Page 1
Roma 08022013
Relazione finale progetto
Dottssa Silvia Bosello
Attivitagrave di IDO1 (lrsquoenzima indoleamina 23-diossigenasi-1) nella sclerosi sistemica
possibile link tra infiammazione cellule B e T e fibrosi
Background
La sclerosi sistemica (SSc) egrave una patologia sistemica autoimmune caratterizzata da unrsquoimportante
disfunzione endoteliale da alterazioni immunologiche e da unrsquoabnorme deposizione di matrice
extracellulare che provoca unrsquoeccessiva fibrosi della cute e degli organi interni
In letteratura sono state riportate numerose alterazioni immunologiche in corso di SSc quali
modificazioni della frequenza delle sottopopolazioni B cellulari ipergammaglobulinemia
produzione di autoanticorpi modificazione nei livelli di citochine infiammatorie alterazione dei
linfociti T tra i quali un aumento delle cellule T regolatorie (1) La SSc egrave inoltre caratterizzata da
aumentati livelli di citochine proangiogenetiche quali VEGF PDGF and FGF-2 e in alcuni
sottogruppi di pazienti sono stati riportati aumentati livelli di fattori anti- e pro-angiogenetici
quali CXCL4 hepatocyte growth factor (HGF) (2) trombospondina ed IL-4 (1)
Lrsquoenzima indoleamina 23-diossigenasi (IDO1) catabolizza la scissione del triptofano in chinurenine
(KYN) una famiglia di molecole con importanti effetti sulle cellule del sistema immunitario Ersquo
stato riportato che questo enzima contribuisca alla tolleranza immunologica in corso di neoplasie e
recentemente egrave stato suggerito un ruolo di IDO1 nelle patologie autoimmuni infiammatorie (34)
IDO1 contribuisce alla formazione di autoanticorpi da parte delle cellule B come suggeriscono gli
studi effettuati su modelli murini KBxN di artrite indotta da collagene (5) Inoltre la
somministrazione di DL-1MT un inibitore chimico di ID01 induce una riduzione della
infiammazione articolare indipendentemente dalle modifiche della frequenza delle cellule T
regolatorie (Treg) o dal profilo delle citochine secrete dalle cellule T Infine la somministrazione
dellrsquoinibitore dellrsquoattivitagrave di IDO diminuisce la risposta delle cellule B autoreattive suggerendo che
IDO possa avere un ruolo nelle patologie autoimmuni non solo riducendo lrsquoattivitagrave delle cellule T
regolatorie ma anche attraverso modifiche del compartimento B cellulare che determinano una
modulazione del microambiente infiammatorio
LrsquoHGF egrave una citochina prodotta dalle cellule mesenchimali quali i fibroblasti dai macrofagi e da
cellule della filiera B linfocitariaplasmacellulare che attraverso la sua attivitagrave sulle cellule
endoteliali sulle cellule dendritiche e sulle cellule T riduce lrsquoinfiammazione cronica immuno-
mediata e induce un miglioramento della fibrosi Recentemente egrave stato riportato che lrsquoHGF egrave in
grado di indurre lrsquoespressione di IDO1 nelle cellule dendritiche umane di derivazione monocitaria
(6) Inoltre lrsquoHGF egrave in grado di migliorare in modelli murini di SSc la sclerosi dermica (7)
suggerendo che lrsquoHGF possa rappresentare un fattore essenziale nella risposta di feed-back
allrsquoinfiammazione
Obiettivi
Gli obiettivi del nostro progetto sono stati quelli di valutare
Le sottopopolazioni delle cellule B nei pazienti con sclerosi sistemica
lrsquoattivitagrave di IDO1 e i livelli di chinurenina in relazione ai diversi subset di SSc (attivitagrave di
malattia caratteristiche autoanticorpali infiammazione)
i livelli di HGF e VEGF nel siero e nel wound fluid prelevato dalle ulcere di pazienti
sclerodermici in accordo con le caratteristiche cliniche di malattia
lrsquoespressione di mRNA di IDO1 nelle cellule B di pazienti sclerodermici dopo purificazione
dal sangue periferico
visto il ruolo di IDO1 nella conversione delle cellule T naive in cellule T regolatorie valutare
la frequenza delle cellule T regolatorie
Pazienti e metodi
Sono stati arruolati 100 pazienti con diverse caratteristiche di malattia afferenti al Divisione di
Reumatologia dellrsquoUniversitagrave Cattolica
80 pazienti soddisfacevano i seguenti criteri drsquoinclusione etagrave compresa tra i 18 e i 75 anni e
soddisfacevano i criteri dellrsquoACR per la sclerodermia (11) 20 pazienti invece avevano unrsquo etagrave
compresa tra i 18 e i 75 anni ma soddisfacevano i criteri per la early sclerodermia proposti da
LeRoy (12) Sono stati esclusi tutti i pazienti che presentavano una connettivite da overlap e i
pazienti che erano in trattamento con farmaci immunosoppressori (ciclofosfamide azatioprina
Rituximab antiTNF Methotrexate e Leflunomide)
Commento [sr1] HGF non egrave classificata tra le chemochine pur inducendo migrazione cellulare Cfr Immunity 2000 Feb12(2)121-7
Tutti i pazienti erano in trattamento con farmaci di supporto quali prostacicline di sintesi acido
acetilsalicilico calcio antagonisti e inibitori della pompa protonica Lrsquoetagrave media dei pazienti era di
539plusmn135 anni con durata media di malattia di 158plusmn58 anni Trentatre pazienti presentavano
ulcere mentre 29 avevano una malattia polmonare restrittiva Le caratteristiche demografiche e
cliniche della coorte in esame sono riportate in tabella 1
Tabella 1 Caratteristiche demografiche e cliniche
100 pazienti con SSC
Etagrave (anni mediaplusmnDS) 539plusmn135
Durata di malattia (anni mediaplusmnDS) 158plusmn58
Malattia early n () 20 (20)
Donne n () 82 (820)
Skin score (mediaplusmnDS) 85plusmn63
Malattia diffusa n () 42 (420)
Positivitagrave per lrsquoantiScl70 n () 41 (410)
Positivtagrave per lrsquoanticentromero n () 38 (380)
Positivitagrave per antinulceolo n () 6 (60)
Positivitagrave ANA senza specificitagrave n () 15 (150)
FVC (mediaplusmnDS) 986plusmn199
TLCO (mediaplusmnDS) 653plusmn154
Malattia polmonare restrittiva n () 29 (290)
Riscontro di alveolite al BAL 35 (35)
PASP (mmHg mediaplusmnDS) 230plusmn55
Ipertensione polmonare n () 6 (109)
Ulcere cutanee n () 33 (330)
Smokers n () 13 (130)
Sono stati inoltre arruolati 40 soggetti sani paragonabili per etagrave e sesso e sono state raccolti
campioni di plasma siero e PBMC
Sottopopolazioni B cellulari
I campioni di sangue periferico sono stati analizzati poche ore dopo il prelievo Le sottopopolazioni
B cellulari di tutti i pazienti sono state studiate mediante citofluorimetria attraverso lo staining con
i seguenti marcatori di superficie CD45 CD19 CD3 CD56 CD38 CD27 CD5 CD23 e IgD e il
marcatore intracellulare ZAP-70 Le cellule sono state fissate e permeabilizzate utilizzando
IntraPrep kit (Beckman Coulter France) secondo le indicazioni della casa costruttrice e incubate
con ldquoantindashZAP70-PE monoclonal antibodyrdquo per 30 minuti (clone SBZAP Beckman Coulter
Fullerton CA USA) Tutti i campioni sono stati analizzati utilizzando il citofluorimetro ad otto colori
Navios flow cytometer
Citochine VEGF HGF
Nel plasma e nel wound fluid sono stati inoltre analizzati i livelli delle seguenti citochine HGF
utilizzando la metodica ELISA (RampD Systems United Kingdom) VEGF and VEGF-D IL-6 utilizzando
un ldquobead-based plex assayrdquo (Bender MedSystems GmbH Vienna Austria) I livelli quantitativi delle
citochine sono stati determinati utilizzando come confronto delle curve standard e riportati come
picogrammi per millilitro (pgmL) Il limite delle metodiche era 12 pgmL per IL-6 400 pgml per lrsquo
HGF 72 pgml per il VEGF 250 pgml per VEGF-D I livelli plasmatici sono stati espressi in pgml
mentre nel WF in pgml1gr di albumina per normalizzare i valori
Determinazione triptofano e chinurenine nel siero
I livelli di triptofano e chinurenine sono stati determinate con metodica di proteomica in Reverse
phase - high performance liquid cromotography (RP-HPLC)
Determinazione dellrsquoespressione di mRNA di IDO
Le cellule mononucleate (PBMC) del sangue sono state isolate mediante centrifugazione con
gradiente densitagrave Ficoll-Hypaque Le cellule B sono state isolate dalle cellule PBMC usando biglie
immunomagnetiche Dalle cellule B purificate egrave stato estratto lrsquomRNA per la determinazione
dellrsquoespressione dellrsquomRNA di IDO mediante qPCR
Frequenza delle cellule T regolatorie
Le cellule T regolatorie sono state analizzate in citofluorimetria Le cellule T regolatorie sono state
identificate come cellule T CD4 positive e FoxP3 positive Le cellule sono state fissate e
permeabilizzate con lrsquoanticorpo murino specifico per Fox-P3 (PCH101 clone Human Regulatory T
CellStaining Kit eBioscience San Diego CA)
Analisi Statistica
Lrsquoanalisi statistica egrave stata effettuata utilizzando il programma statistico SPSS versione 200 (SPSS
Inc Chicago IL USA) I valori sono stati espressi come media ( DS) o come mediana e range in
base alla distribuzione della variabile Le differenze tra i sottogruppi di pazienti nellrsquoespressione
delle diverse molecule sono state analizzate con il test ANOVA o con il test non parametrico di
Mann Whitney come appropriato Le correlazioni tra le diverse variabili sono state valutate con la
correlazione di Pearson Ersquo stata considerata statisticamente significativa una plt 005
Risultati
Le sottopopolazioni B cellulari nella sclerodermia
I pazienti con SSc presentano una piugrave alta percentuale di cellule Bm2+Bm2 (624plusmn178) e una piugrave
bassa percentuale sia di cellule eBm5 (94plusmn64) sia cellule Bm5 (88plusmn79) e di cellule
CD19+IgD-CD27-(61plusmn42) rispetto ai soggetti sani di controllo (Bm2+Bm2 430plusmn125plt0001
eBm5160plusmn71 plt0001 Bm5 151plusmn65 plt0001 CD19+IgD-CD27- 162plusmn91 plt0001)
Inoltre i pazienti sclerodermici presentavano piugrave bassi livelli di Bm1 (94plusmn64) e di Bm3-4
(06plusmn05)rispetto ai controlli sani (233plusmn104 e 07plusmn04) (p=001 e p=004)
Inoltre i pazienti sclerodermici presentano una percentuale piugrave elevata di cellule circolanti
CD19+ZAP70+ (60plusmn53) e di cellule CD19+CD23+ (515plusmn169) rispetto ai soggetti sani
(CD19+ZAP70+ 22plusmn14 p=0004 CD19+CD23+ 397plusmn107 p=001) Inoltre la percentuale di
cellule circolanti CD19+ZAP-70+ correla inversamente con il rapporto tra le cellule
Bm2+Bm2eBm5+Bm5 (r=-038p=0001) e direttamente con le cellule CD19+IgD-CD27- (r=045
plt0001) Nella tabella sono riportate le frequenze delle sottopopolazioni linfocitarie
Variables SSc Controls P
N 74 30
WBC 6771 plusmn 2376 6047 plusmn 1289 036
Lymphocytes 286 plusmn 81 332 plusmn 81 005
CD19+ 98 plusmn 55 96 plusmn 29 064
Bm1 172 plusmn 124 233 plusmn 104 001
Bm2+Bm2rsquo 624 plusmn 178 430 plusmn 125 000
Bm3-4 06 plusmn 05 07 plusmn 04 004
eBm5 94 plusmn 64 160 plusmn 71 000
Bm5 88 plusmn 79 151 plusmn 65 000
ratioBm2+Bm2rsquoeBm5+
Bm5
56 plusmn 51 17 plusmn 09 000
CD19+IgD+CD27+ 67 plusmn 73 67 plusmn 34 006
CD19+IgD-CD27+ 129 plusmn 94 163 plusmn 70 001
CD19+IgD-CD27- 61 plusmn 42 162 plusmn 91 000
CD19+IgD+CD27- 722 plusmn 156 608 plusmn 118 000
CD19+CD38+CD27+ 26 plusmn 29 80 plusmn 34 000
CD19+ZAP-70+ 60 plusmn 53 22 plusmn 14 0004
CD19+CD38+ 471 plusmn 227 408 plusmn 144 043
CD19+CD5+ 110 plusmn 75 139 plusmn 85 017
CD19+CD23+ 515 plusmn 169 397 plusmn 107 001
IL6 pgml 53 plusmn 10
Inoltre la percentuale di cellule circolanti CD19+ZAP-70+ correla inversamente con il rapporto tra
le cellule Bm2+Bm2eBm5+Bm5 (r=-038p=0001) e direttamente con le cellule CD19+IgD-CD27-
(r=045 plt0001) Inoltre la percentuale di cellule CD19+ZAP70+ egrave piugrave elevata nei pazienti con
malattia cutanea diffusa (69plusmn43 mediana 57) rispetto ai pazienti con malattia cutanea
limitata (56plusmn57 mediana35 p=005)
Considerando inoltre i pazienti con malattia diffusa i pazienti con dSSc presentano una minor
percentuale di cellule Bm1 eBm5 e Bm5 rispetto ai controlli sani e unrsquoaumentata percentuale di
cellule CD19+ZAP-70+ di cellule CD19+CD38+ e di cellule CD19+CD23+
Nei pazienti con malattia limitata inoltre abbiamo riscontrato una minor percentuale di cellule
Bm1 eBm5 Bm5 rispetto ai controlli sani e unrsquoaumentata percentuale di cellule CD19+ZAP70+ e di
cellule CD19+CD23+
Considerando i pazienti con malattia attiva e inattiva non egrave stata individuata nessuna differenza
nella distribuzione delle sottopopolazioni B cellulari
Non egrave stata inoltre individuata alcuna differenza nella distribuzione delle sottopopolazioni B
circolanti tra i pazienti che presentano positivitagrave per lrsquoanticorpo anti-scl70 e anticentromero e tra i
pazienti senza queste specificitagrave
Considerando il coinvolgimento drsquoorgano lo score di severitagrave polmonare correla direttamente con
la percentuale di cellule Bm2+Bm2 (r=031 p=001) CD19+CD23+ (r=043 p=0003) e
inversamente con la percentuale di cellule Bm1 (r=-028p=002) e di cellule CD19+IgD+CD27+
(r=-025p=003) Infine lrsquoindice di attivitagrave correla inversamente con la percentuale di cellule CD19+
(r=-031p=001) e direttamente con la percentuale di cellule CD19+CD23+ (r=032 p=001)
p=001
plt0001
plt0001
plt0001
I livelli di chinurenine e di triptofano nei pazienti sclerodermici
I livelli sierici di chinurenine sono risultati significativamente piugrave elevati nei pazienti sclerodermici
(317plusmn082 μM) se confrontati con soggetti sani paragonati per sesso e per etagrave (182plusmn037 μM)
(plt00001) I livelli di chinurenine non differiscono nei diversi sottogruppi di malattia (pazienti con
malattia diffusa e limitata) e nei pazienti con le diverse specificitagrave anticorpali (antiscl70
anticentromero anti-nucleolo) Inoltre i livelli di chinurenine sono risultati paragonabili nei
pazienti con e senza malattia interstiziale polmonare ipertensione polmonare e ulcere cutanee A
differenza dei livelli delle chinurenine i livelli di triptofano sono risultati paragonabili nei pazienti e
nei controlli sani
r=031
p=001
r=024
p=004
r=-038
p=0001
r=045
plt0001
Le cellule T regolatorie nei pazienti sclerodermici
Poicheacute le chinurenine sono implicate nella conversione periferica delle cellule T naive in cellule T
regolatorie egrave stata analizzata la frequenza delle cellule T regolatorie La frequenza delle cellule T
reg (CD4+FoxP3+) nei pazienti con SSc egrave risultata piugrave elevata rispetto ai soggetti sani
indipendentemente dalle caratteristiche cliniche della malattia dal coinvolgimento drsquoorgano e
cutaneo e dallo stato autoanticorpale
Ctrl Pts Ltd Diff Scl70-Scl70
+
0
2
4
6
8 lt 00001
Se
rum
ky
nu
ren
ine
(
M)
Ctrl Pts Ltd Diff Scl70+
Scl70-
0
20
40
60
80
100
Se
rum
try
pto
ph
an
(
M)
Ctrl Pts Ltd Diff Scl70-Scl70
+
0
5
10
1500060
CD
4+F
ox
P3
+ T
reg
s
Nella figura sono rappresentate le cellule T reg in 3 pazienti con SSc
Lrsquoespressione di mRNA di IDO nelle celllule B di pazienti sclerodermici
In un sottogruppo di pazienti sclerodermici abbiamo inoltre purificato le cellule B per misurare i
livelli di mRNA di IDO di queste cellule Le cellule B purificate da pazienti sclerodermici esprimono
mRNA di IDO e lrsquoespressione di questa molecola egrave risultata aumentata nelle cellule B se
confrontata con lrsquoespressione di IDO nei corrispondenti PBMC dopo la purificazione per le cellule
B
81
88
95
CD4
FoxP3
Pt 1
Pt 2
Pt 3
Inoltre lrsquoespressione dellrsquomRNA di IDO correla con i livelli di proteina C reattiva (R=060 p=0035)
Inoltre il numero di copie di mRNA per IDO correla con la frequenza delle cellule Treg CD4+FoxP3+
La piugrave alta frequenza di cellule T regolatorie nei pazienti le cui cellule B esprimevano i piugrave alti livelli
di mRNA per IDO suggerisce che lrsquoattivitagrave di questo enzima potrebbe influenzare la conversione
delle cellule T in cellule T regolatorie
B cells MNC
0
2
4
6
8
10
IDO
-1 m
RN
A (
qP
CR
)
0 2 4 6 8 10
0
5
10
15 06084
00358
IDO mRNA (B cells)
CR
P (
mg
dl)
I livelli di HGF nei pazienti sclerodermici
Lo studio dellrsquoHGF in questa coorte di pazienti ha evidenziato che i pazienti sclerodemici
presentano piugrave elevati livelli di HGF rispetto ai controlli sani nonostante i suoi livelli non correlino
con i diversi sottogruppi di malattia il coinvolgimento drsquoorgano e cutaneo e il diverso assetto
autoanticorpale
Infine abbiamo correlato tra loro lrsquoattivitagrave di IDO lrsquoespressione di HGF e lrsquoinfiammazione I livelli di
PCR correlano positivamente con il rapporto chinureninetriptofano (R=0045 p=002) e con i
livelli di HGF (R=005 p=002) Inoltre in questa coorte di pazienti i livelli di HGF sembrano
correlare anche se non viene raggiunta la significativitagrave statistica con piugrave elevati livelli di
chinurenine (R=002 p=006) suggerendo che lrsquoHGF potrebbe essere uno dei meccanismi di
induzione dellrsquoenzima IDO
B cells MNC
0
2
4
6
8
10
IDO
-1 m
RN
A (
qP
CR
) 63
78
624 936
FoxP3
FIG 4c
Ctrl Pts Ltd Diff Scl70-Scl70
+
0
1000
2000
300000001
Se
rum
HG
F (
pg
mL
)
I livelli di VEGF nel plasma nel wound fluid
I livelli di VEGF nel plasma erano paragonabili nei soggetti sclerodermici con e senza ulcere e nei
soggetti sani
Analizzando le caratteristiche dei pazienti con ulcere I pazienti sclerodermici che presentavano
ulcere maggiori presentavano piugrave elevati livelli di VEGF rispetto ai pazienti con ulcere digitali
(8028 10331 pgml vs 3670 4201 pgml p=007) anche se tale differenza non raggiungeva la
significativitagrave statistica Non egrave stata evidenziata inoltre alcune differenza nei livelli di VEGF nel
wound fluid nei pazienti con ulcere infette rispetto ai pazienti con ulcere non infette
Per confrontare i livelli di VEGF nello stesso paziente nel siero e nel plasma i livelli di VEGF sono
