Appunti di Microbiologia 01 anatom .pdf · Appunti di Microbiologia Informazioni: Prof Eugenio Debbia Università di Genova Scuola di Scienze Mediche e Farmaceutiche DISC-Sezione

Appunti di Microbiologia

Informazioni:Prof Eugenio Debbia

Università di Genova Scuola di Scienze Mediche e Farmaceutiche

DISC-Sezione di Microbiologia,

Largo Rosanna Benzi 10,16132 Genova

http://www.microbiologia.unige.it/dpb/indexxx.htm

Dinamica delle Popolazioni BattericheLaboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia

Largo Rosanna Benzi 10,16132 Genova

Tel: 010-353 38136,

329 260 5218 338 88 05 256

FAX: +39-010-353 7651


e-mail: [email protected]

W. Churchill

Testi consigliati

Antonelli et al. Principi di Microbiologia Medica II ed. CEA 2012

La Placa Microbiologia Medica. Edises 2014

Jawetz et al. Microbiologia Medica. Piccin 2012

M P Conte, P. Mastromarino . Microbiologia Medica



M P Conte, P. Mastromarino . Microbiologia Medica Batteriologia e Virologia. Esculapio 2014

Wessner et al. Microbiologia. CEA, 2015

Brock- 3 Biologia dei microorganismi Pearson 2016

Con il microscopio si incomincia a pensare all’invisibileE ciò permette la scoperta dei microrganismi



Olanda 1674

Anton van Leeuwenhoek





Il microscopio a lente singola di Leeuwenhoek

Germania 1840Friedrich Henle

Teoria del “germe”

I microorganismi sono responsabili di



responsabili di MALATTIA nell’uomo

Vienna 1850-1860

I.F. Semmelweis

Tentò di dimostrare che igermi dalla sala di anatomiagiungevano alla sala parto,



giungevano alla sala parto,tramite i medici e gli studentiSuggerì la disinfezione dellemani prima di interveniresulla puerpera.Non fu mai ascoltato

1870-1880Francia e Germania

viene dimostrato che alcuni microorganismi sono i responsabili di carbonchio, rabbia, peste, colera e tubercolosi

Pasteur Koch



MICROBIOLOGIA

• Batteri

• Virus• Virus

• Miceti

• Protozoi e altri parassiti

MicrorganismiOrganismi unicellulari

EucariotiNucleo evidente con

Batteri



Nucleo evidente con membrana

Nucleo non evidente

AlgheProtozoiMiceti

EubatteriClamidie

SpirocheteRickettsie

Micoplasmi



Cellula Eucariotica

Cellulaprocariotica

BATTERIdimensioni



Nucleo

procariotica

Citoplasma Nucleoide Ribosomi

Membranacitoplasmatica

Reticolo endoplasmatico

RibosomiNucleo

NucleoloMembrana

STRUTTURA INTERNA DELLA CELLULA MICROBICAa) CELLULA PROCARIOTICA b) CELLULA EUCARIOTICA



Paretecellulare Membrana

citoplasmatica

Membrananucleare

Citoplasma

Mitocondrio

Cloroplasto

plasmide

Parete

CitoplasmaFlagelloMembrana

Composizione: H2O (80%), K, Na, Mg, Ca, Fe, Zn, P, S e macromolecole organiche

localizzazione delle macromolecole nella cellula batterica



Proteine

Acidi nucleici

Lipidi

Polisaccaridi

Nucleoide Ribosomi

GranuliD’accumulo



G. Antonelli, M. Clementi, G. Pozzi, G.M. Rossolini Principi di Microbiologia medica, II ed. Copyright 2011 C.E.A. Casa Editrice Ambrosiana

1. Cocchi, 2. Diplococchi,

3. Streptococchi, 4. Stafilococchi

5.Tetradi di cocchi, 6. Coccobacilli

7. Clostridi, 8. Bastoncini,

9. Carbonchi, 10. Fusobatteri



11. Vibrioni, 12. Spirilli

13. Borrelie, 14. Treponemi

15. Leptospira



IL MICROSCOPIO OTTICO

• Vite macrometrica : è la manopola di regolazione grossolana della messa a fuoco.

