pagalba patikrinti fermento aktyvumą individualiose

ląstelėse ir gali būti naudojami tirti audiniui ar ląstelei specifinę, o taip pat vystymosi

eigoje reguliuojamą perkeltojo geno raišką. Genai-žymenys turi būti surišti su

promotoriais, gautais iš augalų patogenų, pavyzdžiui, Agrobacterium T-DNR ar

augalų virusų. Tada galima tikėtis, jog tokie promotoriai gerai funkcionuos visose

augalo ląstelėse, nors vis labiau aiškėja, kad tokių promotorių valdoma ekspresija gali

būti tam tikru moduliuojama pagal augale veikiančius vystymosi veiksnius.

Parenkant atrankos geną-žymenį svarbu atsižvelgti į du dalykus. Tai, pirmiausia, geno

struktūra (nukleorūgščių seka), kuri apsprendžia trnskripcijos reguliavimo pobūdį

(gali būti pastovi, priklausoma nuo aplinkos arba kintanti vystyosi eigoje geno raiška),

transkripcijos lygį, transkripto stabilumą bei transliacijos efektyvumą. Antras dalykas

– pats geno produktas, kuris turi būti atsakingas už dominuojantį tinkamo atrankinio

fenotipo pasireiškimą. Daugumos įprastų transformacijos vektorių atrankinės

funkcijos pasireiškia tuo, jog jie koduoja atsparumą antibiotikams lemiančius

fermentus. Taip pat naudojami genai-žymenys, kurie koduoja fermentus,

apsaugančius augalo ląstelę nuo specifinių herbicidų. Ruošiant geną-žymenį, fermentą

koduojanti geno dalis viename sekos gale suliejama su promotoriumi, išskirtu iš

Agrobacterium T-DNR arba augalų viruso CaMV genomo, tuo tarpu kitame gale

prijungiamas poliadenilinimo signalas, kuris taip pat dažniausiai būna išskirtas iš

vieno T-DNR genų. Taigi, kaip atrankos žymenys gali tarnauti genai, suteikiantys

atsparumą antibiotikams arba herbicidams. Ypač efektyvi transformantų atranka

vyksta naudojant geną, kuris lemia augalinių ląstelių atsparumą herbicidui

kanamicinui. Šis atrankos būdas dažnai taikomas atliekant augalų transformaciją

Agrobacterium pagalba. Atsparumą kanamicinui suteikiantis genas įeina į T-DNR

sudėtį drauge su tiksliniu genu ir po to, kai T-DNR iš Agrobacterium pernešama į

augalo ląstelę, čia vykstanti atsparumo geno ekspresija parodo, jog augalinė ląstelė

30

sėkmingai transformavosi, t.y. T-DNR įsiterpė į augalo genomą transkribuojamoje

chromosomos dalyje. Tuo būdu augalo audiniai po transformacijos procedūros yra

kultivuojami ant atrankinės terpės, į kurios sudėtį įeina kanamicinas. Toliau vystytis ir

regeneruoti naujus augalus geba tik transformuotos ląstelės, kadangi kitos ląstelės dėl

herbicido poveikio lieka negyvybingos. Taigi, yra didelė tikimybė, jog visi ant tokios

atrankinės terpės regeneravę augalai bus genetiškai modifikuoti.

Patikros genai-žymenys suteikia galimybę patikrinti audinių transformaciją

nepriklausomai nuo atrankinėje terpėje esančių antibiotikų ar herbicidų. Dažniausiai

naudojami patikros žymenys yra chloramfenikolio acetil transferazė, β-gliukuronidazė

(GUS), β-galaktozidazė ir liuciferazė. Tai yra bakterijų fermentai, augaluose

aptinkami tik tada, jei augalas transformuojamas šiuos fermentus koduojančiais

genais. Ypač dažnai naudojamas patikros žymuo yra β-gliukuronidazę koduojantis

genas iš bakterijos E. coli. β-gliukuronidazė (GUS) yra fermentas hidrolazė,

katalizuojantis β-gliukuronidų skilimą. Dauguma β-gliukuronidų yra naudojami kaip

substratai spektrofotometrinėje, fluorometrinėje ir histocheminėje analizėje. GUS yra

ypač parankus augalų transformacijos tyrimuose, kadangi augaluose šio fermento

natūraliai neaptinkama. Tai reiškia, jog histocheminės analizės metu išryškėja būtent

specialiai tyrimui į augalą įvesto GUS geno produkto veiklos aktyvumas. Fermentas

atsparus fiksacijai, jo aktyvumas nustatomas lengvai, jautriai ir pigiai, histochemiškai

jį galima lokalizuoti labai tiksliai. Kaip GUS substratas histocheminėje analizėje

dažniausiai naudojamas 5-bromo-4 chloro-3-indolil- β-D-gliukuronidas (X-gluc).