stati normalizzati per la concentrazione dellrsquoalbumina I pazienti sclerodermici presentavano piugrave
alti livelli di VEGF nel wound fluid (492530 1332646 pgml 1g alb) rispetto al plasma (6794 plusmn
9899 pgml)(plt005)
2 4 6 8 10 12 14 16 18
0
5
10
15
20
04495
00187
KYNTRP ratio
CR
P (
mg
dl)
300 1300 2300 3300
1
2
3
4
5
6
7
00617
02033
HGF (pgml)
Ky
nu
ren
ine
(m
M)
Abbiamo inoltre suddiviso i pazienti in due gruppi in base alla guarigione dellrsquoulcera dopo 3 mesi di
follow-up Il 50 dei pazienti sclerodermici presentava una risoluzione dellrsquoulcera e questi
presentavano meno frequentemente una malattia diffusa (429) rispetto ai pazienti che non
guarivano (714) (p=004) Mentre non egrave stata evidenzita alcuna differenza nei livelli di VEGF
plasmatico tra i pazienti che guarivano e quelli che non guarivano i livelli di VEGF nel wound fluid
sono risultati statisticamente piugrave bassi nei pazienti che guarivano rispetto a quelli che non
guarivano (535394 51990 pgml1g albumin vs 8688080 17865451 pgml1g albumina
p=005)
SSc patients with ulcer
WO
UN
D F
LU
ID
P
LA
SM
A
IL-6 (pgml) 282 plusmn 532
HGF (pgml) 343520 plusmn 487366
VEGF (pgml) 6794 plusmn 9899
VEGF-D (pgml) 6783 plusmn 6473
IL-6 (pgml 1g alb) 5745532 10051587
HGF (pgml 1g alb) 1781821 4692675
TNF-α (pgml 1g alb) 144362 4945585
VEGF (pgml 1g alb) 492530 1332646
VEGF-D (pgml 1g alb) 4366 plusmn 11968
Conclusioni
I risultati di questo progetto a ricerca ci hanno permesso di individuare alcune alterazioni dei
linfociti B e T e del loro network citochinico nei pazienti affetti da sclerosi sistemica Le
modificazioni di alcune sottopopolazioni linfocitarie sembrano essere strettamente associate a
modificazione dei livelli delle citochine coinvolte nella risposta autoimmune
Lo studio delle sottopopolazioni linfocitarie B ha evidenziato una riduzione delle cellule della
memoria e un aumento delle cellule naive che potrebbero rappresentare un biomarcatore di
malattia sclerodermica aggressiva visto la loro correlazione con il coinvolgimento drsquoorgano
Per la prima volta egrave stata valutata lrsquoattivitagrave di IDO in corso di sclerodermia che egrave risultata
aumentata come supportato dagli aumentati livelli di chinurenine nonostante paragonabili livelli
di triptofano Lrsquoenzima IDO quindi risulta piugrave attivo nei pazienti con SSc rispetto ai soggetti sani e
lrsquoaumentata attivitagrave di questo enzima potrebbe essere responsabile dellrsquoalterazione del numero di
cellule T regolatorie nei pazienti sclerodermici anche se saranno necessari ulteriori studi per
capire se allrsquoaumento del numero di cellule T regolatorie si associ anche ad una loro aumentata
attivitagrave La capacitagrave delle cellule B di esprimere IDO potrebbe rappresentare un possibile link tra le
alterazioni dei linfociti B e dei linfociti T
Infine i dati sulla presenza di un gradiente di concentrazione del VEGF dal plasma al liquido delle
ulcere suggerisce lrsquoimportanza di studiare i singoli compartimenti drsquoorgano per cercare di
comprendere lrsquoampia variabilitagrave fenotipica delle manifestazioni drsquoorgano della sclerodermia
Page 2
IDO possa avere un ruolo nelle patologie autoimmuni non solo riducendo lrsquoattivitagrave delle cellule T
regolatorie ma anche attraverso modifiche del compartimento B cellulare che determinano una
modulazione del microambiente infiammatorio
LrsquoHGF egrave una citochina prodotta dalle cellule mesenchimali quali i fibroblasti dai macrofagi e da
cellule della filiera B linfocitariaplasmacellulare che attraverso la sua attivitagrave sulle cellule
endoteliali sulle cellule dendritiche e sulle cellule T riduce lrsquoinfiammazione cronica immuno-
mediata e induce un miglioramento della fibrosi Recentemente egrave stato riportato che lrsquoHGF egrave in
grado di indurre lrsquoespressione di IDO1 nelle cellule dendritiche umane di derivazione monocitaria
(6) Inoltre lrsquoHGF egrave in grado di migliorare in modelli murini di SSc la sclerosi dermica (7)
suggerendo che lrsquoHGF possa rappresentare un fattore essenziale nella risposta di feed-back
allrsquoinfiammazione
Obiettivi
Gli obiettivi del nostro progetto sono stati quelli di valutare
Le sottopopolazioni delle cellule B nei pazienti con sclerosi sistemica
lrsquoattivitagrave di IDO1 e i livelli di chinurenina in relazione ai diversi subset di SSc (attivitagrave di
malattia caratteristiche autoanticorpali infiammazione)
i livelli di HGF e VEGF nel siero e nel wound fluid prelevato dalle ulcere di pazienti
sclerodermici in accordo con le caratteristiche cliniche di malattia
lrsquoespressione di mRNA di IDO1 nelle cellule B di pazienti sclerodermici dopo purificazione
dal sangue periferico
visto il ruolo di IDO1 nella conversione delle cellule T naive in cellule T regolatorie valutare
la frequenza delle cellule T regolatorie
Pazienti e metodi
Sono stati arruolati 100 pazienti con diverse caratteristiche di malattia afferenti al Divisione di
Reumatologia dellrsquoUniversitagrave Cattolica
80 pazienti soddisfacevano i seguenti criteri drsquoinclusione etagrave compresa tra i 18 e i 75 anni e
soddisfacevano i criteri dellrsquoACR per la sclerodermia (11) 20 pazienti invece avevano unrsquo etagrave
compresa tra i 18 e i 75 anni ma soddisfacevano i criteri per la early sclerodermia proposti da
LeRoy (12) Sono stati esclusi tutti i pazienti che presentavano una connettivite da overlap e i
pazienti che erano in trattamento con farmaci immunosoppressori (ciclofosfamide azatioprina
Rituximab antiTNF Methotrexate e Leflunomide)
Commento [sr1] HGF non egrave classificata tra le chemochine pur inducendo migrazione cellulare Cfr Immunity 2000 Feb12(2)121-7
Tutti i pazienti erano in trattamento con farmaci di supporto quali prostacicline di sintesi acido
acetilsalicilico calcio antagonisti e inibitori della pompa protonica Lrsquoetagrave media dei pazienti era di
539plusmn135 anni con durata media di malattia di 158plusmn58 anni Trentatre pazienti presentavano
ulcere mentre 29 avevano una malattia polmonare restrittiva Le caratteristiche demografiche e
cliniche della coorte in esame sono riportate in tabella 1
Tabella 1 Caratteristiche demografiche e cliniche
100 pazienti con SSC
Etagrave (anni mediaplusmnDS) 539plusmn135
Durata di malattia (anni mediaplusmnDS) 158plusmn58
Malattia early n () 20 (20)
Donne n () 82 (820)
Skin score (mediaplusmnDS) 85plusmn63
Malattia diffusa n () 42 (420)
Positivitagrave per lrsquoantiScl70 n () 41 (410)
Positivtagrave per lrsquoanticentromero n () 38 (380)
Positivitagrave per antinulceolo n () 6 (60)
Positivitagrave ANA senza specificitagrave n () 15 (150)
FVC (mediaplusmnDS) 986plusmn199
TLCO (mediaplusmnDS) 653plusmn154
Malattia polmonare restrittiva n () 29 (290)
Riscontro di alveolite al BAL 35 (35)
PASP (mmHg mediaplusmnDS) 230plusmn55
Ipertensione polmonare n () 6 (109)
Ulcere cutanee n () 33 (330)
Smokers n () 13 (130)
Sono stati inoltre arruolati 40 soggetti sani paragonabili per etagrave e sesso e sono state raccolti
campioni di plasma siero e PBMC
Sottopopolazioni B cellulari
I campioni di sangue periferico sono stati analizzati poche ore dopo il prelievo Le sottopopolazioni
B cellulari di tutti i pazienti sono state studiate mediante citofluorimetria attraverso lo staining con
i seguenti marcatori di superficie CD45 CD19 CD3 CD56 CD38 CD27 CD5 CD23 e IgD e il
marcatore intracellulare ZAP-70 Le cellule sono state fissate e permeabilizzate utilizzando
IntraPrep kit (Beckman Coulter France) secondo le indicazioni della casa costruttrice e incubate
con ldquoantindashZAP70-PE monoclonal antibodyrdquo per 30 minuti (clone SBZAP Beckman Coulter
Fullerton CA USA) Tutti i campioni sono stati analizzati utilizzando il citofluorimetro ad otto colori
Navios flow cytometer
Citochine VEGF HGF
Nel plasma e nel wound fluid sono stati inoltre analizzati i livelli delle seguenti citochine HGF
utilizzando la metodica ELISA (RampD Systems United Kingdom) VEGF and VEGF-D IL-6 utilizzando
un ldquobead-based plex assayrdquo (Bender MedSystems GmbH Vienna Austria) I livelli quantitativi delle
citochine sono stati determinati utilizzando come confronto delle curve standard e riportati come
picogrammi per millilitro (pgmL) Il limite delle metodiche era 12 pgmL per IL-6 400 pgml per lrsquo
HGF 72 pgml per il VEGF 250 pgml per VEGF-D I livelli plasmatici sono stati espressi in pgml
mentre nel WF in pgml1gr di albumina per normalizzare i valori
Determinazione triptofano e chinurenine nel siero
I livelli di triptofano e chinurenine sono stati determinate con metodica di proteomica in Reverse
phase - high performance liquid cromotography (RP-HPLC)
Determinazione dellrsquoespressione di mRNA di IDO
Le cellule mononucleate (PBMC) del sangue sono state isolate mediante centrifugazione con
gradiente densitagrave Ficoll-Hypaque Le cellule B sono state isolate dalle cellule PBMC usando biglie
immunomagnetiche Dalle cellule B purificate egrave stato estratto lrsquomRNA per la determinazione
dellrsquoespressione dellrsquomRNA di IDO mediante qPCR
Frequenza delle cellule T regolatorie
Le cellule T regolatorie sono state analizzate in citofluorimetria Le cellule T regolatorie sono state
identificate come cellule T CD4 positive e FoxP3 positive Le cellule sono state fissate e
permeabilizzate con lrsquoanticorpo murino specifico per Fox-P3 (PCH101 clone Human Regulatory T
CellStaining Kit eBioscience San Diego CA)
Analisi Statistica
Lrsquoanalisi statistica egrave stata effettuata utilizzando il programma statistico SPSS versione 200 (SPSS
Inc Chicago IL USA) I valori sono stati espressi come media ( DS) o come mediana e range in
base alla distribuzione della variabile Le differenze tra i sottogruppi di pazienti nellrsquoespressione
delle diverse molecule sono state analizzate con il test ANOVA o con il test non parametrico di
Mann Whitney come appropriato Le correlazioni tra le diverse variabili sono state valutate con la
correlazione di Pearson Ersquo stata considerata statisticamente significativa una plt 005
Risultati
Le sottopopolazioni B cellulari nella sclerodermia
I pazienti con SSc presentano una piugrave alta percentuale di cellule Bm2+Bm2 (624plusmn178) e una piugrave
bassa percentuale sia di cellule eBm5 (94plusmn64) sia cellule Bm5 (88plusmn79) e di cellule
CD19+IgD-CD27-(61plusmn42) rispetto ai soggetti sani di controllo (Bm2+Bm2 430plusmn125plt0001
eBm5160plusmn71 plt0001 Bm5 151plusmn65 plt0001 CD19+IgD-CD27- 162plusmn91 plt0001)
Inoltre i pazienti sclerodermici presentavano piugrave bassi livelli di Bm1 (94plusmn64) e di Bm3-4
(06plusmn05)rispetto ai controlli sani (233plusmn104 e 07plusmn04) (p=001 e p=004)
Inoltre i pazienti sclerodermici presentano una percentuale piugrave elevata di cellule circolanti
CD19+ZAP70+ (60plusmn53) e di cellule CD19+CD23+ (515plusmn169) rispetto ai soggetti sani
(CD19+ZAP70+ 22plusmn14 p=0004 CD19+CD23+ 397plusmn107 p=001) Inoltre la percentuale di
cellule circolanti CD19+ZAP-70+ correla inversamente con il rapporto tra le cellule
Bm2+Bm2eBm5+Bm5 (r=-038p=0001) e direttamente con le cellule CD19+IgD-CD27- (r=045
plt0001) Nella tabella sono riportate le frequenze delle sottopopolazioni linfocitarie
Variables SSc Controls P
N 74 30
WBC 6771 plusmn 2376 6047 plusmn 1289 036
Lymphocytes 286 plusmn 81 332 plusmn 81 005
CD19+ 98 plusmn 55 96 plusmn 29 064
Bm1 172 plusmn 124 233 plusmn 104 001
Bm2+Bm2rsquo 624 plusmn 178 430 plusmn 125 000
Bm3-4 06 plusmn 05 07 plusmn 04 004
eBm5 94 plusmn 64 160 plusmn 71 000
Bm5 88 plusmn 79 151 plusmn 65 000
ratioBm2+Bm2rsquoeBm5+
Bm5
56 plusmn 51 17 plusmn 09 000
CD19+IgD+CD27+ 67 plusmn 73 67 plusmn 34 006
CD19+IgD-CD27+ 129 plusmn 94 163 plusmn 70 001
CD19+IgD-CD27- 61 plusmn 42 162 plusmn 91 000
CD19+IgD+CD27- 722 plusmn 156 608 plusmn 118 000
CD19+CD38+CD27+ 26 plusmn 29 80 plusmn 34 000
CD19+ZAP-70+ 60 plusmn 53 22 plusmn 14 0004
CD19+CD38+ 471 plusmn 227 408 plusmn 144 043
CD19+CD5+ 110 plusmn 75 139 plusmn 85 017
CD19+CD23+ 515 plusmn 169 397 plusmn 107 001
IL6 pgml 53 plusmn 10
Inoltre la percentuale di cellule circolanti CD19+ZAP-70+ correla inversamente con il rapporto tra
le cellule Bm2+Bm2eBm5+Bm5 (r=-038p=0001) e direttamente con le cellule CD19+IgD-CD27-
(r=045 plt0001) Inoltre la percentuale di cellule CD19+ZAP70+ egrave piugrave elevata nei pazienti con
malattia cutanea diffusa (69plusmn43 mediana 57) rispetto ai pazienti con malattia cutanea
limitata (56plusmn57 mediana35 p=005)
Considerando inoltre i pazienti con malattia diffusa i pazienti con dSSc presentano una minor
percentuale di cellule Bm1 eBm5 e Bm5 rispetto ai controlli sani e unrsquoaumentata percentuale di
cellule CD19+ZAP-70+ di cellule CD19+CD38+ e di cellule CD19+CD23+
Nei pazienti con malattia limitata inoltre abbiamo riscontrato una minor percentuale di cellule
Bm1 eBm5 Bm5 rispetto ai controlli sani e unrsquoaumentata percentuale di cellule CD19+ZAP70+ e di
cellule CD19+CD23+
Considerando i pazienti con malattia attiva e inattiva non egrave stata individuata nessuna differenza
nella distribuzione delle sottopopolazioni B cellulari
Non egrave stata inoltre individuata alcuna differenza nella distribuzione delle sottopopolazioni B
circolanti tra i pazienti che presentano positivitagrave per lrsquoanticorpo anti-scl70 e anticentromero e tra i
pazienti senza queste specificitagrave
Considerando il coinvolgimento drsquoorgano lo score di severitagrave polmonare correla direttamente con
la percentuale di cellule Bm2+Bm2 (r=031 p=001) CD19+CD23+ (r=043 p=0003) e
inversamente con la percentuale di cellule Bm1 (r=-028p=002) e di cellule CD19+IgD+CD27+
(r=-025p=003) Infine lrsquoindice di attivitagrave correla inversamente con la percentuale di cellule CD19+
(r=-031p=001) e direttamente con la percentuale di cellule CD19+CD23+ (r=032 p=001)
p=001
plt0001
plt0001
plt0001
I livelli di chinurenine e di triptofano nei pazienti sclerodermici
I livelli sierici di chinurenine sono risultati significativamente piugrave elevati nei pazienti sclerodermici
(317plusmn082 μM) se confrontati con soggetti sani paragonati per sesso e per etagrave (182plusmn037 μM)
(plt00001) I livelli di chinurenine non differiscono nei diversi sottogruppi di malattia (pazienti con
malattia diffusa e limitata) e nei pazienti con le diverse specificitagrave anticorpali (antiscl70
anticentromero anti-nucleolo) Inoltre i livelli di chinurenine sono risultati paragonabili nei
pazienti con e senza malattia interstiziale polmonare ipertensione polmonare e ulcere cutanee A
differenza dei livelli delle chinurenine i livelli di triptofano sono risultati paragonabili nei pazienti e
nei controlli sani
r=031
p=001
r=024
p=004
r=-038
p=0001
r=045
plt0001
Le cellule T regolatorie nei pazienti sclerodermici
Poicheacute le chinurenine sono implicate nella conversione periferica delle cellule T naive in cellule T
regolatorie egrave stata analizzata la frequenza delle cellule T regolatorie La frequenza delle cellule T
reg (CD4+FoxP3+) nei pazienti con SSc egrave risultata piugrave elevata rispetto ai soggetti sani
indipendentemente dalle caratteristiche cliniche della malattia dal coinvolgimento drsquoorgano e
cutaneo e dallo stato autoanticorpale
Ctrl Pts Ltd Diff Scl70-Scl70
+
0
2
4
6
8 lt 00001
Se
rum
ky
nu
ren
ine
(
M)
Ctrl Pts Ltd Diff Scl70+
Scl70-
0
20
40
60
80
100
Se
rum
try
pto
ph
an
(
M)
Ctrl Pts Ltd Diff Scl70-Scl70
+
0
5
10
1500060
CD
4+F
ox
P3
+ T
reg
s
Nella figura sono rappresentate le cellule T reg in 3 pazienti con SSc
Lrsquoespressione di mRNA di IDO nelle celllule B di pazienti sclerodermici
In un sottogruppo di pazienti sclerodermici abbiamo inoltre purificato le cellule B per misurare i
livelli di mRNA di IDO di queste cellule Le cellule B purificate da pazienti sclerodermici esprimono
mRNA di IDO e lrsquoespressione di questa molecola egrave risultata aumentata nelle cellule B se
confrontata con lrsquoespressione di IDO nei corrispondenti PBMC dopo la purificazione per le cellule
B
81
88
95
CD4
FoxP3
Pt 1
Pt 2
Pt 3
Inoltre lrsquoespressione dellrsquomRNA di IDO correla con i livelli di proteina C reattiva (R=060 p=0035)
Inoltre il numero di copie di mRNA per IDO correla con la frequenza delle cellule Treg CD4+FoxP3+
La piugrave alta frequenza di cellule T regolatorie nei pazienti le cui cellule B esprimevano i piugrave alti livelli
di mRNA per IDO suggerisce che lrsquoattivitagrave di questo enzima potrebbe influenzare la conversione
delle cellule T in cellule T regolatorie
B cells MNC
0
2
4
6
8
10
IDO
-1 m
RN
A (
qP
CR
)
0 2 4 6 8 10
0
5
10
15 06084
00358
IDO mRNA (B cells)
CR
P (
mg
dl)
I livelli di HGF nei pazienti sclerodermici
Lo studio dellrsquoHGF in questa coorte di pazienti ha evidenziato che i pazienti sclerodemici
presentano piugrave elevati livelli di HGF rispetto ai controlli sani nonostante i suoi livelli non correlino
con i diversi sottogruppi di malattia il coinvolgimento drsquoorgano e cutaneo e il diverso assetto
autoanticorpale
Infine abbiamo correlato tra loro lrsquoattivitagrave di IDO lrsquoespressione di HGF e lrsquoinfiammazione I livelli di
PCR correlano positivamente con il rapporto chinureninetriptofano (R=0045 p=002) e con i
livelli di HGF (R=005 p=002) Inoltre in questa coorte di pazienti i livelli di HGF sembrano
correlare anche se non viene raggiunta la significativitagrave statistica con piugrave elevati livelli di
chinurenine (R=002 p=006) suggerendo che lrsquoHGF potrebbe essere uno dei meccanismi di
