Revista Brasileira de Produtos Agroindustriais, Campina Grande,
v.7, n.1, p.1-14, 2005 ISSN 1517-8595
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PRODUO E ESTUDO DO POTENCIAL DE HIDRLISE DE UMA NOVA FONTE DE
ENZIMAS AMILOLTCAS A PARTIR DO MALTE DE MILHO (Zea mays)Alex
Ferreira Evangelista1, Joana Paula Menezes Biazus1, Jos Carlos
Curvelo Santana2, Elizabete Jordo3, Roberto Rodrigues de Souza4
RESUMO O malte de cevada um produto bastante utilizado pelas
indstrias alimentcias, porm seu custo relativamente elevado quando
comparado com o malte de milho. Como o malte de milho possui um
potencial enzimtico relativamente menor que o de cevada, a
concentrao das enzimas deste malte tornaria este produto mais vivel
que na forma in natura. Assim, este trabalho objetivou a obteno de
um derivado do malte de milho obtido por extrao lquidolquido em
sistema bifsico aquoso PEG/CaCl2 e comparar seu potencial enzimtico
com o malte de milho. Os dados de tempo (t) e de atividade
enzimtica (AE) resultaram numa curva em forma de pico, onde a mxima
atividade das sementes foi observada no quarto dia de germinao e a
atividade enzimtica apresentou uma dependncia exponencial com
tempo, anlogo ao crescimento de microrganismos. Estas enzimas ao
serem recuperadas em PEG 4000, tornaram-se mais ativas que no malte
de milho, mostrando que o PEG um meio que alm de conservar, ativa
as enzimas. Desta forma conseguiu-se gerar uma nova forma de
comercializao das enzimas amilolticas de malte de milho. Palavras
chaves: Zea mays L., fonte de amilases, amilases em PEG, cintica
enzimtica.
PRODUCTION AND STUDY OF THE HYDROLYSE POWER OF A NEW AMYLASES
SOURCE BY MAIZE (Zea mays) MALTABSTRACT The barley malt is a
product very utilized by food industries, but its cost is
relatively elevated when its comparated to maize (Zea mays) malt.
As this malt has a smaller enzymatic activity than barley malt, the
enzymes concentration of maize malt could become this product more
viable than its in nature form. Thus, this work aimed to obtain a
maize malt derivate through liquid-liquid extraction in aqueous
two-phase system PEG/ CaCl2 and to compare its enzymatic potential
with maize malt. The data of the time (t) and enzymatic activity
(EA) were shown as a curve in top form and EA presented on
dependence with t, it was analogy to microorganisms growth. These
recovering enzymes in PEG 4000 became more active that in the maize
malt form. It showed that PEG is the best mean for preserving and
activing its enzymes. Thus, we obtained a new commercial source of
amylases enzymes from maize malt. Keywords: Zea mays L., amylases
source, amylases in PEG, enzymes kinetic.
__________________________Protocolo 702 de 8 de abril de 20031
1
Graduandos em Engenharia Qumica, DEQ/ CCET/ UFS. Doutorando em
Engenharia Qumica, DESQ/ FEQ/ UNICAMP. [email protected]
. 1 Prof. Dr do Departamento de Engenharia e Sistemas Qumicos,
FEQ/UNICAMP, Cid. Univ. Zeferino Vaz, Av. Albert Eistein, s/n, Baro
Geraldo, Campinas SP, Caixa Postal: 6066, CEP: 13081-970, Tel:
0xx13 3788 3900. 1 Prof. Dr do Departamento de Engenharia Qumica,
CCET/UFS. Cid. Univ. Prof. Jos Alosio de Campos, Av. Marechal
Rondon, s/n, Rosa Elze, So Cristvo SE, CEP: 49480 000, Tel: 0xx79
2126687e-mail: [email protected].
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Produo e estudo do potencial de hidrlise de uma nova fonte de
enzimas amiloltcas ...... Evangelista et al.
INTRODUO Sistemas bifsicos aquosos A bioseparao um ramo da
bioengenharia que, nos ltimos tempos, vem sendo muito estudada, com
o intuito de aprimorar tcnicas mais eficientes e mais econmicas, em
larga escala (scale-up), alcanando um elevado grau de pureza e
recuperao da biomolcula, mantendo sua atividade. A mais eficiente
destas tcnicas a cromatografia em fase lquida. Contudo, esta,
embora produza um material de alto grau de pureza e com boa
atividade, seu rendimento baixo e o custo do produto elevado. Uma
das tcnicas que possuem bom rendimento na separao de biomolcula sem
interferir em sua atividade, com boa viabilidade econmica, a partio
em sistemas bifsicos aquosos (SBA) (Diamond & Hsu, 1992). Os
sistemas bifsicos aquosos mais utilizados, atualmente, so os
sistemas polimero/polmero, mais comumente representados pelo
polietileno glicol (PEG)/Dextrana e os sistemas polmero/ sal,
representados na maioria dos estudos por PEG/fosfato de potssio.
