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Portugal
Mendoza-Muoz, Nstor;Pin-Segundo,
Elizabeth;Ganem-Quintanar,Adriana;Quintanar-Guerrero, David
PREPARACIN Y EVALUACIN IN VITRO DE NANOPARTCULAS
POLIMRICASBIODEGRADABLES COMO AGENTE DE CONTRASTE PARA
ULTRASONIDO
Tip Revista Especializada en Ciencias Qumico-Biolgicas, Vol. 10,
Nm. 1, junio-sinmes, 2007, pp. 14-20
Universidad Nacional Autnoma de MxicoMxico
Cmo citar? Nmero completo Ms informacin del artculo Pgina de la
revista
Tip Revista Especializada en Ciencias Qumico-BiolgicasISSN
(Versin impresa): [email protected] Nacional
Autnoma de MxicoMxico
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desarrollado bajo la iniciativa de acceso abierto
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TIP Rev.Esp.Cienc.Qum.Biol.14 Vol. 10, No. 1
RRRRRESUMENESUMENESUMENESUMENESUMENLos agentes de contraste para
ultrasonido hasta ahora disponibles en el mercado, no permiten la
deteccineficiente de tumores en diversos rganos, la miniaturizacin
de este tipo de sistemas a escala nanomtricapodra resolver este
problema. La finalidad de este trabajo fue la adaptacin del mtodo
de desplazamiento desolvente que permitiera la preparacin de
nanopartculas huecas, a partir de la encapsulacin de un
ncleosublimable (naftaleno), para despus caracterizarlas desde el
punto de vista de tamao, densidad y morfologa,as como llevar a cabo
su evaluacin in vitro mediante un sistema de ultrasonido comercial.
Las nanopartculaspreparadas tuvieron un dimetro entre 50-400 nm
logrando una eficiencia de entrampamiento del 66.55% denaftaleno.
Mediante liofilizacin se retir un 98% de la cantidad de naftaleno
encapsulada, sin embargo, deacuerdo con las micrografas obtenidas
por microscopa electrnica de barrido y de transmisin no se
evidencila presencia de huecos en la matriz polimrica adems la
densidad fue similar para las preparaciones connaftaleno y
nanoesferas formadas nicamente con polmero, por otro lado, los
resultados de la evaluacin invitro sugieren un aumento en la
ecogenicidad de las preparaciones que contienen nanopartculas,
encomparacin con aquellas soluciones en donde no estn
presentes.Palabras Clave: Agentes de contraste, desplazamiento de
solvente, liofilizacin, nanopartculas, ultrasonido.
AAAAABSTRACTBSTRACTBSTRACTBSTRACTBSTRACTUltrasound contrast
agents available in the market do not allow the efficient detection
of tumors in diverseorgans. The miniaturization of this kind of
systems on nanometric scale could solve this problem. The purposeof
this work was to adapt the solvent displacement method in order to
obtain the hollow nanoparticles fromthe encapsulation of a
sublimate nucleus (naphthalene), characterizing them for their
size, density andmorphology. An in vitro evaluation by means of a
commercial ultrasound system was also performed.Nanoparticles with
a diameter of 50-400 nm and an entrapment efficiency of 66.55% of
naphthalene wereobtained. Lyophilization allow to take off 98% of
the encapsulated amount of naphthalene, however, themicrographs
obtained by scanning electronic microscopy and transmission, did
not demonstrate the presenceof pores or hollows in the polymeric
matrix. In addition, the density of the preparations with
naphthalene wassimilar to the systems with nanospheres formed only
by polymer. Nevertheless, in vitro results suggest an increasein
echogenicity for those preparations containing nanoparticles, in
comparison with those solutions withoutnanoparticles.Key Words:
Contrast agents, solvent displacement, lyophilization,
nanoparticles, ultrasound.