induzione dellrsquoenzima IDO
B cells MNC
0
2
4
6
8
10
IDO
-1 m
RN
A (
qP
CR
) 63
78
624 936
FoxP3
FIG 4c
Ctrl Pts Ltd Diff Scl70-Scl70
+
0
1000
2000
300000001
Se
rum
HG
F (
pg
mL
)
I livelli di VEGF nel plasma nel wound fluid
I livelli di VEGF nel plasma erano paragonabili nei soggetti sclerodermici con e senza ulcere e nei
soggetti sani
Analizzando le caratteristiche dei pazienti con ulcere I pazienti sclerodermici che presentavano
ulcere maggiori presentavano piugrave elevati livelli di VEGF rispetto ai pazienti con ulcere digitali
(8028 10331 pgml vs 3670 4201 pgml p=007) anche se tale differenza non raggiungeva la
significativitagrave statistica Non egrave stata evidenziata inoltre alcune differenza nei livelli di VEGF nel
wound fluid nei pazienti con ulcere infette rispetto ai pazienti con ulcere non infette
Per confrontare i livelli di VEGF nello stesso paziente nel siero e nel plasma i livelli di VEGF sono
stati normalizzati per la concentrazione dellrsquoalbumina I pazienti sclerodermici presentavano piugrave
alti livelli di VEGF nel wound fluid (492530 1332646 pgml 1g alb) rispetto al plasma (6794 plusmn
9899 pgml)(plt005)
2 4 6 8 10 12 14 16 18
0
5
10
15
20
04495
00187
KYNTRP ratio
CR
P (
mg
dl)
300 1300 2300 3300
1
2
3
4
5
6
7
00617
02033
HGF (pgml)
Ky
nu
ren
ine
(m
M)
Abbiamo inoltre suddiviso i pazienti in due gruppi in base alla guarigione dellrsquoulcera dopo 3 mesi di
follow-up Il 50 dei pazienti sclerodermici presentava una risoluzione dellrsquoulcera e questi
presentavano meno frequentemente una malattia diffusa (429) rispetto ai pazienti che non
guarivano (714) (p=004) Mentre non egrave stata evidenzita alcuna differenza nei livelli di VEGF
plasmatico tra i pazienti che guarivano e quelli che non guarivano i livelli di VEGF nel wound fluid
sono risultati statisticamente piugrave bassi nei pazienti che guarivano rispetto a quelli che non
guarivano (535394 51990 pgml1g albumin vs 8688080 17865451 pgml1g albumina
p=005)
SSc patients with ulcer
WO
UN
D F
LU
ID
P
LA
SM
A
IL-6 (pgml) 282 plusmn 532
HGF (pgml) 343520 plusmn 487366
VEGF (pgml) 6794 plusmn 9899
VEGF-D (pgml) 6783 plusmn 6473
IL-6 (pgml 1g alb) 5745532 10051587
HGF (pgml 1g alb) 1781821 4692675
TNF-α (pgml 1g alb) 144362 4945585
VEGF (pgml 1g alb) 492530 1332646
VEGF-D (pgml 1g alb) 4366 plusmn 11968
Conclusioni
I risultati di questo progetto a ricerca ci hanno permesso di individuare alcune alterazioni dei
linfociti B e T e del loro network citochinico nei pazienti affetti da sclerosi sistemica Le
modificazioni di alcune sottopopolazioni linfocitarie sembrano essere strettamente associate a
modificazione dei livelli delle citochine coinvolte nella risposta autoimmune
Lo studio delle sottopopolazioni linfocitarie B ha evidenziato una riduzione delle cellule della
memoria e un aumento delle cellule naive che potrebbero rappresentare un biomarcatore di
malattia sclerodermica aggressiva visto la loro correlazione con il coinvolgimento drsquoorgano
Per la prima volta egrave stata valutata lrsquoattivitagrave di IDO in corso di sclerodermia che egrave risultata
aumentata come supportato dagli aumentati livelli di chinurenine nonostante paragonabili livelli
di triptofano Lrsquoenzima IDO quindi risulta piugrave attivo nei pazienti con SSc rispetto ai soggetti sani e
lrsquoaumentata attivitagrave di questo enzima potrebbe essere responsabile dellrsquoalterazione del numero di
cellule T regolatorie nei pazienti sclerodermici anche se saranno necessari ulteriori studi per
capire se allrsquoaumento del numero di cellule T regolatorie si associ anche ad una loro aumentata
attivitagrave La capacitagrave delle cellule B di esprimere IDO potrebbe rappresentare un possibile link tra le
alterazioni dei linfociti B e dei linfociti T
Infine i dati sulla presenza di un gradiente di concentrazione del VEGF dal plasma al liquido delle
ulcere suggerisce lrsquoimportanza di studiare i singoli compartimenti drsquoorgano per cercare di
comprendere lrsquoampia variabilitagrave fenotipica delle manifestazioni drsquoorgano della sclerodermia
Page 3
Tutti i pazienti erano in trattamento con farmaci di supporto quali prostacicline di sintesi acido
acetilsalicilico calcio antagonisti e inibitori della pompa protonica Lrsquoetagrave media dei pazienti era di
539plusmn135 anni con durata media di malattia di 158plusmn58 anni Trentatre pazienti presentavano
ulcere mentre 29 avevano una malattia polmonare restrittiva Le caratteristiche demografiche e
cliniche della coorte in esame sono riportate in tabella 1
Tabella 1 Caratteristiche demografiche e cliniche
100 pazienti con SSC
Etagrave (anni mediaplusmnDS) 539plusmn135
Durata di malattia (anni mediaplusmnDS) 158plusmn58
Malattia early n () 20 (20)
Donne n () 82 (820)
Skin score (mediaplusmnDS) 85plusmn63
Malattia diffusa n () 42 (420)
Positivitagrave per lrsquoantiScl70 n () 41 (410)
Positivtagrave per lrsquoanticentromero n () 38 (380)
Positivitagrave per antinulceolo n () 6 (60)
Positivitagrave ANA senza specificitagrave n () 15 (150)
FVC (mediaplusmnDS) 986plusmn199
TLCO (mediaplusmnDS) 653plusmn154
Malattia polmonare restrittiva n () 29 (290)
Riscontro di alveolite al BAL 35 (35)
PASP (mmHg mediaplusmnDS) 230plusmn55
Ipertensione polmonare n () 6 (109)
Ulcere cutanee n () 33 (330)
Smokers n () 13 (130)
Sono stati inoltre arruolati 40 soggetti sani paragonabili per etagrave e sesso e sono state raccolti
campioni di plasma siero e PBMC
Sottopopolazioni B cellulari
I campioni di sangue periferico sono stati analizzati poche ore dopo il prelievo Le sottopopolazioni
B cellulari di tutti i pazienti sono state studiate mediante citofluorimetria attraverso lo staining con
i seguenti marcatori di superficie CD45 CD19 CD3 CD56 CD38 CD27 CD5 CD23 e IgD e il
marcatore intracellulare ZAP-70 Le cellule sono state fissate e permeabilizzate utilizzando
IntraPrep kit (Beckman Coulter France) secondo le indicazioni della casa costruttrice e incubate
con ldquoantindashZAP70-PE monoclonal antibodyrdquo per 30 minuti (clone SBZAP Beckman Coulter
Fullerton CA USA) Tutti i campioni sono stati analizzati utilizzando il citofluorimetro ad otto colori
Navios flow cytometer
Citochine VEGF HGF
Nel plasma e nel wound fluid sono stati inoltre analizzati i livelli delle seguenti citochine HGF
utilizzando la metodica ELISA (RampD Systems United Kingdom) VEGF and VEGF-D IL-6 utilizzando
un ldquobead-based plex assayrdquo (Bender MedSystems GmbH Vienna Austria) I livelli quantitativi delle
citochine sono stati determinati utilizzando come confronto delle curve standard e riportati come
picogrammi per millilitro (pgmL) Il limite delle metodiche era 12 pgmL per IL-6 400 pgml per lrsquo
HGF 72 pgml per il VEGF 250 pgml per VEGF-D I livelli plasmatici sono stati espressi in pgml
mentre nel WF in pgml1gr di albumina per normalizzare i valori
Determinazione triptofano e chinurenine nel siero
I livelli di triptofano e chinurenine sono stati determinate con metodica di proteomica in Reverse
phase - high performance liquid cromotography (RP-HPLC)
Determinazione dellrsquoespressione di mRNA di IDO
Le cellule mononucleate (PBMC) del sangue sono state isolate mediante centrifugazione con
gradiente densitagrave Ficoll-Hypaque Le cellule B sono state isolate dalle cellule PBMC usando biglie
immunomagnetiche Dalle cellule B purificate egrave stato estratto lrsquomRNA per la determinazione
dellrsquoespressione dellrsquomRNA di IDO mediante qPCR
Frequenza delle cellule T regolatorie
Le cellule T regolatorie sono state analizzate in citofluorimetria Le cellule T regolatorie sono state
identificate come cellule T CD4 positive e FoxP3 positive Le cellule sono state fissate e
permeabilizzate con lrsquoanticorpo murino specifico per Fox-P3 (PCH101 clone Human Regulatory T
CellStaining Kit eBioscience San Diego CA)
Analisi Statistica
Lrsquoanalisi statistica egrave stata effettuata utilizzando il programma statistico SPSS versione 200 (SPSS
Inc Chicago IL USA) I valori sono stati espressi come media ( DS) o come mediana e range in
base alla distribuzione della variabile Le differenze tra i sottogruppi di pazienti nellrsquoespressione
delle diverse molecule sono state analizzate con il test ANOVA o con il test non parametrico di
Mann Whitney come appropriato Le correlazioni tra le diverse variabili sono state valutate con la
correlazione di Pearson Ersquo stata considerata statisticamente significativa una plt 005
Risultati
Le sottopopolazioni B cellulari nella sclerodermia
I pazienti con SSc presentano una piugrave alta percentuale di cellule Bm2+Bm2 (624plusmn178) e una piugrave
bassa percentuale sia di cellule eBm5 (94plusmn64) sia cellule Bm5 (88plusmn79) e di cellule
CD19+IgD-CD27-(61plusmn42) rispetto ai soggetti sani di controllo (Bm2+Bm2 430plusmn125plt0001
eBm5160plusmn71 plt0001 Bm5 151plusmn65 plt0001 CD19+IgD-CD27- 162plusmn91 plt0001)
Inoltre i pazienti sclerodermici presentavano piugrave bassi livelli di Bm1 (94plusmn64) e di Bm3-4
(06plusmn05)rispetto ai controlli sani (233plusmn104 e 07plusmn04) (p=001 e p=004)
Inoltre i pazienti sclerodermici presentano una percentuale piugrave elevata di cellule circolanti
CD19+ZAP70+ (60plusmn53) e di cellule CD19+CD23+ (515plusmn169) rispetto ai soggetti sani
(CD19+ZAP70+ 22plusmn14 p=0004 CD19+CD23+ 397plusmn107 p=001) Inoltre la percentuale di
cellule circolanti CD19+ZAP-70+ correla inversamente con il rapporto tra le cellule
Bm2+Bm2eBm5+Bm5 (r=-038p=0001) e direttamente con le cellule CD19+IgD-CD27- (r=045
plt0001) Nella tabella sono riportate le frequenze delle sottopopolazioni linfocitarie
Variables SSc Controls P
N 74 30
WBC 6771 plusmn 2376 6047 plusmn 1289 036
Lymphocytes 286 plusmn 81 332 plusmn 81 005
CD19+ 98 plusmn 55 96 plusmn 29 064
Bm1 172 plusmn 124 233 plusmn 104 001
Bm2+Bm2rsquo 624 plusmn 178 430 plusmn 125 000
Bm3-4 06 plusmn 05 07 plusmn 04 004
eBm5 94 plusmn 64 160 plusmn 71 000
Bm5 88 plusmn 79 151 plusmn 65 000
ratioBm2+Bm2rsquoeBm5+
Bm5
56 plusmn 51 17 plusmn 09 000
CD19+IgD+CD27+ 67 plusmn 73 67 plusmn 34 006
CD19+IgD-CD27+ 129 plusmn 94 163 plusmn 70 001
CD19+IgD-CD27- 61 plusmn 42 162 plusmn 91 000
CD19+IgD+CD27- 722 plusmn 156 608 plusmn 118 000
CD19+CD38+CD27+ 26 plusmn 29 80 plusmn 34 000
CD19+ZAP-70+ 60 plusmn 53 22 plusmn 14 0004
CD19+CD38+ 471 plusmn 227 408 plusmn 144 043
CD19+CD5+ 110 plusmn 75 139 plusmn 85 017
CD19+CD23+ 515 plusmn 169 397 plusmn 107 001
IL6 pgml 53 plusmn 10
Inoltre la percentuale di cellule circolanti CD19+ZAP-70+ correla inversamente con il rapporto tra
le cellule Bm2+Bm2eBm5+Bm5 (r=-038p=0001) e direttamente con le cellule CD19+IgD-CD27-
(r=045 plt0001) Inoltre la percentuale di cellule CD19+ZAP70+ egrave piugrave elevata nei pazienti con
malattia cutanea diffusa (69plusmn43 mediana 57) rispetto ai pazienti con malattia cutanea
limitata (56plusmn57 mediana35 p=005)
Considerando inoltre i pazienti con malattia diffusa i pazienti con dSSc presentano una minor
percentuale di cellule Bm1 eBm5 e Bm5 rispetto ai controlli sani e unrsquoaumentata percentuale di
cellule CD19+ZAP-70+ di cellule CD19+CD38+ e di cellule CD19+CD23+
Nei pazienti con malattia limitata inoltre abbiamo riscontrato una minor percentuale di cellule
Bm1 eBm5 Bm5 rispetto ai controlli sani e unrsquoaumentata percentuale di cellule CD19+ZAP70+ e di
cellule CD19+CD23+
Considerando i pazienti con malattia attiva e inattiva non egrave stata individuata nessuna differenza
nella distribuzione delle sottopopolazioni B cellulari
Non egrave stata inoltre individuata alcuna differenza nella distribuzione delle sottopopolazioni B
circolanti tra i pazienti che presentano positivitagrave per lrsquoanticorpo anti-scl70 e anticentromero e tra i
pazienti senza queste specificitagrave
Considerando il coinvolgimento drsquoorgano lo score di severitagrave polmonare correla direttamente con
la percentuale di cellule Bm2+Bm2 (r=031 p=001) CD19+CD23+ (r=043 p=0003) e
inversamente con la percentuale di cellule Bm1 (r=-028p=002) e di cellule CD19+IgD+CD27+
(r=-025p=003) Infine lrsquoindice di attivitagrave correla inversamente con la percentuale di cellule CD19+
(r=-031p=001) e direttamente con la percentuale di cellule CD19+CD23+ (r=032 p=001)
p=001
plt0001
plt0001
plt0001
I livelli di chinurenine e di triptofano nei pazienti sclerodermici
I livelli sierici di chinurenine sono risultati significativamente piugrave elevati nei pazienti sclerodermici
(317plusmn082 μM) se confrontati con soggetti sani paragonati per sesso e per etagrave (182plusmn037 μM)
(plt00001) I livelli di chinurenine non differiscono nei diversi sottogruppi di malattia (pazienti con
malattia diffusa e limitata) e nei pazienti con le diverse specificitagrave anticorpali (antiscl70
anticentromero anti-nucleolo) Inoltre i livelli di chinurenine sono risultati paragonabili nei
pazienti con e senza malattia interstiziale polmonare ipertensione polmonare e ulcere cutanee A
differenza dei livelli delle chinurenine i livelli di triptofano sono risultati paragonabili nei pazienti e
nei controlli sani
r=031
p=001
r=024
p=004
r=-038
p=0001
r=045
plt0001
Le cellule T regolatorie nei pazienti sclerodermici
Poicheacute le chinurenine sono implicate nella conversione periferica delle cellule T naive in cellule T
regolatorie egrave stata analizzata la frequenza delle cellule T regolatorie La frequenza delle cellule T
reg (CD4+FoxP3+) nei pazienti con SSc egrave risultata piugrave elevata rispetto ai soggetti sani
indipendentemente dalle caratteristiche cliniche della malattia dal coinvolgimento drsquoorgano e
cutaneo e dallo stato autoanticorpale
Ctrl Pts Ltd Diff Scl70-Scl70
+
0
2
4
6
8 lt 00001
Se
rum
ky
nu
ren
ine
(
M)
Ctrl Pts Ltd Diff Scl70+
Scl70-
0
20
40
60
80
100
Se
rum
try
pto
ph
an
(
M)
Ctrl Pts Ltd Diff Scl70-Scl70
+
0
5
10
1500060
CD
4+F
ox
P3
+ T
reg
s
Nella figura sono rappresentate le cellule T reg in 3 pazienti con SSc
Lrsquoespressione di mRNA di IDO nelle celllule B di pazienti sclerodermici
In un sottogruppo di pazienti sclerodermici abbiamo inoltre purificato le cellule B per misurare i
livelli di mRNA di IDO di queste cellule Le cellule B purificate da pazienti sclerodermici esprimono
mRNA di IDO e lrsquoespressione di questa molecola egrave risultata aumentata nelle cellule B se
confrontata con lrsquoespressione di IDO nei corrispondenti PBMC dopo la purificazione per le cellule
B
81
88
95
CD4
FoxP3
Pt 1
Pt 2
Pt 3
Inoltre lrsquoespressione dellrsquomRNA di IDO correla con i livelli di proteina C reattiva (R=060 p=0035)
Inoltre il numero di copie di mRNA per IDO correla con la frequenza delle cellule Treg CD4+FoxP3+
La piugrave alta frequenza di cellule T regolatorie nei pazienti le cui cellule B esprimevano i piugrave alti livelli
di mRNA per IDO suggerisce che lrsquoattivitagrave di questo enzima potrebbe influenzare la conversione
delle cellule T in cellule T regolatorie
B cells MNC
0
2
4
6
8
10
IDO
-1 m
RN
A (
qP
CR
)
0 2 4 6 8 10
0
5
10
15 06084
00358
IDO mRNA (B cells)
CR
P (
mg
dl)
I livelli di HGF nei pazienti sclerodermici
Lo studio dellrsquoHGF in questa coorte di pazienti ha evidenziato che i pazienti sclerodemici
presentano piugrave elevati livelli di HGF rispetto ai controlli sani nonostante i suoi livelli non correlino
con i diversi sottogruppi di malattia il coinvolgimento drsquoorgano e cutaneo e il diverso assetto
autoanticorpale
Infine abbiamo correlato tra loro lrsquoattivitagrave di IDO lrsquoespressione di HGF e lrsquoinfiammazione I livelli di
PCR correlano positivamente con il rapporto chinureninetriptofano (R=0045 p=002) e con i
livelli di HGF (R=005 p=002) Inoltre in questa coorte di pazienti i livelli di HGF sembrano
correlare anche se non viene raggiunta la significativitagrave statistica con piugrave elevati livelli di
chinurenine (R=002 p=006) suggerendo che lrsquoHGF potrebbe essere uno dei meccanismi di
induzione dellrsquoenzima IDO
B cells MNC
0
2
4
6
8
10
IDO
-1 m
RN
A (
qP
CR
) 63
78
624 936
FoxP3
FIG 4c
Ctrl Pts Ltd Diff Scl70-Scl70
+
0
1000
2000
300000001
Se
rum
HG
F (
pg
mL
)
I livelli di VEGF nel plasma nel wound fluid
I livelli di VEGF nel plasma erano paragonabili nei soggetti sclerodermici con e senza ulcere e nei
soggetti sani
Analizzando le caratteristiche dei pazienti con ulcere I pazienti sclerodermici che presentavano
ulcere maggiori presentavano piugrave elevati livelli di VEGF rispetto ai pazienti con ulcere digitali
(8028 10331 pgml vs 3670 4201 pgml p=007) anche se tale differenza non raggiungeva la
significativitagrave statistica Non egrave stata evidenziata inoltre alcune differenza nei livelli di VEGF nel
wound fluid nei pazienti con ulcere infette rispetto ai pazienti con ulcere non infette
Per confrontare i livelli di VEGF nello stesso paziente nel siero e nel plasma i livelli di VEGF sono
stati normalizzati per la concentrazione dellrsquoalbumina I pazienti sclerodermici presentavano piugrave
alti livelli di VEGF nel wound fluid (492530 1332646 pgml 1g alb) rispetto al plasma (6794 plusmn
9899 pgml)(plt005)
2 4 6 8 10 12 14 16 18
0
5
10
15
20
04495
00187
KYNTRP ratio
CR
P (
mg
dl)
300 1300 2300 3300
1
2
3
4
5
6
7
00617
02033
HGF (pgml)
Ky
nu
ren
ine
(m
M)
Abbiamo inoltre suddiviso i pazienti in due gruppi in base alla guarigione dellrsquoulcera dopo 3 mesi di
follow-up Il 50 dei pazienti sclerodermici presentava una risoluzione dellrsquoulcera e questi