Estes sistemas foram descobertos por Per - ka Albertsson em 1955 e,
desde esta data, os sistemas bifsicos so estudados e utilizados na
recuperao e/ou purificao de diversas substncias, principalmente, de
biomolculas (Albertsson, 1986). Os SBAs polmero/polmero, ou
polmero/sal so muito utilizados na recuperao de biomolculas por
oferecem ambientes fsico-qumicos apropriados para as biomolculas,
apresentando baixas diferenas de potencial, tenso superficial em
torno de 10-7 N/cm, que contm 80% a 90% em peso de gua em suas
fases (Diamond & Hsu, 1992). Nas ltimas dcadas, tem-se
pesquisado novos sistemas bifsicos que permitam uma melhora na
recuperao de biomolculas especficas, como foi o caso de Santana
(2003), que empregou um SBA obtido, a partir do polietileno glicol
(PEG) e do sal CaCl2, na recuperao de amilases de malte de milho.
Os resultados mostraram que no pH 5,0 e na linha de amarrao mais
concentrada (3, neste estudo) este sistema foi seis vezes mais
eficiente que os utilizados por alguns autores; quando estes
recuperaram as mesmas enzimas de A. Niger em sistema PEG/ sais de
fosfato e PEG/ Dextrana.
Enzimas amilolticas Desde o incio do sculo, o estudo da
viabilidade de aplicao das enzimas em processos biotecnolgicos tem
tido um grande destaque em nvel Mundial. Dentre estas enzimas,
podemos destacar como as mais importantes para a biotecnologia; at
o momento, as enzimas e amilases. O uso fundamental das amilases
est na hidrlise do amido, principalmente, na indstria de panificao;
no pr-cozimento de cereais, nas indstrias de fermentao, para a
produo de lcool e bebidas alcolica; na fabricao de xaropes de
glicose, via hidrlise pelas amilases; no preparo de gomas de
dextrinas, usadas para acabamento de papis e tecidos, dentre
outros. A enzima com cdigo e nome sistemtico EC 3.2.1.1; -1,4
glicano 4-glicanohidroxilase, respectivamente, comumente conhecida
como -amilase. Esta uma grande enzima extracelular que hidrolisa,
aleatriamente, e vrias ligaes -1,4 no terminais de molcula de
amilose, amilopectina, glicognio e dextrinas, no atuam sobre as
ligaes -1-6. Os produtos finais da hidrlise so 70 a 90%, de
maltose, oligossacardeos e dextrinas, a maioria com quatro a oito
unidades de glicose, alm de pequenas quantidades de D-glicose. A
-amilase, tambm, chamada de enzima dextrinizante e de liquefao e
encontram-se nos tecidos e diversos meios: saliva, pncreas,
cereais, bactrias, fungos. Sua resistncia desnaturao trmica, a qual
inativa a enzima, difere conforme sua origem ou biossntese. Algumas
amilases bacterianas, de Bacillus subtilis, B. coagulans, B.
licheniformis e B. stearothermophilus, tm temperatura tima entre
70C a 80C de temperatura (algumas so ativas at acima de 100C), isto
devido presena de um on Ca2+ em sua estrutura molecular, com pH
timo entre 5,5 a 7,0 e peso molecular variando entre 10 kDa a 20
kDa (Wiseman, 1987; Dixon & Webb, 1967). A enzima com cdigo e
nome sistemtico EC.3.2.1.1, -1,4 glicano-maltohidrolase,
respectivamente, comumente conhecida como -amilase. Esta uma enzima
extracelular, largamente encontrada em gros de vegetais, degradando
a amilopectina e glicognio, hidrolisando cada segunda ligao -1,4,
mas, sempre, a partir dos terminais no redutores das cadeias. A
maioria dos seus produtos quase sempre -maltose, so inibidas por
reagentes sulfidricos, no atuam em ligaes -1,6 e desta forma, a
hidrlise total da amilopectina no
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pode ser realizada por elas. Estas enzimas possuem temperatura
tima por volta do 55 C, pH timo entre 6,5 a 7,0 e massa molar de,
aproximadamente, 50 kDa (Wiseman, 1987; Dixon & Webb, 1967).
Cintica enzimtica o estudo do caminho mais provvel para se definir
a equao da taxa da reao de um sistema reacional catalisado por
enzimas. Para que seja possvel a compreenso deste estudo
considera-se o caso mais simples onde o substrato (S) transformado
no produto (P) em uma reao catalisada por uma enzima (E). Com as
condies experimentais do meio reacional em estudo prdefinidas
(presso, temperatura, pH, concentraes inicial de substrato e de
enzimas, etc). Supondo-se que seja possvel medir a concentrao do
substrato (ou do produto) com o decorrer do tempo, a partir do
instante em que esta teve incio. Estas medidas permitem configurar
uma curva do tipo que se encontra na Figura 1, a qual traduz a
variao da velocidade de reao com o consumo de substrato (formao do
produto) com o tempo. Na realidade o nico instante em que se
conhece com certeza a concentrao do substrato o tempo inicial, por
isto as velocidades de reaes enzimticas so calculadas nos instantes
iniciais.
