L’IMPORTANZA DEL METABOLISMO MICROBICO NELLA DEFINIZIONE DI “TERROIR”: IL POTENZIALE RUOLO DELLO ZOLFO Premessa Premessa Il concetto di “terroir” e noto soprattutto in viticoltura per indicare un’area ben delimitata in cui le condizioni naturali, il suolo, le attivita umane ed il clima interagiscono tra loro permettendo la realizzazione di un prodotto specifico e identificabile con quel territorio. Tra i diversi parametri in gioco, il suolo sta assumendo sempre maggiore importanza e considerazione in quanto parametro in grado di influenzare in modo significativo la qualita del vino non solo a livello di distretto produttivo ma anche a livello aziendale o di singolo vigneto. Tuttavia, nonostante la maggior parte dei processi che determinano la qualita del suolo siano regolati dalle comunita microbiche del suolo, il potenziale ruolo dei microrganismi nella definizione del terroir e ancora per lo piu sconosciuta. BRO11 BRO11 BRO12 BRO12 pH 8.1 8.4 K tot (ppm) 109 109 39 N tot (‰) 0,66 0,66 0,24 C org (%) 0,65 0,65 0,23 O.M. (%) 1,13 1,13 0,39 Total carbonates 15,6 6,4 Clay % 20 12 Silt % 28 18 Sand % 52 72 Texture SCL SL C/N ratio 9,9 9,6 CEC (meq/100g) 10,7 7,7 Calcium_exc (meq/100g) 9,8 7,3 Magnesium_exc (meq/100g) 0,53 0,25 Sodium_exc (meq/100g) 0,04 0,04 Potassium_exc (meq/100g) 0,28 0,11 EC 0,124 0,473 0,473 • Wine: sensory evaluation • Grape: sugar content • Grape: sugar accumulation rate • Grape: mean berry weight • Grape: extractable polyphenol index (EPI) Vine Performance of Sangiovese (VPS) Vine Performance of Sangiovese (VPS) BRO 11 BRO 12 Agricoltura di precisione e produzione di vino nella regione del Chianti Soil morphology : Pliocenic marine sands and conglomerates. Substrate : Marine deposits, alternations of clays, silts, sands and conglomerates. Period: Pliocene . Soil description : Inceptisols (USDA); weakly developed, not well structured with sandy topsoil. The content of stones/rocks can vary from 5% to 60% with coarse gravels. Drainage is almost always too high. Materiali e Metodi Materiali e Metodi Area sperimentale Area sperimentale • Campionamento di suolo ed estrazione del DNA: due vigneti adiacenti (BRO11 and BRO12) di Sangiovese sono stati individuati su suoli simili nel cuore del Chianti Classico (Brolio, SI). Tre repliche di suolo sono state prelevate ad una profondità di 0-30cm, vagliati a 2mm e conservati a -30°C. Il DNA totale è stato estratto da 5 g di suolo con un protocollo manuale (Richard et al., 2001). • Analis Geochip: il DNA genomico totale è stato trattato preliminarmente mediante TempliPhi kit (GE Healthcare, Piscataway, NJ) per 6 ore a 30°C. Il DNA ottenuto è stato fatto ibridare su Geochip 3.0 (He et al., 2010). Le ibridazioni sono state condotte a 45°C per 10 ore con 50% di formammide mediante un TECAN HS4800. Gli array ottenuti sono stati scansionati mediante il sistema ScanArray 5000 (Perkin-Elmer, Wellesley, MA). E’ stata applicata una soglia di segnale pari a 2000, e solo spots con un rapporto segnale-rumore [SNR = (signal intensity- background intensity)/standard deviation of the background] maggiori di 2.0 sono stati considerati per le analisi. • Amplificazione e pirosequenziamento dei geni 16S rRNA e 18S rRNA: per il 454 pyrosequencing del gene 18S rRNA, sono stati utilizzati i primer universali FR1 e FF390, che amplificano una regione di 350 bp che include le regioni ipervariabili V7 e V8 del gene SSU rRNA (Prévost-Bouré et al., 2011). Per il sequenziamento del gene 16S rRNA sono stati utilizzati i primer UNI515F and UNI806R (regione V4). Il pirosequenziamento è stato eseguito dalla ditta Macrogen inc. (Seoul, Korea) mediante GS FLX titanium (Roche, Basel, Switzerland). L’analisi delle sequenze è statoeffettuato mediante Qiime 1.2.1 con interfaccia Galaxy (Goecks et al., 2010). Tutti I barcode, linker e tags sono stati rimossi attraverso il tool Denoiser 0.91 e clusterizzati al 97% di similarità mediante UCLUST 1.2.21 algorithm. • Analisi enzimatiche: le attività enzimatiche arilsulfatasi (aryS), β-glucosidasi (gluc), leucina-aminopeptidasi (leu), fosfomonoesterasi (alkP), fosfodiesterasi (bis-P) and pirofosfatase (pyro) sono state determinate mediante una procedura di estrazione/desorbimento in micropiastra, utilizzando analoghi fluorescenti dei substrati di ciascun enzima (Fornasier et al., 2007). References • Fornasier, F. and A. Margon. 