presentavano meno frequentemente una malattia diffusa (429) rispetto ai pazienti che non
guarivano (714) (p=004) Mentre non egrave stata evidenzita alcuna differenza nei livelli di VEGF
plasmatico tra i pazienti che guarivano e quelli che non guarivano i livelli di VEGF nel wound fluid
sono risultati statisticamente piugrave bassi nei pazienti che guarivano rispetto a quelli che non
guarivano (535394 51990 pgml1g albumin vs 8688080 17865451 pgml1g albumina
p=005)
SSc patients with ulcer
WO
UN
D F
LU
ID
P
LA
SM
A
IL-6 (pgml) 282 plusmn 532
HGF (pgml) 343520 plusmn 487366
VEGF (pgml) 6794 plusmn 9899
VEGF-D (pgml) 6783 plusmn 6473
IL-6 (pgml 1g alb) 5745532 10051587
HGF (pgml 1g alb) 1781821 4692675
TNF-α (pgml 1g alb) 144362 4945585
VEGF (pgml 1g alb) 492530 1332646
VEGF-D (pgml 1g alb) 4366 plusmn 11968
Conclusioni
I risultati di questo progetto a ricerca ci hanno permesso di individuare alcune alterazioni dei
linfociti B e T e del loro network citochinico nei pazienti affetti da sclerosi sistemica Le
modificazioni di alcune sottopopolazioni linfocitarie sembrano essere strettamente associate a
modificazione dei livelli delle citochine coinvolte nella risposta autoimmune
Lo studio delle sottopopolazioni linfocitarie B ha evidenziato una riduzione delle cellule della
memoria e un aumento delle cellule naive che potrebbero rappresentare un biomarcatore di
malattia sclerodermica aggressiva visto la loro correlazione con il coinvolgimento drsquoorgano
Per la prima volta egrave stata valutata lrsquoattivitagrave di IDO in corso di sclerodermia che egrave risultata
aumentata come supportato dagli aumentati livelli di chinurenine nonostante paragonabili livelli
di triptofano Lrsquoenzima IDO quindi risulta piugrave attivo nei pazienti con SSc rispetto ai soggetti sani e
lrsquoaumentata attivitagrave di questo enzima potrebbe essere responsabile dellrsquoalterazione del numero di
cellule T regolatorie nei pazienti sclerodermici anche se saranno necessari ulteriori studi per
capire se allrsquoaumento del numero di cellule T regolatorie si associ anche ad una loro aumentata
attivitagrave La capacitagrave delle cellule B di esprimere IDO potrebbe rappresentare un possibile link tra le
alterazioni dei linfociti B e dei linfociti T
Infine i dati sulla presenza di un gradiente di concentrazione del VEGF dal plasma al liquido delle
ulcere suggerisce lrsquoimportanza di studiare i singoli compartimenti drsquoorgano per cercare di
comprendere lrsquoampia variabilitagrave fenotipica delle manifestazioni drsquoorgano della sclerodermia
Page 4
Sottopopolazioni B cellulari
I campioni di sangue periferico sono stati analizzati poche ore dopo il prelievo Le sottopopolazioni
B cellulari di tutti i pazienti sono state studiate mediante citofluorimetria attraverso lo staining con
i seguenti marcatori di superficie CD45 CD19 CD3 CD56 CD38 CD27 CD5 CD23 e IgD e il
marcatore intracellulare ZAP-70 Le cellule sono state fissate e permeabilizzate utilizzando
IntraPrep kit (Beckman Coulter France) secondo le indicazioni della casa costruttrice e incubate
con ldquoantindashZAP70-PE monoclonal antibodyrdquo per 30 minuti (clone SBZAP Beckman Coulter
Fullerton CA USA) Tutti i campioni sono stati analizzati utilizzando il citofluorimetro ad otto colori
Navios flow cytometer
Citochine VEGF HGF
Nel plasma e nel wound fluid sono stati inoltre analizzati i livelli delle seguenti citochine HGF
utilizzando la metodica ELISA (RampD Systems United Kingdom) VEGF and VEGF-D IL-6 utilizzando
un ldquobead-based plex assayrdquo (Bender MedSystems GmbH Vienna Austria) I livelli quantitativi delle
citochine sono stati determinati utilizzando come confronto delle curve standard e riportati come
picogrammi per millilitro (pgmL) Il limite delle metodiche era 12 pgmL per IL-6 400 pgml per lrsquo
HGF 72 pgml per il VEGF 250 pgml per VEGF-D I livelli plasmatici sono stati espressi in pgml
mentre nel WF in pgml1gr di albumina per normalizzare i valori
Determinazione triptofano e chinurenine nel siero
I livelli di triptofano e chinurenine sono stati determinate con metodica di proteomica in Reverse
phase - high performance liquid cromotography (RP-HPLC)
Determinazione dellrsquoespressione di mRNA di IDO
Le cellule mononucleate (PBMC) del sangue sono state isolate mediante centrifugazione con
gradiente densitagrave Ficoll-Hypaque Le cellule B sono state isolate dalle cellule PBMC usando biglie
immunomagnetiche Dalle cellule B purificate egrave stato estratto lrsquomRNA per la determinazione
dellrsquoespressione dellrsquomRNA di IDO mediante qPCR
Frequenza delle cellule T regolatorie
Le cellule T regolatorie sono state analizzate in citofluorimetria Le cellule T regolatorie sono state
identificate come cellule T CD4 positive e FoxP3 positive Le cellule sono state fissate e
permeabilizzate con lrsquoanticorpo murino specifico per Fox-P3 (PCH101 clone Human Regulatory T
CellStaining Kit eBioscience San Diego CA)
Analisi Statistica
Lrsquoanalisi statistica egrave stata effettuata utilizzando il programma statistico SPSS versione 200 (SPSS
Inc Chicago IL USA) I valori sono stati espressi come media ( DS) o come mediana e range in
base alla distribuzione della variabile Le differenze tra i sottogruppi di pazienti nellrsquoespressione
delle diverse molecule sono state analizzate con il test ANOVA o con il test non parametrico di
Mann Whitney come appropriato Le correlazioni tra le diverse variabili sono state valutate con la
correlazione di Pearson Ersquo stata considerata statisticamente significativa una plt 005
Risultati
Le sottopopolazioni B cellulari nella sclerodermia
I pazienti con SSc presentano una piugrave alta percentuale di cellule Bm2+Bm2 (624plusmn178) e una piugrave
bassa percentuale sia di cellule eBm5 (94plusmn64) sia cellule Bm5 (88plusmn79) e di cellule
CD19+IgD-CD27-(61plusmn42) rispetto ai soggetti sani di controllo (Bm2+Bm2 430plusmn125plt0001
eBm5160plusmn71 plt0001 Bm5 151plusmn65 plt0001 CD19+IgD-CD27- 162plusmn91 plt0001)
Inoltre i pazienti sclerodermici presentavano piugrave bassi livelli di Bm1 (94plusmn64) e di Bm3-4
(06plusmn05)rispetto ai controlli sani (233plusmn104 e 07plusmn04) (p=001 e p=004)
Inoltre i pazienti sclerodermici presentano una percentuale piugrave elevata di cellule circolanti
CD19+ZAP70+ (60plusmn53) e di cellule CD19+CD23+ (515plusmn169) rispetto ai soggetti sani
(CD19+ZAP70+ 22plusmn14 p=0004 CD19+CD23+ 397plusmn107 p=001) Inoltre la percentuale di
cellule circolanti CD19+ZAP-70+ correla inversamente con il rapporto tra le cellule
Bm2+Bm2eBm5+Bm5 (r=-038p=0001) e direttamente con le cellule CD19+IgD-CD27- (r=045
plt0001) Nella tabella sono riportate le frequenze delle sottopopolazioni linfocitarie
Variables SSc Controls P
N 74 30
WBC 6771 plusmn 2376 6047 plusmn 1289 036
Lymphocytes 286 plusmn 81 332 plusmn 81 005
CD19+ 98 plusmn 55 96 plusmn 29 064
Bm1 172 plusmn 124 233 plusmn 104 001
Bm2+Bm2rsquo 624 plusmn 178 430 plusmn 125 000
Bm3-4 06 plusmn 05 07 plusmn 04 004
eBm5 94 plusmn 64 160 plusmn 71 000
Bm5 88 plusmn 79 151 plusmn 65 000
ratioBm2+Bm2rsquoeBm5+
Bm5
56 plusmn 51 17 plusmn 09 000
CD19+IgD+CD27+ 67 plusmn 73 67 plusmn 34 006
CD19+IgD-CD27+ 129 plusmn 94 163 plusmn 70 001
CD19+IgD-CD27- 61 plusmn 42 162 plusmn 91 000
CD19+IgD+CD27- 722 plusmn 156 608 plusmn 118 000
CD19+CD38+CD27+ 26 plusmn 29 80 plusmn 34 000
CD19+ZAP-70+ 60 plusmn 53 22 plusmn 14 0004
CD19+CD38+ 471 plusmn 227 408 plusmn 144 043
CD19+CD5+ 110 plusmn 75 139 plusmn 85 017
CD19+CD23+ 515 plusmn 169 397 plusmn 107 001
IL6 pgml 53 plusmn 10
Inoltre la percentuale di cellule circolanti CD19+ZAP-70+ correla inversamente con il rapporto tra
le cellule Bm2+Bm2eBm5+Bm5 (r=-038p=0001) e direttamente con le cellule CD19+IgD-CD27-
(r=045 plt0001) Inoltre la percentuale di cellule CD19+ZAP70+ egrave piugrave elevata nei pazienti con
malattia cutanea diffusa (69plusmn43 mediana 57) rispetto ai pazienti con malattia cutanea
limitata (56plusmn57 mediana35 p=005)
Considerando inoltre i pazienti con malattia diffusa i pazienti con dSSc presentano una minor
percentuale di cellule Bm1 eBm5 e Bm5 rispetto ai controlli sani e unrsquoaumentata percentuale di
cellule CD19+ZAP-70+ di cellule CD19+CD38+ e di cellule CD19+CD23+
Nei pazienti con malattia limitata inoltre abbiamo riscontrato una minor percentuale di cellule
Bm1 eBm5 Bm5 rispetto ai controlli sani e unrsquoaumentata percentuale di cellule CD19+ZAP70+ e di
cellule CD19+CD23+
Considerando i pazienti con malattia attiva e inattiva non egrave stata individuata nessuna differenza
nella distribuzione delle sottopopolazioni B cellulari
Non egrave stata inoltre individuata alcuna differenza nella distribuzione delle sottopopolazioni B
circolanti tra i pazienti che presentano positivitagrave per lrsquoanticorpo anti-scl70 e anticentromero e tra i
pazienti senza queste specificitagrave
Considerando il coinvolgimento drsquoorgano lo score di severitagrave polmonare correla direttamente con
la percentuale di cellule Bm2+Bm2 (r=031 p=001) CD19+CD23+ (r=043 p=0003) e
inversamente con la percentuale di cellule Bm1 (r=-028p=002) e di cellule CD19+IgD+CD27+
(r=-025p=003) Infine lrsquoindice di attivitagrave correla inversamente con la percentuale di cellule CD19+
(r=-031p=001) e direttamente con la percentuale di cellule CD19+CD23+ (r=032 p=001)
p=001
plt0001
plt0001
plt0001
I livelli di chinurenine e di triptofano nei pazienti sclerodermici
I livelli sierici di chinurenine sono risultati significativamente piugrave elevati nei pazienti sclerodermici
(317plusmn082 μM) se confrontati con soggetti sani paragonati per sesso e per etagrave (182plusmn037 μM)
(plt00001) I livelli di chinurenine non differiscono nei diversi sottogruppi di malattia (pazienti con
malattia diffusa e limitata) e nei pazienti con le diverse specificitagrave anticorpali (antiscl70
anticentromero anti-nucleolo) Inoltre i livelli di chinurenine sono risultati paragonabili nei
pazienti con e senza malattia interstiziale polmonare ipertensione polmonare e ulcere cutanee A
differenza dei livelli delle chinurenine i livelli di triptofano sono risultati paragonabili nei pazienti e
nei controlli sani
r=031
p=001
r=024
p=004
r=-038
p=0001
r=045
plt0001
Le cellule T regolatorie nei pazienti sclerodermici
Poicheacute le chinurenine sono implicate nella conversione periferica delle cellule T naive in cellule T
regolatorie egrave stata analizzata la frequenza delle cellule T regolatorie La frequenza delle cellule T
reg (CD4+FoxP3+) nei pazienti con SSc egrave risultata piugrave elevata rispetto ai soggetti sani
indipendentemente dalle caratteristiche cliniche della malattia dal coinvolgimento drsquoorgano e
cutaneo e dallo stato autoanticorpale
Ctrl Pts Ltd Diff Scl70-Scl70
+
0
2
4
6
8 lt 00001
Se
rum
ky
nu
ren
ine
(
M)
Ctrl Pts Ltd Diff Scl70+
Scl70-
0
20
40
60
80
100
Se
rum
try
pto
ph
an
(
M)
Ctrl Pts Ltd Diff Scl70-Scl70
+
0
5
10
1500060
CD
4+F
ox
P3
+ T
reg
s
Nella figura sono rappresentate le cellule T reg in 3 pazienti con SSc
Lrsquoespressione di mRNA di IDO nelle celllule B di pazienti sclerodermici
In un sottogruppo di pazienti sclerodermici abbiamo inoltre purificato le cellule B per misurare i
livelli di mRNA di IDO di queste cellule Le cellule B purificate da pazienti sclerodermici esprimono
mRNA di IDO e lrsquoespressione di questa molecola egrave risultata aumentata nelle cellule B se
confrontata con lrsquoespressione di IDO nei corrispondenti PBMC dopo la purificazione per le cellule
B
81
88
95
CD4
FoxP3
Pt 1
Pt 2
Pt 3
Inoltre lrsquoespressione dellrsquomRNA di IDO correla con i livelli di proteina C reattiva (R=060 p=0035)
Inoltre il numero di copie di mRNA per IDO correla con la frequenza delle cellule Treg CD4+FoxP3+
La piugrave alta frequenza di cellule T regolatorie nei pazienti le cui cellule B esprimevano i piugrave alti livelli
di mRNA per IDO suggerisce che lrsquoattivitagrave di questo enzima potrebbe influenzare la conversione
delle cellule T in cellule T regolatorie
B cells MNC
0
2
4
6
8
10
IDO
-1 m
RN
A (
qP
CR
)
0 2 4 6 8 10
0
5
10
15 06084
00358
IDO mRNA (B cells)
CR
P (
mg
dl)
I livelli di HGF nei pazienti sclerodermici
Lo studio dellrsquoHGF in questa coorte di pazienti ha evidenziato che i pazienti sclerodemici
presentano piugrave elevati livelli di HGF rispetto ai controlli sani nonostante i suoi livelli non correlino
con i diversi sottogruppi di malattia il coinvolgimento drsquoorgano e cutaneo e il diverso assetto
autoanticorpale
Infine abbiamo correlato tra loro lrsquoattivitagrave di IDO lrsquoespressione di HGF e lrsquoinfiammazione I livelli di
PCR correlano positivamente con il rapporto chinureninetriptofano (R=0045 p=002) e con i
livelli di HGF (R=005 p=002) Inoltre in questa coorte di pazienti i livelli di HGF sembrano
correlare anche se non viene raggiunta la significativitagrave statistica con piugrave elevati livelli di
chinurenine (R=002 p=006) suggerendo che lrsquoHGF potrebbe essere uno dei meccanismi di
induzione dellrsquoenzima IDO
B cells MNC
0
2
4
6
8
10
IDO
-1 m
RN
A (
qP
CR
) 63
78
624 936
FoxP3
FIG 4c
Ctrl Pts Ltd Diff Scl70-Scl70
+
0
1000
2000
300000001
Se
rum
HG
F (
pg
mL
)
I livelli di VEGF nel plasma nel wound fluid
I livelli di VEGF nel plasma erano paragonabili nei soggetti sclerodermici con e senza ulcere e nei
soggetti sani
Analizzando le caratteristiche dei pazienti con ulcere I pazienti sclerodermici che presentavano
ulcere maggiori presentavano piugrave elevati livelli di VEGF rispetto ai pazienti con ulcere digitali
(8028 10331 pgml vs 3670 4201 pgml p=007) anche se tale differenza non raggiungeva la
significativitagrave statistica Non egrave stata evidenziata inoltre alcune differenza nei livelli di VEGF nel
wound fluid nei pazienti con ulcere infette rispetto ai pazienti con ulcere non infette
Per confrontare i livelli di VEGF nello stesso paziente nel siero e nel plasma i livelli di VEGF sono
stati normalizzati per la concentrazione dellrsquoalbumina I pazienti sclerodermici presentavano piugrave
alti livelli di VEGF nel wound fluid (492530 1332646 pgml 1g alb) rispetto al plasma (6794 plusmn
9899 pgml)(plt005)
2 4 6 8 10 12 14 16 18
0
5
10
15
20
04495
00187
KYNTRP ratio
CR
P (
mg
dl)
300 1300 2300 3300
1
2
3
4
5
6
7
00617
02033
HGF (pgml)
Ky
nu
ren
ine
(m
M)
Abbiamo inoltre suddiviso i pazienti in due gruppi in base alla guarigione dellrsquoulcera dopo 3 mesi di
follow-up Il 50 dei pazienti sclerodermici presentava una risoluzione dellrsquoulcera e questi
presentavano meno frequentemente una malattia diffusa (429) rispetto ai pazienti che non
guarivano (714) (p=004) Mentre non egrave stata evidenzita alcuna differenza nei livelli di VEGF
plasmatico tra i pazienti che guarivano e quelli che non guarivano i livelli di VEGF nel wound fluid
sono risultati statisticamente piugrave bassi nei pazienti che guarivano rispetto a quelli che non
guarivano (535394 51990 pgml1g albumin vs 8688080 17865451 pgml1g albumina
p=005)
SSc patients with ulcer
WO
UN
D F
LU
ID
P
LA
SM
A
IL-6 (pgml) 282 plusmn 532
HGF (pgml) 343520 plusmn 487366
VEGF (pgml) 6794 plusmn 9899
VEGF-D (pgml) 6783 plusmn 6473
IL-6 (pgml 1g alb) 5745532 10051587
HGF (pgml 1g alb) 1781821 4692675
TNF-α (pgml 1g alb) 144362 4945585
VEGF (pgml 1g alb) 492530 1332646
VEGF-D (pgml 1g alb) 4366 plusmn 11968
Conclusioni
I risultati di questo progetto a ricerca ci hanno permesso di individuare alcune alterazioni dei
linfociti B e T e del loro network citochinico nei pazienti affetti da sclerosi sistemica Le
modificazioni di alcune sottopopolazioni linfocitarie sembrano essere strettamente associate a
modificazione dei livelli delle citochine coinvolte nella risposta autoimmune
Lo studio delle sottopopolazioni linfocitarie B ha evidenziato una riduzione delle cellule della
memoria e un aumento delle cellule naive che potrebbero rappresentare un biomarcatore di
malattia sclerodermica aggressiva visto la loro correlazione con il coinvolgimento drsquoorgano
Per la prima volta egrave stata valutata lrsquoattivitagrave di IDO in corso di sclerodermia che egrave risultata
aumentata come supportato dagli aumentati livelli di chinurenine nonostante paragonabili livelli
di triptofano Lrsquoenzima IDO quindi risulta piugrave attivo nei pazienti con SSc rispetto ai soggetti sani e
lrsquoaumentata attivitagrave di questo enzima potrebbe essere responsabile dellrsquoalterazione del numero di
cellule T regolatorie nei pazienti sclerodermici anche se saranno necessari ulteriori studi per
capire se allrsquoaumento del numero di cellule T regolatorie si associ anche ad una loro aumentata
attivitagrave La capacitagrave delle cellule B di esprimere IDO potrebbe rappresentare un possibile link tra le
alterazioni dei linfociti B e dei linfociti T
Infine i dati sulla presenza di un gradiente di concentrazione del VEGF dal plasma al liquido delle
ulcere suggerisce lrsquoimportanza di studiare i singoli compartimenti drsquoorgano per cercare di
comprendere lrsquoampia variabilitagrave fenotipica delle manifestazioni drsquoorgano della sclerodermia
Page 5
identificate come cellule T CD4 positive e FoxP3 positive Le cellule sono state fissate e
permeabilizzate con lrsquoanticorpo murino specifico per Fox-P3 (PCH101 clone Human Regulatory T
CellStaining Kit eBioscience San Diego CA)
Analisi Statistica
Lrsquoanalisi statistica egrave stata effettuata utilizzando il programma statistico SPSS versione 200 (SPSS