aproximadamente, proporcional sua concentrao (o que indica uma
reao de primeira ordem em relao ao substrato), porm para altas
concentraes do substrato, a velocidade tende para um valor
assinttico, designado pela velocidade mxima (Vmax), onde V0 tido
como constante em relao concentrao do substrato (reao de ordem
zero) (Friedman, 1994; Peter, et al., 1987). No incio do sculo XX,
trabalhos realizados por Henri e posteriormente por Leonor
Michaelis e Maud Menten levaram formulao da Teoria do Mecanismo de
Reao Enzimtica mais conhecida at o presente momento; a qual segue
os seguintes passos: Em reao rpida, enzima e substrato formam o
complexo denominado de enzima substrato (ES). Em reao lenta, o
complexo enzimasubstrato forma o produto e liberta a enzima. Esta
reao representada pela Figura 2.k1
E + S ES k2 E + P k 1
Figura 2 Esquema de uma reao enzimtica global, simples. Onde:
k1, k-1 e k2 so constantes cinticas. Como notao foi admitida [E],
[S] e [ES], como as respectivas concentraes de E, de S e de ES. Ao
admitir-se que o sistema reacional esteja em equilbrio, pode-se
definir Ks, como sendo a constante de dissociao do complexo ES,
dada por:
Ks =Figura 1 Curva de desenvolvimento cintico de um sistema
reacional enzimtico. comum indicar a velocidade inicial (V0),
numericamente igual tangente curva de formao do produto com o tempo
(Halpern, 1997; Peter et al.; 1987). Os primeiros estudos
comprovaram que a velocidade de reao enzimtica proporcional
concentrao de enzimas (V0 [E]) e que esta velocidade possui uma
dependncia hiperblica com a concentrao do substrato. Para baixas
concentraes de substrato, a velocidade ,
k 1 [ E ][S ] = [ES] k1
(1)
Esta suposio conhecida como hiptese de equilbrio e s vlida
quando k-1 >>> k2, ou seja, no foi levada em considerao a
complexao da enzima com o produto para retornar ao complexo enzima
substrato (E + P em ES) para determinao da velocidade inicial (V0
), j que [P] = 0 (Voet & Voet, 1995). Em 1925, Briggs e Haldane
propuseram uma hiptese de equilbrio rpido, onde as constantes k-1 e
k-1 so aproximadamente iguais. Estes cientistas verificaram que se
fazendo medidas em pequenos intervalos de tempo, onde a variao da
concentrao do complexo
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ES to pequena que pode ser considerada constante; desta maneira
eles conseguiram observar um estado estacionrio (ou
pseudoestacionrio) para ES. No entanto, para que isto ocorra,
necessrio que a concentrao do substrato seja muito superior de
enzimas, o que acontece na maioria dos sistemas in vitro. Desta
forma, de acordo com a definio de velocidade de reao, tem-se
(Friedman, 1994; Halpern, 1997; Voet & Voet, 1995):
V0 =
Vmx [S ] K m + [S ]
(8)
V0 =
d [P] = k 2 [ES ] dt
(2)
Na Equao 8, Vmax a velocidade mxima da reao e Km a constante de
MichaelisMenten. Quando ocorre um estado de equilbrio rpido
(k-1>>k2), constata-se que a constante de Michaelis-Menten se
aproxima da constante de dissociao do complexo enzimasubstrato
(Halpern, 1997; Peter et al., 1987; Voet & Voet, 1995):
Como difcil medir [ES], logo esta grandeza deve ser substituda.
Para isto, considera-se a hiptese de estado estacionrio e iguala-se
as duas equaes de velocidade (de formao e decomposio do complexo
ES), como descrito abaixo (Peter et al., 1987; Voet & Voet,
1995):
Km =
k 1 = Ks k1
(9)
A Equao 8 tambm comprova a variao hiperblica de V0 com [S]. Um
estudo de dois casos abaixo relatado, os quais apresentam limites
de concentrao de substrato. i) Para baixas concentraes de substrato
([S] > Km); a Equao 8 toma a forma da Equao 6, j que V0 Vmax, o
que esta de acordo com as observaes j mencionadas para os extremos
cinticos de ordem zero e ordem um, em relao ao substrato [S]
(Halpern, 1997; Peter et al., 1987; Voet & Voet, 1995). Para
que seja entendido o significado de Vmax e Km, so feitas as
seguintes igualdades:
E assim por substituio da equao 4.b na equao 3, obtm-se:
[ ES ] =
[E ]0 [S ]k 1 + k 2 + [S ] k1
(5)
V0 = k 2 [ ES ] = k 2 [ E]0 Vmx
(11)
Fazendo-se as seguintes consideraes:
Vmx = k 2 [E ]0e
(6)
Km =
k 1 + k 2 k1
(7)
Esta equao indica que a velocidade mxima ocorre quando todas as
enzimas esto na forma complexada, ES, ou seja, todas as enzimas
esto saturadas de substrato. No entanto se [S] = Km e for
substitudo na Equao 8, tem-se:
Obte-se assim, a equao de Michaelis Menten, dada por:
V0 =
Por meio desta expresso pode-se concluir que o Km corresponde
concentrao do substrato onde se observa que a reao
Vmx 2
(12)
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alcanou um valor mdio da velocidade mxima e a concentrao de
enzimas est 50% saturada. Outros mecanismos podem ser obtidos, como
o que considera tambm o complexo enzima-produto (EP), os que
inserem as influncias do pH, de inibidores, etc; mas todos so
deduzidos, levando-se em considerao as hiptese de Michaelis-Menten.