• Vite micrometrica : permette la regolazione fine della messa a fuoco.


fuoco.

•• Regolatore dell’intensità

luminosa: permette di variare l’intensità luminosa del campo.

COLORAZIONE semplice DELLE CELLULE PER L’OSSERVAZIONE

MICROSCOPICA

Strisciare la coltura su un vetrinoFormando uno strato sottile



Asciugare all’aria

Passare il vetrino sulla fiamma per fissare il campione

Ricoprire il vetrino con coloranteRisciacquare e asciugare

Porre una goccia d’olio (da immersione) sul vetrino; osservare con l’obiettivo 100x

Vetrino Olio100x

Hans Joachim Christian GramIl suo nome è legato all'importante scoperta della colorazione di Gram da lui effettuata nel 1884 a Berlino:

mentre esaminava del tessuto polmonare di pazienti deceduti per

polmonite notò che le cellule



polmonite notò che le cellule batteriche si coloravano più

intensamente con cristal violetto e soluzione di lugol

Tale colorazione è tutt'oggi essenziale nella classificazione dei

batteri

COLORAZIONE DI GRAM (complessa o differenziale)

Fase 1

Fase 2

Ricoprire lo striscio fissato al calore con cristal-violetto per 2-3 minutiTutte le cellule si coloreranno di viola

Aggiungere soluzione iodata per 1 minuto

Le cellule rimarranno viola



Fase 3

Fase 4

Le cellule rimarranno viola

Decolorare in alcool per circa 1-2 minutiLe celluleGram-positive risulteranno viola, quelle Gram-negative incolori

Colorare con fucsina per 1-2 minutiG-

G+

Le celluleGram-positive (G+) risulteranno viola, quelleGram-negative (G-) avranno una tonalità da rosa a rosso

La colorazione di Gram

Un Gram positivo Un Gram negativo Un Gram positivo


Un Gram positivo Un Gram negativo Un Gram positivo

Bastoncelli Gram negativi misti a cocchi Gram positivi

Cocchi Gram positivi

Cocchi Gram positivi


Colorazione di Ziehl-Neelsen(bacilli alcool-acido resistenti)

Fucsina fenicata a caldo 5 m

Acido solforico (20%) 30’’



Acido solforico (20%) 30’’

Alcool 30’’

Blu di metilene 1 m

Batteri alcool-acido resistenti: rossi su fondo blu azzurro


Osservazione a contrasto di fase

Un batterio (L. sakei), Un lievito (S. cerevisiae), Una muffa (G. candidum),


Un batterio (L. sakei),400x 400x

Una muffa (G. candidum),400x

Un attinomicete400x

Un lievito (Y. lipolytica)400x

Una muffa (R. oligosporus),400x

Osservazione in campo scuro


Anatomia della cellula batterica

Schematicamente dall'esterno verso l'interno i batteri presentano:

a) glicocalice o slimeb) capsulac) flagelli, pili o fimbried) involucro (parete in generale) totalmente diverso tra gram-positivi e gram-negativi (tale differenza è messa in rilievo proprio dalla colorazione di Gram)



dalla colorazione di Gram)e) membrana citoplasmaticaf) mesosomig) citoplasma cromosoma o altro materiale genetico accessorio: es. plasmidi. ribosomicorpi inclusi

Glicocalice

Materiale stratificato intorno alla cellula

Strato S: distribuzione regolare (cristallina)di sub-unità glicoproteiche



di sub-unità glicoproteiche

Capsula: matrice fibrosa costituita dapolimeri di carboidrati

Flagelli

Moto brownianoMovimento attivo

Flagello: unico filamento sprovvisto



Flagello: unico filamento sprovvistodi membrana – flagellina-(diversa in specie batteriche diverse)Chemiotassi positivae negativa

STRUTTURA DI UN FLAGELLO

BATTERICO

Anello L

Uncino

Flagellina

Filamento

Membrana EsternaLPS

Richiede molta energia



Membranacitoplasmatica

Proteina Mot

Periplasma

Proteina Fli invertitore del motore

Anello MS

Peptidoglicano

Anello P

Richiede molta energiaATP



Pili o Fimbrie

Le fimbrie sono appendici diverse dai flagelli,sono costituite da una proteina detta pilina chegioca un ruolo fondamentale nel processo diadesione dei batteri ad altre cellule(patogenicità). Spesso sono codificati dai



(patogenicità). Spesso sono codificati daiplasmidi (vedi oltre) sia come fimbrie perl'adesività sia come pilo detto sessuale percreare un ponte citoplasmatico tra due cellulebatteriche nei processi di coniugazione.