Inc Chicago IL USA) I valori sono stati espressi come media ( DS) o come mediana e range in
base alla distribuzione della variabile Le differenze tra i sottogruppi di pazienti nellrsquoespressione
delle diverse molecule sono state analizzate con il test ANOVA o con il test non parametrico di
Mann Whitney come appropriato Le correlazioni tra le diverse variabili sono state valutate con la
correlazione di Pearson Ersquo stata considerata statisticamente significativa una plt 005
Risultati
Le sottopopolazioni B cellulari nella sclerodermia
I pazienti con SSc presentano una piugrave alta percentuale di cellule Bm2+Bm2 (624plusmn178) e una piugrave
bassa percentuale sia di cellule eBm5 (94plusmn64) sia cellule Bm5 (88plusmn79) e di cellule
CD19+IgD-CD27-(61plusmn42) rispetto ai soggetti sani di controllo (Bm2+Bm2 430plusmn125plt0001
eBm5160plusmn71 plt0001 Bm5 151plusmn65 plt0001 CD19+IgD-CD27- 162plusmn91 plt0001)
Inoltre i pazienti sclerodermici presentavano piugrave bassi livelli di Bm1 (94plusmn64) e di Bm3-4
(06plusmn05)rispetto ai controlli sani (233plusmn104 e 07plusmn04) (p=001 e p=004)
Inoltre i pazienti sclerodermici presentano una percentuale piugrave elevata di cellule circolanti
CD19+ZAP70+ (60plusmn53) e di cellule CD19+CD23+ (515plusmn169) rispetto ai soggetti sani
(CD19+ZAP70+ 22plusmn14 p=0004 CD19+CD23+ 397plusmn107 p=001) Inoltre la percentuale di
cellule circolanti CD19+ZAP-70+ correla inversamente con il rapporto tra le cellule
Bm2+Bm2eBm5+Bm5 (r=-038p=0001) e direttamente con le cellule CD19+IgD-CD27- (r=045
plt0001) Nella tabella sono riportate le frequenze delle sottopopolazioni linfocitarie
Variables SSc Controls P
N 74 30
WBC 6771 plusmn 2376 6047 plusmn 1289 036
Lymphocytes 286 plusmn 81 332 plusmn 81 005
CD19+ 98 plusmn 55 96 plusmn 29 064
Bm1 172 plusmn 124 233 plusmn 104 001
Bm2+Bm2rsquo 624 plusmn 178 430 plusmn 125 000
Bm3-4 06 plusmn 05 07 plusmn 04 004
eBm5 94 plusmn 64 160 plusmn 71 000
Bm5 88 plusmn 79 151 plusmn 65 000
ratioBm2+Bm2rsquoeBm5+
Bm5
56 plusmn 51 17 plusmn 09 000
CD19+IgD+CD27+ 67 plusmn 73 67 plusmn 34 006
CD19+IgD-CD27+ 129 plusmn 94 163 plusmn 70 001
CD19+IgD-CD27- 61 plusmn 42 162 plusmn 91 000
CD19+IgD+CD27- 722 plusmn 156 608 plusmn 118 000
CD19+CD38+CD27+ 26 plusmn 29 80 plusmn 34 000
CD19+ZAP-70+ 60 plusmn 53 22 plusmn 14 0004
CD19+CD38+ 471 plusmn 227 408 plusmn 144 043
CD19+CD5+ 110 plusmn 75 139 plusmn 85 017
CD19+CD23+ 515 plusmn 169 397 plusmn 107 001
IL6 pgml 53 plusmn 10
Inoltre la percentuale di cellule circolanti CD19+ZAP-70+ correla inversamente con il rapporto tra
le cellule Bm2+Bm2eBm5+Bm5 (r=-038p=0001) e direttamente con le cellule CD19+IgD-CD27-
(r=045 plt0001) Inoltre la percentuale di cellule CD19+ZAP70+ egrave piugrave elevata nei pazienti con
malattia cutanea diffusa (69plusmn43 mediana 57) rispetto ai pazienti con malattia cutanea
limitata (56plusmn57 mediana35 p=005)
Considerando inoltre i pazienti con malattia diffusa i pazienti con dSSc presentano una minor
percentuale di cellule Bm1 eBm5 e Bm5 rispetto ai controlli sani e unrsquoaumentata percentuale di
cellule CD19+ZAP-70+ di cellule CD19+CD38+ e di cellule CD19+CD23+
Nei pazienti con malattia limitata inoltre abbiamo riscontrato una minor percentuale di cellule
Bm1 eBm5 Bm5 rispetto ai controlli sani e unrsquoaumentata percentuale di cellule CD19+ZAP70+ e di
cellule CD19+CD23+
Considerando i pazienti con malattia attiva e inattiva non egrave stata individuata nessuna differenza
nella distribuzione delle sottopopolazioni B cellulari
Non egrave stata inoltre individuata alcuna differenza nella distribuzione delle sottopopolazioni B
circolanti tra i pazienti che presentano positivitagrave per lrsquoanticorpo anti-scl70 e anticentromero e tra i
pazienti senza queste specificitagrave
Considerando il coinvolgimento drsquoorgano lo score di severitagrave polmonare correla direttamente con
la percentuale di cellule Bm2+Bm2 (r=031 p=001) CD19+CD23+ (r=043 p=0003) e
inversamente con la percentuale di cellule Bm1 (r=-028p=002) e di cellule CD19+IgD+CD27+
(r=-025p=003) Infine lrsquoindice di attivitagrave correla inversamente con la percentuale di cellule CD19+
(r=-031p=001) e direttamente con la percentuale di cellule CD19+CD23+ (r=032 p=001)
p=001
plt0001
plt0001
plt0001
I livelli di chinurenine e di triptofano nei pazienti sclerodermici
I livelli sierici di chinurenine sono risultati significativamente piugrave elevati nei pazienti sclerodermici
(317plusmn082 μM) se confrontati con soggetti sani paragonati per sesso e per etagrave (182plusmn037 μM)
(plt00001) I livelli di chinurenine non differiscono nei diversi sottogruppi di malattia (pazienti con
malattia diffusa e limitata) e nei pazienti con le diverse specificitagrave anticorpali (antiscl70
anticentromero anti-nucleolo) Inoltre i livelli di chinurenine sono risultati paragonabili nei
pazienti con e senza malattia interstiziale polmonare ipertensione polmonare e ulcere cutanee A
differenza dei livelli delle chinurenine i livelli di triptofano sono risultati paragonabili nei pazienti e
nei controlli sani
r=031
p=001
r=024
p=004
r=-038
p=0001
r=045
plt0001
Le cellule T regolatorie nei pazienti sclerodermici
Poicheacute le chinurenine sono implicate nella conversione periferica delle cellule T naive in cellule T
regolatorie egrave stata analizzata la frequenza delle cellule T regolatorie La frequenza delle cellule T
reg (CD4+FoxP3+) nei pazienti con SSc egrave risultata piugrave elevata rispetto ai soggetti sani
indipendentemente dalle caratteristiche cliniche della malattia dal coinvolgimento drsquoorgano e
cutaneo e dallo stato autoanticorpale
Ctrl Pts Ltd Diff Scl70-Scl70
+
0
2
4
6
8 lt 00001
Se
rum
ky
nu
ren
ine
(
M)
Ctrl Pts Ltd Diff Scl70+
Scl70-
0
20
40
60
80
100
Se
rum
try
pto
ph
an
(
M)
Ctrl Pts Ltd Diff Scl70-Scl70
+
0
5
10
1500060
CD
4+F
ox
P3
+ T
reg
s
Nella figura sono rappresentate le cellule T reg in 3 pazienti con SSc
Lrsquoespressione di mRNA di IDO nelle celllule B di pazienti sclerodermici
In un sottogruppo di pazienti sclerodermici abbiamo inoltre purificato le cellule B per misurare i
livelli di mRNA di IDO di queste cellule Le cellule B purificate da pazienti sclerodermici esprimono
mRNA di IDO e lrsquoespressione di questa molecola egrave risultata aumentata nelle cellule B se
confrontata con lrsquoespressione di IDO nei corrispondenti PBMC dopo la purificazione per le cellule
B
81
88
95
CD4
FoxP3
Pt 1
Pt 2
Pt 3
Inoltre lrsquoespressione dellrsquomRNA di IDO correla con i livelli di proteina C reattiva (R=060 p=0035)
Inoltre il numero di copie di mRNA per IDO correla con la frequenza delle cellule Treg CD4+FoxP3+
La piugrave alta frequenza di cellule T regolatorie nei pazienti le cui cellule B esprimevano i piugrave alti livelli
di mRNA per IDO suggerisce che lrsquoattivitagrave di questo enzima potrebbe influenzare la conversione
delle cellule T in cellule T regolatorie
B cells MNC
0
2
4
6
8
10
IDO
-1 m
RN
A (
qP
CR
)
0 2 4 6 8 10
0
5
10
15 06084
00358
IDO mRNA (B cells)
CR
P (
mg
dl)
I livelli di HGF nei pazienti sclerodermici
Lo studio dellrsquoHGF in questa coorte di pazienti ha evidenziato che i pazienti sclerodemici
presentano piugrave elevati livelli di HGF rispetto ai controlli sani nonostante i suoi livelli non correlino
con i diversi sottogruppi di malattia il coinvolgimento drsquoorgano e cutaneo e il diverso assetto
autoanticorpale
Infine abbiamo correlato tra loro lrsquoattivitagrave di IDO lrsquoespressione di HGF e lrsquoinfiammazione I livelli di
PCR correlano positivamente con il rapporto chinureninetriptofano (R=0045 p=002) e con i
livelli di HGF (R=005 p=002) Inoltre in questa coorte di pazienti i livelli di HGF sembrano
correlare anche se non viene raggiunta la significativitagrave statistica con piugrave elevati livelli di
chinurenine (R=002 p=006) suggerendo che lrsquoHGF potrebbe essere uno dei meccanismi di
induzione dellrsquoenzima IDO
B cells MNC
0
2
4
6
8
10
IDO
-1 m
RN
A (
qP
CR
) 63
78
624 936
FoxP3
FIG 4c
Ctrl Pts Ltd Diff Scl70-Scl70
+
0
1000
2000
300000001
Se
rum
HG
F (
pg
mL
)
I livelli di VEGF nel plasma nel wound fluid
I livelli di VEGF nel plasma erano paragonabili nei soggetti sclerodermici con e senza ulcere e nei
soggetti sani
Analizzando le caratteristiche dei pazienti con ulcere I pazienti sclerodermici che presentavano
ulcere maggiori presentavano piugrave elevati livelli di VEGF rispetto ai pazienti con ulcere digitali
(8028 10331 pgml vs 3670 4201 pgml p=007) anche se tale differenza non raggiungeva la
significativitagrave statistica Non egrave stata evidenziata inoltre alcune differenza nei livelli di VEGF nel
wound fluid nei pazienti con ulcere infette rispetto ai pazienti con ulcere non infette
Per confrontare i livelli di VEGF nello stesso paziente nel siero e nel plasma i livelli di VEGF sono
stati normalizzati per la concentrazione dellrsquoalbumina I pazienti sclerodermici presentavano piugrave
alti livelli di VEGF nel wound fluid (492530 1332646 pgml 1g alb) rispetto al plasma (6794 plusmn
9899 pgml)(plt005)
2 4 6 8 10 12 14 16 18
0
5
10
15
20
04495
00187
KYNTRP ratio
CR
P (
mg
dl)
300 1300 2300 3300
1
2
3
4
5
6
7
00617
02033
HGF (pgml)
Ky
nu
ren
ine
(m
M)
Abbiamo inoltre suddiviso i pazienti in due gruppi in base alla guarigione dellrsquoulcera dopo 3 mesi di
follow-up Il 50 dei pazienti sclerodermici presentava una risoluzione dellrsquoulcera e questi
presentavano meno frequentemente una malattia diffusa (429) rispetto ai pazienti che non
guarivano (714) (p=004) Mentre non egrave stata evidenzita alcuna differenza nei livelli di VEGF
plasmatico tra i pazienti che guarivano e quelli che non guarivano i livelli di VEGF nel wound fluid
sono risultati statisticamente piugrave bassi nei pazienti che guarivano rispetto a quelli che non
guarivano (535394 51990 pgml1g albumin vs 8688080 17865451 pgml1g albumina
p=005)
SSc patients with ulcer
WO
UN
D F
LU
ID
P
LA
SM
A
IL-6 (pgml) 282 plusmn 532
HGF (pgml) 343520 plusmn 487366
VEGF (pgml) 6794 plusmn 9899
VEGF-D (pgml) 6783 plusmn 6473
IL-6 (pgml 1g alb) 5745532 10051587
HGF (pgml 1g alb) 1781821 4692675
TNF-α (pgml 1g alb) 144362 4945585
VEGF (pgml 1g alb) 492530 1332646
VEGF-D (pgml 1g alb) 4366 plusmn 11968
Conclusioni
I risultati di questo progetto a ricerca ci hanno permesso di individuare alcune alterazioni dei
linfociti B e T e del loro network citochinico nei pazienti affetti da sclerosi sistemica Le
modificazioni di alcune sottopopolazioni linfocitarie sembrano essere strettamente associate a
modificazione dei livelli delle citochine coinvolte nella risposta autoimmune
Lo studio delle sottopopolazioni linfocitarie B ha evidenziato una riduzione delle cellule della
memoria e un aumento delle cellule naive che potrebbero rappresentare un biomarcatore di
malattia sclerodermica aggressiva visto la loro correlazione con il coinvolgimento drsquoorgano
Per la prima volta egrave stata valutata lrsquoattivitagrave di IDO in corso di sclerodermia che egrave risultata
aumentata come supportato dagli aumentati livelli di chinurenine nonostante paragonabili livelli
di triptofano Lrsquoenzima IDO quindi risulta piugrave attivo nei pazienti con SSc rispetto ai soggetti sani e
lrsquoaumentata attivitagrave di questo enzima potrebbe essere responsabile dellrsquoalterazione del numero di
cellule T regolatorie nei pazienti sclerodermici anche se saranno necessari ulteriori studi per
capire se allrsquoaumento del numero di cellule T regolatorie si associ anche ad una loro aumentata
attivitagrave La capacitagrave delle cellule B di esprimere IDO potrebbe rappresentare un possibile link tra le
alterazioni dei linfociti B e dei linfociti T
Infine i dati sulla presenza di un gradiente di concentrazione del VEGF dal plasma al liquido delle
ulcere suggerisce lrsquoimportanza di studiare i singoli compartimenti drsquoorgano per cercare di
comprendere lrsquoampia variabilitagrave fenotipica delle manifestazioni drsquoorgano della sclerodermia
Page 6
Variables SSc Controls P
N 74 30
WBC 6771 plusmn 2376 6047 plusmn 1289 036
Lymphocytes 286 plusmn 81 332 plusmn 81 005
CD19+ 98 plusmn 55 96 plusmn 29 064
Bm1 172 plusmn 124 233 plusmn 104 001
Bm2+Bm2rsquo 624 plusmn 178 430 plusmn 125 000
Bm3-4 06 plusmn 05 07 plusmn 04 004
eBm5 94 plusmn 64 160 plusmn 71 000
Bm5 88 plusmn 79 151 plusmn 65 000
ratioBm2+Bm2rsquoeBm5+
Bm5
56 plusmn 51 17 plusmn 09 000
CD19+IgD+CD27+ 67 plusmn 73 67 plusmn 34 006
CD19+IgD-CD27+ 129 plusmn 94 163 plusmn 70 001
CD19+IgD-CD27- 61 plusmn 42 162 plusmn 91 000
CD19+IgD+CD27- 722 plusmn 156 608 plusmn 118 000
CD19+CD38+CD27+ 26 plusmn 29 80 plusmn 34 000
CD19+ZAP-70+ 60 plusmn 53 22 plusmn 14 0004
CD19+CD38+ 471 plusmn 227 408 plusmn 144 043
CD19+CD5+ 110 plusmn 75 139 plusmn 85 017
CD19+CD23+ 515 plusmn 169 397 plusmn 107 001
IL6 pgml 53 plusmn 10
Inoltre la percentuale di cellule circolanti CD19+ZAP-70+ correla inversamente con il rapporto tra
le cellule Bm2+Bm2eBm5+Bm5 (r=-038p=0001) e direttamente con le cellule CD19+IgD-CD27-
(r=045 plt0001) Inoltre la percentuale di cellule CD19+ZAP70+ egrave piugrave elevata nei pazienti con
malattia cutanea diffusa (69plusmn43 mediana 57) rispetto ai pazienti con malattia cutanea
limitata (56plusmn57 mediana35 p=005)
Considerando inoltre i pazienti con malattia diffusa i pazienti con dSSc presentano una minor
percentuale di cellule Bm1 eBm5 e Bm5 rispetto ai controlli sani e unrsquoaumentata percentuale di
cellule CD19+ZAP-70+ di cellule CD19+CD38+ e di cellule CD19+CD23+
Nei pazienti con malattia limitata inoltre abbiamo riscontrato una minor percentuale di cellule
Bm1 eBm5 Bm5 rispetto ai controlli sani e unrsquoaumentata percentuale di cellule CD19+ZAP70+ e di
cellule CD19+CD23+
Considerando i pazienti con malattia attiva e inattiva non egrave stata individuata nessuna differenza
nella distribuzione delle sottopopolazioni B cellulari
Non egrave stata inoltre individuata alcuna differenza nella distribuzione delle sottopopolazioni B
circolanti tra i pazienti che presentano positivitagrave per lrsquoanticorpo anti-scl70 e anticentromero e tra i
pazienti senza queste specificitagrave
Considerando il coinvolgimento drsquoorgano lo score di severitagrave polmonare correla direttamente con
la percentuale di cellule Bm2+Bm2 (r=031 p=001) CD19+CD23+ (r=043 p=0003) e
inversamente con la percentuale di cellule Bm1 (r=-028p=002) e di cellule CD19+IgD+CD27+
(r=-025p=003) Infine lrsquoindice di attivitagrave correla inversamente con la percentuale di cellule CD19+
(r=-031p=001) e direttamente con la percentuale di cellule CD19+CD23+ (r=032 p=001)
p=001
plt0001
plt0001
plt0001
I livelli di chinurenine e di triptofano nei pazienti sclerodermici
I livelli sierici di chinurenine sono risultati significativamente piugrave elevati nei pazienti sclerodermici
(317plusmn082 μM) se confrontati con soggetti sani paragonati per sesso e per etagrave (182plusmn037 μM)
(plt00001) I livelli di chinurenine non differiscono nei diversi sottogruppi di malattia (pazienti con
malattia diffusa e limitata) e nei pazienti con le diverse specificitagrave anticorpali (antiscl70
anticentromero anti-nucleolo) Inoltre i livelli di chinurenine sono risultati paragonabili nei
pazienti con e senza malattia interstiziale polmonare ipertensione polmonare e ulcere cutanee A
differenza dei livelli delle chinurenine i livelli di triptofano sono risultati paragonabili nei pazienti e
nei controlli sani
r=031
p=001
r=024
p=004
r=-038
p=0001
r=045
plt0001
Le cellule T regolatorie nei pazienti sclerodermici
Poicheacute le chinurenine sono implicate nella conversione periferica delle cellule T naive in cellule T
regolatorie egrave stata analizzata la frequenza delle cellule T regolatorie La frequenza delle cellule T
reg (CD4+FoxP3+) nei pazienti con SSc egrave risultata piugrave elevata rispetto ai soggetti sani
indipendentemente dalle caratteristiche cliniche della malattia dal coinvolgimento drsquoorgano e
cutaneo e dallo stato autoanticorpale
Ctrl Pts Ltd Diff Scl70-Scl70
+
0
2
4
6
8 lt 00001
Se
rum
ky
nu
ren
ine
(
M)
Ctrl Pts Ltd Diff Scl70+
Scl70-
0
20
40
60
80
100
Se
rum
try
pto
ph
an
(
M)
Ctrl Pts Ltd Diff Scl70-Scl70
+
0
5
10
1500060
CD
4+F
ox
P3
+ T
reg
s
Nella figura sono rappresentate le cellule T reg in 3 pazienti con SSc
Lrsquoespressione di mRNA di IDO nelle celllule B di pazienti sclerodermici
In un sottogruppo di pazienti sclerodermici abbiamo inoltre purificato le cellule B per misurare i
livelli di mRNA di IDO di queste cellule Le cellule B purificate da pazienti sclerodermici esprimono
mRNA di IDO e lrsquoespressione di questa molecola egrave risultata aumentata nelle cellule B se
confrontata con lrsquoespressione di IDO nei corrispondenti PBMC dopo la purificazione per le cellule
B
81
88
95
CD4
FoxP3
Pt 1
Pt 2
Pt 3
Inoltre lrsquoespressione dellrsquomRNA di IDO correla con i livelli di proteina C reattiva (R=060 p=0035)
Inoltre il numero di copie di mRNA per IDO correla con la frequenza delle cellule Treg CD4+FoxP3+
La piugrave alta frequenza di cellule T regolatorie nei pazienti le cui cellule B esprimevano i piugrave alti livelli
di mRNA per IDO suggerisce che lrsquoattivitagrave di questo enzima potrebbe influenzare la conversione
delle cellule T in cellule T regolatorie
B cells MNC
0
2
4
6
8
10
IDO
-1 m
RN
A (
qP
CR
)
0 2 4 6 8 10
0
5
10
15 06084
00358
IDO mRNA (B cells)
CR
P (
mg
dl)
I livelli di HGF nei pazienti sclerodermici
