Astaxantina de Haematococcus Con CO2

PONTIFICIA UNIVERSIDAD CATÓLICA DE CHILE

ESCUELA DE INGENIERÍA

EXTRACCIÓN DE ASTAXANTINA DE

HAEMATOCOCCUS PLUVIALIS USANDO

CO2 SUPERCRÍTICO

RAÚL IGNACIO ARAVENA CONTRERAS

Tesis para optar al grado de

Magíster en Ciencias de la Ingeniería

Profesor Supervisor:

JOSÉ MANUEL DEL VALLE LL.

Santiago de Chile, Abril, 2011

PONTIFICIA UNIVERSIDAD CATÓLICA DE CHILE

ESCUELA DE INGENIERÍA

EXTRACCIÓN DE ASTAXANTINA DE

HAEMATOCOCCUS PLUVIALIS USANDO CO2

SUPERCRÍTICO

RAÚL IGNACIO ARAVENA CONTRERAS

Tesis presentada a la Comisión integrada por los profesores:

JOSÉ MANUEL DEL VALLE LL.

CÉSAR SÁEZ N.

PAZ ROBERT C.

JOSÉ MUÑOZ P.

Para completar las exigencias del grado de

Magister en Ciencias de la Ingeniería

Santiago de Chile, Abril, 2011

ii

(A mis Padres, hermanos y amigos,

que me apoyaron cuando más los

necesite)

iii

AGRADECIMIENTOS

Al concluir esta Tesis quisiera agradecer a la empresa Atacama Bionatural Products S.A

por facilitar la materia prima necesaria para poder llevar a cabo los experimentos. Al

profesor César Sáez y su alumno Fabián Reyes por permitirme utilizar su laboratorio para

efectuar el análisis de los extractos. A los alumnos y administrativos del Departamento de

Ingeniería Química quienes siempre me entregaron su apoyo, en especial a Gonzalo y

Freddy con quienes discutí en más de alguna oportunidad diversos temas relacionado con

mi Tesis que me ayudaron a ir mejorando procedimientos y análisis. Finalmente, al

profesor José Manuel del Valle por permitirme efectuar mi investigación en su laboratorio

bajo su supervisión.

ÍNDICE GENERAL

Pág.

DEDICATORIA.................................................................................................................... ii

AGRADECIMIENTOS ....................................................................................................... iii

INDICE DE TABLAS .......................................................................................................... vi

INDICE DE FIGURAS ....................................................................................................... vii

RESUMEN ......................................................................................................................... viii

ABSTRACT .......................................................................................................................... ix

1. INTRODUCCIÓN ....................................................................................................... 1

1.1 Haematococcus pluvialis y astaxantina ................................................................ 2

1.2 Producción de compuestos de alto valor a partir de microalgas .......................... 3

1.3.1 Extracción con fluidos supercríticos .......................................................... 4

1.3.2 Extracción supercrítica de microalgas ........................................................ 8

1.3 Objetivos ............................................................................................................. 9

2. MATERIALES Y MÉTODOS .................................................................................. 10

2.1 Materiales .......................................................................................................... 10

2.2 Análisis de materia prima ................................................................................. 10

2.3 Extracción supercrítica ..................................................................................... 11

2.4 Medición de astaxantina por espectrofotometría ............................................... 13

3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ................................................................................ 14

3.1 Extracción supercrítica de polvo de H. pluvialias .............................................. 14

3.2 Extracción supercrítica de homogenato de H. pluvialias ................................... 20

3.3 Comparación extracción de polvo con extracción de homogenato .................... 24

4. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES ........................................................ 28

4.1 Conclusiones ..................................................................................................... 28

4.2 Recomendaciones ............................................................................................... 29

BIBLIOGRAFIA .................................................................................................................. 31

A N E X O S ......................................................................................................................... 37

ANEXO A : Estudios publicados sobre fraccionamiento y extracción de corrientes líquidas

usando CO2-SC ........................................................................................................... 37

ANEXO B: Estudios publicados sobre extracción de microalgas usando CO2-SC ............. 38

ANEXO C: Validación metodología……………………………………………………... 42

ANEXO D: Resultados extracción de polvo de H. pluvialis .............................................. 44

ANEXO E: Estructura de monoesteres y diestres de astaxantina ....................................... 47

ANEXO F: Resultados extracción de homogenato de H. pluvialis .................................... 48

vi

ÍNDICE DE TABLAS

Pág.

Tabla 1-1: Comparación entre procesos de Extracción SuperCrítica (ESC) de Sólidos (S) y

Líquidos (L). ................................................................................................................. 7

Tabla 3-1: Solubilidad de astaxantina .................................................................................. 16

Tabla 3-2: Resultados obtenidos en estre trabajo y los reportados por Machmudah et al.

(2006) para la extracción de H. pluvialis .................................................................... 18

Tabla 3-3: Pureza de extractos de polvo de H. pluvialis ..................................................... 20

Tabla 3-4: Resultados obtenidos al final del proceso de extracción de homogenato .......... 23

Tabla 3-5: Pureza de extractos de homogenato de H. pluvialis .......................................... 24

Tabla 3-6: Factor de productividad (G) ............................................................................... 25

Tabla Anexo A: Estudios publicados sobre fracciobamiento y extracción de corrientes

líquidas usando CO2.SC……………………………………………………………..37

Tabla Anexo B: Estudios publicados sobre extracción de microalgas usando CO2-SC…...38

Tabla Anexo D: Resultados extracción polvo de H. pluvialis……………………………..44

Tabla Anexo F: Resultados extracción de homogenato de H. pluvialis…………………...48

vii

ÍNDICE DE FIGURAS

Pág.

Figura 1-1: Estructura molecular de astaxantina .................................................................... 3

Figura 2-1: Diagrama del equipo de extracción ................................................................... 12

Figura 3-1: Cinéticas de extracción de sólido en condiciones isobáricas ............................ 15

Figura 3-2: Cinéticas de extracción de homogenato en condiciones isobáricas .................. 22

Figura 3-3: Comparación pureza de extractos...................................................................... 27

Figura Anexo C-1: Extracción de sólidos………………………………………………….42

Figura Anexo C-2: Extracción de líquidos……...…………………………………………43

viii

RESUMEN

En los últimos años las microalgas han cobrado interés industrial por sus aplicaciones en

biocombustibles, alimentos, nutraceútos, farmaceúticos, y cosméticos. En particular,

Haematoccocus pluviales destaca por ser la mayor fuente natural de astaxantina, un

carotenoide con propiedades funcionales y antioxidantes derivadas de sus cadenas de

dobles enlaces conjugados. La extracción con dióxido de carbono supercrítico es un

método atractivo para la obtención de astaxantina de H. pluvialis, pues permite operar a

baja temperatura de extracción sin dejar trazas de solventes en los extractos. Esta técnica se

puede aplicar tanto a sustratos secos como líquidos.

El objetivo de esta tesis fue estudiar el proceso de extracción de astaxantina de H. pluvialis

desde un medio acuoso (homogenato) usando dióxido de carbono supercrítico. Los efectos

de presión (350-550 bar) y temperatura (40-70 ºC) fueron evaluados y comparados con

resultados obtenidos de la extracción de astaxantina de la microalga seca bajo estas mismas

condiciones.

Los resultados obtenidos indican que la presencia de agua en el homogenato genera un

retardo en el inicio del proceso de extracción dando origen a curvas de extracción con

forma sigmoidal. Además, el agua reduce la solubilidad de astaxantina y otros compuestos

del extracto en el CO2, requiriéndose un mayor consumo de CO2 para obtener un mismo

rendimiento de extracción, registrándose la mejor relación recuperación astaxantina

(60.75%) para la extracción de polvo de H. pluvialis a 550 bar y 70ºC. Por otro lado, bajo

las condiciones de extracción evaluadas, el extracto de mayor pureza se obtuvo para la

extracción de homogenato a 450 bar y 40 ºC (6.77%).

Palabras Claves: Haematoccocus pluvialis; Astaxantina; Extracción Supercritica,

Homogenato.

ix

ABSTRACT

In recent years, microalgae have gained interesting in the industry by its applications in

biofuels, foods, nutraceuticals, pharmaceutical, and cosmetics. Particularly,

Haematoccocus pluviales is the main natural source of astaxanthin, a carotenoid with

functional and antioxidant properties derived from its double bound carbon chain.

Supercritical carbon dioxide extraction is an interesting method for obtaining H. pluvialis’

s astaxanthin natural products, because of its low operational temperature, the complete

separation of solvent from the extract. Furthermore, this technical can be applied to solid

and liquids samples.

The objective of this thesis was studing the extraction of H. pluvialis’ s astaxanthin in

aqueous medium (homogenate) using supercritical carbon dioxide. The effects of pressure

(350-550 bar) and temperature (40-70 ºC) were evaluated and compared with the

extraction of dry microalgae under the same conditions.

Results showed that water delayed extraction of homogenate so that sigmodal curves were

obtained. Besides, water reduces the solubility of astaxanthin and other extract components

in CO2 so that CO2 consumption in extraction of homogenate was larger than the solid

counterpart when obtain the same yield. The best relation between astaxanthin recovery

and CO2 consumption was recorded for H. pluvialis powder extraction at 500 bar and 70

ºC. On the other hand, the highest astaxanthin concentration in the extract (6.77%) was

obtained when extracting homogenate at 450 bar and 70 ºC.

Keywords: Haematoccocus pluvialis; Astaxanthin; Supercritical Extraction; Homogenate.

1

1. INTRODUCCIÓN

La producción de microalgas a escala industrial ha sufrido un fuerte aumento desde

sus comienzos (en Japón en la década de los 60 con la producción de Chlorella),

existiendo hoy en día plantas de producción en diversos países del mundo con variadas

especies (Spolaore et al., 2006). Lo anterior se debe a que estos microorganismos son

fuente de gran cantidad de compuestos de alto interés comercial para las industrias:

alimenticia, farmacéutica, cosmética, y energética (Capelli y Cysewski, 2006; Spolaore et

al., 2006). En relación con la industria energética, el uso de microalgas como fuente de

materia prima para la producción de biocombustibles ha cobrado importancia en los

últimos años por el creciente interés a nivel mundial en fuentes de energías renovables y

menos contaminantes. El interés se sustenta en el alto contenido en varias especies de

microalgas de aceites (Chisti, 2007), que constituyen la principal materia prima para la

síntesis de biocombustibles (Ma y Hanna, 1999; Chisti, 2007; Huang et al., 2010). Sumado

a lo anterior, las microalgas se reproducen rápidamente, lo que permite obtener una mayor

cantidad de aceite por unidad de área de cultivo y tiempo que cultivando vegetales, de

modo que permiten limitar el uso de los terrenos cultivables al cultivo de alimentos de

consumo humano (Chisti, 2007).