D.R. TIP Revista Especializada en Ciencias Qumico-Biolgicas,
10(1):14-20, 2007
PPPPPREPREPREPREPREPARACINARACINARACINARACINARACIN YYYYY
EVEVEVEVEVALUACINALUACINALUACINALUACINALUACIN INININININ
VITROVITROVITROVITROVITRO DEDEDEDEDE
NANOPNANOPNANOPNANOPNANOPARARARARARTCULASTCULASTCULASTCULASTCULASPOLIMRICASPOLIMRICASPOLIMRICASPOLIMRICASPOLIMRICAS
BIODEGRADABLESBIODEGRADABLESBIODEGRADABLESBIODEGRADABLESBIODEGRADABLES
COMOCOMOCOMOCOMOCOMO AGENTEAGENTEAGENTEAGENTEAGENTE DEDEDEDEDE
CONTRASTECONTRASTECONTRASTECONTRASTECONTRASTE
PPPPPARAARAARAARAARA
ULULULULULTRASONIDOTRASONIDOTRASONIDOTRASONIDOTRASONIDO
Nstor Mendoza-Muoz, Elizabeth Pin-Segundo,Nstor Mendoza-Muoz,
Elizabeth Pin-Segundo,Nstor Mendoza-Muoz, Elizabeth
Pin-Segundo,Nstor Mendoza-Muoz, Elizabeth Pin-Segundo,Nstor
Mendoza-Muoz, Elizabeth Pin-Segundo,Adriana Ganem-Quintanar y David
Quintanar-GuerreroAdriana Ganem-Quintanar y David
Quintanar-GuerreroAdriana Ganem-Quintanar y David
Quintanar-GuerreroAdriana Ganem-Quintanar y David
Quintanar-GuerreroAdriana Ganem-Quintanar y David
Quintanar-Guerrero
Divisin de Estudios de Posgrado (Tecnologa Farmacutica),
Facultad de Estudios SuperioresCuautitln, Universidad Nacional
Autnoma de Mxico. Av. 1 de Mayo s/n, Cuautitln Izcalli,
C.P. 54740, Estado de Mxico. E-mail:
[email protected],[email protected],,
[email protected], [email protected].
Nota: Artculo recibido el 20 de marzo de 2007 y aceptado el 14
demayo de 2007.
ARTCULO ORIGINAL
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15Mendoza-Muoz, N. et al.: Preparacin y evaluacin de
nanopartculas huecasjunio, 2007
na de las modalidades imagenolgicas con mayoraceptacin y uso en
el mbito mdico es el ultrasonido(US), ya que presenta diversas
ventajas sobre otrascomo los rayos X, la resonancia magntica
nuclear yla tomografa computarizada. Algunas de estas ventajas
son: su bajo costo (tanto en equipo como en precio del
estudio),no es invasivo, es en tiempo real y no usa radiacin
ionizante1.
Sin embargo, la principal desventaja del diagnstico medianteUS
es la dificultad de diferenciar entre el tejido anormal y
elsaludable debido a las propiedades acsticas similares, por loque,
las seales recibidas producen imgenes que tienen bajocontraste2.
Esta situacin ha conducido al desarrollo de losagentes de contraste
para US (ACUS) los cuales estn diseadoscon el objetivo de aumentar
la diferencia de seales entre el tejidode inters y sus alrededores.
Un ACUS es un sistema capaz dealterar la absorcin, reflexin o
refraccin de las ondasultrasnicas3.
Los inicios de los ACUS se reportan en la publicacin de Gramiaky
Shah4 (1968), quienes al inyectar verde de indocianuro en aortade
conejo obtuvieron un mejor contraste debido a las burbujasde aire
generadas por cavitacin. A partir de este hecho se hanpropuesto
diversos sistemas partiendo del principio de que losgases tienen
menor densidad y mayor compresibilidad, que ensu conjunto son
capaces de aumentar la seal acstica reflejada.Actualmente los ACUS
disponibles en el mercado se componende micropartculas de 3 a 10 m
de dimetro llenas de aire uotros gases, estos sistemas reciben el
nombre genrico demicroburbujas.
A pesar del avance que ha representado la introduccin de
lasmicroburbujas para el diagnstico ultrasnico, an no es posiblela
deteccin eficiente de tumores; esta limitacin est relacionadaen
parte con el actual tamao de los ACUS comercialmentedisponibles. Se
ha sugerido que la miniaturizacin de estossistemas podra mejorar la
capacidad para detectar tumores enuna gran variedad de rganos, como
hgado, rin, pncreas,etc.5 Por otra parte, el tener partculas
relativamente grandesaumenta en mucho la posibilidad de presentar
efectos adversostales como la tromblisis y lisis celular, entre
otros6.