Mtodo para determinao da velocidade mxima e a constante de
Michaelis-Menten Como a representao grfica da Equao 8 hiperblica, o
valor de Vvax no pode ser obtido exatamente, pois este se torna
assinttico. Contudo, ao se linearizar a expresso de
Michaelis-Menten em funo de 1/V0 e 1/[S], chega-se a:
K 1 1 1 = + m V0 V mx V mx [ S ]
(13)
Esta expresso chamada de equao de Lineweaver-Burk, que uma relao
linear onde 1/Vmax o seu coeficiente linear e Km/ Vmax o seu
coeficiente angular. Ao tocar no eixo das abscissas, esta reta
fornece o valor 1/Km (recproco negativo da constante de
MichaelisMenten), como se observa na Figura 3, que uma representao
esquemtica da linearizao desta equao (Friedman, 1994; Halpern,
1997; Morris, 1979; Peter, et al., 1987; Voet & Voet,
1995).
camada protetora (casca), aleurona, endosperma e o embrio. Este
ltimo composto pelo cotildone, o epictilo (que origina o broto) e a
radcula (que se origina a raiz). Na Figura 4, encontra-se uma
representao esquemtica da germinao de uma monocotiledonea que
ocorre, quando o crescimento da radcula rompe o tegumento da
semente e aparece como uma raiz jovem. A energia para a germinao da
semente vem da respirao e do acar do endosperma. Contudo, o embrio
e o amido esto separados um do outro, ou seja, para que a semente
germine deve haver ao de foras externas para ativar suas funes
fisiolgicas. Naturalmente, h uma pequena atividade biolgica nas
sementes, devido presena das enzimas -amilase que degrada o amido
para produzir a maltose e fornecer energia para manter a atividade
biolgica, nas clulas da semente. A gua, entrando na semente e no
embrio, dissolve uma substncia produzida no interior do embrio.
Esta substncia conhecida como cido giberlico (AG). Este um hormnio
vegetal no muito diferente dos esterides. O AG dissolvido
transportado com a gua pelo restante dos tecidos da semente, at
chegar camada de aleurona. O AG entra no citoplasma dessas clulas,
"ativando" certos genes do DNA nuclear. O DNA , naturalmente, a
molcula hereditria e contm as instrues para fazer todas as protenas
necessrias para a sobrevivncia da planta. O mecanismo preciso sobre
como o AG "ativa" o DNA ainda desconhecido. claro, contudo, que o
modo de ao ligar apenas alguns genes especficos do DNA (Borzani et
al., 1986; Santana, 2003).
Figura 3 Linearizao dos dados cinticos ou mtodo de
Lineweaver-Burk (Morris, 1979). Germinao das sementes de milho O
milho (Zea mays) tem um mono cotildone, e sua semente est dividida
em Figura 4 Esquema da sntese da enzima amilase, em uma semente
monocotiledonea Os genes que so "ligados" so transcritos. A
informao arquivada em DNA preciosa, de modo que as clulas de
aleurona
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Produo e estudo do potencial de hidrlise de uma nova fonte de
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fazem uma cpia "descartvel" em RNA do gene a que est ligado. Est
cpia, como um tipo de projeto, chamada de RNA mensageiro. O
processo de fazer esta cpia chamado transcrio. O RNA que foi feito
no processo de transcrio transportado at o citoplasma das clulas de
aleurona. No citoplasma, o RNA mensageiro se junta ao ribossomo
para comear o processo de produo de uma protena. Este processo
denominado sntese protica ou traduo. Neste processo o ribossomo
examina a informao mantida na seqncia de bases do RNA. RNAs
transportadores carregados com aminocidos especficos so colocados
nas posies especificadas nas instrues do RNA mensageiro e os
aminocidos so agrupados na seqncia certa pelo ribossomo. A seqncia
de aminocidos determina as propriedades da protena que est sendo
montada. Neste caso, a protena crtica feita com a informao mantida
no RNA a -amilase. Esta protena resulta em uma enzima de mesmo nome
que tem grande importncia para a indstria de alimentos (Santana,
2003). Maltagem A maltagem a tcnica de preparo do malte, e constam
de operaes como a macerao, a germinao e a secagem. O processo
altera os gros e esta alterao afeta a composio deles, e estes
diferem conforme o tipo de malte a ser obtido, podendo ser
utilizado nas cervejarias e ou destilarias. Se for destinado para
ser utilizado em cervejarias, que o caso mais comum para as
sementes de cevada, os gros devem ser densos, com endosperma macio
e frivel, sua macerao ser entre 43% a 46% de umidade, aps a
germinao so secos a 4% de umidade em temperaturas variando de 70C a
100C, o que torna o malte mais escuro, reduz sua atividade
enzimtica, d a cerveja uma colorao mais escura, sabor e aroma mais
encorpado (Borzani et al., 1986). No caso do malte para destilaria,
so usados gros menores, com teor protico mais elevado, sendo
macerados na faixa de 45% a 49% de umidade, seca depois de
germinados, de 5% a 7% de umidade, em temperaturas, variando entre
50C a 60C, gerando um malte de maior potencial enzimtico e mais
claro. Suas etapas basicamente so: Limpeza e classificao das
sementes, que, geralmente, so feitas, usando-se peneiras,
ventiladores ou eletroims, isolados ou em conjunto. Depois feita a
macerao, que nada mais que elevar o
teor de umidade na semente at nveis prximos de 45% de umidade,
condio necessria germinao. O tempo de germinao depende da
velocidade com que as enzimas hidrolticas atuam. Segundo Borzani et
al. (1986), para que as sementes de cevada atinjam o mximo de
atividade enzimtica, estas devem apresentar o broto com 1 a 2 vezes
o seu tamanho. A secagem destas sementes (agora malte) necessria
para aumentar a conservao do malte por um maior tempo. A
temperatura empregada no deve exceder as temperaturas timas das
enzimas para evitar a inativao delas. O malte um produto muito