Fermentinės reakcijos, kurią katalizuoja GUS, metu nuo X-gluc atskyla indoksilo

grupė, kuri dimerizuojasi į vandeninėje aplinkoje netirpų indigą (mėlyna spalva).

Taigi histocheminės GUS analizės metu tiriamasis augalo audinys mirkomas substrato

tirpale ir stebimas mėlynos spalvos pasirodymas. Tiksli GUS aktyvumo audinyje

lokalizacija atliekama stereomikroskopo pagalba.

GUS analizė plačiai pritaikoma augalų genų raiškos tyrimuose. Ši analizė naudojama

ne vien tada, kai transformuojant augalą stengiamasi įvesti kokį nors tikslinį, t.y.

augalo savybes pagerinantį geną, o GUS genas reikalingas tiesiog patikrinti, kiek

sėkminga buvo transformacija, bet taip pat ir kitokio pobūdžio tyrimuose. Naudojant

GUS geną gali būti tiriami kitų genų raiškos ypatumai augalo audiniuose. Tokiu

atveju paprastai konstruojamas genas, sudarytas iš tiriamojo geno promotoriaus ir

fermentą gliukuronidazę koduojančios sekos. Tada augalas transformuojamas šiuo

31

dirbtiniu genu. Histocheminė analizė leidžia sekti po transformacijos regeneravusių

augalų audiniuose GUS geno aktyvumą, kuris yra priklausomas nuo kito (tiriamojo)

geno promotoriaus, dirbtinai prijungto prie gliukuronidazę koduojančios sekos. Tokiu

būdu gali būti nustatomi tiriamojo geno ekspresijos ypatumai įvairiuose audiniuose,

taip pat įvairiomis augalo vystymosi stadijomis, kadangi taikant tokį analizės metodą,

galima stebėti, kaip GUS genas yra transkribuojamas nuo tiriamojo geno

promotoriaus, taigi tiriama šio promotoriaus veikla ir tuo pačiu gaunami duomenys

apie tiriamojo geno transkripciją. Analogiška metodika gali būti taikoma ir siekiant

atrasti promotorius ar kitas reguliuojančias sekas, kurios būtų naudojamos

konstruojant vektorių tiksliniam genui įvesti. GUS geno panaudojimas suliejant šio

geno koduojančią seką su tiriamais promotoriais leidžia ištirti transkripcijos nuo šių

promotorių ypatumus. Tokių tyrimų eigoje sukaupti duomenys leidžia atitinkamai

parinkti promotorius įvedamiems tiksliniams genams atsižvelgiant į tai, kokių geno

raiškos ypatumų augale pageidaujama, pavyzdžiui, aktyvios transkripcijos, ilgalaikės

transkripcijos, transkripcijos tam tikrame audinyje arba nuo tam tikrų aplinkos

veiksnių priklausomos transkripcijos.

Augalų transformacijoje taikomi molekuliniai tyrimo metodai skirti tiesioginei

transformuotų audinių genetinės medžiagos analizei. Transgeninių augalų analizei

taikomuose molekulinių tyrimų metoduose dažnai naudojama polimerazės grandininė

reakcija. Paprasčiausiu atveju, kai siekiama tiesiog nustatyti svetimos DNR buvimą

augalinėse ląstelėse, atliekama iš transformuoto audinio regeneravusių augalų DNR

analizė. Iš regeneravusio augalo audinių išskiriama DNR, kuri bus naudojama

polimerazės grandininėje reakcijoje (PGR). Šios reakcijos tikslas yra tam tikro DNR

fragmento amplifikacija. Tipiška PGR susideda iš 3 temperatūra kontroliuojamų

pakopų, kurios kartojamos 30 – 40 kartų. Reakcijos mišinys susideda iš buferio,

temperatūrai atsparios DNR polimerazės, keturių rūšių deoksinukleotidtrifosfatų,

dviejų oligonukleotidinių pradmenų, šabloninės (tiriamosios) DNR. Reakcijos

selektyvumą lemia pradmenų pasirinkimas. Pradmenys – tai vienagrandės DNR

gabaliukai (oligonukleotidai), turintys seką, komplementarią šabloninės DNR sekoms.