Hasta la fecha, muy pocos trabajos han sido publicados acercadel
desarrollo de ACUS a escala nanomtrica. Wheatley y cols.7(2004)
lograron separar por centrifugacin poblaciones de tamaonanomtrico
(450-690 nm) de una suspensin de microburbujasobtenidas mediante
sonicacin de una solucin de Span 60 yTween 80 en presencia de
octafluoropropano. Sin embargo, laprincipal desventaja de estas
nanoburbujas es su pocaestabilidad in vitro. Adicionalmente, un
trabajo reciente de estosmismos autores ampli la informacin acerca
de este tipo desistemas, pero sin poder solucionar el problema de
estabilidad8.Asimismo, Bloch y cols.9 (2005) han descrito la
preparacin de
IIIIINTRODUCCINNTRODUCCINNTRODUCCINNTRODUCCINNTRODUCCIN
UUUUUACUS de 740 y 910 nm. La metodologa reportada por Bloch
ycolaboradores consisti en una modificacin de la tcnicaempleada y
patentada por POINT Biomedical Inc. (2005) para lapreparacin de
microburbujas de nitrgeno envueltas en unadoble pared, la exterior
de naturaleza protenica y la interiorcompuesta por un polmero
biodegradable, este ACUS sedenomin biSphere y el trabajo resulta
muy interesante debidoa la incursin de las nanopartculas polimricas
como agentes decontraste.
Por otra parte, las tcnicas usadas para la elaboracin
denanopartculas a partir de polmeros preformados pueden seruna
alternativa para la elaboracin de ACUS de tamaonanomtrico, estas
tcnicas son utilizadas principalmente parael desarrollo de sistemas
acarreadores de frmacos. En esesentido, el mtodo de desplazamiento
de solvente es uno de losms difundidos debido a que es fcil y
simple de implementar.Esta tcnica fue descrita y patentada por
Fessi y cols.10 (1998),en este proceso, polmero, frmaco y,
opcionalmente, unestabilizante lipoflico son disueltos en un
solvente semipolarmiscible con el agua, como acetona o etanol, esta
solucin esvertida o inyectada dentro de una solucin acuosa que
contieneun estabilizante bajo agitacin magntica. Las
nanopartculasson formadas instantneamente por la rpida difusin
delsolvente, el cual es eliminado mediante presin reducida.
Elmecanismo de formacin de las nanopartculas por esta tcnicaha sido
explicado por la turbulencia interfacial que se generadurante el
desplazamiento del solvente. La violenta difusin delsolvente es
debida a la mutua miscibilidad entre los solventes,entonces,
glbulos de solvente probablemente de tamaonanomtrico, son formados
en torno a la interfase. Estos glbulosson rpidamente estabilizados
por el agente estabilizante, hastala difusin completa del
solvente11.
El objetivo de este trabajo es proponer una metodologa
paraelaborar nanopartculas huecas las cuales puedan
serpotencialmente usadas como agente de contraste en
ultrasonidomediante la encapsulacin de un ncleo voltil, as como
llevara cabo la caracterizacin fisicoqumica de las
nanopartculasobtenidas y su evaluacin in vitro en un sistema de
ultrasonidocomercial.
MMMMMATERIALESATERIALESATERIALESATERIALESATERIALES YYYYY
MTODOSMTODOSMTODOSMTODOSMTODOSMaterialesMaterialesMaterialesMaterialesMaterialesAlcohol
polivinlico (PVAL) Mw 26 000 y 98% hidrolizadoobtenido de Glomarza
(Mxico); copolmero de cido lctico-co-gliclico 50:50 (PLGA); resomer
RG 502 H de BoehringerIngelheim (Alemania); naftaleno grado
reactivo adquirido deMerk (Alemania); percoll (suspensin de slica
coloidal)obtenido de Fluka (Suiza); marcadores de densidad
(consistentesde microesferas de dextrn de densidad conocida)
obtenidos dePharmacia Biotech AB (Suecia); los solventes acetona
gradoanaltico de Fermont (Mxico) y agua desionizada obtenida
porsmosis inversa del sistema RiOs Millipore (USA). Todos los
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TIP Rev.Esp.Cienc.Qum.Biol.16 Vol. 10, No. 1
otros reactivos fueron de grado analtico y usados sin
posteriorpurificacin.
MMMMMTODOSTODOSTODOSTODOSTODOSPreparacin y caracterizacin de las
nanopartculasPreparacin y caracterizacin de las
nanopartculasPreparacin y caracterizacin de las
nanopartculasPreparacin y caracterizacin de las
nanopartculasPreparacin y caracterizacin de las nanopartculasLas
nanopartculas se prepararon por el mtodo dedesplazamiento de
solvente, para ello se disolvieron 300 mg dePLGA y la cantidad de
naftaleno requerida para la preparacin(37.5 75 mg, 12.5 y 25%
respectivamente) en 25 mL de acetona,posteriormente esta solucin se
inyect lentamente en 50 mL deuna solucin acuosa de PVAL al 5%, bajo
agitacin magnticamoderada. Despus de 5 minutos de agitacin, se
retir elsolvente y la dispersin se concentr hasta aproximadamente
25mL bajo presin reducida, por medio de un rotavapor.