utilizado nas indstrias cervejeiras, e em outras indstrias que
trabalham com processos fermentativos a partir do malte, sendo as
sementes de cevada as mais utilizadas, pelo seu alto poder
enzimtico. Contudo estas sementes no so muito cultivadas em nosso
pas, necessitando a sua importao e, elevando o custo na obteno do
produto. J as sementes de milho, para produzir malte, pode ser uma
alternativa vivel, uma vez que esta cultura bastante difundida no
Brasil, o que torna o custo na obteno do malte menor se comparado
com o da cevada, porm difcil encontrar relatos de estudos da sua
atividade enzimtica com relao ao tempo de germinao, que d suporte a
interrupo do processo, pelo maltador. A literatura, apenas, faz
meno do maior poder enzimtico das sementes de cevada (potencial
tido como 100) que as de milho (tido como 28). Com um estudo das
melhores condies de germinao para que se obtenha a mxima atividade
enzimtica no malte e uma posterior concentrao destas enzimas em PEG
4000, pode-se obter um produto com maior potencial enzimtico e,
assim, poder oferecer ao mercado um novo de malte de milho com alto
potencial de hidrlise de amido. Portanto, o presente trabalho teve
como objetivo a obteno de um derivado do malte de milho obtido por
extrao lquido-lquido em sistema bifsico aquoso PEG/CaCl2 e comparar
seu potencial enzimtico com o malte de milho. MATERIAIS E MTODOS
Macerao das Sementes Sementes selecionadas provenientes da
EMBRAPA-SE foram limpas com gua destilada, para eliminar cidos
volteis e outras substncias retidas na superfcie dos gros, depois
se umedeceram as sementes, at que elas
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atingissem um teor de gua entre 40 a 45%, trocando-se a gua a
cada uma hora. O tempo de durao deste processo foi em torno de 12 a
14 horas, sendo observada a mxima absoro relativa de umidade pelas
sementes, durante a lavagem e nas primeiras 4 horas (Borzani, 1986;
Reguly, 1996; Santana, 2003). Germinao Foi feita em bancada de
laboratrio, onde as sementes midas foram distribudas sobre uma
superfcie artificial. As sementes foram, sempre, umedecidas com
borrifadores de gua destilada, a superfcie era composta de folhas
de papel filtro (tamanho A4) e estas sobre camadas de algodo, para
reter o mximo possvel de umidade na superfcie, evitando, assim, que
as sementes perdessem umidade. A germinao era interrompida entre 8
e o 10 dia, quando se observava o aparecimento de fololos nos
brotos (Borzani et. al., 1986; Santana, 2003). Amostragem As
amostras foram coletadas, diariamente, em um mesmo horrio, sendo
depois modas em moinho de parafuso e uma pequena massa variando
entre 1,0 g a 2,0g dela foi solubilizada a 50 mL em soluo de NaCl e
CaCl2 a 3 e 2 g/L, respectivamente, (Santana, 2003). Determinao da
atividade enzimtica da amilase nas sementes Foi feita pelo Mtodo de
Wohlgenuth, modificado por Sandstedt, Kneen, Blish, o qual se
baseia na dextrinizao de certa massa de amido solvel que, sob
influncia de um excesso de -amilase, pela -amilase em uma hora,
sendo sua unidade usual dada em SKB (Reguly, 1996). Com base neste
mtodo foram utilizados volumes variados das amostras (dependendo da
atividade), para dextrinizar 20 mL de uma soluo de amilodextrina 2%
a 30C. A anlise foi feita por comparao colorimtrica com um padro de
iodo/dextrina. O mtodo do DNS, ou do Miles Laboratory, tambm, foi
utilizado para medir a variao da concentrao de acares redutores com
o tempo de incubao, no estudo cintico enzimtico, descrito a seguir
(Reguly, 1996). Quantificao da protena total Foi feita pelo mtodo
de Bradford (1976), o qual consistiu em coletar amostras,
adicionar nestas o reagente Coomasie Biliante Blue e medir sua
absorbncia a 595 nm. A concentrao de protenas encontrada ao se
comparar a absorbncia da amostras na curva de calibrao obtida com a
protena padro BSA (soro de albumina bovina). Recuperao das enzimas
A partir do sistema bifsico aquoso de composio 25% PEG 4000 e 1,8 %
de CaCl2, as enzimas em malte de milho foram recuperadas. Uma soluo
de malte a 2% em CaCl2 foi introduzida com o auxlio de uma
micro-seringa na fase inferior do sistema. Esperou que o equilbrio
fosse estabelecido (24 a 48 h). Recolheram-se amostras de ambas as
fases e, nelas, mediu-se a concentrao de protena total para que
estas fossem utilizadas nos ensaios de cintica. Cintica de hidrlise
do amido Foram feitos estudos comparativos de cintica enzimtica
entre as enzimas e amilases do extrato em malte de milho e do
extrato em PEG 4000. Utilizou-se o pH 5,0 e as temperaturas de 75C
e 55, j que estas variveis esto prximas das condies timas das
-amilase e -amilase, respectivamente. Para tanto, foram preparadas
solues de amido a 10 g/L e 0,2 g/L em pH 5,0, e a partir destas
foram feitas as devidas diluies para fornecer concentraes dentro
das especificaes da metodologia que se baseia nas condies limite do
substrato (Friedman, 1994; Peter et al., 1987). Possibilitando
desta forma, observar se o PEG atua como inibidor ou ativador
destas enzimas, enquanto que a temperatura definiu qual das enzimas
encontra-se mais ativa no extrato em PEG 4000. Para este estudo,
usou-se como base matemtica para obteno dos modelos cinticos a
metodologia de Michaelis-Menten, que se baseia na determinao das
velocidades iniciais de reao nas condies limites do sistema
reacional, ou seja: 1- Para baixas concentraes de substrato ([S]
> Km). A linearizao do modelo foi feita seguindo a metodologia
de Lineweave-Burk. A determinao da concentrao de acares redutores
gerados no meio foi feita segundo o Mtodo do Milles Laboratory
(Reguly, 1996).