Type I fimbriaeAfimbrial adhesin

Type IV fimbriae (= bundle forming pilus) Curli



La Parete (Cell-Wall)

E’ lo strato compreso tra la membrana citoplasmatica e la capsula

Gram+: peptidoglicano e ac. teicoici



Gram-: peptiglicano, lipoproteine, membrana esterna e lipolisaccaride (LPS)

Fornisce protezione osmotica (5-20 atm) entra in gioco nella divisione non ha permeabilità selettiva

Gram positivi Gram negativiPeptidoglicano Peptidoglicano

RAPPRESENTAZIONE SCHEMATICA

DELLA PARETE CELLULAREDEI GRAM POSITIVI E NEGATIVI



Membrana citoplasmatica

MembranaPeriplasmaMembrana esternaLipopolisaccaridi eproteine

PARETE CELLULARE DEI GRAM POSITIVI

Acido teicoicoProteina associata alla parete

Acido lipoteicoico



lipoteicoico

Peptidoglicano


BATTERIO GRAM NEGATIVO

Membrana esterna




citoplasmatica

Peptidoglicano

PARETE CELLULARE DEI GRAM NEGATIVI

Polisaccaride O-specifico Core polisaccaridico

Esterno



Membranaesterna

Periplasma

Membranacitoplasmastica Interno

FosfolipidePeptidoglicano

Lipoproteina

Lipide APorina

Lipopolisaccaride(LPS)



G. Antonelli, M. Clementi, G. Pozzi, G.M. Rossolini Principi di Microbiologia medica, II ed. Copyright 2011 C.E.A. Casa Editrice Ambrosiana

Enzimi attivi sulla parete

Lisozima, contenuto nella saliva, lacrime e mucosa nasale,

Autolisine, contenute negli stessi batteri:



Autolisine, contenute negli stessi batteri: glicosidasi, amidasi e peptidasi

(enzimi che intervengono sulla sintesi di parete).


Costituita da fosfolipidi e proteine, noncontiene steroli (negli eucarioti) presentainvaginazioni: i mesosomi importanti nella



invaginazioni: i mesosomi importanti nellaformazione del setto vi è attaccato il DNAincerte specie su altri mesosomi vi è un sistemadi trasporto attivo (fotosintesi, azoto)

Doppio strato fosfolipidico della Membrana Citoplasmatica batterica

Regione idrofila

Acidi grassi

Lipidi 40% (steroli assenti, fosfolipidi ++)



idrofila

Regioneidrofobica

H2OFosfato

Glicerolo

STRUTTURA DELLA MEMBRANA

CITOPLASMATICA

Fosfolipidi Esterno Gruppi idrofilici

Gruppi



MolecolafosfolipidicaProteine integrali

di membrana

Gruppi idrofobici

Interno

Membrana citoplasmaticaFunzioni

permeabilità selettiva e trasporto,trasporto elettroni e fosforilasi ossidativaescrezione enzimi idroliticicontiene enzimi e proteine (carrier) deputate alla sintesi del



contiene enzimi e proteine (carrier) deputate alla sintesi del DNA, polimeri della parete, lipidi di membrana contiene recettori e proteine necessarie alla chemiotassi

Il 50% della membrana si presenta in uno stato semifluido dovuto alla grande attività per la crescita batterica

FUNZIONI DELLA MEMBRANA CITOPLASMATICA

Barriera di permeabilità

Previene dispersioni e funziona come centro di transito per il trasporto di nutrienti da e verso la cellula



Sito di ancoraggio

Produzione dell’energia

Siti di molte proteine coinvolte nel trasporto, nelle vie biosintetiche e nella chemiotassi

Enzimi della catena respiratoria

Mesosomi ?