Pirmoje pakopoje denatūruojama dvigrandė šabloninė DNR keliant temperatūrą iki 94 0 C. Antroje pakopoje žeminant temperatūrą prisijungia pradmenys prie šabloninės

DNR. Pradmenys prisijungia tose vietose, kuriose šabloninė DNR yra jiems visiškai

ar beveik visiškai komplementari. Trečiojoje pakopoje pasirenkama temperatūra,

optimali termostabiliai DNR polimerazei (dažniausiai 72 0 C). Tai – elongacijos

32

pakopa. Jos metu fermentas dėka savo 5’→3’ polimerazinio aktyvumo nuo pradmens

3’ galo susintetina ant šabloninės DNR antrą grandinę. Kai tai nutinka abiejose

pradmenų prisijungimo vietose ant abiejų DNR grandinių, taikinio fragmentas yra

pilnai replikuotas. Sekančiame cikle visos susintetintos dvigrandės DNR, tiek

pirminės, tiek naujai susintetintos, vėl denatūruojamos. Pakartojus šį tripakopį ciklą

30 – 40 kartų, pagausinamas DNR fragmentas, apribotas pradmenimis. Ilgesni

produktai taip pat gaminami, bet jų kiekiai galutiniame produkte yra nereikšmingi.

Taigi, turi būti pasirinkti atitinkami oligonukleotidiniai pradmenys, apribojantys geno,

kuriuo buvo siekiama transformuoti augalą, DNR seką. Po PGR reakcijos atliekama

jos produktų analizė. Ši analizė pagrįsta DNR fragmentų išfrakcionavimu pagal dydį

agarozės arba poliakrilamidiniame gelyje elektroforezės eigoje. Jei po elektroforezės

padarytoje gelio nuotraukoje matome, jog PGR reakcijos metu buvo amplifikuotas

DNR fragmentas, dydžiu atitinkantis ieškomą geną, tai reiškia, jog transformacija

buvo sėkminga bent tuo atžvilgiu, jog svetimas genas integravosi į augalo ląstelės

genomą. Tačiau tai galima pasakyti tik tuomet, kai tiriama jau iš transformuoto

audinio regeneravusio augalo DNR. Tuo tarpu jei PGR reakcijos pagalba norima

ištirti augalo audinį iškart po transformacijos, tai tada ši reakcija gali patvirtinti tik

svetimos DNR buvimą augalo ląstelėse, bet ne jos integraciją į augalo genomą,

kadangi dar nežinoma, ar perkeltas genas bus stabiliai replikuojamas. Iš kitos pusės,

netgi stabili svetimo

geno replikacija kartu

su ląstelės genomu dar

nerodo, jog

transformacija tikrai

pavyko, kadangi

pernešamas genas turi

ne tik integruotis į

ląstelės genomą, bet ir

būti ekspresuojamas.

10 pav. Polimerazės

grandininė reakcija.

33

Tad transformacijos sėkmę labiau gali patvirtinti svetimo geno transkriptų, t.y.

informacinės RNR (iRNR), nustatymas transformuoto augalo audiniuose. Ieškant

perkelto geno transkriptų galima ištirti jo ekspresiją skirtinguose augalo audiniuose

arba tiesiog pasirinkti tyrimui tą audinį, kuriame tikimasi intensyviausios šio geno

raiškos. Taigi iš pasirinktojo audinio pirmiausia išskiriama visų rūšių RNR, o paskui,

naudojant politimino daleles, galima išgaudyti būtent informacinę RNR, kadangi ši

turi poliadenino uodegėles (iRNR atskyrimas pagrįstas adenino-timino sąveika). Tada

fermento atvirkštinės transkriptazės pagalba pagal iRNR matricas sintetinamos

dvigubos grandinės kopijinės DNR (cDNR). Šių cDNR rinkinys ir tarnauja kaip

šabloninė DNR PGR reakcijoje. Tokiu būdu, naudojant atitinkamus pradmenis,

galima iš kitų cDNR išskirti (amplifikuoti) tą, kuri atitinka į augalą perkeltą svetimą

geną, šitaip įsitikinant, jog šio geno raiška vyksta transformuotame augale.

Molekuliniam transformuotų augalų tyrimui taip pat dažnai pritaikomas vadinamasis

Southern analizės metodas. Jis gali patvirtinti stabilią svetimos DNR integraciją į

augalo genomą, be to, parodyti kiek yra genome įsiterpusių svetimos DNR kopijų,

kaip tos kopijos išsidėstę genome, taip pat galima nustatyti perkeltosios DNR

stabilumą pirmos kartos palikuonyse. Atliekant Southern analizę augalo DNR

restrikcijos fermentais yra sukarpoma į atskirus fragmentus. Šie fragmentai

elektroforezės eigoje išskirstomi agarozės gelyje (gelyje DNR taip pat denatūruojama

ir neutralizuojama). Tada frakcionuota DNR perkeliama ant tam tikros membranos.