Lasnanopartculas fueron separadas mediante
ultracentrifugacin(Ultracentrfuga Optima LE-80K, Beckman, USA) a 30
000 rpmpor 30 minutos utilizando un rotor 50.2 Ti. El sobrenandante
fuedesechado y la pastilla formada resuspendida en agua
desionizadamediante agitacin magntica durante toda la noche,
esteprocedimiento de lavado se llev a cabo tres veces.
La eficiencia de entrampamiento (EE) fue calculada de acuerdocon
la siguiente ecuacin12:
(1)
Donde CN corresponde a la cantidad cargada de naftaleno la
cualse calcul de la siguiente manera12:
(2)
El porcentaje inicial de naftaleno corresponde a la
cantidadterica de naftaleno cargado y fue calculado a partir del
peso denaftaleno usado en la preparacin dividido entre el peso
delpolmero usado en la preparacin y el peso del naftaleno.
Pararetirar el naftaleno encapsulado se procedi a liofilizar
lasnanopartculas obtenidas, para ello la suspensin denanopartculas
fue congelada a 15C y secada durante 72 horasa una presin < 100
Bar en un liofilizador Labconco FreeZone(USA). El dimetro de las
nanopartculas se determin mediantela tcnica de dispersin de luz
lser (Coulter N4 Plus, Coulter,USA). La longitud de onda de la luz
lser (He/Ne, 10 mW) fue de678 nm. Las mediciones fueron hechas a un
ngulo de 90 durante180 s, a una temperatura de 25C. Las
dispersiones fuerondiluidas con agua desionizada para asegurar que
el nmero departculas contadas por segundo estuviera dentro del
rango desensibilidad del instrumento. Las medidas fueron hechas
portriplicado para todos los lotes preparados. Se observ
lamorfologa de las nanopartculas recubiertas con una pelcula deoro
de 20 nm con un microscopio electrnico de barrido JEOLJMS-25SII
(Japn) a 12.5 kV, mientras que la estructura fueobservada con un
microscopio electrnico de transmisin JEOL
JEM-2010 (Japn) a 200 kV. La determinacin de la densidad
fuellevada a cabo mediante la separacin de las nanopartculas enun
gradiente de slica coloidal formado in situ durante
laultracentrifugacin en un rotor modelo 90Ti (Beckman, USA) a5C y
10, 000 rpm durante 3 horas. En el tubo de centrfuga
fueroncolocados 7.5 mL de Percoll al 45 % v/v en NaCl 0.15 M
juntocon 200 L de la dispersin de las nanopartculas. En un tubo
porseparado, fueron colocados marcadores de densidadconstituidos
por micropartculas de diferentes densidades,adicionados bajo las
mismas condiciones que las muestras yusados para la calibracin
externa de las bandas formadas. Ladistancia entre la parte superior
del menisco y la banda (altura)fue determinada mediante un Vernier
(Digitex , USA). La densidadde las nanopartculas fue situada
grficamente mediante lainterpolacin de su altura en una curva
obtenida a partir de lasalturas de los marcadores de diferente
densidad.
EvaluacinEvaluacinEvaluacinEvaluacinEvaluacin in vitro in vitro
in vitro in vitro in vitroSe construy un dispositivo formado por un
tubo deultracentrfuga (16 x 76 mm) de policarbonato, el cual se
perforcon la finalidad de formar dos ventanas centradas y opuestas
de10 x 50 mm. Posteriormente, el tubo se forr con ltex (obtenidode
un guante quirrgico) y fue sellado con un tapn de baquelita.El tapn
de baquelita se perfor de tal forma que se introdujo unamanguera de
2 mm de dimetro la cual se conect a una jeringade 20 mL (Figura 1).
En dicho dispositivo se inyectaron 15 mL dela dispersin de
nanopartculas en una concentracin deaproximadamente 5x108
partculas/mL determinada por medio delNanosizer N4 Plus (Coulter,
USA). Despus, el dispositivo fuesometido al ultrasonido por el lado
de la ventana utilizando comoamplificador una bolsa de acoplamiento
(bolsa con agua)colocada debajo del dispositivo, el estudio se
realiz con unequipo de US comercial en modo B marca Mitsubishi,
equipadocon un transductor convexo, trabajando a una frecuencia
centralde 3.5 MHz, la imagen obtenida fue impresa directamente
delequipo, digitalizada y convertida en escala de grises a 8
bitsutilizando un scanner Hewelt Packard Modelo 5100C a
unaresolucin de 600 dpi. Dicha imagen fue analizada mediante
elsoftware Image v.1.35p (National Institutes of Health, USA),para
ello se defini la regin de inters (RDI) correspondiendoen lo
posible a la ventana del dispositivo y se obtuvo el valorpromedio
de la escala de grises (VPEG), as como el
histogramacorrespondiente.