Lo studio dellrsquoHGF in questa coorte di pazienti ha evidenziato che i pazienti sclerodemici
presentano piugrave elevati livelli di HGF rispetto ai controlli sani nonostante i suoi livelli non correlino
con i diversi sottogruppi di malattia il coinvolgimento drsquoorgano e cutaneo e il diverso assetto
autoanticorpale
Infine abbiamo correlato tra loro lrsquoattivitagrave di IDO lrsquoespressione di HGF e lrsquoinfiammazione I livelli di
PCR correlano positivamente con il rapporto chinureninetriptofano (R=0045 p=002) e con i
livelli di HGF (R=005 p=002) Inoltre in questa coorte di pazienti i livelli di HGF sembrano
correlare anche se non viene raggiunta la significativitagrave statistica con piugrave elevati livelli di
chinurenine (R=002 p=006) suggerendo che lrsquoHGF potrebbe essere uno dei meccanismi di
induzione dellrsquoenzima IDO
B cells MNC
0
2
4
6
8
10
IDO
-1 m
RN
A (
qP
CR
) 63
78
624 936
FoxP3
FIG 4c
Ctrl Pts Ltd Diff Scl70-Scl70
+
0
1000
2000
300000001
Se
rum
HG
F (
pg
mL
)
I livelli di VEGF nel plasma nel wound fluid
I livelli di VEGF nel plasma erano paragonabili nei soggetti sclerodermici con e senza ulcere e nei
soggetti sani
Analizzando le caratteristiche dei pazienti con ulcere I pazienti sclerodermici che presentavano
ulcere maggiori presentavano piugrave elevati livelli di VEGF rispetto ai pazienti con ulcere digitali
(8028 10331 pgml vs 3670 4201 pgml p=007) anche se tale differenza non raggiungeva la
significativitagrave statistica Non egrave stata evidenziata inoltre alcune differenza nei livelli di VEGF nel
wound fluid nei pazienti con ulcere infette rispetto ai pazienti con ulcere non infette
Per confrontare i livelli di VEGF nello stesso paziente nel siero e nel plasma i livelli di VEGF sono
stati normalizzati per la concentrazione dellrsquoalbumina I pazienti sclerodermici presentavano piugrave
alti livelli di VEGF nel wound fluid (492530 1332646 pgml 1g alb) rispetto al plasma (6794 plusmn
9899 pgml)(plt005)
2 4 6 8 10 12 14 16 18
0
5
10
15
20
04495
00187
KYNTRP ratio
CR
P (
mg
dl)
300 1300 2300 3300
1
2
3
4
5
6
7
00617
02033
HGF (pgml)
Ky
nu
ren
ine
(m
M)
Abbiamo inoltre suddiviso i pazienti in due gruppi in base alla guarigione dellrsquoulcera dopo 3 mesi di
follow-up Il 50 dei pazienti sclerodermici presentava una risoluzione dellrsquoulcera e questi
presentavano meno frequentemente una malattia diffusa (429) rispetto ai pazienti che non
guarivano (714) (p=004) Mentre non egrave stata evidenzita alcuna differenza nei livelli di VEGF
plasmatico tra i pazienti che guarivano e quelli che non guarivano i livelli di VEGF nel wound fluid
sono risultati statisticamente piugrave bassi nei pazienti che guarivano rispetto a quelli che non
guarivano (535394 51990 pgml1g albumin vs 8688080 17865451 pgml1g albumina
p=005)
SSc patients with ulcer
WO
UN
D F
LU
ID
P
LA
SM
A
IL-6 (pgml) 282 plusmn 532
HGF (pgml) 343520 plusmn 487366
VEGF (pgml) 6794 plusmn 9899
VEGF-D (pgml) 6783 plusmn 6473
IL-6 (pgml 1g alb) 5745532 10051587
HGF (pgml 1g alb) 1781821 4692675
TNF-α (pgml 1g alb) 144362 4945585
VEGF (pgml 1g alb) 492530 1332646
VEGF-D (pgml 1g alb) 4366 plusmn 11968
Conclusioni
I risultati di questo progetto a ricerca ci hanno permesso di individuare alcune alterazioni dei
linfociti B e T e del loro network citochinico nei pazienti affetti da sclerosi sistemica Le
modificazioni di alcune sottopopolazioni linfocitarie sembrano essere strettamente associate a
modificazione dei livelli delle citochine coinvolte nella risposta autoimmune
Lo studio delle sottopopolazioni linfocitarie B ha evidenziato una riduzione delle cellule della
memoria e un aumento delle cellule naive che potrebbero rappresentare un biomarcatore di
malattia sclerodermica aggressiva visto la loro correlazione con il coinvolgimento drsquoorgano
Per la prima volta egrave stata valutata lrsquoattivitagrave di IDO in corso di sclerodermia che egrave risultata
aumentata come supportato dagli aumentati livelli di chinurenine nonostante paragonabili livelli
di triptofano Lrsquoenzima IDO quindi risulta piugrave attivo nei pazienti con SSc rispetto ai soggetti sani e
lrsquoaumentata attivitagrave di questo enzima potrebbe essere responsabile dellrsquoalterazione del numero di
cellule T regolatorie nei pazienti sclerodermici anche se saranno necessari ulteriori studi per
capire se allrsquoaumento del numero di cellule T regolatorie si associ anche ad una loro aumentata
attivitagrave La capacitagrave delle cellule B di esprimere IDO potrebbe rappresentare un possibile link tra le
alterazioni dei linfociti B e dei linfociti T
Infine i dati sulla presenza di un gradiente di concentrazione del VEGF dal plasma al liquido delle
ulcere suggerisce lrsquoimportanza di studiare i singoli compartimenti drsquoorgano per cercare di
comprendere lrsquoampia variabilitagrave fenotipica delle manifestazioni drsquoorgano della sclerodermia
Page 7
Considerando inoltre i pazienti con malattia diffusa i pazienti con dSSc presentano una minor
percentuale di cellule Bm1 eBm5 e Bm5 rispetto ai controlli sani e unrsquoaumentata percentuale di
cellule CD19+ZAP-70+ di cellule CD19+CD38+ e di cellule CD19+CD23+
Nei pazienti con malattia limitata inoltre abbiamo riscontrato una minor percentuale di cellule
Bm1 eBm5 Bm5 rispetto ai controlli sani e unrsquoaumentata percentuale di cellule CD19+ZAP70+ e di
cellule CD19+CD23+
Considerando i pazienti con malattia attiva e inattiva non egrave stata individuata nessuna differenza
nella distribuzione delle sottopopolazioni B cellulari
Non egrave stata inoltre individuata alcuna differenza nella distribuzione delle sottopopolazioni B
circolanti tra i pazienti che presentano positivitagrave per lrsquoanticorpo anti-scl70 e anticentromero e tra i
pazienti senza queste specificitagrave
Considerando il coinvolgimento drsquoorgano lo score di severitagrave polmonare correla direttamente con
la percentuale di cellule Bm2+Bm2 (r=031 p=001) CD19+CD23+ (r=043 p=0003) e
inversamente con la percentuale di cellule Bm1 (r=-028p=002) e di cellule CD19+IgD+CD27+
(r=-025p=003) Infine lrsquoindice di attivitagrave correla inversamente con la percentuale di cellule CD19+
(r=-031p=001) e direttamente con la percentuale di cellule CD19+CD23+ (r=032 p=001)
p=001
plt0001
plt0001
plt0001
I livelli di chinurenine e di triptofano nei pazienti sclerodermici
I livelli sierici di chinurenine sono risultati significativamente piugrave elevati nei pazienti sclerodermici
(317plusmn082 μM) se confrontati con soggetti sani paragonati per sesso e per etagrave (182plusmn037 μM)
(plt00001) I livelli di chinurenine non differiscono nei diversi sottogruppi di malattia (pazienti con
malattia diffusa e limitata) e nei pazienti con le diverse specificitagrave anticorpali (antiscl70
anticentromero anti-nucleolo) Inoltre i livelli di chinurenine sono risultati paragonabili nei
pazienti con e senza malattia interstiziale polmonare ipertensione polmonare e ulcere cutanee A
differenza dei livelli delle chinurenine i livelli di triptofano sono risultati paragonabili nei pazienti e
nei controlli sani
r=031
p=001
r=024
p=004
r=-038
p=0001
r=045
plt0001
Le cellule T regolatorie nei pazienti sclerodermici
Poicheacute le chinurenine sono implicate nella conversione periferica delle cellule T naive in cellule T
regolatorie egrave stata analizzata la frequenza delle cellule T regolatorie La frequenza delle cellule T
reg (CD4+FoxP3+) nei pazienti con SSc egrave risultata piugrave elevata rispetto ai soggetti sani
indipendentemente dalle caratteristiche cliniche della malattia dal coinvolgimento drsquoorgano e
cutaneo e dallo stato autoanticorpale
Ctrl Pts Ltd Diff Scl70-Scl70
+
0
2
4
6
8 lt 00001
Se
rum
ky
nu
ren
ine
(
M)
Ctrl Pts Ltd Diff Scl70+
Scl70-
0
20
40
60
80
100
Se
rum
try
pto
ph
an
(
M)
Ctrl Pts Ltd Diff Scl70-Scl70
+
0
5
10
1500060
CD
4+F
ox
P3
+ T
reg
s
Nella figura sono rappresentate le cellule T reg in 3 pazienti con SSc
Lrsquoespressione di mRNA di IDO nelle celllule B di pazienti sclerodermici
In un sottogruppo di pazienti sclerodermici abbiamo inoltre purificato le cellule B per misurare i
livelli di mRNA di IDO di queste cellule Le cellule B purificate da pazienti sclerodermici esprimono
mRNA di IDO e lrsquoespressione di questa molecola egrave risultata aumentata nelle cellule B se
confrontata con lrsquoespressione di IDO nei corrispondenti PBMC dopo la purificazione per le cellule
B
81
88
95
CD4
FoxP3
Pt 1
Pt 2
Pt 3
Inoltre lrsquoespressione dellrsquomRNA di IDO correla con i livelli di proteina C reattiva (R=060 p=0035)
Inoltre il numero di copie di mRNA per IDO correla con la frequenza delle cellule Treg CD4+FoxP3+
La piugrave alta frequenza di cellule T regolatorie nei pazienti le cui cellule B esprimevano i piugrave alti livelli
di mRNA per IDO suggerisce che lrsquoattivitagrave di questo enzima potrebbe influenzare la conversione
delle cellule T in cellule T regolatorie
B cells MNC
0
2
4
6
8
10
IDO
-1 m
RN
A (
qP
CR
)
0 2 4 6 8 10
0
5
10
15 06084
00358
IDO mRNA (B cells)
CR
P (
mg
dl)
I livelli di HGF nei pazienti sclerodermici
Lo studio dellrsquoHGF in questa coorte di pazienti ha evidenziato che i pazienti sclerodemici
presentano piugrave elevati livelli di HGF rispetto ai controlli sani nonostante i suoi livelli non correlino
con i diversi sottogruppi di malattia il coinvolgimento drsquoorgano e cutaneo e il diverso assetto
autoanticorpale
Infine abbiamo correlato tra loro lrsquoattivitagrave di IDO lrsquoespressione di HGF e lrsquoinfiammazione I livelli di
PCR correlano positivamente con il rapporto chinureninetriptofano (R=0045 p=002) e con i
livelli di HGF (R=005 p=002) Inoltre in questa coorte di pazienti i livelli di HGF sembrano
correlare anche se non viene raggiunta la significativitagrave statistica con piugrave elevati livelli di
chinurenine (R=002 p=006) suggerendo che lrsquoHGF potrebbe essere uno dei meccanismi di
induzione dellrsquoenzima IDO
B cells MNC
0
2
4
6
8
10
IDO
-1 m
RN
A (
qP
CR
) 63
78
624 936
FoxP3
FIG 4c
Ctrl Pts Ltd Diff Scl70-Scl70
+
0
1000
2000
300000001
Se
rum
HG
F (
pg
mL
)
I livelli di VEGF nel plasma nel wound fluid
I livelli di VEGF nel plasma erano paragonabili nei soggetti sclerodermici con e senza ulcere e nei
soggetti sani
Analizzando le caratteristiche dei pazienti con ulcere I pazienti sclerodermici che presentavano
ulcere maggiori presentavano piugrave elevati livelli di VEGF rispetto ai pazienti con ulcere digitali
(8028 10331 pgml vs 3670 4201 pgml p=007) anche se tale differenza non raggiungeva la
significativitagrave statistica Non egrave stata evidenziata inoltre alcune differenza nei livelli di VEGF nel
wound fluid nei pazienti con ulcere infette rispetto ai pazienti con ulcere non infette
Per confrontare i livelli di VEGF nello stesso paziente nel siero e nel plasma i livelli di VEGF sono
stati normalizzati per la concentrazione dellrsquoalbumina I pazienti sclerodermici presentavano piugrave
alti livelli di VEGF nel wound fluid (492530 1332646 pgml 1g alb) rispetto al plasma (6794 plusmn
9899 pgml)(plt005)
2 4 6 8 10 12 14 16 18
0
5
10
15
20
04495
00187
KYNTRP ratio
CR
P (
mg
dl)
300 1300 2300 3300
1
2
3
4
5
6
7
00617
02033
HGF (pgml)
Ky
nu
ren
ine
(m
M)
Abbiamo inoltre suddiviso i pazienti in due gruppi in base alla guarigione dellrsquoulcera dopo 3 mesi di
follow-up Il 50 dei pazienti sclerodermici presentava una risoluzione dellrsquoulcera e questi
presentavano meno frequentemente una malattia diffusa (429) rispetto ai pazienti che non
guarivano (714) (p=004) Mentre non egrave stata evidenzita alcuna differenza nei livelli di VEGF
plasmatico tra i pazienti che guarivano e quelli che non guarivano i livelli di VEGF nel wound fluid
sono risultati statisticamente piugrave bassi nei pazienti che guarivano rispetto a quelli che non
guarivano (535394 51990 pgml1g albumin vs 8688080 17865451 pgml1g albumina
p=005)
SSc patients with ulcer
WO
UN
D F
LU
ID
P
LA
SM
A
IL-6 (pgml) 282 plusmn 532
HGF (pgml) 343520 plusmn 487366
VEGF (pgml) 6794 plusmn 9899
VEGF-D (pgml) 6783 plusmn 6473
IL-6 (pgml 1g alb) 5745532 10051587
HGF (pgml 1g alb) 1781821 4692675
TNF-α (pgml 1g alb) 144362 4945585
VEGF (pgml 1g alb) 492530 1332646
VEGF-D (pgml 1g alb) 4366 plusmn 11968
Conclusioni
I risultati di questo progetto a ricerca ci hanno permesso di individuare alcune alterazioni dei
linfociti B e T e del loro network citochinico nei pazienti affetti da sclerosi sistemica Le
modificazioni di alcune sottopopolazioni linfocitarie sembrano essere strettamente associate a
modificazione dei livelli delle citochine coinvolte nella risposta autoimmune
Lo studio delle sottopopolazioni linfocitarie B ha evidenziato una riduzione delle cellule della
memoria e un aumento delle cellule naive che potrebbero rappresentare un biomarcatore di
malattia sclerodermica aggressiva visto la loro correlazione con il coinvolgimento drsquoorgano
Per la prima volta egrave stata valutata lrsquoattivitagrave di IDO in corso di sclerodermia che egrave risultata
aumentata come supportato dagli aumentati livelli di chinurenine nonostante paragonabili livelli
di triptofano Lrsquoenzima IDO quindi risulta piugrave attivo nei pazienti con SSc rispetto ai soggetti sani e
lrsquoaumentata attivitagrave di questo enzima potrebbe essere responsabile dellrsquoalterazione del numero di
cellule T regolatorie nei pazienti sclerodermici anche se saranno necessari ulteriori studi per
capire se allrsquoaumento del numero di cellule T regolatorie si associ anche ad una loro aumentata
attivitagrave La capacitagrave delle cellule B di esprimere IDO potrebbe rappresentare un possibile link tra le
alterazioni dei linfociti B e dei linfociti T
Infine i dati sulla presenza di un gradiente di concentrazione del VEGF dal plasma al liquido delle
ulcere suggerisce lrsquoimportanza di studiare i singoli compartimenti drsquoorgano per cercare di
comprendere lrsquoampia variabilitagrave fenotipica delle manifestazioni drsquoorgano della sclerodermia
Page 8
I livelli di chinurenine e di triptofano nei pazienti sclerodermici
I livelli sierici di chinurenine sono risultati significativamente piugrave elevati nei pazienti sclerodermici
(317plusmn082 μM) se confrontati con soggetti sani paragonati per sesso e per etagrave (182plusmn037 μM)
(plt00001) I livelli di chinurenine non differiscono nei diversi sottogruppi di malattia (pazienti con
malattia diffusa e limitata) e nei pazienti con le diverse specificitagrave anticorpali (antiscl70
anticentromero anti-nucleolo) Inoltre i livelli di chinurenine sono risultati paragonabili nei
pazienti con e senza malattia interstiziale polmonare ipertensione polmonare e ulcere cutanee A
differenza dei livelli delle chinurenine i livelli di triptofano sono risultati paragonabili nei pazienti e
nei controlli sani
r=031
p=001
r=024
p=004
r=-038
p=0001
r=045
plt0001
Le cellule T regolatorie nei pazienti sclerodermici
Poicheacute le chinurenine sono implicate nella conversione periferica delle cellule T naive in cellule T
regolatorie egrave stata analizzata la frequenza delle cellule T regolatorie La frequenza delle cellule T
reg (CD4+FoxP3+) nei pazienti con SSc egrave risultata piugrave elevata rispetto ai soggetti sani
indipendentemente dalle caratteristiche cliniche della malattia dal coinvolgimento drsquoorgano e
cutaneo e dallo stato autoanticorpale
Ctrl Pts Ltd Diff Scl70-Scl70
+
0
2
4
6
8 lt 00001
Se
rum
ky
nu
ren
ine
(
M)
Ctrl Pts Ltd Diff Scl70+
Scl70-
0
20
40
60
80
100
Se
rum
try
pto
ph
an
(
M)
Ctrl Pts Ltd Diff Scl70-Scl70
+
0
5
10
1500060
CD
4+F
ox
P3
+ T
reg
s
Nella figura sono rappresentate le cellule T reg in 3 pazienti con SSc
Lrsquoespressione di mRNA di IDO nelle celllule B di pazienti sclerodermici
In un sottogruppo di pazienti sclerodermici abbiamo inoltre purificato le cellule B per misurare i
livelli di mRNA di IDO di queste cellule Le cellule B purificate da pazienti sclerodermici esprimono
mRNA di IDO e lrsquoespressione di questa molecola egrave risultata aumentata nelle cellule B se
confrontata con lrsquoespressione di IDO nei corrispondenti PBMC dopo la purificazione per le cellule
B
81
88
95
CD4
FoxP3
Pt 1
Pt 2
Pt 3
Inoltre lrsquoespressione dellrsquomRNA di IDO correla con i livelli di proteina C reattiva (R=060 p=0035)
Inoltre il numero di copie di mRNA per IDO correla con la frequenza delle cellule Treg CD4+FoxP3+
La piugrave alta frequenza di cellule T regolatorie nei pazienti le cui cellule B esprimevano i piugrave alti livelli
di mRNA per IDO suggerisce che lrsquoattivitagrave di questo enzima potrebbe influenzare la conversione
delle cellule T in cellule T regolatorie
B cells MNC
0
2
4
6
8
10
IDO
-1 m
RN
A (
qP
CR
)
0 2 4 6 8 10
0
5
10
15 06084
00358
IDO mRNA (B cells)
CR
P (
mg
dl)
I livelli di HGF nei pazienti sclerodermici
Lo studio dellrsquoHGF in questa coorte di pazienti ha evidenziato che i pazienti sclerodemici
presentano piugrave elevati livelli di HGF rispetto ai controlli sani nonostante i suoi livelli non correlino
con i diversi sottogruppi di malattia il coinvolgimento drsquoorgano e cutaneo e il diverso assetto
autoanticorpale
Infine abbiamo correlato tra loro lrsquoattivitagrave di IDO lrsquoespressione di HGF e lrsquoinfiammazione I livelli di
PCR correlano positivamente con il rapporto chinureninetriptofano (R=0045 p=002) e con i
livelli di HGF (R=005 p=002) Inoltre in questa coorte di pazienti i livelli di HGF sembrano