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Produo e estudo do potencial de hidrlise de uma nova fonte de
enzimas amiloltcas ...... Evangelista et al.
RESULTADOS E DISCUSSO Na Tabela 1, encontram-se os dados de
atividade enzimtica das sementes de milho, durante a germinao em
escala laboratorial. Foram realizados trs ensaios num mesmo perodo
com as sementes de uma mesma safra. Todos os ensaios foram
realizados em triplicata e seus valores mdios esto na Tabela 1.
Tabela 1 Dados experimentais de atividade enzimtica durante a
germinao das sementes de milho Tempo Atividade Enzimtica (SKB)
(dias) Ensaio 01 Ensaio 02 Ensaio 03 0 0,157 0,117 0,0762 1 0,234
0,234 0,25 2 2,182 2,074 1,959 3 5,714 5,648 5,581 4 21,818 24,242
26,667 5 6,667 8,386 10,105 8 5,714 7,48 8,727 Na Figura 5,
encontra-se o crescimento da atividade enzimtica (AE) das amilases,
durante o decorrer de um perodo de 8 dias, para trs ensaios com
amostras de uma mesma variedade de milho, de mesma poca de
colheita, germinadas no mesmo perodo, com umidade controlada e nas
condies ambientais de temperatura e presso. Nesta figura, pode ser
observado que a atividade enzimtica, durante a germinao, apresenta
comportamento semelhante para ambos os ensaios. V-se que a
atividade enzimtica apresenta crescimento lento at o terceiro dia
aps as sementes serem postas a germinar, sendo que no quarto dia
alcanam seu valor mximo em ambos os experimentos, gerando um pico
nos grficos, para depois cair a um valor constante. de se esperar,
inicialmente, uma taxa de atividade enzimtica baixa nas sementes
(quase que exclusiva devido presena das -amilases) j que estas
ainda esto em estado de dormncia. Quando a gua penetra na semente,
facilita o transporte de glicerdeos (formas pela -amilase) e do
cido giberlico (AG) para as camadas de aleurona onde, os primeiros
fornecero energia para alimentar as clulas, enquanto que o segundo
ativa os genes do DNA, responsveis pela formao das -amilases. Com
isto, percebe-se que esta gerao de enzimas, a princpio, lenta,
acelerando, posteriormente, at alcanar seu valor mximo, no quarto
dia, quando a
concentrao de produtos gerados pelas enzimas faz com que parte
destas sejam inibidas e sua atividade se reduza a um valor
constante (Santana, 2003). Na Figura 5, perceptvel observar um
comportamento da atividade enzimtica semelhante a uma curva do tipo
exponencial, na etapa de crescimento enzimtico (primeira parte
antes dos picos nos grficos). Logo este comportamento pode ser
modelado semelhante ao da taxa de crescimento microbiano, do tipo y
=y0 eb x. Ento, neste estudo, para provar que esta analogia vlida,
fizeram-se as seguintes denominaes: AE, ser a simbologia usada para
a atividade enzimtica (neste caso em SKB); AE0, a atividade
enzimtica das sementes 'in natura' ou a atividade inicial das
sementes (SKB); t, o tempo de germinao das sementes (em dias); E a
taxa de crescimento da atividade enzimtica da semente caracterstica
para cada variedade. Desta forma, o modelo para este trabalho : AE
= AE0 et
(14)
A partir de um ajuste exponencial dos dados de atividades
enzimticas (valores mdios), obtidos, experimentalmente, em escala
laboratorial, Tabela 01, foram encontrados os valores dos parmetros
AE0 e . Esses valores encontram-se nas equaes 15, 16 e 17. Como se
pode observar a taxa de crescimento enzimtico () apresenta um valor
prximo de 1,362 s-1 (0,133 de desvio, 9,8% de erro), mostrando que
este valor caracterstico para a variedade estudada. Contudo, mesmo
em amostras de uma mesma safra, a atividade destas no estado
natural (atividade inicial, AE0) no pode ser considerada como
constante, j que seu valor mdio ficou em torno de 0,110 e sua
oscilao foi de 44 % (0,048 de desvio padro), ou seja, este valor
caracterstico das amostras, embora seus gentipos sejam parecidos.
Na Figura 6, esto as curvas geradas pelos modelos empricos (equaes
15, 16 e 17) que correlacionam a atividade enzimtica com o tempo de
germinao das sementes de milho. Percebe-se que as curvas
representam satisfatoriamente os dados experimentais, pois os
coeficientes de correlao encontram-se prximos ao do valor mximo
(1,0), indicando assim, um bom ajuste dos modelos.
