1. Introducere 1.1 Scurt istoric al studiilor asupra apoptozei Moartea celulară este un element necesar în decursul vieţii unui organism multicelular, îndeplinind numeroase funcţii. Prima descriere a apoptozei în decursul dezvoltării embrionare a fost realizată de Vogt 1 în 1842, iar primul studiu integrativ care a propus conceptul de “apoptoză” a fost realizat de către Kerr 2 în 1972, care a observat recurenţa fenomenului în timpul proliferării celulare sau în situaţii patologice. Numeroşi cercetători au propus termeni diferiţi pentru a descrie fenomenul, cum ar fi anoikis, degenerare, autoliză, cromatoliză, sinucidere celulară (vezi Majno şi Jolis, 1995) 3 , fapt care se datorează modelelor diferite de cercetare. Dacă înainte de precizarea terminologică termenul de “necroză” era utilizat ca un termen general pentru a descrie toate tipurile de moarte 1
This document is posted to help you gain knowledge. Please leave a comment to let me know what you think about it! Share it to your friends and learn new things together.
Transcript
1. Introducere
1.1 Scurt istoric al studiilor asupra apoptozei
Moartea celulară este un element necesar în decursul vieţii unui
organism multicelular, îndeplinind numeroase funcţii.
Prima descriere a apoptozei în decursul dezvoltării embrionare a fost
realizată de Vogt1 în 1842, iar primul studiu integrativ care a propus
conceptul de “apoptoză” a fost realizat de către Kerr2 în 1972, care a
observat recurenţa fenomenului în timpul proliferării celulare sau în situaţii
patologice.
Numeroşi cercetători au propus termeni diferiţi pentru a descrie
fenomenul, cum ar fi anoikis, degenerare, autoliză, cromatoliză, sinucidere
celulară (vezi Majno şi Jolis, 1995)3, fapt care se datorează modelelor
diferite de cercetare.
Dacă înainte de precizarea terminologică termenul de “necroză” era
utilizat ca un termen general pentru a descrie toate tipurile de moarte
celulară, astăzi el este folosit cu un conţinut limitat la dezintegrarea pasivă a
celulei, diferită de distrugerea voluntară, programată a acesteia. Pe parcursul
acestei lucrări voi folosi termenul de “moarte celulară programată” (MCP)
ca fiind similar celui de “apoptoză”.
Analiza in vivo diferitelor tipuri de moarte celulară non-necrotică a
arătat existenţa unor trăsături comune, indiferent de originea celulei sau
stimulul utilizat.
Cu toate acestea, studiile in vitro au evidenţiat diferenţe în expresia
proceselor sau inexistenţa unor trăsături tipice în anumite cazuri. De pildă,
1
utilizarea staurosporinei pentru a induce apoptoză generează distrugerea
celulei fără formarea corpilor apoptotici, probabil datorită acţiunii inhibitorii
asupra unor kinaze implicate în apoptoza normală .4
De asemenea, metamorfoza insectelor diferă în anumite privinţe de
tipul descris ca universal 5, iar în anumite cazuri când apoptoza este genetic
imposibilă, distrugerea capătă o expresie diferită 6.
1.2 Necroza vs. Apoptoza
Despre diferenţele dintre necroză şi apoptoză până s-a scris o literatura
bogata, accentuându-se caracterul voluntar, controlat şi dinamic al
apoptozei, sau diferenţele morfologice caracteristice fiecărui proces în parte. 1
Există însă unele procese ce împărtăşesc cu apoptoza multe trăsături
dar cărora le lipsesc altele caracteristice acesteia, sau care încalcă modelul
descris ca fiind tipic. 2
S-a observat recurenţa necrozei în urma acelor procese de leziune
celulară brutală, cum ar fi atacul a numeroşi agenţi fizici sau chimici,
hipoxia, toxinele, infecţiile, fiind acceptat rolul necrozei în răspunsul generat
la adresa unor agenţi patogeni şi importanţa procesului imflamator. 3
Unele dintre elementele necrotice distinctive sunt scăderea ATP
citosolic, datorită creşterii permeabilităţii membranare, disfuncţia unor
canale cationice, degradarea fosfolipidelor şi creşterea calciului
intracitoplasmatic. 4
Are loc prin urmare dilatarea reticulului endoplasmatic, degradarea
membranelor mitocondriale şi modificarea activităţii translaţionale.
2
În a doua fază necrotică se declanşază o degradare accentuată a
membranelor celulare şi a organitelor, hidratarea mitocondriilor şi apariţia
unor agregate dense şi bogate în lipide.