En la actualidad la síntesis de biocombustibles a partir de microalgas no es

económicamente atractiva en comparación con sus aplicaciones alternativas como sustratos

para productos de alto valor agregado para las industrias de alimentos, fármacos, y

cosméticos. No obstante lo anterior, recientemente se ha considerado la obtención de

biocombustible a partir de microalgas como un co-producto en la extracción de

compuestos de alto valor agregado por transesterificación de los ácidos grasos residuales

(Bitran, 2009). Por lo tanto, interesa el desarrollo de nuevas tecnologías que permitan

recuperar bioproductos de alto valor agregado selectivamente, de manera de obtener un

producto de alta pureza, y un residuo rico en ácidos grasos que sea utilizable en la

producción de biodiesel. Entre los productos de alto valor agregado obtenidos desde

microalgas para el uso en diversas industrias destacan -caroteno de Dunaliella salina y D.

2

bardawil, ácidos grasos poliinsaturados (PUFAs, del inglés para Polyunsaturated Fatty

Acids) de Spirulina máxima, S. platensis, y Crypthecodinium, proteínas de Arthrospira, -

1,3-glucano de Chlorella, y astaxantina de Haematococcus pluvialis entre otros (Olaizola,

2003; Spolaore et al., 2006).

En el caso de nuestro país, la producción de microalgas se inició a fines del siglo

pasado con la producción a pequeña escala de las microalgas H. pluvialis, S. máxima, y D.

salina aprovechando una serie de ventajas que tiene Chile para su cultivo: zonas de alta

radiación solar que favorecen la reproducción de las microalgas; bastas extensiones de

suelo desértico que pueden ser ocupados para el cultivo; y disponibilidad de aguas no

contaminadas. Desde un punto de vista comercial, la microalga más importante

actualmente en nuestro país es H. pluviales debido a su alto contenido en astaxantina

(Sección 1.2), siendo cultivada por Astax, Atacama BioNatural Products, y Pigmentos

Naturales en la I Región, y por Algas Chañar y Alimtec en la IV Región, para generar

principalmente productos de consumo animal para la industria del salmón.

1.1 Haematoccocus pluvialis y astaxantina

Haematococus pluvialis es de gran importancia comercial, ya que bajo condiciones

de cultivo apropiadas es capaz de sintetizar y acumular gran cantidad de astaxantina, que

llega a constituir entre 2 y 5% del peso seco de la microalga (Dufossé et al., 2005; Mendes,

2008). Lo anterior convierte a H. pluvialis en la mayor fuente natural de este bioproducto,

por sobre otras fuentes convencionales como son la levadura Phaffia rhodozyma y restos

de crustáceos (Higuera-Ciapara, et al., 2006).

La astaxantina (3.3’-dihidroxi- . -caroteno-4,4’-diona) (Figura 1-1) es un

carotenoide perteneciente a la clase de la xantófilas, que está formado por una estructura

hidrocarbonada de 40 átomos de carbono con dos anillos terminales, unidos por una

cadena con dobles enlaces conjugados. En la actualidad el principal mercado de la

astaxantin es la industria del salmón, en donde se utiliza como suplemento alimenticio para

3

pigmentar su carne. Sin embargo, en los últimos años la industria farmacéutica y

nutracéutica también se ha interesado en la astaxantina (Olaizola, 2003) debido a su alto

poder antioxidante, muy superior al resto de los antioxidantes conocidos tales como -

caroteno, tocoferoles, y vitamina C (Dufossé et al., 2005; Capelli y Cysewski, 2006).

Además, la astaxantina ha demostrado tener efectos positivos en la salud tales como

reducción del estrés oxidativo celular, prevención de procesos inflamatorios, mejoramiento

de la respuesta inmune, reducción del nivel de triglicéridos en la sangre, y prevención de

diversos tipos de cáncer, entre otros (Guerin et al., 2003).

Figura 1-1: Estructura molecular de astaxantina.

Desde un punto de vista comercial, la existencia de una versión sintética de la

astaxantin, ha vuelto el proceso de extracción desde fuentes naturales poco rentable, debido

a que la mayor parte de la industria del salmón se abastece con esta versión sintética

(Olaizola, 2003). Sin embargo, estudios recientes que informan los efectos positivos de la

astaxantina en la salud humana antes mencionados, han abierto un nuevo mercado para la

comercialización del producto de origen natural.

1.2 Producción de compuestos de alto valor agregado de microalga.

La producción de microalgas secas o productos derivados como extractos,

comienza con el cultivo controlado de la microalga favoreciendo la síntesis del producto

deseado, inclusive estresando al microorganismo en alguna etapa de su desarrollo.

Una vez generada una cantidad de biomasa óptima, es necesario efectuar el proceso

de cultivo de la microalga de manera de separarla del caldo de cultivo. Con este fin, se

4

utilizan diferentes operaciones unitarias dependiendo de las características de las

microalgas y las necesidades del proceso. Entre estas técnicas la más habitualmente

implementada es la centrifugación debido a su mayor eficiencia.

En la mayoría de los casos, dado que el producto de interés se encuentra al interior

de las células, una etapa de ruptura debe ser utilizada. En general, métodos de ruptura

mecánica son recomendados debido a la complejidad que presenta la ruptura de este tipo

de microorganismos, destacándose el uso de molinos de bolas y homogenizadores de alta

presión. Una vez efectuada la ruptura de las microalgas se obtiene un homogenato, el cual

en algunos casos puede ser sometido directamente a un proceso de secado para su

comercialización, o en su defecto debe ser procesado de tal forma de obtener un producto

final de alta pureza. Para este último caso, es necesario desarrollar tecnologías adecuadas

para la recuperación de compuestos de alto valor agregado desde las microalgas. En el caso

particular de los carotenoides, como la astaxantina, existen serios inconvenientes a la hora

de su extracción, derivados principalmente de la facilidad con que estos compuestos se

degradan al estar expuestos al oxigeno, luz, y altas temperaturas (Gouveia y Empis, 2003).

Técnicas convencionales para la recuperación de astaxantina de H. pluvialis utilizan

solventes orgánicos (e.g. acetona, hexano), los que presentan baja selectividad; y requieren

procesos posteriores para eliminar trazas de solvente, que exponen los extractos a altas

temperaturas y provoca su isomerización y oxidación con su consecuente degradación.

Además, deben enfrentar las cada vez mayores restricciones puestas al uso de este tipo de

solventes en la producción de sustancias para consumo humano.

Finalmente, sin importar la metodología empleada para recuperar el producto

deseado, este debe ser sometido a un proceso de formulación y estabilización que permita

su posterior comercialización.

1.2.1 Extracción con fluidos supercríticos

La extracción utilizando Fluidos SuperCríticos (FSC) aparece como una alternativa

interesante de ser explorada para superar las carencias que presentan los solventes

5

convencionales en la recuperación de bioproductos específicos desde fuentes naturales y

que sean aptos para el consumo humano. Una gran diferencia de los FSC con los solventes

líquidos convencionales es que su densidad es muy variable con las condiciones de estado,

particularmente cerca del punto crítico en que el fluido es marcadamente compresible, lo

que les otorga un poder solvente variable (Brunner, 1994; del Valle y Aguilera, 1999), y

con ello una selectividad variable. Además, los FSC presentan propiedades intermedias

entre las de los líquidos y gases convencionales, lo que se traduce en que a altas presiones

tienen densidades que se aproximan a la de los líquidos y les otorga alto poder solvente

(ideal para la recuperación de compuestos), y a bajas presiones tienen propiedades de

transportes que se aproximan a la de los gases (baja viscosidad, alta autodifusividad), que

facilitan los procesos de transferencia de masa y reducen los tiempos (Brunner, 1994: del

Valle y Aguilera, 1999). Por otro lado, los FSC permiten una fácil separación entre el

extracto y el solvente por medio de la precipitación del producto de interés al reducir la

presión del sistema, lo que evita recurrir a un cambio de fase para desolventizar el extracto,

etapa que demanda mucha energía al usar solventes líquidos convencionales (Brunner,

1994: del Valle y Aguilera, 1999).

Sumado a lo anterior, el dióxido de carbono (CO2) SuperCrítico (SC) presenta una

serie de ventajas particulares que lo han convertido en el FSC más ampliamente estudiado

como solvente para la extracción de productos de origen natural. Desde un punto de vista

operacional el hecho que la temperatura crítica del CO2 sea cercana a la ambiental (Tc=

31.0 ºC) reduce el daño de compuestos termolábiles como los carotenoides. Por otro lado,

el CO2-SC presenta otras propiedades que lo convierten en un solvente ideal para la

extracción de compuestos bioactivos (Brunner, 1994; del Valle y Aguilera, 1999; Lang y

Wai, 2001): i) es de bajo costo; ii) es inerte, y no se quema ni explota; iii) no es tóxico y no

daña los extractos ni sustratos agotados; y, iv) es muy selectivo para la extracción de

compuestos de alto valor agregado como aceites esenciales, lípidos, y compuestos

lipofílicos seleccionados.