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v.7, n.1, p.1-14, 2005
Produo e estudo do potencial de hidrlise de uma nova fonte de
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AE(1) = 0,1643 e1,2197 t R = 0,9986 AE(2) = 0,0944 e R =
0,990230
(15) (16)
. AE(3) = 0,0727e1,4821 t R = 0,9958 (17)
1,3851 t
25
E n s a io 0 1 E n s a io 0 2 E n s a io 0 3
20
AE (SKB)
15
10
5
0
0
2
4
6
8
T e m p o ( d ia s )
Figura 5 Comportamento da atividade enzimtica (AE) durante o
decorrer da germinao das sementes de milho.30
25
20
AE (SKB)
15
10
5
0 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5
Tempo (dias)1 Ensaio 2 Ensaio 3 Ensaio Expon. (3 Ensaio) Expon.
(2 Ensaio) Expon. (1 Ensaio)
Figura 6 Grfico da dependncia da atividade enzimtica (AE) com o
tempo de germinao de acordo com o modelo emprico Cintica
comparativa entre as amilases de malte de milho in natura e em PEG
Este estudo foi baseado, exclusivamente, na equao de cintica
enzimtica proposta por Michaelis-Menten, que usa as concentraes de
substrato no limites inferior e superior da curva gerada pela equao
de cintica. A aplicao de uma regresso linear dos recprocos das
concentraes do substrato e das velocidades iniciais na equao
linearizada da curva de cintica enzimtica, segundo a metodologia
aplicada por Lineweaver-Burk (Morris, 1979; Voet & Voet, 1995),
foi usada para determinao das constantes de MichaelisMenten (Km) e
de cintica da reao (kcat), e a velocidade mxima de reao (Vmax). Nas
Figuras de 7 a 12, encontram-se os comportamentos das cinticas
enzimticas, proposta por Michaelis Menten, das enzimas e -amilases
de malte de milho nos estados in natura e em meio contendo PEG
4000.
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Produo e estudo do potencial de hidrlise de uma nova fonte de
enzimas amiloltcas ...... Evangelista et al.
Todas as curvas foram determinadas em microbioreatores de 5,0
mL, que contm como substrato o amido a concentraes variadas em
tampo fosfato a pH 5,0 (prximo do timo das duas enzimas) e a
temperaturas de 75 2 C e 55 2C e (timos da e -amilases,
respectivamente). Percebe-se que em ambas as figuras as curva
geradas pelas enzimas em PEG, apresentam valores maiores em suas
regies assintticas que as curvas geradas pelas enzimas em malte de
milho. Sendo assim, as primeiras possuem velocidades mximas maiores
que as segundas, j que nesta regio se encontram os valores quase
constantes de Vmx. Isto indica que as enzimas em extrato de malte
possuem uma atividade menor que as enzimas em extrato de PEG 4000,
pois necessitam de
um tempo maior para hidrolisar totalmente uma mesma massa de
amido. O que tambm pode ser comprovado ao se observar as Figuras 8
e 10, que se referem s curvas anteriores linearizadas pelo mtodo de
Liweneaver-Burk. Nestas ltimas figuras, pode-se comparar melhor s
atividades das enzimas em malte de milho com as recuperadas em PEG,
pois o coeficiente linear destas retas o recproco da velocidade
mxima, logo aquela que apresentou um menor valor deste coeficiente
possui uma maior atividade enzimtica. Este fato comprova que o PEG
agente ativador destas enzimas como j foi percebido por outros
autores (Malinowski, 2001), alm de ser um meio propcio para a
catalise sem contaminao dos produtos, com uso liberado pelo FDA em
alimentos (Harris, 1992).Amilases em malte Amilases em PEG 4000
0,7 0,6 0,5
V (g/L.m in)
0,4 0,3 0,2 0,1 0,0 -0,5 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5
[S] (g/L)
Figura 7 Cinticas de hidrlise do amido, a pH 5,0 e 75C.Amilases
em malte Amilases em PEG 40005,5 5,0 4,5 4,0
1 /V
3,5 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 -50 0 50 100 150 200 250 300 350 400
1/[S]
Figura 8 Linearizao pelo mtodo de Lineweaver Burk das curvas de
hidrlise do amido, a pH 5,0 e 75C.Revista Brasileira de Produtos
Agroindustriais, Campina Grande, v.7, n.1, p.1-14, 2005
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As Figuras 11 e 12 representam a comparao entre as curvas de
cintica normal e linearizada das enzimas recuperada em PEG nas
temperaturas de 55 2C e 75 2C. Observa-se por comparao que em ambas
h uma superao dos dados das enzimas em PEG a 75C sobre as enzimas
em PEG a 55C, de forma que ambas as figuras demonstram que na
primeira temperatura as enzimas possuem uma
atividade maior, ou seja, h uma maior percentagem das -amilases
que as -amilases no extrato enzimtico em PEG, j que as primeiras
possuem atividade tima para o pH e a temperatura prxima de 5,0 e
75C, respectivamente, e as segundas enzimas perderem sua atividade
medida que se eleva a temperatura alm do seu timo, 55C.
Amilases em malte Amilases em PEG0,65 0,60 0,55 0,50
V(g .m ) /L in
0,45 0,40 0,35 0,30 0,25 0,20 -0,5
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
[S] (g/L)
Figura 9 Cinticas de hidrlise do amido, a pH 5,0 e 55C.