Dacă în apoptoză celula în restrânge în mod treptat volumul, în
necroză are loc un proces invers; cromatina apare agregată haotic, fiind
împrăştiată aleatoriu. 5 Celulele devin eozinofile, iar citoplasma este
vacuolizată; degradarea finală a organitelor nu este urmată de apariţia unor
structuri similare corpilor apoptotici.
În apoptoză, modificarea volumului celular se realizează prin
pierderea de apă şi ioni, nu însă şi de macromolecule, membranele rămânând
relativ intacte; apar “cute” 6 la suprafaţa plasmalemală, iar organitele rămân
nedigerate până la final. Condensarea cromatinei este ordonată, are loc
fragmentarea şi condensarea sa în mase compacte distincte la nivelul laminei
celulare.
Caracteristica definitorie este fără îndoială formarea corpilor
apoptotici şi activarea programului fagocitar, ceea ce nu declanşază
inflamaţia.
Procesul apoptotic este controlat genetic, în etape distincte, fiind
declanşat ireversibil după depăşirea unui “punct critic” 7, iar sinteza proteică
nu cunoaşte un moment similar celui “catastrofic” necrotic. În acest caz sunt
activate endonucleazele (calciu şi magneziu dependente şi care sunt inhibate
de către Zn) care fragmentează ADN la nivelul fragmentelor linker,
rezultând fragmente de 180 – 200 perechi de baze 8.
La celulele anucleate apoptoza urmează acelaşi scenariu, chiar în
absenţa degradării nucleare.
Apoptoza necesită sinteza unor proteine cu rol apoptotic şi ca urmare
nu se produce o dezorganizare rapidă a procesului.
3
Recent s-a descoperit că procesul sintetic este inhibat prin distrugerea
factorului 4G eucariotic 9, ceea ce nu afectează sinteza proteinelor cu funcţie
prooncogenă de tip c – myc care necesită un segment intern de ataşare
ribozomal (IRES) localizat la segmentul 5’ reglator.
Pentru a sintetiza, apoptoza este caracterizată de următoarele trăsături: 10
1. membranele plasmatice rămân intacte, formând însă cute;
2. reducerea volumului celular ;
3. condensarea cromatinei la periferia nucleului, ce devine picnotic;
4. fragmentarea ADN si a nucleului;
5. distrugerea structurilor membranare;
6. vacuolizarea citoplasmei;
7. formarea corpilor apoptotici.
1.3 Funcţiile apoptozei
Acest proces nu este numai unul de “curăţare”, ci şi unul de
construcţie, având un rol hotărâtor în dezvoltare.
Apoptoza intervine în modelarea unor structuri (formarea unor
cavităţi) 1, eliminarea celulelor redundante (neuronii motori ai vertebratelor),
sau în turnover-ul tisular normal. 2
De asemenea, apoptoza are o funcţie esenţială în menţinerea
homeostaziei tisulare, cum ar fi cazul hematopoiezei, menţinând un echilibru
între proliferare şi eliminare. 3
Prin apoptoză sunt îndepărtate celulele sistemului imunitar care
recunosc antigenele self, celulele imunitare activate inutile, clonele care
generează anticorpi anti-self, si celulele T care nu recunosc CMH sau cele cu
mare afinitate pentru antigenele self. 4
4
Limfocitele T pot fi distruse în manieră Fas-independentă sau Fas-
dependentă.
Apoptoza reprezintă un mecanism fundamental de protecţie a
organismului în cazul infecţiei virale, când mecanismul de atac preferat al
virusurilor este sinteza proteinelor cu funcţie antiapoptotică, cum ar fi LPM
1 sau LPM 2, în cazul virusului Epstein – Barr 5, sau proteina Tat care
blochează apoptoza, în urma infecţiei cu HIV 6.
Alteori virusurile modifică proteina cu rol proapoptotic, pentru a
favoriza diseminarea.
La fel se întâmplă în cazul infecţiilor bacteriene, însă în timp de
virusurile au mecanisme eficiente de inhibare a apoptozei pentru a iniţia
propria replicare, bacteriile au nevoie de supravieţuirea celulelor infectate.
Apoptoza este necesară şi în procesul de eliminare a celulelor cu rol
imflamator, după îndeplinirea funcţiei. 7
Mecanismele apoptotice nefunctionale duc la apariţia tumorilor, dar,
dată fiind importanţa procesului, o vom trata într-un capitol separat. 8
Apoptoza este implicată în numeroase maladii dintre care cităm :
A) Boli neurodegenerative: Alzheimer, Parkinson, scleroză laterală
amiotrofică, degenerescenţă cerebrală;
B) Sindrom mielodisplazic;
C) Infarct miocardic.