RRRRRESULTADOSESULTADOSESULTADOSESULTADOSESULTADOS YYYYY
DISCUSINDISCUSINDISCUSINDISCUSINDISCUSINPreparacin de las
nanopartculasPreparacin de las nanopartculasPreparacin de las
nanopartculasPreparacin de las nanopartculasPreparacin de las
nanopartculasEl mtodo de desplazamiento de solvente permiti
prepararnanopartculas de PLGA de tamao submicrnico con un
dimetropromedio 150 nm y una estrecha distribucin monodispersa(50-
400 nm), no se encontr diferencia significativa en eldimetro
promedio entre la preparacin al 12.5 % y la de 25 % denaftaleno. La
eficiencia de encapsulamiento fue de 66.55%. Bajolas condiciones de
la liofilizacin se logr sublimar un 98% de lacantidad total
encapsulada, quedando un 2% de naftaleno
CN(%) = x 100Peso de naftaleno en las nanopartculas
Peso recuperado de nanopartculas
EE(%) = x 100CN(%)
Porcentaje inicial de naftaleno
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17Mendoza-Muoz, N. et al.: Preparacin y evaluacin de
nanopartculas huecasjunio, 2007
residual, estos datos muestran que los materiales voltiles
osublimables como el naftaleno, cuyo punto de sublimacin
bajocondiciones estndares de presin y temperatura es < 80C
13,son compuestos que pueden ser fcilmente retirados. Estemtodo ha
sido ampliamente utilizado en la elaboracin demicropartculas
huecas14-16. Las imgenes obtenidas medianteMEB (Figura 2) no
evidencian la presencia de poros o huecos enla matriz polimrica de
PLGA, sin embargo, podemos observarque el tamao de las
nanopartculas corresponde al determinadopor dispersin de luz lser.
Por otro lado, las micrografasobtenidas por MET (Figura 3) tampoco
muestran la presencia deestructuras que pudieran sugerir huecos o
poros en lasnanopartculas, stas pueden observarse como
partculasesfricas con una matriz compacta similares a las
nanoesferasformadas nicamente por PLGA (sin incluir naftaleno en
supreparacin). De acuerdo con lo anterior, a pesar de que se llevaa
cabo la encapsulacin y sublimacin del naftaleno que seencuentra
situado en la matriz polimrica no se evidencianhuecos, la hiptesis
que planteamos es que el naftaleno puedeencontrarse disperso en
forma molecular. Se ha reportado que lassubstancias encapsuladas en
nanoesferas (como es nuestrocaso) se encuentran dispersas en forma
molecular17,18. Losresultados de densidad (Figura 4) confirman el
hecho que elpolmero se est reacomodando porque no presenta cambios
dedensidad por retencin de aire, ya que se encontraron
densidadessimilares para las nanoesferas y las preparaciones
denanopartculas a las cuales se les incorpor el naftaleno.
Esimportante sealar que los resultados esperados eran que
laspreparaciones con naftaleno tuvieran una densidad muchomenor en
comparacin con las nanoesferas de PLGA debido ala presencia de aire
producto de los huecos formados.
Evaluacin in vitroPrimeramente, con respecto al dispositivo
podemos afirmar que
ste cumpli con el objetivo planteado al permitir que las
ondasultrasnicas atravesaran la ventana creada y se lograra
observarel lquido inyectado en su interior. En general, en las
imgenes(Figura 5) se ve el dispositivo bien definido debido a que
lasondas ultrasnicas rebotan principalmente en la regin rgida
deltubo. Entre las dos paredes que delimitan al tubo se observa
unaregin de menor brillo la cual est constituida por el
lquidoinyectado, en esta seccin es donde fue delimitada la RDI.
Lazona de alto brillo por debajo del dispositivo est dada por
labolsa de acoplamiento que es un sistema constituido por unabolsa
de plstico la cual en su interior tiene agua, sta sirve
paraamplificar estructuras que tienen bajo contraste o que son
muypequeas.