La extracción con CO2-SC puede ser efectuada sobre sustratos sólidos como

corrientes líquidas (Reverchon y De Marco, 2006). Con respecto al proceso usando

6

sustratos sólidos, este consiste en cargar el sólido de interés en un extractor o serie de

extractores por los cuales se hace circular el CO2 para posteriormente, por medio de la

expansión de CO2, precipitar los compuestos extraídos. Este tipo de operación es

eminentemente por lotes, pues cada vez que el sustrato se agota es necesario abrir el

extractor para renovar la materia prima. Por su parte, el procesamiento de corrientes

líquidas haciendo uso de CO2-SC es un proceso continuo donde la mezcla líquida y el

CO2-SC se contactan en una columna a contra-corriente. La Extracción SuperCrítica (ESC)

de Líquidos (L) presenta diversas ventajas frente a ESC de sólidos (ESCS), siendo la más

relevante la posibilidad de fraccionar compuestos que poseen un factor de separación

pequeño debido a las múltiples etapas de equilibrio que se establecen a lo largo de la

columna debido a la naturaleza de contacto a contra-corrientes del proceso, lo cual es

posible en la ESCS, siendo en muchos casos la ESCL la única alternativa para obtener

productos de alta pureza. Desde un punto de vista operacional la ESCL disminuye tiempos

muertos en el uso de equipos al no requerir procesos discontinuos de carga y descarga de

material, además de reducir las pérdidas de CO2 debido a la menor apertura de equipos por

tratarse de un proceso continuo. La Tabla 1-1 muestra una comparación entre ambas ESCL

y ESCS.

En relación a la ESCS son diversas las aplicaciones tanto a nivel de laboratorio

como industrial que utilizan CO2-SC para la recuperación de aceites esenciales, aceites

vegetales, y compuestos de alto valor agregado (e.g. carotenoides, tocoferoles,

flavonoides) desde una amplia gama de materias primas (Reverchon y De Marco, 2006).

Por su parte, la ESCL ha sido mucho menos estudiada, centrándose principalmente en el

fraccionamiento de corrientes oleosas para la purificación de ácidos grasos poli-

insaturados, aún cuando se han efectuado algunas investigaciones en soluciones y

suspensiones acuosas (Anexo A). Sin embargo, sin importar cuál de las dos alternativas de

extracción se use, la selección de condiciones adecuadas de operación (temperatura,

presión, flujo de CO2-SC, tiempo de extracción en el caso de ESCS, flujo de líquido en el

caso de ESCL) es crucial en el resultado del proceso (velocidad de extracción, cantidad de

extracto recuperado, selectividad, entre otros), y dependen principalmente del sustrato o

líquido procesado y el bioproducto que se busca extraer o purificar (Reverchon y De

7

Marco, 2006). Por ejemplo, para el caso de ESCS no siempre las condiciones que

maximizan el rendimiento coinciden con las condiciones de máxima actividad biológica,

posiblemente porque el extracto se diluye con compuestos más solubles, reduciendoce la

pureza.

Tabla 1-1: Comparación entre procesos de Extracción SuperCrítica (ESC) de Sólidos (S) y Líquidos (L).

Criterio ESCS ESCL

Cantidad de solvente usado Alta Baja

Etapas de equilibrio Pocas Varias

Ensuciamiento Poco relevante Problema serio

Factor de separación requerido Alto Bajo

Tipo de Proceso Por lotes Continuo

Los efectos de las condiciones de extracción en el rendimiento y la pureza en

astaxantina del extracto de H. pluvialis dependen principalmente de la solubilidad en el

CO2-SC de los componentes del extracto y de éste como un todo, por un lado, y de la

velocidad del proceso, por el otro (del Valle y Aguilera, 1999). Para cortos tiempos de

proceso el rendimiento está determinado principalmente por la transferencia de masa entre

la matriz sólida y el CO2-SC (factores cinéticos), y por la solubilidad del soluto en el CO2-

SC; pero para tiempos largos de extracción el rendimiento depende de la partición del

soluto entre la matriz sólida y el CO2-SC, y por la transferencia de masa al interior de la

matiz (factores cinéticos). Los parámetros de transferencia de masa externo mejoran al

aumentar la velocidad superficial del solvente, aumentar la temperatura, o disminuir la

presión. Por su parte, la solubilidad generalmente aumenta al aumentar la presión del

sistema (incremento en la densidad y poder solvente del CO2-SC) y la temperatura del

sistema (incremento en la presión de vapor y volatilidad del soluto). Sin embargo, a bajas

presiones el aumento de la volatilidad del soluto al aumentar la temperatura muchas veces

no compensa la disminución en la densidad del CO2-SC, disminuyendo solubilidad al

aumentar la temperatura a presión constante.

8

1.2.2 Extracción supercrítica de microalgas

La ESC de microalgas como sustrato sólido ha sido estudiada por diversos autores

para diferentes especies y bioproductos de interés. El Anexo B presenta una tabla resumen

de algunos de estos estudios. En el caso de la extracción de H. pluvialis distintos

investigadores han evaluado el efecto de las condiciones de operación (Valderrama et a.l,

2003; Machmudah et a.l, 2006; Nobre et al., 2006; Thana et al., 2008), el grados de

ruptura del material (Valderrama et al., 2003; Nobre et al., 2006) y el uso de etanol

(Valderrama et al., 2003; Nobre et al., 2006; Machmudah et al., 2006) como co-solvente

sobre la extracción de astaxantina, carotenoides totales, y extracto total. Los estudios han

mostrado que un aumento en la presión a una temperatura constante (Machmudah et al.,

2006; Nobre et al., 2006; Thana et al., 2008), en la temperatura a una presión constante

(Machmudah et al., 2006; Nobre et al., 2006), y en el flujo (Machmudah et al., 2006),

aumentan la velocidad y rendimiento del proceso. Por su parte, una eficiente ruptura del

material (Valderrama et al., 2003; Nobre et al., 2006) y el uso de co-solvente (Valderrama

et al., 2003; Machmudah et al., 2006; Nobre et al., 2006) también afectan positivamente la

velocidad y rendimiento de extracción.

Sin embargo, como se indicó en la Sección 1.2, la obtención de un sustrato sólido a

partir de un cultivo de microalgas implica un proceso de secado (Valderrama et al., 2003;

Machmudah et al., 2006; Nobre et al., 2006; Thana et al., 2008) que aumenta la

complejidad y el tiempo de ciclo del proceso, por lo que extraer en forma directa una

suspensión de microalgas o restos de microalgas derivado del cultivo o ruptura celular se

presenta como una alternativa interesante de ser considerada, tomando en cuenta las

ventajas mencionadas en la Sección 1.2.1. Sin embargo, como se puede apreciar en el

Anexo A, los esfuerzos de investigación en esta área se han centrado principalmente en la

recuperación de compuestos de menor peso molecular que la astaxantina. No obstante lo

anterior, las patentes de Kanel y Marentis (2000) y Roney et al. (2008), que proponen la

recuperación de caroteno desde una pasta de zanahoria y de una salmuera de la

microalga Dunaliella salina, respectivamente, dan indicios de los posibles beneficios que

9

presentaría efectuar un proceso de ESCL para la recuperación de carotenoides, como la

astaxantina, desde suspensiones acuosas.

1.3 Objetivos

El objetivo de esta tesis consiste en estudiar el efecto que tienen las distintas

condiciones de operación (presión, temperatura) sobre la extracción de un homogenato de

H. pluvialis y comparar estos resultados con los obtenidos a partir de la extracción de un

polvo de esta misma microalga. Para cumplir con dicho objetivo, se plantearon los

siguientes objetivos específicos:

i. Implementar una metodología para el estudio de la extracción de soluciones

acuosas en el equipo de screening de sustratos sólidos con que cuenta el

Laboratorio de Extracción de Materiales Biológicos (LEMaB) del Departamento de

Ingeniería Química y Bioprocesos de la Pontificia Universidad Católica de Chile.

ii. Estudiar a nivel de laboratorio los efectos de presión y temperatura sobre la

extracción de un polvo seco de H. pluvialis.

iii. Estudiar a nivel de laboratorio los efectos de presión y temperatura sobre la

extracción de un homogenato de H. pluvialis y comparar los resultado con los

obtenidos en ii).

10

2. MATERIALES Y METODOS

2.1 Materiales

La materia prima utilizada consistió en polvo seco de H. pluvialis, el cual fue

facilitado por la empresa Atacama Bionatural Products S.A. (Iquique, Chile). Para evitar su

degradación, las muestras fueron almacenada en bolsas de aluminio selladas a vacío y

almacenadas a -15 ºC hasta ser usadas.

El solvente de extracción supercrítica fue CO2 de grado alimenticio con un 99.8%,

adquirido a la empresa AGA S.A. (Santiago, Chile). El nitrógeno utilizado para el secado

de las muestras fue adquirido a esta misma empresa. Para la extracción con acetona y la

medición espectrofotométrica de contenido de astaxantina en las muestras se utilizó

acetona grado HPLC marca J.T. Baker adquirida en LabTec Ltda. (Santiago, Chile).

2.2 Análisis de materia prima

Para determinar la cantidad total de extracto presente en el polvo seco de H. pluvialis

se procedió a extraer 10 mg de polvo en un tubo ependorff con 1 ml acetona como solvente

de extracción recuperando el sobrenadante obtenido, previa centrifugación a 6400 RPM

por 2 minutos. El procedimiento se repitió 6 hasta que el polvo de H. pluvialis quedo

completamente decolorado. Luego se tomaron 3 cm3 del sobrenadante acumulado los que

fueron colocados en un vial previamente pesado para posteriormente desolventizar el

extracto en atmósfera de nitrógeno y con ello determinar la cantidad total de extracto en la

microalga. Paralelamente, se tomaron 2 cm3 del sobrenadante total a los cuales se les

efectuó análisis espectrofotométrico para determinar el contenido de astaxantina (Sección

2.4).

Por otro lado, para medir la humedad del extracto, se tomaron 3 g de polvo seco, los

cuales se secaron en un horno a 105 ºC hasta peso constante (del Valle et al., 2003).

11

2.3 Extracción supercrítica

Las extracciones con CO2 supercrítico se efectuaron utilizando el sistema de

extracción SFE-1L de Thar Designs (Pittsburgh, PA, EE.UU) con que cuenta el

Laboratorio de Extracción de Materiales Biológicos (LEMaB) de la Pontificia Universidad

Católica de Chile (Santiago, Chile). En este sistema (Figura 2-1) el CO2 proveniente del

cilindro pasa por un chiller que lo enfría hasta 0 ºC asegurando el estado líquido del fluido

antes de ingresar a la bomba de doble pistón modelo P-200 que se encarga de presurizar el

sistema y hacer circular el CO2 a través del extractor cargado con la muestra. Por su parte,

el extractor se encuentra al interior de un horno calefactor a temperatura controlada y que

se encarga de mantener el CO2 que ingresa al extractor a la temperatura de extracción

deseada. Luego, a la salida del sistema, se encuentra un BPR (del inglés Back Pressure

Regulator) que consiste en una válvula de aguja de alta precisión controlada por un

controlador PID el que permite mantener la presión de extracción del sistema. Finalmente,

el sistema cuenta con una válvula de seis vías y dos posiciones que posibilita efectuar un

análisis cinético del proceso de extracción al poder conectar dos viales de muestreo al

mismo tiempo.