5
1.4 Trăsături generale ale apoptozei
1.4.1 Apoptoza în cazul celulelor nucleate.
Putem clasifica trăsăturile apoptozei în esenţiale şi neesenţiale. Cea
mai importanţă trăsătură a celui de-al doilea tip este modificarea de la
nivelul nucleului, deoarece apoptoza are loc în aceeaşi formă şi în celulele
anucleate (Jacobson, 1994, Osthoff, 1994)1. Asemenea trăsături sunt
clasificate ca “postmortem”, putând fi absente în anumite cazuri, şi au loc
după “punctul de neîntoarcere” (point of no return).
În 1966 Tata2 a observat faptul că apoptoza necesită ARN şi sinteză
proteică, ceea ce a subliniat faptul că acest proces este unul activ, dinamic,
iar recurenta unor trăsături comune a generat speculaţia că procesul
apoptozei este reprezentat de catre o cale biochimică unică 3 fapt ce a fost
întărit de descoperirea existenţei aceloraşi principii de organizare si în cazul
C. elegans şi al omului.
Dar faptul care a generat o teorie unificată despre apoptoză a fost
descoperirea caspazelor, care au fost identificate în toate organismele, mai
puţin în drojdii, fiind identificate insa şi unele mecanisme apoptotice ce nu
necesită existenţa lor.
Ipoteza originală a fost aceea că apoptoza constă in primul rand în
distrugerea citoscheletului de către caspază, ceea ce a fost infirmat ulterior.
(Martin 1995) .4
6
1.4.2 Dinamica citoplasmatică
Schimbările sunt predominant biochimice, nu morfologice, cu
excepţia dispariţiei microvililor ce are loc în urma activării caspazelor şi
concomitent cu defosforilarea ezrinelor si a radixinelor care stabilizează
microvilii prin interacţiunea cu actina.
Schimbările plasmatice cele mai evidente sunt datorate semnalelor
fagocitice adresate celulelor înconjurătoare, ceea ce va activa ultima etapă a
apoptozei. 5
1.4.3 Schimbări la nivelul formei şi structurii
În timpul apoptozei, celula îşi modifică forma, distrugând relaţiile cu
vecinii, iar la suprafaţa membranei apar anumite cute (blebs) precedând
formarea corpilor apoptotici.
La nivelul citoplasmei apar uneori vacuole, proces ce urmează
distrugerii citoscheletului, in distrugerea acestuia un eveniment fundamental
constituiindu-l activarea caspazelor, care distrug direct gelsolina, fodrina,
actina sau Gas 2 (Kotha-Kota, Martin, Mashima). 6
La soarecii knok-out pentru caspaza 3 apoptoza hepatocitelor şi
timocitelor prezintă o formare mai redusă a cutelor, lucru observat şi în cazul
unei linii celulare derivate dintr-un cancer mamar uman. Dacă tratăm
celulele cu proteinază K, cutele se formează în mod normal, iar adăugarea
inhibitorilor caspazici anihilează această formare, ceea ce evidenţiază rolul
caspazelor.
Distrugerea citoscheletului 7 nu e haotică, ci organizată, ea necesitând
actina, care formează o structură asemănătoare unui cerc la periferie, şi
7
gelsolina modificată, soarecii K.O. pentru gelsolină – având o formare mai
întârziată a cutelor.
Odată declanşată de activarea caspazei 3 formarea acestora e
inevitabilă, chiar dacă sunt adăugaţi inhibitori caspazici.
La nivelul miozinei au loc fosforilări pa lanţul uşor de către MLCK
(miosin light chain kinase), care determină o nouă interacţie actină – lanţul
uşor al miozinei. 8
Reorganizarea citoscheletului necesită numeroase kinaze: MAP
kinaza ce fosforilează hs27 1, (II). Pak 2 ce activează p 21, în urma actiunii
caspazelor (III). SLK, Ste-20 kinaza, care e clivată de caspaza 3 şi care
rearanjează citoscheletul. Pak 2 e implicată în formarea corpilor apoptotici,
iar din moment ce acest proces este inhibat de citocalasina B, probabil ca e
implicată şi actina F.
Apariţia vacuolelor depinde de activarea caspazelor, o proteină
implicată fiind rabaptina 5 care afectează membrana celulară.9
1.4.4 Schimbări la nivelul organitelor citoplasmatice
Distrugerea acetora este tardivă, schimbări mai pronunţate apărând la
nivelul RE 10 care se dilată şi pierde ribozomii ataşaţi, iar proteina integrală
Bap 31 de leagă de Bcl 2 şi pro-caspaza 9, fiiind distrusa de către caspaze.
Clivarea rabaptinei 5 va afecta fuziunea endozomilor şi va dezorganiza
metabolismul. Daca sunt translocate caspaze sau numai factori activati de
catre acestea ramane de stabilit, in prezent ambele tabere avand argumente
pro si contra.