El anlisis de las imgenes digitalizadas se bas en obtener
elvalor promedio de escala de grises (VPEG) de la RDI. El VPEG
esdeterminado asignndole a la imagen (la cual deber estar enformato
de escala de grises) valores desde 0 hasta 255, en donde
Figura 1. Esquema del dispositivo elaborado para laFigura 1.
Esquema del dispositivo elaborado para laFigura 1. Esquema del
dispositivo elaborado para laFigura 1. Esquema del dispositivo
elaborado para laFigura 1. Esquema del dispositivo elaborado para
ladeterminacin de la ecogenicidad determinacin de la ecogenicidad
determinacin de la ecogenicidad determinacin de la ecogenicidad
determinacin de la ecogenicidad in vitroin vitroin vitroin vitroin
vitro de las nanopartculas de las nanopartculas de las
nanopartculas de las nanopartculas de las nanopartculas(unidades en
mm).(unidades en mm).(unidades en mm).(unidades en mm).(unidades en
mm).
Figura 2. Micrografas obtenidas por MEB para las
nanopartculasFigura 2. Micrografas obtenidas por MEB para las
nanopartculasFigura 2. Micrografas obtenidas por MEB para las
nanopartculasFigura 2. Micrografas obtenidas por MEB para las
nanopartculasFigura 2. Micrografas obtenidas por MEB para las
nanopartculasformadas por PLGA posteriores a la liofilizacin. a)
Nanoesferasformadas por PLGA posteriores a la liofilizacin. a)
Nanoesferasformadas por PLGA posteriores a la liofilizacin. a)
Nanoesferasformadas por PLGA posteriores a la liofilizacin. a)
Nanoesferasformadas por PLGA posteriores a la liofilizacin. a)
Nanoesferasde PLGA; b) nanopartculas de PLGA formadas con 12.5%
dede PLGA; b) nanopartculas de PLGA formadas con 12.5% dede PLGA;
b) nanopartculas de PLGA formadas con 12.5% dede PLGA; b)
nanopartculas de PLGA formadas con 12.5% dede PLGA; b)
nanopartculas de PLGA formadas con 12.5% denaftaleno. 15000 x
Barra= 1mnaftaleno. 15000 x Barra= 1mnaftaleno. 15000 x Barra=
1mnaftaleno. 15000 x Barra= 1mnaftaleno. 15000 x Barra= 1m
a)
b)
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TIP Rev.Esp.Cienc.Qum.Biol.18 Vol. 10, No. 1
0 corresponde al negro puro y 255 al blanco puro; de esta
manerael VPEG es el tono promedio de los pixeles analizados.
Esimportante mencionar que el software utilizado, Image
v.1.35p(National Institute of Health, USA), es un programa
desarrolladopara el anlisis de imgenes mdicas utilizado en tcnicas
comoson: el US, la resonancia magntica nuclear, la
tomografacomputarizada, entre otras. El VPEG es equivalente a un
ndiceque proporciona un estimado de la cantidad de color blanco
onegro presente en la imagen. Por lo tanto, en este caso si
elsistema es capaz de aumentar el contraste, ste se ver traducidoen
un aumento en el brillo y, por ende, en una mayor cantidad detonos
blancos, por lo que el VPEG deber desplazarse a laderecha en
comparacin con un sistema de menor contraste. Estetipo de anlisis
ya ha sido utilizado en la determinacin de laecogenicidad de
algunos ACUS como SonoVue y algunosotros trabajos de
investigacin19,20. La Figura 6 muestra loshistogramas de frecuencia
de la escala de grises para cada unode los sistemas evaluados y en
la Tabla I se reporta el VPEG. Demanera general las tendencias de
los sistemas analizados son entodos los casos distribuciones
sesgadas hacia la izquierda.Adems una caracterstica importante es
que contienennanopartculas que presentan una distribucin bimodal en
dondeuna de estas modas corresponde al valor para el blanco puro.
Porotra parte se observa que el VPEG del sistema blanco presentael
menor valor numrico, sin embargo, este valor puede
Figura 3. Micrografas obtenidas por MET para las
nanopartculasFigura 3. Micrografas obtenidas por MET para las
nanopartculasFigura 3. Micrografas obtenidas por MET para las
nanopartculasFigura 3. Micrografas obtenidas por MET para las
nanopartculasFigura 3. Micrografas obtenidas por MET para las
nanopartculasformadas por PLGA posteriores a la liofilizacin. a)
Nanoesferasformadas por PLGA posteriores a la liofilizacin. a)
Nanoesferasformadas por PLGA posteriores a la liofilizacin. a)
Nanoesferasformadas por PLGA posteriores a la liofilizacin. a)
Nanoesferasformadas por PLGA posteriores a la liofilizacin. a)
Nanoesferasde PLGA; b) nanopartculas de PLGA formadas con 12.5%
dede PLGA; b) nanopartculas de PLGA formadas con 12.5% dede PLGA;
b) nanopartculas de PLGA formadas con 12.5% dede PLGA; b)
nanopartculas de PLGA formadas con 12.5% dede PLGA; b)
nanopartculas de PLGA formadas con 12.5% denaftaleno. 20000
x.naftaleno. 20000 x.naftaleno. 20000 x.naftaleno. 20000
x.naftaleno. 20000 x.