El procedimiento de extracción consistió en cargar un extractor de 50 cm3 (22 mm

de diámetro interno) con la muestra a extraer (homogenato o polvo seco) y el volumen

vacío llenado con esferitas de vidrio. Para la extracción de homogenato la muestra cargada

correspondió a 4 g de una mezcla al 25% p/p de polvo de microalga con agua, lo que

equivale a cargar 1 g de microalga. Por su parte, para la extracción de la muestra sólida se

procedió a cargar una mezcla de 1 g de microalga con 1.5 g de tierra de diatomeas. El uso

de las tierras de diatomeas se debió a la existencia de un problema de aglomeración del

material al ser cargado sólo en el extractor, lo cual se puede evitar agregando

coadyuvantes de filtración que reducen la humedad y mejoran la porosidad del lecho

(Hopper y King, 1992). Una vez cargado el extractor con la muestra respectiva se procedió

a colocarlo en el horno calefactor para llevar la temperatura del sistema a la deseada de

extracción, la cual fue mantenida durante todo el proceso (± 1 ºC). Una vez alcanzada la

temperatura de extracción la presión fue incrementada lentamente hasta lograr la presión

12

de proceso la que fue mantenida a lo largo de la extracción (±1 MPa). La metodología

anteriormente expuesta fue validada para asegurar reproducibilidad de los datos (Anexo

C). El efecto de la presión fue medido a 350, 450, y 550 bar y el de la temperatura a 40 y

70 ºC. En todos los casos el flujo de CO2 utilizado fue de 10 g/min. En cada extracción se

tomaron muestras periódicas de extracto en viales de vidrio pre-pesado (22 cm3) envueltos

en papel de aluminio. Para el caso de homogenato las muestras se recolectaron cada 1 hora

durante un tiempo total de extracción de 10 horas aproximadamente, mientras que para el

sólido seco las muestras se tomaron en intervalos de tiempo variable para un periodo total

de extracción de 4.5 horas aproximadamente. Finalmente, los extractos obtenido se

almacenaron en oscuridad a -15 ºC hasta su análisis. La medición del extracto recuperado

en cada intervalo de tiempo se efectuó por procedimiento gravimétrico pesando el vial

antes y después de la extracción. Por otro lado, el contenido de astaxantina de cada muestra

se determinó espectrofotométricamente (Sección 2.4).

Figura 2-1: Diagrama del equipo de extracción.

13

2.4 Medición de astaxantina por espectrofotometría

La cantidad total de astaxantina en la muestra expresada como contenido de

astaxantina fue medida por espectrofotometría en acetona (Goodwin y Srisukh, 1949) en

un equipo Hach modelo dr/2000 (Loveland, CO, EE.UU). Para efectuar la medición, el

extracto recuperado en cada uno de los viales fue resuspendido en 5 cm3 de acetona de los

cuales se tomaron volúmenes de entre 150 a 1400 L dependiendo de la concentración de

la muestra y posteriormente aforados hasta un volumen de 20 cm3. El volumen tomado de

cada muestra fue considerado adecuado si la absorbancia de la suspensión aforada se

encontraba entre 0.1 a 0.9 AU al ser medida a una longitud de onda de 470 nm (Mendes-

Pinto et al., 2001). Finalmente, la concentración de astaxantina en el volumen de 20 cm3 se

estimó utilizando la ecuación (2.1):

1

1

10cmE

Ax (2.1)

donde x es la concentración de astaxantina (mg/mL), A es la absorbancia medida, y E1cm1

es el coeficiente específico de extinción óptica que toma el valor de 2100 para astaxantina

en acetona (Mendes-Pinto et al., 2001).

14

3. RESULTADOS Y DUSCUSIÓN

De la extracción con acetona del polvo seco de Haematoccocus pluviales se obtuvo

que 1.92% del peso seco corresponde a astaxantina y 32% del peso seco a oleorresina

extraíble. Por otro lado, el polvo de microalga utilizado poseía una humedad de 4%.

3.1 Extracción supercrítica de polvo de H. pluvialis

Las curvas cinéticas de oleorresina (g de oleorresina/g microalga, R) y de

astaxantina (mg oleorresina/g microalga, y) obtenidas para la extracción de sustrato sólido,

se presentan en las Figura 3-1 en función del consumo específico de CO2 (kg de CO2/g

microalga, F), mientras que los datos numéricos se encuentran en el Anexo D. Una

comparación de las curvas obtenidas tanto para la extracción de oleorresina como

astaxantina con curvas cinéticas obtenidas por otros autores para sustratos similares usando

CO2-SC, permite concluir que existe consistencia en la forma de las curvas, es decir, la

presencia de una o dos regiones iniciales de extracción a tasa constante, las cuales están

determinadas por factores de equilibrio entre el soluto-matriz-CO2, y una segunda región

de tasa variable, y que está limitada principalmente por factores cinéticos de transferencia

de masa. Los factores de equilibrio que afectan la velocidad de la extracción están

representados por la isoterma de adsorción del soluto entre la fase sólida y el CO2-SC, y

por la solubilidad máxima del soluto en el CO2, ambos factores dependientes de la presión

y temperatura del sistema (Sovová, 2005; Oliveira, et al., 2003). Por su parte, los factores

de transferencia de masa están relacionados con la velocidad a la cual ocurre la

transferencia del soluto en la fase sólida desde el interior de la partícula a la superficie de

la misma, y por su posterior transferencia desde este punto al CO2-SC. Estos parámetros

mejoran al aumentar la temperatura o disminuir la presión (del Valle y de la Fuente, 2006).

Al aplicar los conceptos anteriores a las curvas cinéticas obtenidas, podemos

observar que en todos los casos efectivamente existe una zona de extracción inicial a tasa

constante la cual varía según las condiciones de extracción (Presión, P; Temperatura, T).

Al comparar curvas obtenidas a igual temperatura se aprecia que un incremento en la

presión se traduce en un aumento en la pendiente inicial de la curva de extracción (Tabla 3-

15

1), indicando que tanto la solubilidad de la oleorresina como de la astaxantina se ven

favorecida por un aumento de la presión. Este fenómeno es esperable debido a que un

incremento en la presión produce un aumento en la densidad del CO2-SC lo que conlleva a

un aumento en su poder solvente.

Figura 3-1: Cinéticas de extracción de sólido en condiciones isobáricas. Las curvas

verdes en la figura muestran las cinéticas de extracción de oleorresina y las curvas rojas las

de astaxantina.

16

Tabla 3-1: Solubilidad de astaxantina (105×g astaxantina/g CO2). Solubilidad

medida como la pendiente de la zona inicial de las curvas de extracción bajo las mismas

condiciones de operación.

T (ºC)/P (bar) 350 450 550

70 1.73 3.32 6.51

40 1.48 1.94 3.58

Por otro lado, para comparar extracciones a una misma presión de extracción se

debe tener en cuenta que esta variable puede tener un efecto positivo o negativo sobre la

solubilidad de un soluto en CO2 dependiendo de la presión del sistema. Este efecto

contrario se basa en el hecho de que un incremento en la temperatura, si bien produce una

reducción en la densidad del solvente y con ello una disminución de su poder solvente, al

mismo tiempo aumenta la presión de vapor y volatilidad del soluto lo que se traduce en un

mayor traspaso a la fase fluida. Por lo tanto, cuando el efecto sobre la reducción de la

densidad es menos fuerte que el aumento en la volatilidad del soluto, un incremento en la

temperatura se traduce en un aumento en la solubilidad, sucediendo lo contrario si el efecto

sobre la densidad es más fuerte que el de la volatilidad. Lo anterior, implica que existe una

presión a la cual a diferentes temperaturas la solubilidad del soluto en CO2 es la misma

(punto de cross-over), cumpliéndose que por sobre esta presión un incremento en la

temperatura tiene un efecto positivo en la solubilidad del soluto en CO2, mientras que bajo

esta presión se observa el efecto contrario. Al contrastar las curvas de extracción obtenidas

a una presión constante, es posible concluir que la temperatura en todos los casos

incrementa la pendiente de la zona inicial de la curva de extracción, o dicho de otro modo,

tiene un efecto positivo sobre la solubilidad del soluto en el CO2 (Figura 3-1, Tabla 3-1).

Es interesante destacar que al efectuar esta comparación a presiones cada vez menores las

distancias entre las curvas en la región controlada por solubilidad son cada vez menores, es

decir, las pendientes de la primera zona de extracción son cada vez más parecidas, lo que

implica que la solubilidad del soluto bajo dichas condiciones son similares, por la mayor

cercanía del sistema a la presión de cross-over. Lo anterior, coincide con lo publicado por

diversos autores, quienes han observado que el punto de cross-over de diferentes

compuestos en CO2 se encuentra generalmente a bajas presiones, en particular para

carotenoides bajo los 300 bar (Jay et al., 1991; de la Fuente et al., 2006).