Clivarea laminelor A şi B are loc la început, însă caspazele nu distrug
proteinele direct , ci prin intermediul altor molecule care au funcţie specială
în apoptoză. 11
8
Distrugerea ADN se realizează la nivelul unor segmente 200 – 300
Kpb, iar proteinele numite ICAD/CAD/DFF45/DFF 40 au un rol important
în fragmentare, existând în formă inactivă ca dimeri, DFF 40 fiind
complexat de DFF 45 proteină chapperone. 12
DFF 45 e clivată de către caspază şi e eliberat DFF 40 care realizează
tăieturi dublu catenare, mai ales in segmentul de legătură dintre nucleosomi.
Şoarecii trasgenici cu defecte în CAD au o fragmentare incoerentă, iar
tratamentul celulelor cu caspază duce la condensarea cromatinei dar procesul
e inhibat in urma tratamenului cu DFF 45.
Recent a fost izolată o proteină numită Acinus 13 care e activată de
către caspază şi care induce fagocitoza corpilor apoptotici si acest lucru se
realizează atât in cazul fagocitelor cât şi in cel al celulelor nespecializate (de
exemplu celulele epiteliale).
Distrugerea celulei se face pe o cale lizozomală în primul rând în
celula apoptotică prin autofagie, fiind descrisă o proteină beclina, care se
leagă de Bcl 2 şi e implicată în fagocitoză.14
Alteori corpii apoptotici sunt digeraţi de către celulele vecine pe cale
lizozomală.
1.4.5. Mitocondria
Dincolo de funcţia apoptotică a mitocondriei datorită Bcl 2, unele
modificări apar la nivelul membranei externe care e ruptă în urma umflării
matrixului, ulterior apărând fenomenul de condensare.15 Există momentan o
dezbatere privind implicarea mitocondriei în apoptoză, ideea acceptată de
catre majoritatea comuniatii stiintifice a primatului ei în activarea caspazelor
fiind contestată de actre o minoritate cu solide argumente in spate. Li Hu de
9
la Burnham Institute a identificat un tip de “receptor nuclear” care părăseşte
nucleul şi intră în mitocondrie, eliberând citocromul c.
A. Marchenko (Stony Brook) a identificat un mecanism similar în
cazul p 53, care se poate localiza la nivelul mitocondriei generând o
apoptoză mai rapidă.
Alţii au subliniat influenţele tipurilor de modele de cercetare asupra
rezultatelor, studiile pe C. elegans sugerând o activare caspazică
independentă de modificarea permeabilităţii mitocondriale.
H. Steller a arătat că p 53, un inhibitor caspazic al unor virusuri,
previne apoptoza în retina unor insecte au o structură asemănătoare retinis
pigmentosa, ceea ce susţine ideea acţiunii caspazelor înaintea acţiunii
mitocondriei.
1.4.6 Nucleul
Trăsătura iniţială o constituie condensarea periferica a cromatinei, iar
ulterior apare fragmentarea nucleului şi dezintegrarea sa datorită degradării
ADN şi a proteinelor nucleare. 16
Caspazele 3 şi 6 atacă proteinele nucleare, cum ar fi lamine, proteinele
scaffold, si DFF 45 ( Inhibitor DNA fragmentating factor/ ICAD).
Nucleul este distrus şi integrat în corpii apoptotici; un alt factor
implicat în apoptoză, AIF, declaşază apoptoza independent de caspaze şi
determină condensarea parţială a cromatinei.
10
1.4.7 Reglarea volumului celular
Acesta nu este un mecanism pasiv, 17 pierderea volumului celular din
timpul apoptozei în opoziţie cu mecanismul necrotic de umplere, unde
membrana plasmatică este ruptă datorită pierderii timpurii de ATP care
opreşte transportul ionic, fiind controlata. Ruperea membranei plasmatice şi
eliberarea conţinutului celular duce la un răspuns inflamator, în timp ce
apoptoza este acompaniată de scăderea volumului celular şi menţinerea
integrităţii organitelor, iar integritatea plasmalemei se menţine până la
sfârşit. 18
Celula a dezvoltat mecanisme reglatorii prin utilizarea canalelor
ionice, transportorilor şi reorganizarea citoscheletului pentru a menţine ciclul
celular.
La mamifere rinichii joacă rolul de filtru ionic, însă datorită
modificării biochimice celulele trebuie să-şi ajusteze singure volumul prin
mecanisme de mărire (RVI) sau scădere (RVD) a volumului.
Principalii ioni sunt K+, Na+, Cl-, H+, HCO3-, iar elemetele implicate in