Perkėlimas atliekamas kapiliarų pagalba taip, kad santykinės DNR fragmentų

pozicijos išliktų nepakitę. Membrana su imobilizuota DNR inkubuojama su

vienagrande radioaktyviai žymėta DNR, kuri pagal savo seką turi hibridizuotis su į

augalą transformacijos metu perkeltos DNR seka. Tada membrana nuplaunama ir

hibridizavęsi homologinės DNR fragmentai nustatomi naudojant autoradiografiją.

9. Molekuliniai žymenys medžių genetinės įvairovės ir

tapatumo įvertinimui Miško medžių genetikai dažnai susiduria su praktiškais klausimais apie medžių,

miško želdinių ar miško reprodukcinės medžiagos kilmę, genetinį kintamumą ar

prisitaikymą. Šie klausimai gali iškilti biologams, ekologams, miškų savininkams,

miškininkams, aplinkos apsaugos organizacijoms, o taip pat ir patiems miško medžių

genetikams pasirenkant tyrimus. Daugumą šių klausimų galima išspręsti molekulinių

34

žymenų pagalba, kurie gali būti pritaikyti įvairių organizmų genetiniam apibūdinimui.

Naudojant molekulinius žymenis labai ženkliai išaugo galimybės įvertinti biologinę

įvairovę, atkurti tikslų filogenetinį giminingumą ir suprasti miško medžių struktūrą,

evoliuciją ir sąveiką.

Genetinė įvairovė yra vienas iš svarbiausių miškų stabilumą laiduojančių veiksnių,

ypač pastaruoju metu pastebimų ryškių klimato ir aplinkos pokyčių sąlygomis.

Paskutiniais metais Europoje ypač išsiplėtė lapuočių medžių rūšių genetiniai tyrimai,

naudojant tiek įprastus metodus, paremtus kilmių, populiacijų palikuonių, šeimų ir

klonų testavimu atskiruose eksperimentiniuose želdiniuose ar želdinių tinkluose, tiek

ir naujus molekulinių žymenų metodus. Genetiniai žymenys gali būti skirstomi į tris

pagrindines klases: morfologiniai, biocheminiai ir DNR. Pagrindiniai tipai

molekulinių žymenų, naudojamų augalų genetikoje ir selekcijoje, yra tokie:

atsitiktinai pagausintos DNR polimorfizmas (angl. random amplified polymorphic

DNA, RAPD), pagausintų fragmentų ilgio polimorfizmas (angl. amplified fragment

length polymorphism, AFLP), mikrosatelitai (angl. simple sequence repeats, SSR), tarpmikrosatelitinių sekų polimorfizmas (angl. inter-simple sequence repeats, ISSR),

restrikcijos fragmentų ilgio polimorfizmas (angl. restriction fragment length

polymorphism, RFLP) (2 lentelė).

2 lentelė. Dažniausiai naudojamų molekulinių žymenų tipai

Žymens tipas Paremti

PGR

Polimorfizmo lygis Vyravimas

RFLP Ne Vidutiniškai žemas Kodominavimas

RAPD Taip Vidutiniškai aukštas Dominavimas

SSR Taip Aukštas Kodominavimas

ISSR Taip Aukštas Dominavimas

AFLP taip Aukštas Dominavimas

Pirmieji molekuliniai žymenys, RFLP, buvo paremti DNR-DNR hibridizacija. RFLP

apibūdinama kaip įvairaus ilgio DNR fragmentai gauti naudojant specifinę restrikcijos

endonukleazę dviem ar daugiau individų genominės DNR. Galima gauti didelį skaičių

įvairaus ilgio RFLP fragmentų sukarpius DNR su specifiniais restrikcijos fermentais.

Gautų fragmentų analizavimas yra ilgas ir brangus procesas. Hibridizacijos rezultatai

35

gali būti vizualizuojami autoradiografiškai (jeigu pradmenys su radioaktyvia žyme)

arba chemiliuminescencija.

Polimerazinės grandininės reakcijos (PGR), kurios pagalba pagausinami trumpi DNR

segmentai, pritaikymas genetiniuose tyrimuose suteikė galimybę atsirasti naujiems

molekuliniams žymenims, paremtiems PGR (3 lentelė).