Forza motrice protonica: le reazioni biochimiche a livello di MC creano un eccesso di H+ all’esterno (gradiente) che tendono a rientrare. Attraverso ATPasi la cellulagenera ATP.



Lo spazio periplasmico

E’ compreso tra la membrana interna e quellaesterna, è riempito da un gel formato dapeptidoglicano idratato. Diffusi nel gel vi sonoinoltre proteine ed oligosaccaridi nonché proteineleganti specifici substrati,enzimi come la fosfatasi



leganti specifici substrati,enzimi come la fosfatasialcalina che reagendo con substrati li rendonotrasportabili all’interno. Molti di questi compostiintervengono nella regolazione della pressioneosmotica, per esempio, cellule che crescono inambiente ipotonico aumentano la sintesi dioligosaccaridi.

STRUTTURA DEL LIPOPOLISACCARIDE DEI BATTERI

GRAM NEGATIVI

Polisaccaride O-specifico Core polisaccaridico Lipide “A”



Acidi grassi saturi

Struttura UNITA’ BASALE

N-acetilglucosamina (G) Acido N-acetilmuramico (M)



Gruppo N-acetile

Legamipeptidici

Acido Meso diaminopimelico

Legame sensibileAl lisozima

L-alanina

Acido D-glutammico

D-alanina

LEGAME TRA LE UNITA’ PEPTIDICHE E GLICANICHE NELLA FORMAZIONE DELLO

STRATO DI PEPTIDOGLICANOScheletro del glicano

Peptidi



Staphylococcus aureus(Gram positivo)

Escherichia coli(Gram negativo)



Sistemi di secrezione(Gram-negativi)

Sono NOTI SEI (sette) SISTEMI di esportazione di molecole effettrici nella membrana e citoplasma della cellula ospite della quale modulano ed alterano le funzioni per favorire la propria sopravvivenza e replicazione nei tessuti dell.ospite. L’energia

necessaria per il trasporto del substrato è fornita da ATP per azione di ATPasi (tranne che nel sistema IV) situata nella



azione di ATPasi (tranne che nel sistema IV) situata nella faccia interna della membrana citoplasmica. Alla

secrezione di molte proteine batteriche partecipano delle chaperonineche legano il substrato, ne impediscono la

degradazione e ne orientano il passaggio attraverso i vari sistemi

Sistemi di secrezione(Gram-negativi)

Tipo I: la proteina è direttamente liberata nell’ambiente attraverso una porina

Tipo II: la proteina viene immessa nello spazio periplasmico quindi un vettore la porta all’esterno

TipoIII: la proteina è introdotta nella cellula bersaglio direttamente con un meccanismo tipo siringa

TipoIV: il prodotto è inserito in un altro microorganismo o cellula



TipoIV: il prodotto è inserito in un altro microorganismo o cellula mediante un ponte citoplasmatico (donatore e ricevente)

Tipo V: la proteina è portata all’esterno mediante se stessa (autotrasporto)

Tipo VI: la proteina è direttamente iniettata nella cellula bersaglio (eu-procariota) mediante meccanismo attivo (coda di fago)

Tipo VII: (MT) la proteina è immessa fuori dalla membrana interna e portata all’esterno attraverso un meccanismo non ancora noto



57



Fig. 4. Model for type VII secretion. Both Esx and PE/PPE proteins are exported as dimersby the T7S secretion machinery. Substrate recognition occurs via a C-terminal secretion motif on one of the dimer subunits (indicated by a red box). The cytosolic component EspG specifically recognizes PE/PPE proteins and possibly targets these substrates to the putative membrane channel that consists of EccB, EccC, EccD and EccE. The three nucleotide binding domains of EccC are likely involved inenergizing translocation of substrates through this channel. In this model, T7S is a two-step process, in which the channel in the outer membrane refers to a hypothetical, so far unidentified pore.

Figure 1 | Schematic representation of the different type-IV-dependent mechanisms. The three subfamilies of type IV secretion (T4S) systems are shown.

Conjugationmachines deliver DNA to recipient bacteria and other cell types by cell-to-cell contact.

DNA-uptake and –release systems exchange DNA with the extracellular milieu independently of contact with



59 59

milieu independently of contact with target cells.