17

No obstante lo anterior, al comparar la solubilidad de astaxantina reportada por de la

Fuente et al. (2006) a P = 350 bar y T = 40 ºC con la pendiente de la zona inicial de

extracción bajo estas misma condiciones, se observa que la solubilidad operacional es

aproximadamente 4 veces superior a la solubilidad termodinámica. Esta desviación de la

solubilidad estimada con respecto a la solubilidad reportada en literatura se puede deber a

dos fenómenos: (i) La presencia de astaxantina esterificada por sobre astaxantina sin

esterificar (Miao et al., 2006; Lorenz y Cysewski, 2000); (ii) Interacción existente entre los

diferentes componentes de la mezcla compleja que forman el extracto (Lucien y Foster,

2000). Según Lorenz y Cysewski (2000), Haematococcus pluvialis puede llegar a tener un

95% de su astaxantina en forma esterificada formando tanto mono- (70%) como diésteres

(25%). Desde el punto de vista de la solubilidad en CO2, si bien, la esterificación de esta

molécula produce un incremento en su peso molecular, lo cual afecta negativamente la

solubilidad del compuesto en CO2, la reacción de esterificación implica la incorporación de

cadena alifática a la molécula (Anexo E), lo que tendería a disminuir la polaridad de la

sustancia y con ello probablemente incrementar su solubilidad en CO2, por lo que la suma

de los dos efectos contrarios dará como resultado que la solubilidad del éster de astaxantina

difiera de la solubilidad de la astaxantina libre. El efecto de la esterificación de

carotenoides sobre la solubilidad en CO2 puede ser observado al comparar los resultado

reportados por Jay et al. (1991) en solubilidad de luteína libre con los reportados por

Naranjo-Modad et al. (2000) para la solubilidad de esteres de luteína. De éstos es posible

observar que, por ejemplo, a P = 280 bar y T = 40 ºC la solubilidad de luteína libre es

aproximadamente el doble que la de los ésteres de luteína. En relación a la interacción

entre compuestos, ésta generalmente tiende a reducir la solubilidad de los solutos con

respecto a los valores de solubilidad medidos para sustancias puras. Sin embargo, puede

darse el caso que algunos compuestos presentes en la matriz actúan como co-solventes

favoreciendo la extracción de otros solutos debido a la fuerte interacción soluto-soluto

existente (Lucien y Foster, 2000). Por lo tanto, la suma de los dos fenómenos

mencionados anteriormente puede ser la responsable de que, bajo las diferentes

condiciones de extracción estudiadas, la solubilidad de astaxantina medida como la

pendiente de las curvas difiera de los datos reportados en la literatura.

18

La Tabla 3-2 presenta los resultados obtenidos en este trabajo para el extracto total

con los reportados por Machmudah et al. (2006) para la extracción de astaxantina a partir

de H. pluvialis. En esta tabla es posible observar que los efectos de presión y temperatura

descritos anteriormente coinciden con los observados por Machmudah et al. (2006); es

decir, incrementos en ambos factores favorecen la extracción tanto de oleorresina como

astaxantina, lográndose la mejor condición de extracción a P = 550 bar y T = 70 ºC. Sin

embargo, un análisis más detallado de los resultados permite observar diferencias

importantes entre ambos estudios en lo que se refiere a extracción de astaxantina y cinética

del proceso.

Tabla 3-2: Resultados obtenidos en este trabajo y los reportados por

Machmudah et al. (2006) para la extracción de H. pluvialis. En esta tabla R representa

la recuperación de oleorresina (g oleorresina/g microalga) y Ra la recuperación de

astaxantina (g astaxantina/g astaxantina inicialmente en la muestra).

En relación al primer punto, podemos ver que el máximo rendimiento de

recuperación de astaxantina obtenido por Machmudah et al. (2006) es casi un 29% mayor

al encontrado en este trabajo, lo cual puede estar relacionado con el uso de materias primas

diferentes con distinto grado de ruptura celular y que se ha demostrado tiene un efecto

crítico sobre los rendimientos de extracción (Valderrama et al., 2003; Nobre et al., 2006).

Por otro lado, al contrarrestar más detalladamente el efecto de la temperatura de extracción

reportado por Machmudah et al. (2006), se aprecia que a una temperatura de 70ºC un

Este trabajo

Presión (bar) 350 450 550

Temperatura

(ºC) R Ra R Ra R Ra

40 16.71 51.72 17.86 51.99 21.31 58.11

70 18.71 51.71 18.34 56.86 21.88 60.75

Machmudah et al. (2006)

Presión (bar) 300 400 500 550

Temperatura (ºC) R Ra R Ra R Ra R Ra

40 - - - - - - 13 15

70 15.5 15.5 15 16 16 15 22 78

19

incremento de la presión de 500 a 550 bar aumenta en aproximadamente 4 veces el

rendimiento de la extracción de astaxantina, observándose una diferencia similar al

incrementar la presión desde 400 a 550 bar, lo que indica que algo similar debiese suceder

al incrementar la presión desde 450 a 550 bar. Sin embargo, en este estudio, al efectuar

dicho cambio de presión se puede constatar que el efecto es mucho menor (Tabla 3-2) al

que se esperaría obtener. Un comportamiento similar ocurre al comparar los rendimientos

de extracción de astaxantina a 550 bar con un incremento de temperatura de 40 ºC a 70 ºC.

Estas importantes diferencias observadas entre ambos estudios pueden deberse a que en los

experimentos efectuados por Machmudah et al. (2006) la cantidad de CO2 utilizado por

masa de muestra es muy baja (F=0.05 kg CO2/g de microalga), por lo que probablemente

en muchos de los casos, especialmente a bajas presiones y temperatura donde la

solubilidad de los compuestos es menor, las mediciones fueron detenidas cuando aún el

proceso se encontraba regido por factores de equilibrio, registrándose por esto grandes

saltos en los rendimientos de recuperación de astaxantina. Lo anteriormente expuesto se ve

respaldado por los resultados obtenidos por Thana et al. (2008), quien utilizó un flujo de

especifico de CO2 14 veces superior al de Machmudah et al. (2006) registrando a P = 500

bar y T = 40 ºC una recuperación de astaxantina del 79%, lo que es considerablemente

mayor a lo reportado por Machmudah et al. (2006) y mucho más consistente con los

valores de recuperación de astaxantina obtenidos en este trabajo. El mayor rendimiento

reportado por Thana et al. (2008) en comparación al presentado en este informe, puede

deberse a que al uso de una materia prima con un menor grado de ruptura que la utilizada

por Thana et al. (2008).

Respecto a las diferencias en las cinéticas de extracción reportadas por Machmuda

et al. (2006) con las presentadas en la Figura 3-1, se concluye que las velocidades de

extracción medidas en este trabajo son menores para todas las condiciones reportadas

tanto para la recuperación de oleorresina como de astaxantina. Este fenómeno puede estar

relacionado al uso de materias primas distintas con diferente grado de ruptura celular, que

se ha demostrado tiene una fuerte influencia sobre la extracción (Valderrama et al., 2003;

Nobre et al., 2006). El efecto del grado de ruptura celular fue considerado por Sovová

(2005) al plantear su modelo de simulación de procesos de extracción de tejidos usando

20

CO2-SC. Este modelo considera la existencia de dos tipos de células en el sistema, unas

“rotas” cuyo soluto es de libre acceso al CO2 y otras “no rotas” cuyo soluto debe enfrentar

un proceso de transferencia de masa interna para poder ser extraído. Según este modelo el

proceso de extracción está controlado por factores de equilibrio (región de extracción

rápida) hasta que todo el soluto de las células rotas ha sido removido. Por lo tanto, un

material sometido a una mejor ruptura celular presentará una cinética de extracción más

rápida que un material con más baja ruptura, que es lo que pareciera ocurrir en este caso.

Finalmente, es interesante evaluar la pureza de los extractos obtenidos, ya que no

siempre las condiciones de mejor rendimiento de extracción coinciden con la de mayor

concentración del compuesto bioactivo en el extracto. La Tabla 3-3, presenta las purezas

de los extractos obtenidos al final del proceso de extracción bajo las diferentes condiciones

evaluadas. En ella se aprecia que la condición a la cual se logra la mayor pureza de

extracto es P = 450 bar y T = 70 ºC, la cual no coincide con la condición de mayor

rendimiento de extracción que es P = 550 bar y T = 70 ºC (Tabla 3-2). Por otro lado, la

máxima pureza obtenida en este estudio es aproximadamente la mitad de la reportada por

Machmudah et al. (2006), lo cual puede deberse a la presencia de una mayor cantidad de

astaxantina en la muestra procesada en sus estudios (3.43% p/p) con respecto a la usada en

este trabajo (1.92% p/p)

Tabla 3-3: Pureza de extractos (100 × g astaxantina/g oleorresina) de

polvo de H. pluvialis

T (º C)/P (bar) 350 450 550

40 5.95 5.60 5.24

70 5.31 5.96 5.34

3.2 Extracción supercrítica de homogenato de H. pluvialis

Las curvas cinéticas de oleorresina (g de oleorresina/g de sustrato, R) y de

astaxantina (mg oleorresina/g de sustrato, y) obtenidas para la extracción de homogenato se

presentan en la Figura 3-2 en función del consumo específico de CO2 (kg de CO2/g

microalga, F), mientras que los datos numéricos se encuentran en el Anexo F. Es fácil

21

apreciar que las curvas cinéticas tanto de oleorresina como de astaxantina presentan una

forma sigmoidal, a diferencia de lo sucedido con la extracción de sustrato sólido. Este tipo

de curvas se caracterizan por un primera zona de extracción lenta a velocidad creciente,

luego una zona de extracción a tasa constante, para concluir con una zona de extracción a

velocidad decreciente. Las curvas cinéticas reportadas en literatura para la extracción de

diferentes compuestos a partir de sustratos biológicos, presentan en su mayoría la forma de

las curvas reportadas en la Figura 3-1 para sustrato sólido, es decir, una primera región de

extracción a tasa constante y una segunda a tasa decreciente. Sin embargo, en algunos

casos particulares al utilizar co-solventes, se ha visto un pequeño retardo en la tasa inicial

de extracción dando origen a curvas sigmoidales como las observadas para la extracción de

homogenato. Sun y Tamelli (2006) al utilizar aceite de canola como co-solvente para la

extracción de zanahoria, registra curvas de extracción de oleorresina que presentan un

pequeño retardo inicial en la tasa de extracción. Por otro lado, Cocero y García (2001)

registran este mismo fenómeno durante la extracción de aceite de semillas de girasol al

usar diferentes alcoholes como co-solvente. Según Cocero y García (2001), la explicación

de este retardo en la curva de extracción se debería al proceso de desorción del soluto

desde la matriz, ocurriendo el fenómeno cuando el coeficiente de transferencia de masa

desde la superficie del sólido al fluido es pequeño. Por lo tanto, es posible que el agua

presente en el homogenato entorpezca la transferencia de masa hacia la fase supercrítica, lo

que explicaría el retardo en la curva de extracción. Por otro lado, la presencia de una larga

región a tasa de extracción constante indica que el proceso de extracción se encuentra

limitado principalmente por la solubilidad de los solutos en el fluido.

22

Figura 3-2: Cinéticas de extracción de homogenato en condiciones isobáricas.

Las curvas verdes en la figura muestran las cinéticas de extracción de oleorresina y las

curvas rojas las de astaxantina.