3 lentelė. Pagrindinės būtinos sąlygos molekuliniams žymenims

Molekulinis

žymuo

Reikalingas

DNR

kiekis

DNR sekos

reikalingumas

Radioaktyvinė

detekcija

Reikalingas gelis

RFLP Didelis Ne Taip/Ne Agarozės

RAPD Mažas Ne Ne Agarozės

SSR Vidutiniškai

mažas

Taip Ne Akrilamidinis

ISSR Vidutiniškai

mažas

Taip/Ne Ne Akrilamidinis/Agarozės

AFLP Vidutiniškai

didelis

Ne Taip/Ne Akrilamidinis

RAPD - tai techniškai pats paprasčiausias metodas iš visų PGR su atsitiktiniais

pradmenimis. Reakcijos selektyvumą lemia pradmenų pasirinkimas. Pradmenys – tai

vienagrandės DNR gabaliukai (oligonukleotidai), turintys seką, komplementarią

šabloninės DNR sekoms. Specifiškiausia amplifikacija vyksta tuomet, kai tarp

pradmenų prisijungimo vietų yra ne didesnis atstumas kaip 4 kb. Nors produktų

galima tikėtis iki 10 kb, esant optimalioms reakcijos sąlygoms. Naudojant šį metodą

galima nustatyti genetinę įvairovę ar įvertinti giminingumą, net neturint jokios

informacijos apie tiriamų objektų genominės DNR nukleotidų sekas. Tiriamų individų

genetinis panašumas nustatomas vertinant jų genominės DNR pagausinimo spektrus.

Mikrosatelitai priklauso kartotinių DNR sekų grupei. Šie mikrosatelitiniai motyvai

augaluose aptinkami dažnai, maždaug kas 6-7 kb. Šis metodas taip pat pagrįstas

polimerazės grandininė reakcija. Kiekvieno lokuso tyrimui reikalingi du specifiniai

pradmenys: tiesioginis (forward) ir atvirkštinis (reverse). PGR pradmenys yra

sukuriami pagal konservatyvias DNR sekas, supančias mikrosatelitinį lokusą.

Polimorfizmą lemia kartotinio motyvo kopijų skaičiaus kitimai dėl mutacijų. Kai kada

36

įvyksta mutacija pradmenų prisijungimo vietoje. Tada DNR pagausinimas nevyksta ir

gautas alelis vadinamas nuliniu. PGR produktų frakcionavimui naudojamas

poliakrilamidinis gelis. Pavyzdžiams išryškinti naudojamas sidabro arba Sybr-Gold

tirpalai. Mikrosatelitai yra labai informatyvūs dėl aukšto jų polimorfizmo ir

kodominavimo.

ISSR metodas taip pat paremtas PGR, naudojami paprastų pasikartojančių sekų

pradmenys (pvz. (AC)n) , kurie pagausina regionus, atsidūrusius tarp ISSR pradmenų.

Ši technika išnaudoja gausius ir atsitiktinius SSR motyvus, esančius miško medžių

genomuose ir pagausina DNR sekas, atsidūrusias tarp glaudžiai susijusius SSR

motyvus.

AFLP metodas panašus į RFLP metodą, tik jis paremtas PGR technologija. Visa

genominė DNR sukarpoma su restrikcijos fermentų pora. Žinomos sekos adapteriai

priklijuojami prie DNR fragmentų. Pradmenys komplementarūs adapteriams

naudojami pagausinti restrikcijos fragmentus. PGR reakcijos pagausinti fragmentai

frakcionuojami agarozės gelyje ir išryškinamos susirišimo juostelės.

37

10. Praktiniai darbai Įžanga Augalų transformacija yra procesas kurio metu DNR įvedama į augalo ląsteles ar

audinius. DNR iš esmės gali būti iš įvairių šaltinių tiek prokariotinių organizmų tiek

eukariotinių organizmų. Genų perkėlimo metodologija tapo svarbia dalimi

technologijų, naudojamų įvairioms manipuliacijoms atlikti su augalais tiek

moksliniais tiek komerciniais tikslais. Agrobacterium tumfaciens panaudojimas genų

perkėlimui į augalus yra vienas efektyviausių metodų. Visumoje transgeninių augalų

kūrimas susideda iš dviejų skirtingų technologijų, būtent naujos genetinės medžiagos

įvedimo į augalo ląsteles ( transformacijos) ir audinių kultūrų metodų , taikomų

augalų regeneracijai iš ląstelių ar audinių.

Užsiėmimų tikslas – magistrantams suteikti žinias ir suformuoti pirminius įgūdžius,

atliekant manipuliacijas steriliomis sąlygomis su sumedėjusių augalų audinių

kultūromis prieš transformaciją ir po transformacijos Agrobacterium tumefaciens

metodu.