correlare anche se non viene raggiunta la significativitagrave statistica con piugrave elevati livelli di
chinurenine (R=002 p=006) suggerendo che lrsquoHGF potrebbe essere uno dei meccanismi di
induzione dellrsquoenzima IDO
B cells MNC
0
2
4
6
8
10
IDO
-1 m
RN
A (
qP
CR
) 63
78
624 936
FoxP3
FIG 4c
Ctrl Pts Ltd Diff Scl70-Scl70
+
0
1000
2000
300000001
Se
rum
HG
F (
pg
mL
)
I livelli di VEGF nel plasma nel wound fluid
I livelli di VEGF nel plasma erano paragonabili nei soggetti sclerodermici con e senza ulcere e nei
soggetti sani
Analizzando le caratteristiche dei pazienti con ulcere I pazienti sclerodermici che presentavano
ulcere maggiori presentavano piugrave elevati livelli di VEGF rispetto ai pazienti con ulcere digitali
(8028 10331 pgml vs 3670 4201 pgml p=007) anche se tale differenza non raggiungeva la
significativitagrave statistica Non egrave stata evidenziata inoltre alcune differenza nei livelli di VEGF nel
wound fluid nei pazienti con ulcere infette rispetto ai pazienti con ulcere non infette
Per confrontare i livelli di VEGF nello stesso paziente nel siero e nel plasma i livelli di VEGF sono
stati normalizzati per la concentrazione dellrsquoalbumina I pazienti sclerodermici presentavano piugrave
alti livelli di VEGF nel wound fluid (492530 1332646 pgml 1g alb) rispetto al plasma (6794 plusmn
9899 pgml)(plt005)
2 4 6 8 10 12 14 16 18
0
5
10
15
20
04495
00187
KYNTRP ratio
CR
P (
mg
dl)
300 1300 2300 3300
1
2
3
4
5
6
7
00617
02033
HGF (pgml)
Ky
nu
ren
ine
(m
M)
Abbiamo inoltre suddiviso i pazienti in due gruppi in base alla guarigione dellrsquoulcera dopo 3 mesi di
follow-up Il 50 dei pazienti sclerodermici presentava una risoluzione dellrsquoulcera e questi
presentavano meno frequentemente una malattia diffusa (429) rispetto ai pazienti che non
guarivano (714) (p=004) Mentre non egrave stata evidenzita alcuna differenza nei livelli di VEGF
plasmatico tra i pazienti che guarivano e quelli che non guarivano i livelli di VEGF nel wound fluid
sono risultati statisticamente piugrave bassi nei pazienti che guarivano rispetto a quelli che non
guarivano (535394 51990 pgml1g albumin vs 8688080 17865451 pgml1g albumina
p=005)
SSc patients with ulcer
WO
UN
D F
LU
ID
P
LA
SM
A
IL-6 (pgml) 282 plusmn 532
HGF (pgml) 343520 plusmn 487366
VEGF (pgml) 6794 plusmn 9899
VEGF-D (pgml) 6783 plusmn 6473
IL-6 (pgml 1g alb) 5745532 10051587
HGF (pgml 1g alb) 1781821 4692675
TNF-α (pgml 1g alb) 144362 4945585
VEGF (pgml 1g alb) 492530 1332646
VEGF-D (pgml 1g alb) 4366 plusmn 11968
Conclusioni
I risultati di questo progetto a ricerca ci hanno permesso di individuare alcune alterazioni dei
linfociti B e T e del loro network citochinico nei pazienti affetti da sclerosi sistemica Le
modificazioni di alcune sottopopolazioni linfocitarie sembrano essere strettamente associate a
modificazione dei livelli delle citochine coinvolte nella risposta autoimmune
Lo studio delle sottopopolazioni linfocitarie B ha evidenziato una riduzione delle cellule della
memoria e un aumento delle cellule naive che potrebbero rappresentare un biomarcatore di
malattia sclerodermica aggressiva visto la loro correlazione con il coinvolgimento drsquoorgano
Per la prima volta egrave stata valutata lrsquoattivitagrave di IDO in corso di sclerodermia che egrave risultata
aumentata come supportato dagli aumentati livelli di chinurenine nonostante paragonabili livelli
di triptofano Lrsquoenzima IDO quindi risulta piugrave attivo nei pazienti con SSc rispetto ai soggetti sani e
lrsquoaumentata attivitagrave di questo enzima potrebbe essere responsabile dellrsquoalterazione del numero di
cellule T regolatorie nei pazienti sclerodermici anche se saranno necessari ulteriori studi per
capire se allrsquoaumento del numero di cellule T regolatorie si associ anche ad una loro aumentata
attivitagrave La capacitagrave delle cellule B di esprimere IDO potrebbe rappresentare un possibile link tra le
alterazioni dei linfociti B e dei linfociti T
Infine i dati sulla presenza di un gradiente di concentrazione del VEGF dal plasma al liquido delle
ulcere suggerisce lrsquoimportanza di studiare i singoli compartimenti drsquoorgano per cercare di
comprendere lrsquoampia variabilitagrave fenotipica delle manifestazioni drsquoorgano della sclerodermia
Page 9
Le cellule T regolatorie nei pazienti sclerodermici
Poicheacute le chinurenine sono implicate nella conversione periferica delle cellule T naive in cellule T
regolatorie egrave stata analizzata la frequenza delle cellule T regolatorie La frequenza delle cellule T
reg (CD4+FoxP3+) nei pazienti con SSc egrave risultata piugrave elevata rispetto ai soggetti sani
indipendentemente dalle caratteristiche cliniche della malattia dal coinvolgimento drsquoorgano e
cutaneo e dallo stato autoanticorpale
Ctrl Pts Ltd Diff Scl70-Scl70
+
0
2
4
6
8 lt 00001
Se
rum
ky
nu
ren
ine
(
M)
Ctrl Pts Ltd Diff Scl70+
Scl70-
0
20
40
60
80
100
Se
rum
try
pto
ph
an
(
M)
Ctrl Pts Ltd Diff Scl70-Scl70
+
0
5
10
1500060
CD
4+F
ox
P3
+ T
reg
s
Nella figura sono rappresentate le cellule T reg in 3 pazienti con SSc
Lrsquoespressione di mRNA di IDO nelle celllule B di pazienti sclerodermici
In un sottogruppo di pazienti sclerodermici abbiamo inoltre purificato le cellule B per misurare i
livelli di mRNA di IDO di queste cellule Le cellule B purificate da pazienti sclerodermici esprimono
mRNA di IDO e lrsquoespressione di questa molecola egrave risultata aumentata nelle cellule B se
confrontata con lrsquoespressione di IDO nei corrispondenti PBMC dopo la purificazione per le cellule
B
81
88
95
CD4
FoxP3
Pt 1
Pt 2
Pt 3
Inoltre lrsquoespressione dellrsquomRNA di IDO correla con i livelli di proteina C reattiva (R=060 p=0035)
Inoltre il numero di copie di mRNA per IDO correla con la frequenza delle cellule Treg CD4+FoxP3+
La piugrave alta frequenza di cellule T regolatorie nei pazienti le cui cellule B esprimevano i piugrave alti livelli
di mRNA per IDO suggerisce che lrsquoattivitagrave di questo enzima potrebbe influenzare la conversione
delle cellule T in cellule T regolatorie
B cells MNC
0
2
4
6
8
10
IDO
-1 m
RN
A (
qP
CR
)
0 2 4 6 8 10
0
5
10
15 06084
00358
IDO mRNA (B cells)
CR
P (
mg
dl)
I livelli di HGF nei pazienti sclerodermici
Lo studio dellrsquoHGF in questa coorte di pazienti ha evidenziato che i pazienti sclerodemici
presentano piugrave elevati livelli di HGF rispetto ai controlli sani nonostante i suoi livelli non correlino
con i diversi sottogruppi di malattia il coinvolgimento drsquoorgano e cutaneo e il diverso assetto
autoanticorpale
Infine abbiamo correlato tra loro lrsquoattivitagrave di IDO lrsquoespressione di HGF e lrsquoinfiammazione I livelli di
PCR correlano positivamente con il rapporto chinureninetriptofano (R=0045 p=002) e con i
livelli di HGF (R=005 p=002) Inoltre in questa coorte di pazienti i livelli di HGF sembrano
correlare anche se non viene raggiunta la significativitagrave statistica con piugrave elevati livelli di
chinurenine (R=002 p=006) suggerendo che lrsquoHGF potrebbe essere uno dei meccanismi di
induzione dellrsquoenzima IDO
B cells MNC
0
2
4
6
8
10
IDO
-1 m
RN
A (
qP
CR
) 63
78
624 936
FoxP3
FIG 4c
Ctrl Pts Ltd Diff Scl70-Scl70
+
0
1000
2000
300000001
Se
rum
HG
F (
pg
mL
)
I livelli di VEGF nel plasma nel wound fluid
I livelli di VEGF nel plasma erano paragonabili nei soggetti sclerodermici con e senza ulcere e nei
soggetti sani
Analizzando le caratteristiche dei pazienti con ulcere I pazienti sclerodermici che presentavano
ulcere maggiori presentavano piugrave elevati livelli di VEGF rispetto ai pazienti con ulcere digitali
(8028 10331 pgml vs 3670 4201 pgml p=007) anche se tale differenza non raggiungeva la
significativitagrave statistica Non egrave stata evidenziata inoltre alcune differenza nei livelli di VEGF nel
wound fluid nei pazienti con ulcere infette rispetto ai pazienti con ulcere non infette
Per confrontare i livelli di VEGF nello stesso paziente nel siero e nel plasma i livelli di VEGF sono
stati normalizzati per la concentrazione dellrsquoalbumina I pazienti sclerodermici presentavano piugrave
alti livelli di VEGF nel wound fluid (492530 1332646 pgml 1g alb) rispetto al plasma (6794 plusmn
9899 pgml)(plt005)
2 4 6 8 10 12 14 16 18
0
5
10
15
20
04495
00187
KYNTRP ratio
CR
P (
mg
dl)
300 1300 2300 3300
1
2
3
4
5
6
7
00617
02033
HGF (pgml)
Ky
nu
ren
ine
(m
M)
Abbiamo inoltre suddiviso i pazienti in due gruppi in base alla guarigione dellrsquoulcera dopo 3 mesi di
follow-up Il 50 dei pazienti sclerodermici presentava una risoluzione dellrsquoulcera e questi
presentavano meno frequentemente una malattia diffusa (429) rispetto ai pazienti che non
guarivano (714) (p=004) Mentre non egrave stata evidenzita alcuna differenza nei livelli di VEGF
plasmatico tra i pazienti che guarivano e quelli che non guarivano i livelli di VEGF nel wound fluid
sono risultati statisticamente piugrave bassi nei pazienti che guarivano rispetto a quelli che non
guarivano (535394 51990 pgml1g albumin vs 8688080 17865451 pgml1g albumina
p=005)
SSc patients with ulcer
WO
UN
D F
LU
ID
P
LA
SM
A
IL-6 (pgml) 282 plusmn 532
HGF (pgml) 343520 plusmn 487366
VEGF (pgml) 6794 plusmn 9899
VEGF-D (pgml) 6783 plusmn 6473
IL-6 (pgml 1g alb) 5745532 10051587
HGF (pgml 1g alb) 1781821 4692675
TNF-α (pgml 1g alb) 144362 4945585
VEGF (pgml 1g alb) 492530 1332646
VEGF-D (pgml 1g alb) 4366 plusmn 11968
Conclusioni
I risultati di questo progetto a ricerca ci hanno permesso di individuare alcune alterazioni dei
linfociti B e T e del loro network citochinico nei pazienti affetti da sclerosi sistemica Le
modificazioni di alcune sottopopolazioni linfocitarie sembrano essere strettamente associate a
modificazione dei livelli delle citochine coinvolte nella risposta autoimmune
Lo studio delle sottopopolazioni linfocitarie B ha evidenziato una riduzione delle cellule della
memoria e un aumento delle cellule naive che potrebbero rappresentare un biomarcatore di
malattia sclerodermica aggressiva visto la loro correlazione con il coinvolgimento drsquoorgano
Per la prima volta egrave stata valutata lrsquoattivitagrave di IDO in corso di sclerodermia che egrave risultata
aumentata come supportato dagli aumentati livelli di chinurenine nonostante paragonabili livelli
di triptofano Lrsquoenzima IDO quindi risulta piugrave attivo nei pazienti con SSc rispetto ai soggetti sani e
lrsquoaumentata attivitagrave di questo enzima potrebbe essere responsabile dellrsquoalterazione del numero di
cellule T regolatorie nei pazienti sclerodermici anche se saranno necessari ulteriori studi per
capire se allrsquoaumento del numero di cellule T regolatorie si associ anche ad una loro aumentata
attivitagrave La capacitagrave delle cellule B di esprimere IDO potrebbe rappresentare un possibile link tra le
alterazioni dei linfociti B e dei linfociti T
Infine i dati sulla presenza di un gradiente di concentrazione del VEGF dal plasma al liquido delle
ulcere suggerisce lrsquoimportanza di studiare i singoli compartimenti drsquoorgano per cercare di
comprendere lrsquoampia variabilitagrave fenotipica delle manifestazioni drsquoorgano della sclerodermia
Page 10
Nella figura sono rappresentate le cellule T reg in 3 pazienti con SSc
Lrsquoespressione di mRNA di IDO nelle celllule B di pazienti sclerodermici
In un sottogruppo di pazienti sclerodermici abbiamo inoltre purificato le cellule B per misurare i
livelli di mRNA di IDO di queste cellule Le cellule B purificate da pazienti sclerodermici esprimono
mRNA di IDO e lrsquoespressione di questa molecola egrave risultata aumentata nelle cellule B se
confrontata con lrsquoespressione di IDO nei corrispondenti PBMC dopo la purificazione per le cellule
B
81
88
95
CD4
FoxP3
Pt 1
Pt 2
Pt 3
Inoltre lrsquoespressione dellrsquomRNA di IDO correla con i livelli di proteina C reattiva (R=060 p=0035)
Inoltre il numero di copie di mRNA per IDO correla con la frequenza delle cellule Treg CD4+FoxP3+
La piugrave alta frequenza di cellule T regolatorie nei pazienti le cui cellule B esprimevano i piugrave alti livelli
di mRNA per IDO suggerisce che lrsquoattivitagrave di questo enzima potrebbe influenzare la conversione
delle cellule T in cellule T regolatorie
B cells MNC
0
2
4
6
8
10
IDO
-1 m
RN
A (
qP
CR
)
0 2 4 6 8 10
0
5
10
15 06084
00358
IDO mRNA (B cells)
CR
P (
mg
dl)
I livelli di HGF nei pazienti sclerodermici
Lo studio dellrsquoHGF in questa coorte di pazienti ha evidenziato che i pazienti sclerodemici
presentano piugrave elevati livelli di HGF rispetto ai controlli sani nonostante i suoi livelli non correlino
con i diversi sottogruppi di malattia il coinvolgimento drsquoorgano e cutaneo e il diverso assetto
autoanticorpale
Infine abbiamo correlato tra loro lrsquoattivitagrave di IDO lrsquoespressione di HGF e lrsquoinfiammazione I livelli di
PCR correlano positivamente con il rapporto chinureninetriptofano (R=0045 p=002) e con i
livelli di HGF (R=005 p=002) Inoltre in questa coorte di pazienti i livelli di HGF sembrano
correlare anche se non viene raggiunta la significativitagrave statistica con piugrave elevati livelli di
chinurenine (R=002 p=006) suggerendo che lrsquoHGF potrebbe essere uno dei meccanismi di
induzione dellrsquoenzima IDO
B cells MNC
0
2
4
6
8
10
IDO
-1 m
RN
A (
qP
CR
) 63
78
624 936
FoxP3
FIG 4c
Ctrl Pts Ltd Diff Scl70-Scl70
+
0
1000
2000
300000001
Se
rum
HG
F (
pg
mL
)
I livelli di VEGF nel plasma nel wound fluid
I livelli di VEGF nel plasma erano paragonabili nei soggetti sclerodermici con e senza ulcere e nei
soggetti sani
Analizzando le caratteristiche dei pazienti con ulcere I pazienti sclerodermici che presentavano
ulcere maggiori presentavano piugrave elevati livelli di VEGF rispetto ai pazienti con ulcere digitali
(8028 10331 pgml vs 3670 4201 pgml p=007) anche se tale differenza non raggiungeva la
significativitagrave statistica Non egrave stata evidenziata inoltre alcune differenza nei livelli di VEGF nel
wound fluid nei pazienti con ulcere infette rispetto ai pazienti con ulcere non infette
Per confrontare i livelli di VEGF nello stesso paziente nel siero e nel plasma i livelli di VEGF sono
stati normalizzati per la concentrazione dellrsquoalbumina I pazienti sclerodermici presentavano piugrave
alti livelli di VEGF nel wound fluid (492530 1332646 pgml 1g alb) rispetto al plasma (6794 plusmn
9899 pgml)(plt005)
2 4 6 8 10 12 14 16 18
0
5
10
15
20
04495
00187
KYNTRP ratio
CR
P (
mg
dl)
300 1300 2300 3300
1
2
3
4
5
6
7
00617
02033
HGF (pgml)
Ky
nu
ren
ine
(m
M)
Abbiamo inoltre suddiviso i pazienti in due gruppi in base alla guarigione dellrsquoulcera dopo 3 mesi di
follow-up Il 50 dei pazienti sclerodermici presentava una risoluzione dellrsquoulcera e questi
presentavano meno frequentemente una malattia diffusa (429) rispetto ai pazienti che non
guarivano (714) (p=004) Mentre non egrave stata evidenzita alcuna differenza nei livelli di VEGF
plasmatico tra i pazienti che guarivano e quelli che non guarivano i livelli di VEGF nel wound fluid
sono risultati statisticamente piugrave bassi nei pazienti che guarivano rispetto a quelli che non
guarivano (535394 51990 pgml1g albumin vs 8688080 17865451 pgml1g albumina
p=005)
SSc patients with ulcer
WO
UN
D F
LU
ID
P
LA
SM
A
IL-6 (pgml) 282 plusmn 532
HGF (pgml) 343520 plusmn 487366
VEGF (pgml) 6794 plusmn 9899
VEGF-D (pgml) 6783 plusmn 6473
IL-6 (pgml 1g alb) 5745532 10051587
HGF (pgml 1g alb) 1781821 4692675
TNF-α (pgml 1g alb) 144362 4945585
VEGF (pgml 1g alb) 492530 1332646
VEGF-D (pgml 1g alb) 4366 plusmn 11968
Conclusioni
I risultati di questo progetto a ricerca ci hanno permesso di individuare alcune alterazioni dei
linfociti B e T e del loro network citochinico nei pazienti affetti da sclerosi sistemica Le
modificazioni di alcune sottopopolazioni linfocitarie sembrano essere strettamente associate a
modificazione dei livelli delle citochine coinvolte nella risposta autoimmune
Lo studio delle sottopopolazioni linfocitarie B ha evidenziato una riduzione delle cellule della
memoria e un aumento delle cellule naive che potrebbero rappresentare un biomarcatore di
malattia sclerodermica aggressiva visto la loro correlazione con il coinvolgimento drsquoorgano
Per la prima volta egrave stata valutata lrsquoattivitagrave di IDO in corso di sclerodermia che egrave risultata
aumentata come supportato dagli aumentati livelli di chinurenine nonostante paragonabili livelli
di triptofano Lrsquoenzima IDO quindi risulta piugrave attivo nei pazienti con SSc rispetto ai soggetti sani e
lrsquoaumentata attivitagrave di questo enzima potrebbe essere responsabile dellrsquoalterazione del numero di
cellule T regolatorie nei pazienti sclerodermici anche se saranno necessari ulteriori studi per
capire se allrsquoaumento del numero di cellule T regolatorie si associ anche ad una loro aumentata
attivitagrave La capacitagrave delle cellule B di esprimere IDO potrebbe rappresentare un possibile link tra le
alterazioni dei linfociti B e dei linfociti T
Infine i dati sulla presenza di un gradiente di concentrazione del VEGF dal plasma al liquido delle
ulcere suggerisce lrsquoimportanza di studiare i singoli compartimenti drsquoorgano per cercare di
comprendere lrsquoampia variabilitagrave fenotipica delle manifestazioni drsquoorgano della sclerodermia
Page 11
Inoltre lrsquoespressione dellrsquomRNA di IDO correla con i livelli di proteina C reattiva (R=060 p=0035)
Inoltre il numero di copie di mRNA per IDO correla con la frequenza delle cellule Treg CD4+FoxP3+