2007. Bovine serum albumin and Triton X-100 greatly increase phosphomonoesterases and arylsulphatase extraction yield from soil. Soil Biol. Biochem. 39: 2682-2684 • Goecks J, Nekrutenko A, Taylor J. 2010. Galaxy: a comprehensive approach for supporting accessible, reproducible, and transparent computational research in the life sciences. Genome Biol. 11:13 • He ZL, Deng Y, Nostrand JD, Tu Q, Xu M, Hemme CL, Li X, Wu L, Gentry TJ,Yin Y, Liebich J, Hazen TC, Zhou J: GeoChip 3.0 as a high-throughput tool for analyzing microbial community composition, structure and functional activity. ISME J 2010a, 4:1–13. • Prévost-Bouré NC, Christen R, Dequiedt S, Mougel C, Lelièvre M, Jolivet C, Shahbazkia HR, Guillou L, Arrouays D, Ranjard L. 2011. Validation and application of a PCR primer set to quantify fungal communities in the soil environment by Real-Time Quantitative PCR. PLoS One 6:13 • Richard AH, Qiu XY, Wu LY, Roh Y, Palumbo AV, Tiedje JM, Zhou JZ: Simultaneous recovery of RNA and DNA from soils and sediments. Appl Environ Microbiol 2001, 67:4495–4503 Risultati Risultati Stefano Mocali 1 , Flavio Fornasier 2 , Simone Priori 1 , Arturo Fabiani 1 , Maurizio Castaldini 1 , Giuseppe Valboa 1 , Edoardo Costantini 1 (1) Consiglio per la ricerca in agricoltura e l'analisi dell'economia agraria - Centro di Ricerca Agricoltura e Ambiente (CREA - AA), Firenze (2) Consiglio per la ricerca in agricoltura e l'analisi dell'economia agraria - Centro di Ricerca Viticoltura e Enologia (CREA - VE), Gorizia Contact: [email protected] Geochip microarrays 0 5 10 15 20 25 30 35 40 BRO12 BRO11 454 - Pyrosequencing Gene category BRO11 BRO12 Carbon degradation 1730 ± 74 1511 ± 66 Nitrogen 1549 ± 87 1349 ± 59 Nitrification 242 ± 12 210 ± 8 Denitrification 670 ± 45 591 ± 24 Nitrogen fixation 205 ± 6 165 ± 8 Sulfur oxidation 587 ± 26 525 ± 26 Sulfate reduction 154 ± 14 187 ± 12 Nitrogen limitation 300 ± 19 261 ± 18 Cold shock 12 ± 1 9 ± 1 Heat shock 299 ± 14 258 ± 13 Osmotic stress 91 ± 6 80 ± 4 Radiation stress 230 ± 12 199 ± 7 Oxygen stress 962 ± 57 842 ± 32 Phosphate limitation 888 ± 43 785 ± 36 Phosphorous 269 ± 18 244 ± 9 Aromatic pollutant remediation 3656 ± 212 3299 ± 146 Herbicides related compound remediation 422 ± 22 375 ± 15 Pesticides related compound remediation 133 ± 10 120 ± 6 Media geni individuati ± deviazione standard Ricasoli Ricasoli è una delle aziende vitivinicole più antiche d’Italia (http://www.ricasoli.it ), ed è la cantina più grande nell’area del Chianti Classico. Il Il Castello Castello di di Brolio Brolio è il luogo in cui il Barone Bettino Ricasoli inventò la formula del Chianti Chianti nel 1872; è circondato da 240 ettari di vigneti e 26 di uliveti. L’Italia è uno dei maggiori produttori mondiali di vino. Il Chianti è uno dei vini rossi più conosciuti e riconoscibili e viene prodotto in Toscana. La viticoltura di precisione viene applicata per ottimizzare la performance dei vigneti, perciò l’identificazione delle relazioni tra parametri del suolo e quelli produttivi è fondamentale per l’individuazione delle tecniche colturali più appropriate per la gestione di differenti aree viticole. Alcune aree sono risultate più costanti nel tempo, probabilmente condizionate dalle proprietà dei suoli Due suoli simili hanno dato luogo a dei vini di qualità e caratteristiche molto diverse Conclusioni Conclusioni I risultati di questo