Hibridinės drebulės transformacijos Agrobacterium tumefaciens metodu eigos aprašymas

Reikalingos medžiagos ir priemonės Plastikiniai autoklavuojami konteineriai 200 ml augalų audinių kultūrai;

Laminaras;

Įvairaus dydžio pincetai;

Sterilios veinkartinės Petri lėkštelės;

Sterilus filtrinis popierius;

Spiritinė lemputė arba dujinis degiklis;

Mikrobiologinė kilpelė;

Kratytuvas - termostatas;

Audinių ir augalų auginimo kameros;

Mikropipetės ir antgaliai: P20, P200, P1000, ir P5000;

1.5 – ml centrifūgavimui megintuvėliai;

15 – 50 mL užsukami cetrifūgavimo mėgintuvėliai;

15 proc. „ACE“ ar „Belyzna“;

70 proc. etanolis;

Parafilmas;

38

Vandens vonelė +55C arbaUltragarsinė vonelė;

10 ml sterilūs švirkštai;

Filtrai sterilinimui tirpalų;

Autoklavas;

Spektofotometras;

Buteliai: 2 po 0,5L; 2 po 100ml;

Kolbutės 4 po 150-250ml ;

Mėgintuvėliai 50ml;

Stereoskopinis mikroskopas.

Reagentai, tirpalai, terpės

1/2X MSO, pH 5.8: Murashige and Skoog ( MS) terpė agarizuota 0.8 proc.

fitoagaru.

Agrobacterium linijos: kuri nors viena iš keleto ( neformuojančių auglių)

laboratorinių linijų ( EHA 101, 105, C58, LBA4404), talpinančią binarinį

vektorių su tiksliniu genu.

YEP terpė, pH 7.2: 5.0 g/L Bacto-yest ekstraktas, 10.0 g/L Bacto – peptonas,

10.0 g/L NaCl, 15.0 g/L Bacto – agaras.

Sterilinta filtruojant MS20IM Agrobacterium indukcijos terpė, pH 5.25: MS

druskos ir vitaminai papildyti 2 proc. cukraus, 100 mikroM acetosyringono, 1

mikroM betaino fosfato, ar prolino ir 2.5 mikroM 2-( 4 – morfolino)

etanesulfoninės rūgšties ( MES).

Kokultivacijos terpė, pH 5.8: MS terpė papildyta 4.5 mikroM

benzylaminopurinu ( BA), 0.5 mikroM naftaleno rūgštimi ( NAR) ir

agarizuota fitoagaru 8.0 g/L.

MSBN 1.1 ūglių regeneracijos terpė, pH 5.8: identiška sudėtimi kokultivacijos

terpei tik įdedama selektyvinių faktorių, reikalingų atrankai transformuotos

medžiagos; antibiotikų (Rifampicinas, Spectinomicinas, Kanamicinas,

Tikarcilinas, PPT)

Augalinė medžiaga

Medžiaga medžių transformacijos technologinės eigos pademonstravimui bus paimta

iš LMI molekulinės genetikos biotechnologijos laboratorijos.

39

Hibridinės drebulės sterilūs augalai in vitro - klonai , išauginti audinių kultūroje

tiesioginės regeneracijos būdu eksplantais naudojant mikroūglių stiebo atkarpas (1,5

cm) su pažastinių pumpurų meristema.

Medžiagos transformacijai paruošimas: a) imami lapai, vidutinio didumo iš vidurinės

augalo dalies. Lapai turi būti žali, sveiki, nepaveikti nekrozės; b) imami stiebai,

supjaustomi 1,5 cm atkarpas. Eksplantai iš karto nardinami į paruoštą trasformacijai

mikroorganizmų( Agrobacterium) suspensiją.

Visos procedūros atliekamos steriliomis sąlygomis laminare.

Agrobacterium išauginimas ir paruošimas užkrėtimui

Agrobacterium su tiksliniu genu gauta iš LSDI pagal programą ABIOTECHA tyrimų

vyldymui.

Bakterijos auginamos ant kietos LB mitybinės terpės su selektyviniais antibiotikais

28oC temperatūroje. Paruošiama agarizuota LB mitybinė terpė: sudedamos terpės

sudedamosios dalys ir nustatomas pH, jis turi būti 7,0±0,2. Terpės pH matuojamas

pH-juostelėmis, reguliuojama 0,1N NaOH ar 0,1N HCl tirpalais. Kietos terpės

paruošimui dedamas mikrobiologinis agaras. Paruošta terpė išpilstoma į litrinius

butelius ir sterilinama autoklave 30 minučių 115º C temperatūroje, 1 atmosferos

slėgyje.