En cuanto al efecto de la presión de extracción sobre las curvas de extracción, es

posible apreciar que a una temperatura constante un incremento en la presión tiene un leve

efecto sobre el rendimiento de extracción de oleorresina, pero sin presentar un patrón claro

de variación, pues a 40 ºC el efecto es siempre positivo pero a 70 ºC el efecto es variable

(Figura 3-2, Tabla 3-4). Por otro lado, al comparar los resultados de extracción de

astaxantina, es posible apreciar que a 40º C no existe un patrón definido de respuesta,

mientras que a 70º C un aumento en la presión tiene efecto ligeramente negativo. La

23

existencia de patrones no definidos al variar la presión del sistema es un fenómeno que

también fue reportado por Green y Akergman (1996) al estudiar la extracción de

contaminantes de suelo a partir de una pasta acuosa, obteniendo máximos rendimientos de

extracción a presiones inferiores a la máxima. Según los autores el fenómeno se debe a la

forma dispar en que afecta la presión la partición del soluto entre la fase sólida y el agua, lo

que puede estar ocurriendo para el caso de la astaxantina.

Tabla 3-4: Resultados obtenidos al final del proceso de extracción de

homogenato. En esta tabla R representa la recuperación de oleorresina (g oleorresina/g

microalga) y Ra la recuperación de astaxantina (g astaxantina/g astaxantina

inicialmente en la muestra).

Presión (bar) 350 450 550

Temperatura (ºC) R Ra R Ra R Ra

40 12.52 39.16 13.29 50.68 13.61 48.84

70 20.81 54.84 19.90 54.19 22.71 48.45

Por otro lado, de las curvas de extracción de oleorresina es posible apreciar que a

una presión de extracción constante un incremento en la temperatura aumenta el

rendimiento de extracción de oleorresina en forma importante (Figura 3-2, Tabla 3-4), lo

cual sumado al leve efecto que tiene la presión de extracción sobre el rendimiento, parece

indicar que la variación en la volatilidad de los solutos tiene mayor relevancia que los

cambios en la densidad del CO2 sobre la solubilidad de la oleorresina en el CO2. En cuanto

a la extracción de astaxantina, se observa que existe un efecto positivo de la temperatura

sobre el rendimiento de extracción, el cual es altamente dependiente de la presión de

extracción, siendo más fuerte su efecto a presiones más bajas (Tabla 3-4). Esta interacción

entre presión y temperatura sobre la extracción es un resultado no esperado considerando

que el proceso está controlado por la solubilidad en el CO2, ya que para carotenoides la

solubilidad presenta saltos mayores con cambios en la temperatura a medida que la presión

de comparación aumenta, pues existe un alejándose de la temperatura de cross-over (Jay et

al., 1991; de la Fuente et al., 2006). Sin embargo, al ser este un sistema multicomponente

complejo la solubilidad medida para un sistema binario soluto-CO2 no es completamente

24

aplicable, debido a que las condiciones de presión y temperatura no sólo afectan la

solubilidad de los compuestos en el CO2 sino que también en el agua, y es posible que se

establezcan interacciones soluto-soluto que no observadas en sistemas binarios (Lucien y

Foster, 2000).

En cuanto a la pureza de los extractos obtenidos (Tabla 3-5), podemos observar que a

menores temperaturas es posible obtener extractos más ricos en astaxantina, mientras que

pareciera existir una presión intermedia entre 350-550 bar a la cual se alcanza un óptimo

de pureza. Para el caso de las condiciones evaluadas en este estudio, la mayor pureza de

extracto (6.77%) se logra a P = 450 bar y T = 40ºC.

En resumen, considerando los efectos anteriormente descritos de presión y

temperatura sobre la extracción de homogenato, se tiene que el mayor rendimiento para la

extracción de oleorresina (22.7%) se obtiene a P =550 bar y T = 70ºC, mientras que la

mayor recuperación de astaxantina (54.84%) se registra a P = 350 bar y T = 70 ºC (Tabla

3-5). Por su parte, la condición para lograr un extracto más rico en astaxantina (6.77%) es a

P = 450 bar y T = 40ºC.

Tabla 3-5: Pureza de extractos (100 × g astaxantina/g oleorresina) de homogenato de

H. pluvialis.

T (ºC)/P (bar) 350 450 550

70 4.73 4.88 3.87

40 5.65 6.77 6.54

3.3 Comparación extracción de sólido con extracción de homogenato

Al comparar las curvas de extracción obtenidas para sólidos y para homogenato es

fácil darse cuenta que las tasas de extracción para homogenato son mucho menores a las de

sólido, requiriéndose un consumo especifico de CO2 mucho mayor para conseguir igual

rendimiento de extracción, o visto de otra forma, se logran rendimientos de extracción

mucho menores para un mismo consumo específico de CO2. La Tabla 3-6 muestra este

fenómeno, al presentar un factor que representa la masa de astaxantina recuperada por

25

masa de CO2 consumida (G), apreciándose claramente que para todos los casos este valor

es mayor para extracción de sólidos respecto de homogenato. Por lo tanto, es posible

concluir que el agua presente en el homogenato tiene un efecto negativo sobre la

solubilidad de los solutos en la fase supercrítica independiente de las condiciones de

extracción reportadas en este estudio.

Tabla 3-6: Factor de productividad (G). La tabla muestra el factor G (mg

astaxantina/kg CO2) que relaciona la masa de astaxantina recuperada por masa de CO2

consumido en el proceso de extracción total bajo las diferentes condiciones estudiadas.

P (bar) 350 450 550

T (ºC) Homogenato Sólido Homogenato Sólido Homogenato Sólido

70 1.75 3.98 1.73 4.37 1.55 4.67

40 1.25 3.98 1.62 4.00 1.56 4.47

No obstante lo anterior, si bien la velocidad a la que ocurre el proceso de extracción

es una variable importante, pues esta determina el consumo de CO2, la obtención de

extractos de mayor pureza podría contrarrestar este efecto negativo, debido a la mayor

valorización de estos productos en el mercado. Al comparar las purezas de los extractos

finales obtenidos tanto para sustrato sólido (Tabla 3-3) como para homogenato (Tabla 3-5)

podemos observar que las dos mayores purezas de extracto se alcanzan al extraer

homogenato a P = 450 bar; T = 40 oC y P = 550 bar; T = 40

oC, con valores de 6.77% y

6.35% respectivamente. Sin embargo, la recuperación de astaxantina por masa de CO2

consumida es muy baja para estas dos condiciones siendo de 1.62 y 1.56 respectivamente.

Por su parte, si bien la extracción de sustrato sólido presenta una recuperación de

astaxantina por masa de CO2 2-3 veces mayor, la mayor pureza alcanzada es de un 5.96%,

valor inferior al registrado para extracción de homogenato. Por lo tanto, aún cuando la

extracción de homogenato retarda el proceso de extracción, en algunos casos tiene la

ventaja de generar extractos finales de mayor pureza que en la extracción de sustrato

sólido.

Lo anteriormente expuesto queda respaldado por la Figura 3-5, que permite observar la

condición a la cual se obtiene un extracto de mayor pureza para una misma recuperación

26

de oleorresina. En forma práctica, un extracto que se encuentre más alejado del eje de las

abscisas que otro para una misma recuperación presentará una mayor pureza del

compuesto deseado. La ventaja de esta figura es que permite comparar la evolución en la

pureza del extracto conforme se va recuperando oleorresina desde el sustrato. Una primera

conclusión que se deriva del gráfico es que a medida que transcurre la extracción, para

todos los casos la cantidad de astaxantina que se extrae en relación a la oleorresina total va

aumentado (pendiente creciente) lo que puede estar sucediendo por una mayor solubilidad

de los compuestos de oleorresina en CO2, lo que implica que se alcanza más rápidamente

la fase controlada por transferencia de masa o el CO2 deja de salir saturado de la mayoría

de los compuestos de la oleorresina, mientras que la extracción de astaxantina aún se

encuentra en la etapa controlada por solubilidad y abandona saturado el extractor. Sumado

a lo anterior, se puede observar que para el caso de extracción de homogenatos la

composición del extracto permanece constante por un periodo de extracción mucho más

prolongado que para el caso de extracción de microalga seca, lo que refuerza el efecto

negativo del agua sobre la solubilidad de oleorresina y astaxantina en CO2, ya que el

sistema permanece por un periodo más largo de extracción controlado por solubilidad

saliendo saturado de ambas “solutos”.

Finalmente, al comparar las curvas de extracción obtenidas con la recta que se

obtendría si el extracto recolectado tuviese en todo momento la composición presente en la

microalga (1.92% del peso seco de astaxantina; 32% peso seco de oleorresina), es posible

constatar que la mayor parte de las curvas pasan por debajo de esta recta, lo que indica que

la recuperación de oleorresina se ve favorecida por sobre la de astaxantina. Sin embargo,

para la extracción de homogenato a P = 450 bar; T = 40 oC se tiene que en todo momento

la pureza del extracto obtenido es igual o superior a la composición de la microalga, lo cual

es un fenómeno interesante, ya que indica que el agua mejora la selectividad del proceso de

extracción.

27

Figura 3-3: Comparación pureza de extractos. Las figuras sólidas (negras)

corresponden a homogenato y las figuras huecas (rojas) a sólido. Las pendientes de las

curvas permiten obtener las purezas de los extractos a medida que se va recuperando

oleorresina.

28

4. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES

4.1 Conclusiones

De los resultados obtenidos en este trabajo se derivan las siguientes conclusiones:

Es factible efectuar un proceso de extracción por lotes para recuperar astaxantina a

partir de un homogenato de la microalga Haematococcus pluvialis utilizando como

medio solvente CO2 supercrítico.

Para el caso de extracción de Haematoccocus pluvialis como sustrato sólido, y

dentro del rango de presiones (P = 350-550 bar) y temperaturas (T = 40-70 ºC)

estudiados, tanto el rendimiento de oleorresina como de astaxantina se ven

favorecidos por un aumento de la temperatura y presión del proceso, lo cual

concuerda con lo reportado por otros autores, siendo la mejor condición de

extracción, en cuanto a recuperación de astaxantina (60.8%), P = 550 bar y T =

70ºC, y en cuanto a pureza final del extracto (5.96%), P = 450 bar y T = 70ºC . Por

lo tanto, no existe una única condición óptima de extracción, sino que la elección

de condiciones de operación adecuadas dependerá del producto final esperado,

siendo esto un compromiso entre rendimiento, pureza, y tiempo de proceso.