Figura 4. Bandas de las nanoesferas (NE), nanopartculas
(NP)Figura 4. Bandas de las nanoesferas (NE), nanopartculas
(NP)Figura 4. Bandas de las nanoesferas (NE), nanopartculas
(NP)Figura 4. Bandas de las nanoesferas (NE), nanopartculas
(NP)Figura 4. Bandas de las nanoesferas (NE), nanopartculas
(NP)formadas con 12.5% y 25% de naftaleno y estndares
externosformadas con 12.5% y 25% de naftaleno y estndares
externosformadas con 12.5% y 25% de naftaleno y estndares
externosformadas con 12.5% y 25% de naftaleno y estndares
externosformadas con 12.5% y 25% de naftaleno y estndares
externosgeneradas con Percollgeneradas con Percollgeneradas con
Percollgeneradas con Percollgeneradas con Percoll mediante
centrifugacin. mediante centrifugacin. mediante centrifugacin.
mediante centrifugacin. mediante centrifugacin.
Figura 5. Ultrasonogramas digitalizados de los diferentesFigura
5. Ultrasonogramas digitalizados de los diferentesFigura 5.
Ultrasonogramas digitalizados de los diferentesFigura 5.
Ultrasonogramas digitalizados de los diferentesFigura 5.
Ultrasonogramas digitalizados de los diferentessistemas probados.
a) Blanco (agua desionizada), b) nanoesferas;sistemas probados. a)
Blanco (agua desionizada), b) nanoesferas;sistemas probados. a)
Blanco (agua desionizada), b) nanoesferas;sistemas probados. a)
Blanco (agua desionizada), b) nanoesferas;sistemas probados. a)
Blanco (agua desionizada), b) nanoesferas;c) nanopartculas
elaboradas con 25% de naftaleno.c) nanopartculas elaboradas con 25%
de naftaleno.c) nanopartculas elaboradas con 25% de naftaleno.c)
nanopartculas elaboradas con 25% de naftaleno.c) nanopartculas
elaboradas con 25% de naftaleno.
a) b)
c)
a)
b)
NE NP 12.5% NP 25%Densidad(g/cm3)1.0181.035
1.052
1.065
1.075
1.1191.138
1.087
1.102
1.0781.082
1.076
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19Mendoza-Muoz, N. et al.: Preparacin y evaluacin de
nanopartculas huecasjunio, 2007
Figura 6. Histograma de distribucin del valor asignado en la
escala de grises para la RDI de cada uno de los
ultrasonogramasFigura 6. Histograma de distribucin del valor
asignado en la escala de grises para la RDI de cada uno de los
ultrasonogramasFigura 6. Histograma de distribucin del valor
asignado en la escala de grises para la RDI de cada uno de los
ultrasonogramasFigura 6. Histograma de distribucin del valor
asignado en la escala de grises para la RDI de cada uno de los
ultrasonogramasFigura 6. Histograma de distribucin del valor
asignado en la escala de grises para la RDI de cada uno de los
ultrasonogramasanalizados. a) Sistema blanco, b) nanoesferas; c)
nanopartculas elaboradas con 25% de naftaleno.analizados. a)
Sistema blanco, b) nanoesferas; c) nanopartculas elaboradas con 25%
de naftaleno.analizados. a) Sistema blanco, b) nanoesferas; c)
nanopartculas elaboradas con 25% de naftaleno.analizados. a)
Sistema blanco, b) nanoesferas; c) nanopartculas elaboradas con 25%
de naftaleno.analizados. a) Sistema blanco, b) nanoesferas; c)
nanopartculas elaboradas con 25% de naftaleno.
considerarse alto teniendo en cuenta que se trata nicamente
deagua, esto nos indica la presencia de artefactos, siendo
elprincipal el asociado con la impresin de las imgenes de US,
lascuales presentaron una serie de lneas blancas causadas por
laimpresora, sin embargo, esto fue constante para todas
lasimpresiones. Considerando lo anterior se observa que
laspreparaciones formadas nicamente del polmero, es decir,
lasnanoesferas, presentan un ligero grado de ecogenicidad que
esindicado por el aumento del VPEG en comparacin con el
sistemablanco. Esto puede considerarse normal, ya que las
nanoesferastambin pueden comportarse como dispersores acsticos.