lavoro sembrano indicare un ruolo attivo da parte delle comunità microbiche nella definizione del concetto di “Terroir”. In particolare, il metabolismo dello zolfo sembra essere un potenziale parametro discriminante della qualità delle uve e, quindi, del vino. Infatti, BRO12 presenta una maggior presenza di geni per la sulfito reduttasi (es. cysJ, fccAB, sir) rispetto a BRO11 in cui , invece, prevalgono i geni per l’ossidazione dello zolfo (es. dsr, aprA). A conferma di ciò, in BRO11 si rileva sia un maggior contenuto di solfati solubili (7.64ppm) rispetto a BRO12 (7.18ppm) che una maggior presenza di specie coinvolte nel metabolismo ossidativo dello zolfo come, ad esempio, Sulfobacillus thermosulfidooxidans. Infine, anche l'analisi delle attivita enzimatiche hanno evidenziato una maggiore attivita arilsulfatasica (aryS) nei campioni BRO11. E’ quindi opportuno approfondire maggiormente lo studio delle relazioni tra microbiota del suolo e vigneti per orientare sempre più le scelte agronomiche ed enologiche verso una gestione che esalti l'unicità del nostro territorio e la sua sostenibilità. Bucelli et al., 2010 - International journal of vine and wine sciences, 44(4): 207-218 Normalized Normalized Difference Difference Vegetation Vegetation Index Index (NDVI) (NDVI) I suoli BRO11 e BRO12 presentano caratteristiche chimico- fisiche molto simili Soil chemical Soil chemical-physical data physical data Enzymatic assays 0 50 100 150 200 250 300 alkP aryS bis-P gluc leu pyro pmol/g soil BRO11 BRO12 dsDNA 0 2 4 6 8 10 12 14 16 BRO11 BRO12 μg DNA/g soil 36,0 dsDNA 4,1 Pyroposphatase (pyro) 3,1 Leucine-aminopeptidase(leu) 3,8 β-glucosidase (gluc) 3,0 Phosphodiesterase(bis-P) 5,5 Arylsulfatase (aryS) 3,3 Phosphomonoesterase(alkP) Activity ratio (BRO11/BRO12) Similarity percentage analysis (SIMPER) Analisi delle componenti principali (PCA) Contribution to variation (%) Cumulative contribute to variation (%) Sulfate_reduction 3,27 3,27 Clay_ 3,04 6,31 Ca_exc 3,02 9,34 CEC 3,01 12,35 Sand 3,01 15,36 Silt 2,93 18,29 Mg_exc 2,91 21,20 k_ass 2,82 24,02 K_exc 2,80 26,82 Actinobacteria 2,78 29,60 Unknown_fungi 2,77 32,37 Carbonates_tot 2,72 35,09 aryS 2,65 37,74 Nitrogen_fixation 2,46 40,20 Ascomycota 2,45 42,65 N_tot 2,44 45,09 bis-P 2,32 47,41 Organic_matter 2,30 49,71 C_org 2,30 52,01 Category Genes BRO12 BRO11 Shared Tot %shared adenylylsulfate reductase aprA 0 4 30 34 88,2 adenylylsulfate reductase APS_AprA 1 3 40 44 90,9 adenylylsulfate reductase APS_AprB 1 5 19 25 76,0 Sulfite reductase cysJ 12 3 146 161 90,7 Sulfite reductase dsrA 6 38 206 250 82,4 Sulfite reductase dsrB 12 20 154 186 82,8 sulfide oxidation fccAB 9 0 41 50 82,0 Sulfite reductase sir 10 0 50 60 83,3 Sulphur oxidation sox 8 13 135 156 86,5 sulfide oxidation sqr 2 0 5 7 71,4 Sulfur tot 61 86 826 973 84,9 Category Genes BRO12 BRO11 Shared Tot %shared adenylylsulfate reductase aprA 0 4 30 34 88,2 adenylylsulfate reductase APS_AprA 1 3 40 44 90,9 adenylylsulfate reductase APS_AprB 1 5 19 25 76,0 Sulfite reductase cysJ 12 3 146 161 90,7 Sulfite reductase dsrA 6 38 206 250 82,4 Sulfite reductase dsrB 12 20 154 186 82,8 sulfide oxidation fccAB 9 0 41 50 82,0 Sulfite reductase sir 10 0 50 60 83,3 Sulphur oxidation sox 8 13 135 156 86,5 sulfide oxidation sqr 2 0 5 7 71,4 Sulfur tot 61 86 826 973 84,9 Total bacteria (463) BRO12 BRO11 Shared 82,3% Total bacteria (463) BRO12 BRO11 Shared 82,3% -25 -20 -15 -10 -5 0 5 10 Actinobacteria Alfa-Proteobacteria Beta-Proteobacteria Delta-Proteobacteria Gamma-Proteobacteria Epsilon-Proteobacteria Archea Bacteroides Firmicutes Cyanobacteria Chlorobi Other unique BRO12 unique BRO11 BRO12 (4,3%) BRO11 (13,5%) Unique taxa: 42 42° Congresso Nazionale della Congresso Nazionale della Societ Società Italiana di Scienza del Suolo Italiana di Scienza del Suolo 5-7 Dicembre 2017, Firenze 7 Dicembre 2017, Firenze Analisi enzimatiche