Effector translocators deliver DNA or protein substrates to eukaryoticcells during infection. The effector translocators contribute in markedly different ways to the infection processes of the bacterial pathogens shown. PT, pertussis toxin

Eric Cascales and Peter J. Christie 2003 THE VERSATILE BACTERIAL TYPE IV SECRETION SYSTEMS. Nature Rev Microbiology 1:137-149

Sistemi di secrezione(Gram-positivi)

Le proteine elaborate nel citoplasma sono trasferite a livello di membrana citoplasmatica qui alcune proteine vettore (chaperone)



qui alcune proteine vettore (chaperone) mediano il passaggio attraverso la parete durante il quale la proteina si trasforma nella versione funzionale con meccanismo non noto

FUNZIONI DEL CROMOSOMA

Il cromosoma consiste di circa 3,8-4,5 milioni di basiappaiate, esso è diviso funzionalmente in segmenti,ciascuno dei quali determina una sequenza diaminoacidi e quindi la struttura di una proteina.Queste proteine, enzimi, componenti della



Queste proteine, enzimi, componenti dellamembrana ecc. costituiscono le proprietà delmicrorganismo. Un segmento di DNAche determinaun prodotto funzionale è chiamatogene.Gli eventiattraverso i quali una sequenza di nucleotidi di ungene determina una proteina sono i seguenti:

L’enzima RNApolimerasi, usando il DNAcome modello, forma una singola catenapoliribonucleotidica chiamata RNAmessaggero (mRNA). Questo processo è notocome trascrizione. Questo mRNA ha una



come trascrizione. Questo mRNA ha unasequenza nucleotidica che è complementarecon una delle catene della doppia elica diDNA.





Gli aminoacidi sono attivati enzimaticamente etrasferiti ad una molecola particolare di RNAchiamato RNAtransfer (tRNA). Questi tRNAhannouna struttura che presenta ad una estremità unatripletta di basi sul mRNA, ed all’altra estremità



tripletta di basi sul mRNA, ed all’altra estremitàhanno legato l’aminoacido corrispondente. Latripletta posta sul mRNAsi chiama codon.

mRNA ed il tRNA vanno insieme sullasuperficie del ribosoma. Il tRNAtrova latripletta complementare sul mRNA. Il



tripletta complementare sul mRNA. Ilribosoma si muove sul mRNAe la sintesiprocede. Il processo è noto come traduzione.

PLASMIDI

I plasmidi sono piccoli elementi di DNA circolare che si replicano autonomamente (replicon, fattori R, elementi genetici extracromosomici, geni aggiunti,

episomi, profagi non integrati). Codificano per



episomi, profagi non integrati). Codificano per funzioni non indispensabili per la cellula, ma che

possono essere fondamentali in particolari ambienti.

Diffusione della resistenza agli antibiotici

PLASMIDI

Elementi genetici extracromosomici DNA circolare, doppia elica replicazione autonoma ( da 1.5 a 400 Kb 1-1,5 Kb = 1 gene



( da 1.5 a 400 Kb 1-1,5 Kb = 1 gene

4500 Kb = cromosoma

1 Mdal = 1 milione dalt = 3 Kb

1ųm = 2 Mdal

PLASMIDIClassificazione

FenotipoNumero di copiePeso molecolareFrammenti di restrizioneGruppo di compatibilità



Gruppo di compatibilitàGenetico e biochimicoFattori R coniugativi e nonAmplificazione dei geniBatteriocine





ENDOSPORE

Diversi microorganismi (gram+), quando lecondizioni ambientali diventano sfavorevoli,sono in grado di formare endospore (Bacillus,Clostridium, Sporosarcina ecc.) che poi sonoliberate nell’ambiente.

http://www.microbiologia.unige.it/dpb/debbia.htm


liberate nell’ambiente.

La spora è una cellula in fase di riposo,altamente resistente al calore, all’essiccamento,e agenti chimici, quando le condizioni risultanonuovamente favorevoli la spora germina eproduce una cellula vegetativa.