Deigual manera se observa una ecogenicidad superior a la de
lasnanoesferas para el caso de las nanopartculas elaboradas con
Tabla I. VPEG para cada uno de los sistemas analizadosTabla I.
VPEG para cada uno de los sistemas analizadosTabla I. VPEG para
cada uno de los sistemas analizadosTabla I. VPEG para cada uno de
los sistemas analizadosTabla I. VPEG para cada uno de los sistemas
analizadosmostrando tambin el rea de la RDI.mostrando tambin el rea
de la RDI.mostrando tambin el rea de la RDI.mostrando tambin el rea
de la RDI.mostrando tambin el rea de la RDI.
Sistema
BlancoNanoesferasNanopartculas formadascon 25% de naftaleno
rea de RDI (pixeles2)
111496112047116960
VPEG
81.36496.998123.686
25% de naftaleno, siendo sta la que presenta el mayor
valornumrico de VPEG. Si bien es cierto que los resultados de
VPEGreflejan que las nanopartculas preparadas con
naftalenopresentan una mayor ecogenicidad en comparacin con
lasnanoesferas, estos datos debern de tomarse con cierta reservay
es que de acuerdo con la ecuacin para la frecuencia deresonancia
(f)21:
(3)
La frecuencia de resonancia es inversamente proporcional
aldimetro (d) y en ese sentido, considerando que las NPsobtenidas
son de 150 nm, la frecuencia de resonancia calculadacorresponde a
40 MHz, la cual es una frecuencia fuera del rangomdico.
Considerando que el utilizado en este trabajo fue de 5MHz, nos
indica que la frecuencia a la cual el sistema fuesometido no fue lo
suficiente para que entrara en resonancia.Existen reportes que los
ACUS de tamao submicrnico siguenestas ecuaciones22,23, sin embargo,
otros autores consideran quela relacin entre la repuesta ultrasnica
generada y el tamao departcula submicrnico de este tipo de ACUS no
est del todocomprendida, inclusive Wheatley y cols.24 (2006) han
encontradoque los valores experimentales de frecuencia de
resonancia
a) b)
c)
f =6500
d
Inte
nsid
ad
Inte
nsid
ad
Inte
nsid
ad
12000
0
10000
8000
6000
4000
2000
7000
0
6000
5000
4000
3000
2000
1000
7000
0
6000
5000
4000
3000
2000
1000
1 256 1 256
256
-
TIP Rev.Esp.Cienc.Qum.Biol.20 Vol. 10, No. 1
corresponden a la mitad de los valores tericos calculados.
Como puede observarse, el uso de los ACUS de tamaosubmicrnico an
est en desarrollo y falta la comprensin de losfenmenos que permitan
entender la relacin entre la respuestagenerada y el tamao de
partcula, adems de los parmetrosasociados a la composicin de los
ACUS.
CCCCCONCLUSIONESONCLUSIONESONCLUSIONESONCLUSIONESONCLUSIONESSe
lograron preparar nanopartculas con una buena eficiencia
deencapsulamiento de naftaleno, el cual pudo ser
retiradoeficientemente mediante liofilizacin, sin embargo, no
seevidencian poros o huecos en la matriz polimrica, debido quizsa
que el naftaleno se encuentra disperso molecularmente en lamatriz.
Las preparaciones con nanopartculas presentaron unamayor
ecogenicidad en comparacin con el agua, adems,consideramos que la
evaluacin en un rango mayor de frecuenciaspodra evidenciar an mejor
la diferencia en la respuesta generadapor las nanopartculas en
comparacin a medios acuosos sindispersores.
AAAAAGRADECIMIENTOSGRADECIMIENTOSGRADECIMIENTOSGRADECIMIENTOSGRADECIMIENTOSAgradecemos
al Tec. Rodolfo Robles y al IQ Ivn Puente por suasesoramiento en la
Microscopa Electrnica de Barrido yTransmisin, respectivamente. Al
Tec. J. Ignacio Garca por elapoyo en la bsqueda bibliogrfica.
RRRRREFERENCIASEFERENCIASEFERENCIASEFERENCIASEFERENCIAS1. Lewin,
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