La piugrave alta frequenza di cellule T regolatorie nei pazienti le cui cellule B esprimevano i piugrave alti livelli
di mRNA per IDO suggerisce che lrsquoattivitagrave di questo enzima potrebbe influenzare la conversione
delle cellule T in cellule T regolatorie
B cells MNC
0
2
4
6
8
10
IDO
-1 m
RN
A (
qP
CR
)
0 2 4 6 8 10
0
5
10
15 06084
00358
IDO mRNA (B cells)
CR
P (
mg
dl)
I livelli di HGF nei pazienti sclerodermici
Lo studio dellrsquoHGF in questa coorte di pazienti ha evidenziato che i pazienti sclerodemici
presentano piugrave elevati livelli di HGF rispetto ai controlli sani nonostante i suoi livelli non correlino
con i diversi sottogruppi di malattia il coinvolgimento drsquoorgano e cutaneo e il diverso assetto
autoanticorpale
Infine abbiamo correlato tra loro lrsquoattivitagrave di IDO lrsquoespressione di HGF e lrsquoinfiammazione I livelli di
PCR correlano positivamente con il rapporto chinureninetriptofano (R=0045 p=002) e con i
livelli di HGF (R=005 p=002) Inoltre in questa coorte di pazienti i livelli di HGF sembrano
correlare anche se non viene raggiunta la significativitagrave statistica con piugrave elevati livelli di
chinurenine (R=002 p=006) suggerendo che lrsquoHGF potrebbe essere uno dei meccanismi di
induzione dellrsquoenzima IDO
B cells MNC
0
2
4
6
8
10
IDO
-1 m
RN
A (
qP
CR
) 63
78
624 936
FoxP3
FIG 4c
Ctrl Pts Ltd Diff Scl70-Scl70
+
0
1000
2000
300000001
Se
rum
HG
F (
pg
mL
)
I livelli di VEGF nel plasma nel wound fluid
I livelli di VEGF nel plasma erano paragonabili nei soggetti sclerodermici con e senza ulcere e nei
soggetti sani
Analizzando le caratteristiche dei pazienti con ulcere I pazienti sclerodermici che presentavano
ulcere maggiori presentavano piugrave elevati livelli di VEGF rispetto ai pazienti con ulcere digitali
(8028 10331 pgml vs 3670 4201 pgml p=007) anche se tale differenza non raggiungeva la
significativitagrave statistica Non egrave stata evidenziata inoltre alcune differenza nei livelli di VEGF nel
wound fluid nei pazienti con ulcere infette rispetto ai pazienti con ulcere non infette
Per confrontare i livelli di VEGF nello stesso paziente nel siero e nel plasma i livelli di VEGF sono
stati normalizzati per la concentrazione dellrsquoalbumina I pazienti sclerodermici presentavano piugrave
alti livelli di VEGF nel wound fluid (492530 1332646 pgml 1g alb) rispetto al plasma (6794 plusmn
9899 pgml)(plt005)
2 4 6 8 10 12 14 16 18
0
5
10
15
20
04495
00187
KYNTRP ratio
CR
P (
mg
dl)
300 1300 2300 3300
1
2
3
4
5
6
7
00617
02033
HGF (pgml)
Ky
nu
ren
ine
(m
M)
Abbiamo inoltre suddiviso i pazienti in due gruppi in base alla guarigione dellrsquoulcera dopo 3 mesi di
follow-up Il 50 dei pazienti sclerodermici presentava una risoluzione dellrsquoulcera e questi
presentavano meno frequentemente una malattia diffusa (429) rispetto ai pazienti che non
guarivano (714) (p=004) Mentre non egrave stata evidenzita alcuna differenza nei livelli di VEGF
plasmatico tra i pazienti che guarivano e quelli che non guarivano i livelli di VEGF nel wound fluid
sono risultati statisticamente piugrave bassi nei pazienti che guarivano rispetto a quelli che non
guarivano (535394 51990 pgml1g albumin vs 8688080 17865451 pgml1g albumina
p=005)
SSc patients with ulcer
WO
UN
D F
LU
ID
P
LA
SM
A
IL-6 (pgml) 282 plusmn 532
HGF (pgml) 343520 plusmn 487366
VEGF (pgml) 6794 plusmn 9899
VEGF-D (pgml) 6783 plusmn 6473
IL-6 (pgml 1g alb) 5745532 10051587
HGF (pgml 1g alb) 1781821 4692675
TNF-α (pgml 1g alb) 144362 4945585
VEGF (pgml 1g alb) 492530 1332646
VEGF-D (pgml 1g alb) 4366 plusmn 11968
Conclusioni
I risultati di questo progetto a ricerca ci hanno permesso di individuare alcune alterazioni dei
linfociti B e T e del loro network citochinico nei pazienti affetti da sclerosi sistemica Le
modificazioni di alcune sottopopolazioni linfocitarie sembrano essere strettamente associate a
modificazione dei livelli delle citochine coinvolte nella risposta autoimmune
Lo studio delle sottopopolazioni linfocitarie B ha evidenziato una riduzione delle cellule della
memoria e un aumento delle cellule naive che potrebbero rappresentare un biomarcatore di
malattia sclerodermica aggressiva visto la loro correlazione con il coinvolgimento drsquoorgano
Per la prima volta egrave stata valutata lrsquoattivitagrave di IDO in corso di sclerodermia che egrave risultata
aumentata come supportato dagli aumentati livelli di chinurenine nonostante paragonabili livelli
di triptofano Lrsquoenzima IDO quindi risulta piugrave attivo nei pazienti con SSc rispetto ai soggetti sani e
lrsquoaumentata attivitagrave di questo enzima potrebbe essere responsabile dellrsquoalterazione del numero di
cellule T regolatorie nei pazienti sclerodermici anche se saranno necessari ulteriori studi per
capire se allrsquoaumento del numero di cellule T regolatorie si associ anche ad una loro aumentata
attivitagrave La capacitagrave delle cellule B di esprimere IDO potrebbe rappresentare un possibile link tra le
alterazioni dei linfociti B e dei linfociti T
Infine i dati sulla presenza di un gradiente di concentrazione del VEGF dal plasma al liquido delle
ulcere suggerisce lrsquoimportanza di studiare i singoli compartimenti drsquoorgano per cercare di
comprendere lrsquoampia variabilitagrave fenotipica delle manifestazioni drsquoorgano della sclerodermia
Page 12
I livelli di HGF nei pazienti sclerodermici
Lo studio dellrsquoHGF in questa coorte di pazienti ha evidenziato che i pazienti sclerodemici
presentano piugrave elevati livelli di HGF rispetto ai controlli sani nonostante i suoi livelli non correlino
con i diversi sottogruppi di malattia il coinvolgimento drsquoorgano e cutaneo e il diverso assetto
autoanticorpale
Infine abbiamo correlato tra loro lrsquoattivitagrave di IDO lrsquoespressione di HGF e lrsquoinfiammazione I livelli di
PCR correlano positivamente con il rapporto chinureninetriptofano (R=0045 p=002) e con i
livelli di HGF (R=005 p=002) Inoltre in questa coorte di pazienti i livelli di HGF sembrano
correlare anche se non viene raggiunta la significativitagrave statistica con piugrave elevati livelli di
chinurenine (R=002 p=006) suggerendo che lrsquoHGF potrebbe essere uno dei meccanismi di
induzione dellrsquoenzima IDO
B cells MNC
0
2
4
6
8
10
IDO
-1 m
RN
A (
qP
CR
) 63
78
624 936
FoxP3
FIG 4c
Ctrl Pts Ltd Diff Scl70-Scl70
+
0
1000
2000
300000001
Se
rum
HG
F (
pg
mL
)
I livelli di VEGF nel plasma nel wound fluid
I livelli di VEGF nel plasma erano paragonabili nei soggetti sclerodermici con e senza ulcere e nei
soggetti sani
Analizzando le caratteristiche dei pazienti con ulcere I pazienti sclerodermici che presentavano
ulcere maggiori presentavano piugrave elevati livelli di VEGF rispetto ai pazienti con ulcere digitali
(8028 10331 pgml vs 3670 4201 pgml p=007) anche se tale differenza non raggiungeva la
significativitagrave statistica Non egrave stata evidenziata inoltre alcune differenza nei livelli di VEGF nel
wound fluid nei pazienti con ulcere infette rispetto ai pazienti con ulcere non infette
Per confrontare i livelli di VEGF nello stesso paziente nel siero e nel plasma i livelli di VEGF sono
stati normalizzati per la concentrazione dellrsquoalbumina I pazienti sclerodermici presentavano piugrave
alti livelli di VEGF nel wound fluid (492530 1332646 pgml 1g alb) rispetto al plasma (6794 plusmn
9899 pgml)(plt005)
2 4 6 8 10 12 14 16 18
0
5
10
15
20
04495
00187
KYNTRP ratio
CR
P (
mg
dl)
300 1300 2300 3300
1
2
3
4
5
6
7
00617
02033
HGF (pgml)
Ky
nu
ren
ine
(m
M)
Abbiamo inoltre suddiviso i pazienti in due gruppi in base alla guarigione dellrsquoulcera dopo 3 mesi di
follow-up Il 50 dei pazienti sclerodermici presentava una risoluzione dellrsquoulcera e questi
presentavano meno frequentemente una malattia diffusa (429) rispetto ai pazienti che non
guarivano (714) (p=004) Mentre non egrave stata evidenzita alcuna differenza nei livelli di VEGF
plasmatico tra i pazienti che guarivano e quelli che non guarivano i livelli di VEGF nel wound fluid
sono risultati statisticamente piugrave bassi nei pazienti che guarivano rispetto a quelli che non
guarivano (535394 51990 pgml1g albumin vs 8688080 17865451 pgml1g albumina
p=005)
SSc patients with ulcer
WO
UN
D F
LU
ID
P
LA
SM
A
IL-6 (pgml) 282 plusmn 532
HGF (pgml) 343520 plusmn 487366
VEGF (pgml) 6794 plusmn 9899
VEGF-D (pgml) 6783 plusmn 6473
IL-6 (pgml 1g alb) 5745532 10051587
HGF (pgml 1g alb) 1781821 4692675
TNF-α (pgml 1g alb) 144362 4945585
VEGF (pgml 1g alb) 492530 1332646
VEGF-D (pgml 1g alb) 4366 plusmn 11968
Conclusioni
I risultati di questo progetto a ricerca ci hanno permesso di individuare alcune alterazioni dei
linfociti B e T e del loro network citochinico nei pazienti affetti da sclerosi sistemica Le
modificazioni di alcune sottopopolazioni linfocitarie sembrano essere strettamente associate a
modificazione dei livelli delle citochine coinvolte nella risposta autoimmune
Lo studio delle sottopopolazioni linfocitarie B ha evidenziato una riduzione delle cellule della
memoria e un aumento delle cellule naive che potrebbero rappresentare un biomarcatore di
malattia sclerodermica aggressiva visto la loro correlazione con il coinvolgimento drsquoorgano
Per la prima volta egrave stata valutata lrsquoattivitagrave di IDO in corso di sclerodermia che egrave risultata
aumentata come supportato dagli aumentati livelli di chinurenine nonostante paragonabili livelli
di triptofano Lrsquoenzima IDO quindi risulta piugrave attivo nei pazienti con SSc rispetto ai soggetti sani e
lrsquoaumentata attivitagrave di questo enzima potrebbe essere responsabile dellrsquoalterazione del numero di
cellule T regolatorie nei pazienti sclerodermici anche se saranno necessari ulteriori studi per
capire se allrsquoaumento del numero di cellule T regolatorie si associ anche ad una loro aumentata
attivitagrave La capacitagrave delle cellule B di esprimere IDO potrebbe rappresentare un possibile link tra le
alterazioni dei linfociti B e dei linfociti T
Infine i dati sulla presenza di un gradiente di concentrazione del VEGF dal plasma al liquido delle
ulcere suggerisce lrsquoimportanza di studiare i singoli compartimenti drsquoorgano per cercare di
comprendere lrsquoampia variabilitagrave fenotipica delle manifestazioni drsquoorgano della sclerodermia
Page 13
I livelli di VEGF nel plasma nel wound fluid
I livelli di VEGF nel plasma erano paragonabili nei soggetti sclerodermici con e senza ulcere e nei
soggetti sani
Analizzando le caratteristiche dei pazienti con ulcere I pazienti sclerodermici che presentavano
ulcere maggiori presentavano piugrave elevati livelli di VEGF rispetto ai pazienti con ulcere digitali
(8028 10331 pgml vs 3670 4201 pgml p=007) anche se tale differenza non raggiungeva la
significativitagrave statistica Non egrave stata evidenziata inoltre alcune differenza nei livelli di VEGF nel
wound fluid nei pazienti con ulcere infette rispetto ai pazienti con ulcere non infette
Per confrontare i livelli di VEGF nello stesso paziente nel siero e nel plasma i livelli di VEGF sono
stati normalizzati per la concentrazione dellrsquoalbumina I pazienti sclerodermici presentavano piugrave
alti livelli di VEGF nel wound fluid (492530 1332646 pgml 1g alb) rispetto al plasma (6794 plusmn
9899 pgml)(plt005)
2 4 6 8 10 12 14 16 18
0
5
10
15
20
04495
00187
KYNTRP ratio
CR
P (
mg
dl)
300 1300 2300 3300
1
2
3
4
5
6
7
00617
02033
HGF (pgml)
Ky
nu
ren
ine
(m
M)
Abbiamo inoltre suddiviso i pazienti in due gruppi in base alla guarigione dellrsquoulcera dopo 3 mesi di
follow-up Il 50 dei pazienti sclerodermici presentava una risoluzione dellrsquoulcera e questi
presentavano meno frequentemente una malattia diffusa (429) rispetto ai pazienti che non
guarivano (714) (p=004) Mentre non egrave stata evidenzita alcuna differenza nei livelli di VEGF
plasmatico tra i pazienti che guarivano e quelli che non guarivano i livelli di VEGF nel wound fluid
sono risultati statisticamente piugrave bassi nei pazienti che guarivano rispetto a quelli che non
guarivano (535394 51990 pgml1g albumin vs 8688080 17865451 pgml1g albumina
p=005)
SSc patients with ulcer
WO
UN
D F
LU
ID
P
LA
SM
A
IL-6 (pgml) 282 plusmn 532
HGF (pgml) 343520 plusmn 487366
VEGF (pgml) 6794 plusmn 9899
VEGF-D (pgml) 6783 plusmn 6473
IL-6 (pgml 1g alb) 5745532 10051587
HGF (pgml 1g alb) 1781821 4692675
TNF-α (pgml 1g alb) 144362 4945585
VEGF (pgml 1g alb) 492530 1332646
VEGF-D (pgml 1g alb) 4366 plusmn 11968
Conclusioni
I risultati di questo progetto a ricerca ci hanno permesso di individuare alcune alterazioni dei
linfociti B e T e del loro network citochinico nei pazienti affetti da sclerosi sistemica Le
modificazioni di alcune sottopopolazioni linfocitarie sembrano essere strettamente associate a
modificazione dei livelli delle citochine coinvolte nella risposta autoimmune
Lo studio delle sottopopolazioni linfocitarie B ha evidenziato una riduzione delle cellule della
memoria e un aumento delle cellule naive che potrebbero rappresentare un biomarcatore di
malattia sclerodermica aggressiva visto la loro correlazione con il coinvolgimento drsquoorgano
Per la prima volta egrave stata valutata lrsquoattivitagrave di IDO in corso di sclerodermia che egrave risultata
aumentata come supportato dagli aumentati livelli di chinurenine nonostante paragonabili livelli
di triptofano Lrsquoenzima IDO quindi risulta piugrave attivo nei pazienti con SSc rispetto ai soggetti sani e
lrsquoaumentata attivitagrave di questo enzima potrebbe essere responsabile dellrsquoalterazione del numero di
cellule T regolatorie nei pazienti sclerodermici anche se saranno necessari ulteriori studi per
capire se allrsquoaumento del numero di cellule T regolatorie si associ anche ad una loro aumentata
attivitagrave La capacitagrave delle cellule B di esprimere IDO potrebbe rappresentare un possibile link tra le
alterazioni dei linfociti B e dei linfociti T
Infine i dati sulla presenza di un gradiente di concentrazione del VEGF dal plasma al liquido delle
ulcere suggerisce lrsquoimportanza di studiare i singoli compartimenti drsquoorgano per cercare di
comprendere lrsquoampia variabilitagrave fenotipica delle manifestazioni drsquoorgano della sclerodermia
Page 14
Abbiamo inoltre suddiviso i pazienti in due gruppi in base alla guarigione dellrsquoulcera dopo 3 mesi di
follow-up Il 50 dei pazienti sclerodermici presentava una risoluzione dellrsquoulcera e questi
presentavano meno frequentemente una malattia diffusa (429) rispetto ai pazienti che non
guarivano (714) (p=004) Mentre non egrave stata evidenzita alcuna differenza nei livelli di VEGF
plasmatico tra i pazienti che guarivano e quelli che non guarivano i livelli di VEGF nel wound fluid
sono risultati statisticamente piugrave bassi nei pazienti che guarivano rispetto a quelli che non
guarivano (535394 51990 pgml1g albumin vs 8688080 17865451 pgml1g albumina
p=005)
SSc patients with ulcer
WO
UN
D F
LU
ID
P
LA
SM
A
IL-6 (pgml) 282 plusmn 532
HGF (pgml) 343520 plusmn 487366
VEGF (pgml) 6794 plusmn 9899
VEGF-D (pgml) 6783 plusmn 6473
IL-6 (pgml 1g alb) 5745532 10051587
HGF (pgml 1g alb) 1781821 4692675
TNF-α (pgml 1g alb) 144362 4945585
VEGF (pgml 1g alb) 492530 1332646
VEGF-D (pgml 1g alb) 4366 plusmn 11968
Conclusioni
I risultati di questo progetto a ricerca ci hanno permesso di individuare alcune alterazioni dei
linfociti B e T e del loro network citochinico nei pazienti affetti da sclerosi sistemica Le
modificazioni di alcune sottopopolazioni linfocitarie sembrano essere strettamente associate a
modificazione dei livelli delle citochine coinvolte nella risposta autoimmune
Lo studio delle sottopopolazioni linfocitarie B ha evidenziato una riduzione delle cellule della
memoria e un aumento delle cellule naive che potrebbero rappresentare un biomarcatore di
malattia sclerodermica aggressiva visto la loro correlazione con il coinvolgimento drsquoorgano
Per la prima volta egrave stata valutata lrsquoattivitagrave di IDO in corso di sclerodermia che egrave risultata
aumentata come supportato dagli aumentati livelli di chinurenine nonostante paragonabili livelli
di triptofano Lrsquoenzima IDO quindi risulta piugrave attivo nei pazienti con SSc rispetto ai soggetti sani e
lrsquoaumentata attivitagrave di questo enzima potrebbe essere responsabile dellrsquoalterazione del numero di
cellule T regolatorie nei pazienti sclerodermici anche se saranno necessari ulteriori studi per
capire se allrsquoaumento del numero di cellule T regolatorie si associ anche ad una loro aumentata
attivitagrave La capacitagrave delle cellule B di esprimere IDO potrebbe rappresentare un possibile link tra le
alterazioni dei linfociti B e dei linfociti T
Infine i dati sulla presenza di un gradiente di concentrazione del VEGF dal plasma al liquido delle
ulcere suggerisce lrsquoimportanza di studiare i singoli compartimenti drsquoorgano per cercare di
comprendere lrsquoampia variabilitagrave fenotipica delle manifestazioni drsquoorgano della sclerodermia
Page 15
attivitagrave La capacitagrave delle cellule B di esprimere IDO potrebbe rappresentare un possibile link tra le
alterazioni dei linfociti B e dei linfociti T
Infine i dati sulla presenza di un gradiente di concentrazione del VEGF dal plasma al liquido delle
ulcere suggerisce lrsquoimportanza di studiare i singoli compartimenti drsquoorgano per cercare di
comprendere lrsquoampia variabilitagrave fenotipica delle manifestazioni drsquoorgano della sclerodermia