Sporulazione

La sporulazione comporta la produzione di nuovestrutture, enzimi e metaboliti. Circa 200 geni strutturalisono attivati durante il processo. Inizia con unainvaginazione della MC sino a racchiudere il nucleo. Laprespora si trova così racchiusa tra due membranecapaci di sintetizzare parete nella parte compresa traloro. La prima struttura che appare si chiama corteccia,



loro. La prima struttura che appare si chiama corteccia,con internamente la parete della spora, all’esterno delledue membrane si costituisce la tunica sporale(mantello), ed oltre la tunica l’esosporio. Tutto richiedeuna gran quantità di calcio e sintesi di ac. dipicolinico.All’interno ove è contenuto il nucleo (core), gli enzimivegetativi sono degradati e rimpiazzati da costituentidella spora.

STADI DI FORMAZIONE

DELL’ENDOSPORA

Stadio 0

Stadio 1Stadio 6

Stadio 7

Cellula vegetativa

Parete


DNA

Esosporio

CoreSpora libera

7-10h



Stadio 2

Stadio 3 Stadio 4

Stadio 5Spora in via di sviluppo

Membranainterna della spora

Membrana esterna della spora

CoreNucleo centrale

Disidratazione

Esosporio

Corteccia iniziale

Strati corticali

Proprietà

Core: contiene il nucleo, tutti icomponenti della sintesi proteica ed unsistema per generare energia basato sullaglicolisi. L’energia per la germinazione èconservata in 3-fosfoglicerato piuttosto



conservata in 3-fosfoglicerato piuttostoche ATP. La resistenza è dovuta in parteallo stato disidratato e alla presenza nelcore di dipicolinato di calcio (intermedionella sintesi della lisina)

Proprietà

Parete della spora

E’ lo strato più interno di parete che



E’ lo strato più interno di parete checirconda la MI della spora, composta dipeptidoglicano (diventerà parete nellacellula quando germinerà)

Proprietà

Cortex

E’ lo strato più spesso dell’involucrodella spora, contiene peptidoglicano ma



della spora, contiene peptidoglicano macon meno legami crociati di quello usuale.Sensibile al lisozima, la sua autolisi èimportante durante la germinazione.

Proprietà

Mantello

E’ composto da proteine di tipocheratinoso aventi molti legami disolfuro.



cheratinoso aventi molti legami disolfuro.Impermeabile agli agenti chimici.

Proprietà

Esosporio

Lipoproteina contenente alcuni



Lipoproteina contenente alcuni carboidrati.



Fisiologia della spora

Nessun consumo di O2

Attività enzimatiche assenti

Assenza di sintesi macromolecolari



Resistenti agli UV e all’essiccazione

Termoresistenza: stabilità proteine(particolare stabilizzazione della struttura2aria e 3aria), Ca, acido dipicolinico → problemasterilizzazione

Possono sopravvivere per decine di anni

GERMINAZIONE

Avviene in tre stadi: attivazione, iniziazione e crescita.AttivazioneAnche se posta in ambienti favorevoli la spora nongermina se non vi è danno al mantello: calore, abrasione,acidità e composti contenenti gruppi sulfidrici liberi.IniziazioneUna volta attivata la spora, la germinazione avviene secerti effettori sono legati (L-alanina, adenosina). Questo



certi effettori sono legati (L-alanina, adenosina). Questomette in azione l’autolisina che degrada il cortex. E’assunta acqua, è liberato il dipicolinato di calcio e sonodegradati gli altri costituenti della spora.CrescitaSi osserva un rigonfiamento all’interno (core) e quindisintesi di nuova parete su quella già presente (parete dellaspora) con successiva divisione cellulare.

Resistenza Inattivazione

DIFFERENZE PRINCIPALI TRA

ENDOSPORA E CELLULA ORIGINARIA

Morfologia e dimensioni

Composizione

Resistenza agenti chimici e fisici

Attività metaboliche

Batteri non sporigeni

80°C, 5-10 min

SporigeniC. botulinumC. tetaniClostridigangrenagassosa

Bollitura330 min90 min30 min

Vapor acqueo20 min, 121 °C,1 atmosferaCalore secco90 min, 170 °C

Appunti di Microbiologia 01 anatom .pdf · Appunti di Microbiologia Informazioni: Prof Eugenio Debbia Università di Genova Scuola di Scienze Mediche e Farmaceutiche DISC-Sezione

Documents