Sterili terpė atvėsinama iki kambario temperatūros. Steriliomis sąlygomis

pridedami reikalingi antibiotikai ir išpilstoma į Petri lėkšteles.

Užsėjama bakterijų kultūra ir 2 - 3 dienas auginama termostate prie 28oC

temperatūros. Užaugus kolonijoms Petri lėkštelės su bakterijomis patalpinamos prie

4o C temperatūros ir laikomos 3-4 savaites( 11 pav.).

11 pav. A.tumefaciens kultivavimas ant agarizuotos terpės.

40

Agrobacterium paruošimas eksplantų užkrėtimui : paruošiama skysta LB mitybinė

terpė su atitinkamais selektyviniais antibiotikais. Išpilstoma į 10ml tūrio

mėgintuvėlius. Nuo kietos bakterijų terpės pernešiamos 3 kolonijos agrobakterijų ir

kelias dienas laikoma prie prie 28oC temperatūros, 160aps/s kratytuve. Patikrinamas

bakterijų kultūros gyvumas .

Bakterijų kultūrų optimalaus tankio (angl. optimal density (OD)) nustatymas:

Paruošiamos trys kiuvetės: kontrolė (neagarizuota LB mitybinė terpė su

selektyviniais antibiotikais), naktinė kultūra, praskiesta 1:10.

Atliekamas skiedimas: pirmiausia į kiuvetę pilama 900 µl neagarizuota LB

mitybinė terpė su selektyviniais antibiotikais(kontrolė) ir 100 µl naktinės

bakterijos suspencijos. Atsargiai sumaišoma.

Matavimai atliekami spektrofotometru, prie 660 nm bangos ilgio. 1 OD=9·109

bakterijų. Transformacijai atlikti naudojama suspensija 2·108 bakterijų/1ml

terpės.

Praktinių užsiėmimų paskutinę dieną magistrantai įvertins tik pirminius

transformacijos rezultatus : bakterijos ir eksplantų sąveikos pradžią stebint

stereoskopiniu mikroskopu. Taip pat bus supažindinti su įranga, naudojama

molekuliniam įvertinimui augalų, regeneravusių audinių kultūroje po transformacijos

ant selektyvinės terpės.

41

Literatūra

1. Auckland L., Bui T., Zhou Y., Shepherd M., Wiliams C. 2002. Conifer

Microsatellite handbook.

2. Choi J.H., Sung Z.R. 1989. Induction, commitment, and progression of plant

embryogenesis. In: Plant Biotechnology. Butterworths, Boston-London-

Singapore-Sydney-Toronto-Wellington. 141 – 159.

3. Christianson M.L., Warnick D.A. 1988. Organogenesis in vitro as a

developmental process. Horticultural Science. 23: 515 – 519.

4. Darginavičienė J. 1981. Augalų hormonai. Mokslas ir gyvenimas. 7 (286):

30 – 31.

5. Darginavičienė J., Novickienė L. 2002. Augimo problemos šiuolaikinėje

augalų fiziologijoje. Lietuvos mokslų akademijos leidykla, Vilnius.

6. Gallois A., Audran J. C., Burrus M. 1998. Assessment of genetic

relationships and population discrimination among Fagus sylvatica L. by

RAPD. Theor. Appl. Genet., 97: 211 – 219.

7. Guivarcih A., Caissard J.C., Azmi A., Elmayan T., Chriqui D., Tepfer M.

1996. in situ detection of expression of the gus reporter gene in transgenic

plants: ten years for blue genes. Trans. Res. 5: 281 – 288.

8. Halperin W. 1986. Attainment and retention of morphogenic capacity in

vitro. In: Plant regeneration and genetic variability. Academic Press, New

York. 3 – 47.

9. Hood E.E., Gelvin S.B., Melchers L.S., Hoekema A. 1993. New

Agrobacterium helper plasmids for gene transfer to plants. Tans. Res. 2: 208 –

218.

10. Heuertz M., Hausman J.F., Hardy O.J., Vendramin G.G., Lacoste N.F.,

Vekeman X. 2004. Nuclear microsatellites reveal contrasting patterns of

genetics structure between western and southern European populations of the

common ash (Fraxinus excelsior L.). Evolution, 58 (5): 976 – 988.

11. Jain S.M., Minocha S.C. 2000. Molecular biology of woody plants. Kluwer

Academic Publishers, Dordrecht.

