UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS ESCOLA DE VETERINÁRIA E ZOOTECNIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA ANIMAL SEMINÁRIOS APLICADOS ASPECTOS IMUNOLÓGICOS E MÉTODOS DIAGNÓSTICOS de Salmonella SP. APLICADOS À AVICULTURA Denizard André de Abreu Delfino Orientadora: Valéria de Sá Jayme – UFG GOIÂNIA 2013
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ASPECTOS IMUNOLÓGICOS E MÉTODOS DIAGNÓSTICOS de - EVZppgca.evz.ufg.br/up/67/o/2013_Denizard_Delfino_Seminario2Corrig.pdf · de Salmonella sp., em 1993, e 55.911 em 1995 (ROWE &
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sendo a principal característica a especificidade. Por exemplo, o gene invA está
presente nas duas espécies de Salmonella, mas o gene invAB somente em
alguns sorovares de Salmonella enterica (BAUNLER et al., 1997).
A PCR em Tempo Real permite a quantificação das amostras
amplificadas, é de grande relevância para diagnósticos de patógenos e doenças
genéticas. Dentre as vantagens, desta técnica em relação à PCR qualitativa estão
a facilidade na quantificação, maior sensibilidade, maior precisão,
reprodutibilidade e acurácia, velocidade na análise, melhor controle de qualidade
no processo e menor risco de contaminação (HEID, et al., 2004).
A reação em cadeia de polimerização em tempo real combina a
metodologia de PCR convencional com um mecanismo de detecção e
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quantificação por fluorescência. A metodologia, por não mais requerer a detecção
em gel de eletroforese necessário na análise da PCR, permite que os processos
de amplificação, detecção e quantificação de DNA, sejam realizados em uma
única etapa, agilizando a obtenção de resultados e diminuindo o risco de
contaminação da amostra e dando maior precisão. A possibilidade de monitorar a
PCR em tempo real ( PCR) revolucionou, pois, o processo de quantificação de
fragmentos de DNA e RNA e na aplicação em diagnósticos, como a detecção de
patógenos ou doenças, como a salmonelose (MULLIS et al., 1990).
A r PCR realiza a quantificação destes ácidos nucléicos de maneira
precisa e com maior reprodutibilidade, porque determina valores durante a fase
exponencial da reação. O ponto que detecta o ciclo na qual a reação atinge o
limiar da fase exponencial é denominado de Cycle Threshold (CT). Este ponto
permite a quantificação exata e reprodutível baseado na fluorescência (HEID, et
al., 2004).
A r PCR requer uma plataforma de instrumentação que contém um
termociclador com sistema ótico para a excitação da fluorescência e na coleção
da emissão e um computador com um software para aquisição de dados e análise
final da reação. Estas máquinas diferem na capacidade da amostra (96-poços
padrão, processamento de poucas amostras ou requerem tubos capilares de vidro
especializados), no método da excitação (lasers ou fontes claras do espectro
largo com filtros ajustáveis) e na sensibilidade total. Há também diferenças nos
softwares para o processamento dos dados (HEID, et al., 2004).
A emissão dos compostos fluorescentes gera um sinal que aumenta na
proporção direta da quantidade de produto da PCR. Sendo assim, os valores da
fluorescência são gravados durante cada ciclo e representam a quantidade de
produto amplificado. Os compostos fluorescentes mais utilizados são o SYBR®
Green e TaqMan®. (MULLIS et al., 1990), que serão sucintamente enfocados.
O SYBR® Green se liga entre a fita dupla de DNA e com a excitação
da luz emitida pelo sistema ótico do termociclador, emite uma fluorescência verde.
As vantagens da utilização do SYBR® Green são: baixo custo, facilidade no uso e
sensibilidade. A desvantagem é a ligação em todo DNA fita dupla que surge
durante a reação, incluindo os dímeros dos iniciadores e outros produtos
inespecíficos, podendo superestimar a concentração do fragmento alvo. O
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SYBR® Green não ligado ao DNA exibe uma fluorescência muito pequena (HEID,
et al., 2004).
.Entretanto, a fluorescência é realçada quando ligado na fita dupla do
DNA. No começo da amplificação, a mistura da reação contém o DNA
desnaturado, os iniciadores e o SYBR® Green. As moléculas não-ligadas do
SYBR® Green apresentam fluorescência fraca produzindo um sinal mínimo sendo
este subtraído durante a análise de computador. Após o reconhecimento dos
iniciadores, algumas moléculas do SYBR® Green podem ligar-se na fita dupla
previamente formada. Durante a polimerização catalisada pela enzima Taq DNA
polimerase, as moléculas do SYBR® Green vão se ligando ao DNA recentemente
sintetizado. Assim, a reação é monitorada continuamente e um aumento da
fluorescência é observado em tempo real. No ciclo seguinte, na etapa de
desnaturação do DNA, as moléculas do SYBR® Green são liberadas e há queda
no sinal da fluorescência. A detecção da fluorescência no fim da etapa de
extensão de cada ciclo da PCR permite monitorar a quantidade crescente de DNA
amplificado (VITZTHUM et al., 1999).