Para el caso de extracción de un homogenato de Haematoccocus pluvialis, y dentro

del rango de presiones (P = 350-550 bar) y temperaturas (T = 40-70 ºC) estudiados,

el efecto de la presión sobre los rendimientos de extracción de oleorresina y

astaxantina no presentan una tendencia clara, lo cual es consistente con lo

publicado por otros autores para la extracción por lotes de suspensiones acuosas.

Por su parte, un incremento en la temperatura de extracción presenta un efecto

positivo tanto en el rendimiento de extracción de oleorresina como de astaxantina,

siendo para este último caso el efecto altamente dependiente de la presión de

extracción. De los resultados reportados se establece que la condición de extracción

de astaxantina más favorable en relación a la recuperación obtenida es P = 350 bar

y T = 70 ºC con una recuperación de 54.4%, mientras que si se desea alta pureza la

mejor condición es P = 450 bar y T = 40 ºC con un pureza de extracto de 6.77%.

29

Por lo tanto, al igual que lo ocurre para la extracción de sustrato sólido, la mejor

condición de extracción depende del resultado final que se desea obtener.

El agua presente en el homogenato afecta negativamente la solubilidad de la

oleorresina y astaxantina en CO2, lo que se traduce en procesos de extracción más

lentos en comparación a la extracción de microalga seca, requiriéndose un mayor

consumo específico de CO2 para lograr un mismo rendimiento de extracción. Por

otro lado, la presencia de agua hace que se generen diferencias más marcadas en la

pureza de los extractos obtenidos que para el caso de un sólido seco. Además, el

agua no sólo afecta en forma importante la cinética de extracción por reducir la

solubilidad de los compuestos en el CO2, sino que también genera un retardo inicial

en el proceso que se traduce en la obtención de curvas sigmoidales.

4.2 RECOMENDACIONES

A partir de los resultados obtenidos en este estudio y el análisis efectuado se derivan

una serie de recomendaciones:

En relación a lo observado para la extracción de sustrato sólido se recomienda

(i) Medir el efecto de la presión y temperatura sobre la solubilidad de ésteres de

astaxantia en CO2-SC; (ii) Determinar las isotermas de sorción de astaxantina

entre la microalga y el CO2-SC; y, (iii) Modelar la cinética de extracción de

astaxantina desde la microalga seca utilizando el modelo propuesto por Sovová

(2005).

Derivado de la metodología desarrollada para extraer un homogenato en un

extractor, se recomienda (i) Presurizar lentamente el sistema de filtración para

evitar que la muestra sea impulsada al gradiente de presión establecido al

principio del proceso; (ii) Evitar llenar el extractor con homogenato por sobre la

mitad de su capacidad, pues sobre este límite se suelen presentar problemas de

taponamiento de los filtros por el desplazamiento del fluido; (iii) Calefaccionar

la salida del sistema luego del BPR para evitar taponamiento por la formación

de hidratos; (iv) Utilizar algún material inerte (e.g esferitas de vidrio) para

30

evitar la canalización del flujo de CO2; (v) Diseñar un sistema que permita

recuperar el agua extraída con el fin de registrar la cinética de extracción de

agua y entender mejor su efecto sobre el proceso..

En relación al proceso de extracción de homogenato y con el fin de comprender

mejor los fenómenos observados se recomienda (i) Determinar el equilibrio de

fase del sistema ternario agua-CO2-ésteres de astaxantina; y (ii) Estudiar la

partición de los ésteres de astaxantina para el sistema ternario microalga-agua-

CO2.

31

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37

ANEXOS

ANEXO A: Estudios publicados sobre fraccionamiento y extracción de corrientes

líquidas usando CO2-SC

Proceso Referencia

Desacidificación de aceite vegetal Fornari et al. (2008)

Extracción/enriquecimiento de tocoferoles de aceite

destilado deodorizado

Fornari et al. (2008)

Concentración de tococromanoles de aceite de palma Gast et al. (2005)

Recuperación de escualeno a partir de aceite de oliva

deodorizado

Fornari et al. (2008)

Fraccionamiento de etil esteres de ácidos grasos Fleck et al. (1998)

Remoción de esteres de ácidos grasos de mezcla de

reacción

Chuang y Brunner

(2006).

Remoción de compuestos sin reaccionar y sub-

productos de una reacción enzimática

Eller et al. (2008)

Fraccionamiento de aceite de pescado incluyendo

mezclas CO2 + etanol

Catchpole et al. (2000)

Deterpenación de aceites cítricos Budich et al. (1999)

Deterpenación de aceite de piel de limón Benvenuti et al. (2001)

Fraccionamiento de aceite cítrico Sato et al. (1998)

Fraccionamiento de aceite de limón Gironi y Maschietti,

(2005)

Deterpenación de aceite de piel de mandarina Danielski et al. (2008)

Fraccionamiento de aceite esencial de lavanda Varona et al. (2008)

Extracción azeotrópica de etanol de soluciones

acuosas

Budich y Brunner

(2003).

Extracción de aromas y etanol de vino Gamse et al. (1999)

Fraccionamiento de licores Senorans et al. (2001)

Aislamiento de aroma de brandi Senorans et al. (2003)

Ácidos orgánicos Shimshick (1981)

Descafeinación de soluciones acuosas Zosel (1982)

Recuperación b-caroteno de pasta de Dunaliella

salina

Kanel y Marentis

(2000)

Recuperación -caroteno de pasta de Zanahoria Roney et al. (2008)

38

ANEXO B: Estudios publicados sobre extracción de microalgas usando CO2-SC

La presente tabla resume algunos de los estudios reportados en literatura sobre la

extracción de compuestos de alto valor agregado utilizando dióxido de carbono

supercrítico como solvente.

Condiciones de extracción Resultados Ref*

Arthrospira máxima

- Carga: Materia prima más

esferas de vidrio por arriba y abajo

- 60 ºC

- 25-35 MPa

- Etanol (10%)

- El uso de etanol aumenta la

recuperación de GLA (4 a 13%).

- El aumento de presión incrementa la

recuperación de GLA (18% a 45%)

[1]

Chlorella vulgaris


esferas de vidrio por arriba y

abajo.

- 40-55 ºC

- 10-35 MPa

- Grado ruptura

- Mayor ruptura aumenta la recuperación

de Carotenos a 35 MPa y 55ºC (de 10% a

sobre 40%). Para lípidos el aumento de

de 20% a sobre 50%.

- Sobre 20 MPa el efecto de temperatura

en el rendimiento es mucho menor que el

de presión

[1]

- Carga: 5 g de muestras más

esferas de vidrio

- 40-50 ºC

- 10-35 MPa

- Grado ruptura

- Óptimo recuperación lípidos: 35 MPa,

55ºC y células fracturadas (13%).

Mismas condiciones sin ruptura 5%

recuperación.

- Para carotenos a 35 MPa, 55ºC y células

fracturadas 40% recuperación y no

fracturadas un 10%.

[1]

[2]

- 40 ºC

- 30MPa

- Grado ruptura

- 0.34 o 0.6 L NPT/min

- Aceite y etanol

- A40ºC, 30 MPa, alto grado de ruptura y

SC-CO2 se logra recuperar 69% de

carotenos

- A menor grado de ruptura menor

recuperación.

- Con Etanol mejora la recuperación de

células enteras (17% a 20%).

[3]

- Extractor de 10 mL

- 3g de microalga y esferas de

vidrio.

- 60-80 ºC

- 20-50 MPa

- 2.5 mL/min

- Etanol (7.5%)

- Acetona (7.5%).

- Óptimo recuperación Luteina: 80ºC y

50 MPa usando Etanol (baja

selectividad).

- Rendimiento para beta-Caroteno dos

órdenes de magnitud menores a otros

pigmentos.

[4]

39

Dunaliella salina


esferas de vidrio por arriba y

abajo.

- 40-60 ºC

- 20 MPa

- La extracción con SC-CO2 es más

selectiva que la acetona entre -caroteno

cis/trans.

[1]

- Carga: 0.1g de microalga.

- 40-60 ºC

- 10-50 MPa

- 4.5 mmol/min

- Óptimo carotenos: 40MPa y 60ºC con

rendimiento de 12.17 mg/g. La mayor

selectividad se logró a 30MPa y 40ºC

pero la mitad del rendimiento.

[5]

Haematococus pluvialis

- Extractor de 10 mL

- Carga: 0.5g de materia prima y el

resto arena de sílice

- 40-80 ºC

- 30-50 MPa

- 1-4 horas (h)

- 3 mL/min

- Óptimo a 70ºC, 50MPa y 4 h.

- Recuperación: 83.78%

- Rendimiento: 23 mg/g

[6]

- Extractor de 5 mL

- Carga: 2g de materia prima

- 40-60 ºC

- 20-30 MPa

- Grado ruptura

- 10% de etanol

- Óptimo: algas rotas, 30MPa, 60ºC y

etanol.

- Recuperación: 92% de carotenos y 90%

de astaxantina.

- Rendimiento: 16 mg/g

[7]

- 60ºC

- 30 MPa

- 1mL/min

- Grado ruptura

- Rendimiento: Células una vez rota 0.85

%, dos veces rotas 1.3%.

- Con etanol se recupero un 97% (1.6%

rendimeinto). Y la concentración extracto

aumento de 0.35% a 1.75%.

[8]

- Extractor: 50 mL

- Carga: 7g de microalga mas

esferas de vidrio arriba y abajo

- 40-80 ºC

- 20-55 MPa

- 2-4 cm3/min

- Etanol (1.67-7.5%)

- Óptimo: 55 MPa, 70 ºC y 3 cm3/min

con lo cual se logra una recuperación del

79.9% y un contenido en el extracto de

12.3%.

[9]

Nannochloropsis gaditana

- Carga: 0.2 g de microalga

- 40-60 ºC

- 10-50 MPa

- 4.5 mmol/min

- La mayor cantidad de carotenos se logra

a 40 MPa y 60 ºC (rendimiento 0.34

mg/g).