12. Jouanin L., Brasilerio A.C.M., Leple J.C., Pilate G., Cornu D. 1993.

Genetic transformation: a short review of methods and their applications,

results and perspectives for forest trees. Ann.Sci.For. 50: 325 – 336.

42

13. Kakimoto T. 2003. Perception and signal transduction of cytokinins. Annual

Revue of Plant Biology. 54: 605 – 627.

14. King Robert C., Stansfield William D. 1990. A dictionary of genetics.

Fourth editon. Oxford University Press, New York/Oxford.

15. Kleinschmit J., Svolba J., Enescu V., Franke A. 1996. First results of

provenance trials of Fraxinus excelsior established in 1982. Forstarchiv, 67:

114 – 122.

16. Klopfenstein Ned B., Young WooChan, Mee-Sook Kim and M. Raj Ahuja

1997. Micropropagation, Genetic Engineering, and Molecular Biology of

Populus. Rocky Mountain Forest and Range Experiment Station, Fort Colins,

Colorado.

17. Maluszynski M., Kasha K.J., Forster B.P., Szarejko I. 2003. Doubled

haploid production in crop plants. Kluwer Academic Publishers,

Dordrecht/Boston/London.

18. Mildažienė V., Jarmalaitė S., Daugelavičius R. 2004. Ląstelės biologija.

Vytauto Didžiojo universiteto leidykla, Kaunas.

19. McBride K.E., Summerfelt K.R. 1990. Improved binary vectors for

Agrobacterium-mediated plant transformation. Plant. Mol. Biol. 14: 269 –

276.

20. Palme K., Hesse T., Moore I. 1991. Hormonal modulation of plant growth:

the role of auxin perception. Mechanical Development. 33: 97 – 106.

21. Raikhel N.V., Clarke A.E. 1998. Plant cell biology: all an inclusive field.

Current Opinion in Plant Biology. 1: 455 – 457.

22. Rohde A., Prinsen E., De Rycke R., Engler G., Van Montagu M., Boerjan

W. 2002. PtABI3 impinges on the growth and differentiation of embryonic

leaves during bud set in poplar. The Plant Cell. 14: 1885 – 1901.

23. Sánchez N., Manzanera J.A., Bueno M.A. 2004. Agrobacterium-mediated

transformation of white poplar (Populus alba L.).

24. Sankara Rao K., Rohini V.K. 2005. Plant transformation and genetic

markers. Foundation for Biotechnology Awareness and Education.

25. Sliesaravičius A., Stanys V. 2005. Žemės ūkio augalų biotechnologija.

Enciklopedija, Vilnius.

26. Schmulling T., Schell J., Spena A. 1988. Single genes from Agrobacterium

rhizogenes influence plant development. EMBO J. 7: 2621 – 2629.

43

27. Smintina I. 1993. Provenance trials of Fraxinus excelsior. Results 10 years

after planting. Revista Padurilor, 108 (1): 10 – 17.

28. Srivastava L.M. 2002. Plant growth and development: hormones and

enviroment. Academic Press, London.

29. Staub J.E., Serquen F.C. 1996. Genetic markers, map conctruction and their

application in plant breeding. Hort Science, 31 (5): 729-740.

30. Šamaj J., Bobak M., Ovečka M., Blehova A., Pret’ova A. 1997. Structural

features of plant morphogenesis in vitro. Publishing House of the Slovak

Academy of Sciences, Bratislava.

31. Tautz D., Rentz M. 1984. Simple sequences are ubiquitous repetitive

components of eucariotic genomes. Nature. 322: 652-656.

32. Thorpe T.A. 1993. In vitro organogenesis and somatic embryogenesis:

physiological and biochemical aspects. In: Morphogenesis in Plants.

Molecular Approaches. Plenum Press, New York-London. 19 – 38.

33. Tzfira T., Jensen C.S., Wang W., Zuker A., Vinocur B., Altman A.,

Vainstein A. 1997. Transgenic Populus tremula: a step-by-step protocol for

its Agrobacterium-mediated transformation. Plant Molecular Biology

Reporter. 15: 219 – 235.

34. Weiser F. 1995. Studies into the existence of ecotypes of ash (Fraxinus

excelsior L.). Forstarchiv, 66(6): 251 – 257.

35. Williams E.G., Maheswaran G. 1986. Somatic embryogenesis. Factors

influencing coordinate behaviour of cells as an embryogenic group. Annual

Botany. 57. 443 – 462.

36. Williams G.K., Kubelik A.R., Livak J., Rafalski J.A., Tingey S.V. 1990.

DNA polimorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic

markers. Nucleic Acids Research, 18: 6531 – 6535.

44