Já TaqMan® é uma sonda (fragmento de DNA marcado usado para
hibridizar outra molécula de DNA) utilizada para detectar sequências específicas
nos fragmentos de DNA amplificados na PCR. Esta sonda apresenta em uma
extremidade um fluoróforo, e na outra extremidade um quencher (molécula que
aceita energia do fluoróforo na forma de luz e a dissipa na forma de luz ou calor).
Os produtos da reação são detectados pela fluorescência gerada após a atividade
exonuclease 5'—>3' da Taq DNA polimerase. Durante a PCR em tempo real a
sonda TaqMan® hibridiza com a sequência da fita simples de DNA complementar
alvo para a amplificação.
No processo da amplificação, a sonda TaqMan® é degradada devido à
atividade exonuclease 5'—>3' da Taq DNA polimerase, separando o quencher da
molécula fluorescente durante a extensão. A separação do fluoróforo do quencher
resulta em um aumento da intensidade da fluorescência. Assim, durante o
processo de amplificação a emissão de luz é aumentada de forma exponencial.
Esse aumento da fluorescência ocorre apenas quando a sonda hibridiza e quando
a amplificação da sequência alvo é estabelecida (HEID et al., 1996). A reação
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com a TaqMan® é considerada um método sensível para determinar a presença
ou ausência de sequências específicas (VITZTHUM et al., 1999).
Registre-se que esse sistema de quantificação em tempo real, além da
aplicação direta na análise de sequência de patógenos como a Salmonella sp.,
dentre outros agentes virais, bacterianas ou de protozoários a partir de várias
fontes, possibilita a identificação de alelos em DNA genômico, a análise de
patógenos em produtos transgênicos e em alimentos, sendo esta última também
importante para a bactéria aqui abordada (ZHU, et al., 2010).
Muitos estudos vêm sendo conduzidos empregando a técnica de PCR.
Dentre eles, pode-se citar o de MALORNY et al ( 2004), que visando avaliar
amostras de alimentos contaminadas com Salmonella sp. avaliaram 110 amostras
de alimentos pela bacteriologia convencional e pelo PCR em tempo real. Os
primers e a sonda eram específicas para um locus altamente conservado
composto por cinco genes no operon de Salmonella sp. denominado ttr. Até
então, esta região não teria sido relatada para detecção desta bactéria. Os genes
ttrA, ttrB e ttrC são responsáveis pela codificação de proteína tetrationato
reductase. Todas as amostras analisadas, tanto pela microbiologia como pelo
diagnóstico molecular foram positivas, entretanto, a PCR em tempo real (q-PCR),
foi concluída em 24h enquanto que a bacteriologia demorou cinco dias, além de
demonstrar alta seletividade, precisão e probabilidade de detecção
(SHIVAPRASAD & BARROW, 2008).
Destaca-se que a técnica de PCR utilizada nesse referido estudo, a de
PCR em tempo real, é empregada principalmente, segundo GLYNN et al. ( 2006),
devido à característica qualitativa da PCR tradicional, que a torna limitante nos
estudos quantitativos.
3. CONSIDERAÇÕES FINAIS
As infecções causadas por Salmonella sp. são de grande relevância,
tanto na Saúde Pública como na sanidade avícola, uma vez que podem afetar
homens e aves e causar grandes perdas na produção avícola, com impactos
sanitários e econômicos.
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Assim, o controle da salmonelose nos sistemas de criação é
fundamental, dependendo, dentre outros fatores, do conhecimento da
epidemiologia, patogênese e das características do patógeno, principalmente
aquelas relacionadas à virulência e transmissão.
Estudos do grau de infecção das aves e do ambiente de criação de
uma determinada região devem ser conduzidos para que sejam tomadas
decisões a respeito do monitoramento e controle da bactéria, bem como a
utilização de algumas ferramentas como, por exemplo, a vacinação.
Outro aspecto importante e atual refere-se à resistência antimicrobiana,
pois o uso indiscriminado de antibióticos pode levar à seleção de cepas
resistentes e estas podem estar presentes nos alimentos de origem animal e
causar graves infecções em seres humanos.
Portanto, há necessidade de ampliação de pesquisas na área que
permitam não apenas mensurar a circulação do patógeno na avicultura, mas,
dentre outros aspectos, identificar seus principais fatores de risco e avaliar e
desenvolver técnicas de diagnóstico efetivas visando à sua prevenção e controle,
minimizando os impactos da salmonelose tanto no setor avícola quanto para a
saúde humana.
A redução de tais impactos representa um dos maiores desafios para a
avicultura atualmente, pois evitar a ocorrência de doenças transmissíveis aos
seres humanos, garantir a saúde e o desempenho das aves bem como atender às
demandas comerciais são aspectos indissociáveis, destacando-se a crescente
relevância da segurança alimentar, que deve ser aplicada tanto para alimentos
destinados à exportação quanto para abastecimento do mercado interno.
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