- La mayor selectividad de carotenos se

logra a 20 MPa y 60 ºC (1.4 veces más

carotenos q clorofila)

[10]

Nannochloropsis sp

40

- Carga: 180 g materia primas y

100g de esferas de vidrio.

- 40-55 ºC

- 40-70 MPa

- 6h

- 10% de etanol

- 10 kg/h

- Óptimo PUFA’s: 55 MPa y 55 ºC con

una concentración de 54.6% (44.4%

omega-3) y un rendimiento de 250 mg

lipidos/g

[11]

Spirulina maxima

- 60 ºC

- 30 MPa

- 1mL/min

- Rendimiento: con SC-CO2 puro de

1.1% con 10% de etanol 3%.

[8]

- Carga: 173g de materia prima y

173g de esferitas de vidrio.

- 20-70 ºC

- 15-18 MPa

- 306 kg/h

- Óptimo recuperación ac. grasos se logra

a 15 MPa y 50 ºC con 30 mg.

- Óptimo recuperación carotenos es a 18

MPa y 30 ºC con 2.27 mg.

[12]

- Carga: 5 g de microalga.

- 50-60 ºC

- 25-35 MPa

- 2 g/min

- Etanol 10%

- Óptimo: 25 MPa, 50 ºC y Etanol

recuperando 45% de GLA.

[13]

Spirulina platensis

- Extractor: 285 mL

- Carga: 75 g microalga y 120 g

tierra de mar.

- 27-83 ºC

- 7.8-36.1 MPa

- Etanol (10%).

- 75 min.

- Óptimo se logra con etanol, 55 ºC y

presiones intermedias (22-32 MPa) con

una recuperación sobre 65%.

- SC-CO2 puro requiere altas presiones y

temperatura.

[14]

- 40 ºC

- 30-40 MPa.

- 2-4 h.

- Óptimo lípidos: 35 MPa y 4 h con un

rendimiento de 7.2%.

- Óptimo GLA: 40 MPa y 4 h con un

rendimiento de 0.29%

[15]

41

- Carga: 8 g de microalga y 100 g

de esferas de vidrio

- 40-55 ºC

- 25-70 MPa.

- 10 kg/h

- 0-4h

- Óptimo lípidos 55ºC y 70MPa con un

rendimiento de 77.9 mg /g de microalga

en un tiempo de 1.30 h.

- A 55ºC y 55MPa se requiere de 2 h para

conseguir un rendimiento de 77.9 mg/g.

[16]

*[1]Mendes et al., 2003; [2] Mendes et al., 1995; [3] Gouveia et al., 2007; [4] Kitada et al., 2008; [5]

Macías-Sánchez et al, 2009; [6] Thana et al, 2008; [7] Nobre et al, 2006; [8] Valderrama et al., 2003; [9]

Machmudah et al., 2006; [10] Macías-Sánchez et al., 2005; [11] Andrich et al., 2005; [12] Canela et al.,

2002; [13] Mendes et al., 2006; [14] Mandiola et al, 2007; [15] Hu 1999; [16] Andrich et al., 2006

42

ANEXO C: Validación metodología

Extracción de sólidos

Para encontrar una metodología adecuada para la extracción de sólidos se partió

extrayendo el polvo seco sin agregar tierra de diatomeas pero ocurrio un fenómeno de

aglomeración, el cual genera canalización de flujo y por ello zonas muertas en el lecho.

Para evitar esto se decidió agregar tierra de diatomeas como ha sido sugerido por Hopper y

King (1992), lo cual efectivamente eliminó el problema. Posteriormente, se efectuaron

pruebas con distinta carga de soluto (3 g y 1 g) manteniendo la relación entre la microalga

y tierra cargada, de tal forma de asegurar que en la zona inicial del proceso de extracción el

CO2 se encontraba saliendo saturado del extractor y además asegurar reproducibilidad en

los resultados. La figura adjunta muestra un caso particular (P = 550 bar; T = 40 ºC) donde

se aprecia claramente que en un comienzo ambas curvas se superponen. La diferencia que

se aprecia en la zona intermedia entre la curva de las prueba 1, y las pruebas 2 y 3 se pude

deber a diferencias en el lecho debido a que la prueba 1 fue efectuada cargado una mayor

cantidad de microalga (3 g) que las pruebas 2 y 3 (1 g).

Figura Anexo C-1: Pruebas de extracción de sólidos.

43

Extracción de homogenato

Para encontrar una metodología de extracción de líquidos se partió cargando el

homogenato sólo en el extractor, pero se encontró que el CO2 se canalizaba por el interior

medio del extractor desplazando el fluido a las paredes. Para evitar este inconveniente se

procedió a cargar el extractor con esferitas de vidrio las cuales permitieron una mejor

dispersión del flujo en el lecho. Posteriormente se procedieron a efectuar extracciones a P

= 550 bar y T = 70 ºC para verificar la reproducibilidad de los datos. La figura adjunta

presenta las curvas cinéticas obtenidas donde se puede apreciar una alta reproducibilidad

de los resultados obtenidos.

Figura Anexo C-2: Pruebas de extracción de homogenato.

44

ANEXO D: Resultados extracción de polvo de H. pluvialis

Presión de extracción 550 bar, Temperatura de extracción 70 ºC

F

(kg CO2/g microalga)

R

(g extracto/g

microalga)

y

(mg astaxantina/g

microalga)

0,028 4.21 1.94

0,048 6.27 3.13

0,096 9.34 4.62

0,192 12.83 6.01

0,336 15.93 8.09

0,576 18.68 9.79

0,865 20.05 10.76

1,442 20.70 11.10

2,019 21.42 11.45

2,5 21.88 11.69


F


R

(g extracto/g

microalga)

y

(mg astaxantina/g

microalga)

0.022 3.19 0.85

0.036 4.60 1.33

0.073 7.21 2.63

0.147 9.72 3.85

0.220 11.65 4.68

0.514 14.25 6.16

0.808 16.40 7.71

1.397 18.95 9.78

1.985 20.19 10.71

2.5 21.31 11.18

45


F


R

(g extracto/g

microalga)

y

(mg astaxantina/g

microalga)

0.030 2.51 0.85

0.050 3.84 1.63

0.099 7.40 3.29

0.198 12.38 6.68

0.347 15.28 8.83

0.594 16.43 9.70

0.891 16.95 10.21

1.485 17.58 10.49

2.079 18.07 10.62

2.5 18.35 10.95


F


R

(g extracto/g

microalga)

y

(mg astaxantina/g

microalga)

0.029 1.93 0.54

0.048 3.29 0.93

0.095 6.27 2.24

0.190 7.90 3.29

0.333 10.51 4.81

0.571 13.76 6.27

0.857 15.83 7.12

1.429 16.75 8.55

2 17.34 9.46

2.5 17.87 10.01

46


F


R

(g extracto/g

microalga)

y

(mg astaxantina/g

microalga)

0.028 1.72 0.46

0.047 2.79 0.55

0.091 5.35 1.57

0.182 7.43 2.45

0.273 10.00 3.57

0.455 12.29 5.14

0.727 15.25 7.10

1.273 17.17 8.72

1.818 18.42 9.72

2.5 18.72 9.96


F


R

(g extracto/g

microalga)

y

(mg astaxantina/g

microalga)

0.039 1.99 0.58

0.065 3.23 0.96

0.130 5.45 2.01

0.259 8.24 3.42

0.454 11.01 5.28

0.778 12.85 6.88

1.167 14.34 7.93

1.944 15.75 8.96

2.722 16.86 10.10

2.5 16.71 9.96

47

ANEXO E: Estructura de monoésteres y diésteres de astaxantina

La Figura A muestra la estructura de una molécula de astaxantina. Las figuras B y C

muestran moléculas generales de mono y diésteres de astaxantina respectivamente, donde

R representa cualquier cadena alifática (típicamente entre 16-18 átomos de carbono) (Miao

et al., 2006).

48

ANEXO F: Resultados extracción de homogenato de H. pluvialis


F


R

(g extracto/g

microalga)

y

(mg astaxantina/g

microalga)

0.59 2.91 0.92

1.21 6.93 2.16

1.76 10.59 3.37

2.35 13.02 4.19

2.94 15.65 5.01

3.53 17.87 5.74

4.12 19.48 6.55

4.71 21.02 7.35

5.29 22.90 8.23

5.88 23.93 9.16

6 24.05 9.33


F


R

(g extracto/g

microalga)

y

(mg astaxantina/g

microalga)

0.79 1.62 0.90

1.58 4.44 2.64

2.28 6.55 3.86

3.07 9.06 5.30

3.66 10.86 6.27

4.36 12.27 7.30

5.05 13.40 8.44

5.64 14.09 9.12

6 14.37 9.40

49


F


R

(g extracto/g

microalga)

y

(mg astaxantina/g

microalga)

0.67 2.94 1.24

1.33 6.47 3.04

2 9.59 4.41

2.67 12.63 5.71

3.43 15.53 7.12

4 17.30 8.15

4.67 18.90 8.97

5.52 20.43 9.87

6 21.37 10.43


F


R

(g extracto/g

microalga)

y

(mg astaxantina/g

microalga)

0.65 1.28 0.65

1.31 2.68 1.56

1.96 5.31 3.24

2.71 7.81 4.85

3.46 9.63 5.98

4.11 11.21 7.28

4.77 12.59 8.33

5.42 13.58 9.22

6 14.41 9.76

50


F


R

(g extracto/g

microalga)

y

(mg astaxantina/g

microalga)

0.7 2.17 0.84

1.4 5.53 2.34

2.1 9.26 4.21

2.8 12.33 5.54

3.5 15.22 6.87

4.2 17.51 7.90

5 20.28 9.35

5.7 21.88 10.21

6 22.28 10.56


F


R

(g extracto/g

microalga)

y

(mg astaxantina/g

microalga)

0.58 1.23 0.32

1.17 2.17 0.80

1.94 4.77 2.09

2.72 7.28 3.22

3.40 9.02 4.02

3.98 10.66 5.03

4.76 11.96 5.99

5.44 12.77 6.84

6 13.33 7.54

Astaxantina de Haematococcus Con CO2

Documents

ingeniera santiago de

profesor jos manuel

haematococcus pluvialis

ingeniera profesor supervisor

jos muoz

profesor csar sez

iii agradecimientos

comisin integrada