3,6 3,4 3,2 3,0 2,8 2,6
Amilases em malte Amilases em PEG
1 /V
2,4 2,2 2,0 1,8 1,6 1,4 -100
0
100
200
300
400
500
600
700
800
1/[S]
Figura 10 Linearizao pelo mtodo de Lineweaver Burk das curvas de
hidrlise do amido, a pH 5,0 e 55C. Este fato tambm comprovado pelos
dados obtidos aps linearizao das equaes de cintica, j que a
velocidade mxima (Vmax) e a constante cataltica (kcat) do
extrato
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Produo e estudo do potencial de hidrlise de uma nova fonte de
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enzimtico em PEG a 75 superam os valores destas constantes para
o extrato enzimtico em
PEG a 55C.
75 C 55 C0,7
0,6
0,5
V(g .m ) /L in
0,4
0,3
0,2
0,1 -0,5
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
[S]Figura 11 Comparao entre as curvas de cintica de hidrlise do
amido nas temperaturas de 55C e 75C, utilizando as amilases em PEG
4000, a pH 5,0.75 C 55 C5,5 5,0 4,5 4,0
1 /V
3,5 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0 100 200 300 400 500 600 700 800
1/[S]Figura 12 Comparao entre as curvas de hidrlise do amido
linearizadas nas temperaturas de 55C e 75C, utilizando as amilases
em PEG 4000, a pH 5,0. A seguir so descriminadas as equaes 18, 19,
20 e 21 que contem os valores dos parmetros dos modelos de cintica
enzimtica, segundo Michaelis-Menten linearizados por Lineweaver
Burk. As equaes de nmeros pares representam as curvas de cintica
linearizadas para as enzimas em malte de milho e as de nmeros
mpares representam as enzimas recuperadas em PEG 4000, a 75 e 55C,
respectivamente. Abaixo destas equaes encontram-se os valores das
respectivas correlaes mltiplas (R2), da velocidade mxima (Vmx), da
constante de Michaelis Menten (Km) e da constante cataltica (kcat),
com suas devidas unidades. Para os clculos das constantes cinticas,
consideraram-se as concentraes de enzimas, [E], como sendo s
medidas das concentraes de protena total nos
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extratos, as quais foram: 0,01014 g/L e 0,004979 g/L, nos
extratos enzimticos em malte e em PEG, respectivamente. 1 - Modelo
cintico linearizado para as enzimas em extrato de PEG a 75C. 1 1 =
0,0101 + 1,533 V [S]R2 = 0,9964 Vmx = 0,6523 (g / L. min) Km =
0,006588(g / L) kcat = 1310 (min1 ) ,
(18)
2 - Modelo cintico linearizado para as enzimas em extrato do
malte de milho a 75C. 1 1 = 0,0097 + 1,808 V [S]
R2 = 0,9970 Vmx = 0,5529 (g / L. min) Km = 0,01754 (g / L) kcat
= 54,51 (min1 )
(19)
3 Modelo cintico linearizado para as enzimas em extrato de PEG a
55C. 1 1 = 0,0024 + 1,616 V [S]R 2 = 0,9981 Vmx = 0,6189 (g / L.
min) Km = 0,001485 ( g / L) kcat = 124,3 (min1 )
estudo, que no quarto dia de germinao as sementes de milho, tem
a sua mxima atividade enzimtica, sendo considerado ponto timo para
o processo de maltagem dessas sementes; O estudo cintico enzimtico
comparativo entre as enzimas e -amilases nas formas de malte de
milho e de extrato em PEG 4000, ambos a pH 5,0 e temperaturas de 55
2C e 75 2C, demonstrou que as enzimas recuperadas em PEG 4000
possuem uma maior velocidade mxima, para ambas as temperaturas, que
as enzimas em malte de milho, o que j foi comprovado durante a
partio em batelada, onde o valor da atividade especfica do extrato
enzimtico em PEG foi superior ao extrato enzimtico em malte a
temperatura ambiente (30 2C); Tambm se pode concluir que h uma
maior atividade das enzimas -amilases que as -amilases, ao serem
comparados as constantes cinticas e a velocidade de mxima de reao,
obtidos nas devidas temperaturas e pH timos de cada enzima (75C e
55C), percebeu-se que os valores da primeira superaram os valores
da segunda. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS Albertsson, P. - . Partition
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Questions and Explanation.
(20)
4 - Modelo cintico linearizada para as enzimas em extrato do
malte de milho a 55C. 1 1 = 0,0024 + 1,538 V [S]R 2 = 0,9991 Vmx =
0,6504 (g / L. min) Km = 0,003690 (g / L) kcat = 64,17 (min1 )
(21)
CONCLUSES A plotagem dos dados de tempo em dias e atividade
enzimtica em SKB, resultou numa curva em forma de pico, onde a
mxima atividade das sementes, foi observada no quarto dia de
germinao e at a formao do pico a atividade enzimtica (AE) uma funo
exponencial do tempo (t), do tipo: AE = A0 e t, onde AE0 a
atividade da semente 'in natura' e a taxa de crescimento da
atividade enzimtica da semente caracterstica de cada variedade,
anlogo ao crescimento de microrganismos. Concluiu-se, tambm,
neste
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v.7, n.1, p.1-14, 2005
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Produo e estudo do potencial de hidrlise de uma nova fonte de
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