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AO-3958 – REVISÃO DO ORIGINAL EM INGLÊS – SUZANA GONTIJOPREPRINT_MARINA
Analysis of colostrum IgA against bacteria involved in neonatal infections
Análise de IgA do colostro contra bactérias envolvidas em infecções neonatais
Short title: Analysis of colostrum IgA against bacteria involved in neonatal infections
1 Elizabeth Moreira Dias1, Denise Bertulucci Rocha Rodrigues,1 Vinicius Rangel
Geraldo-Martins1 Ruchele Dias Nogueira,
1 Universidade de Uberaba, Uberaba, MG, Brazil.
Corresponding author: Ruchele Dias Nogueira - Avenida Nene Sabino, 1801 -
Universitário – Zip Code: 38055-500 – Uberaba, MG, Brazil - Phone: (55 34) 3319-
8800 - E-mail: [email protected]
Received on: Dec 06, 2016 – Accepted on: May 4, 2017
Conflict of interest: none.
DOI: XXX
Marina Chagas Oliveira, 25/04/17,
AutorDe acordo com a carta de submissão a ordem dos autores é: Elizabeth, Denise, Vinicius e Ruchele.Qual ordem devemos seguir?
Usuário, 05/06/17,
a da carta
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ABSTRACT
Objectives: To describe e compare the specificity of IgA antibodies against bacteria
extract of Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, and
Salmonella enteritidis. Methods: Colostrum samples were aseptically collected in the
first 12 hours after C-section delivery. The specificity of IgA against bacteria extracts
was analyzed by the Western blot. Results: The findings showed proteins of high
molecular weight frequently detectable in the samples. S. aureus was the most
frequently found bacterium in the samples (p<0.05). Approximately 93.8, 56.3, 62.5 e
60.4% of samples presented IgA reactive to S. aureus, K. pneumoniae, S. enteritidis,
and E. coli, respectively. Roughly 40% of samples showed no IgA reactive to K.
pneumoniae, S. enteritidis and E. coli. Conclusions: Clinical evidence of the
importance of breastfeeding for the immune protection of neonates was consistent
with the observed immunological findings, since most samples showed IgA reactive
against the species tested. The application and development of immunotherapies
during pregnancy, focused on frequently detected antigens, could be an important
tool to enhance the presence of IgA in colostrum.
KEYWORDS: Enterobacteriaceae; Staphylococcus aureus; Colostrum;
Immunoglobulin A; Infection
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RESUMO
Objetivos: Descrever e comparar a especificidade de anticorpos IgA de amostras de
colostro contra extratos bacterianos de Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus
aureus, Escherichia coli e Salmonella enteritidis. Métodos: As amostras de colostro
foram coletadas assepticamente nas primeiras 12 horas após o nascimento por
cesariana. A especificidade de IgA contra extratos de bactérias foi analisada por
Western blot. Resultados: Os achados mostraram proteínas de alto peso molecular
frequentemente detectáveis nas amostras. S. aureus foi a bactéria mais encontrada
nas amostras (p<0,05). Cerca de 93,8, 56,3, 62,5 e 60,4% das amostras
apresentaram IgA reativa a S. aureus, K. pneumoniae, S. enteritidis e E. coli,
respectivamente. Aproximadamente 40% das amostras não apresentaram IgA
reativa contra K. pneumoniae, S. enteritidis e E. coli. Conclusões: A evidência
clínica da importância da amamentação para proteção imunológica ao recém-
nascido foi consistente com os achados imunológicos observados, uma vez que a
maioria das amostras mostrou IgA reativa contra as espécies testadas. A aplicação e
o desenvolvimento de imunoterapias durante a gestação, focada nos antígenos
frequentemente detectados, poderia ser um importante instrumento para aumentar a
presença de IgA no colostro.
DESCRITORES: Enterobactérias; Staphylococcus aureus; Colostro; Imunoglobulina
A; Infecção
INTRODUCTION
Neonatal bacterial infection remains a major cause of morbidity and mortality during
the neonatal period. According to the World Health Organization, 6.3 million children
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under five years old died in 2013 - 45% of them during the neonatal period. (1) In
Brazil, about 60% of infant mortality is mainly due to bacterial infections.(2)
The greater susceptibility to neonatal bacterial infection is explained by the
relative immunological immaturity of newborns,(3) which is a direct consequence of
immune adjustment during the transitional period, from intra- to extra-uterine life. (4)
Ontogeny of the immune system begins in the embryo and continues during fetal life,
but it is completed only a few years after birth.(5) However, hospital, maternal and
obstetric practices may contribute to the occurrence of bacterial contamination that
may result in gastrointestinal and respiratory infections,(6) neonatal sepsis and
systemic involvement.(2)
Neonatal sepsis, the third most common cause of death in early life, results in
half a million deaths each year.(7,8) The pathogens most commonly isolated and
involved in neonatal infections are Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli,
Salmonella enteritidis and Staphylococcus aureus.(8)
Although E. coli colonizes the gastrointestinal tract of the neonate within a few
hours of life and develops a mutualistic relation with the host,(9) this species is the one
most frequently involved in neonatal sepsis.(10,11) Some serotypes of E. coli, such as
enteropathogenic, enterohaemorrhagic, enteroaggregative and enterotoxigenic, have
been reported as the main cause of diarrhea in children under one year of age. (12)
Also O6 E. coli serotype was detected in many cases of neonatal meningitis(13) and
sepsis.(14) Another relevant bacterium associated with neonatal gastrointestinal
infections is S. enteritidis, which usually appears after the first week of life, and
causes acute gastroenteritis and thus serious complications to the newborn, such as
sepsis and/or meningitis.(15)
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Also, S. aureus has been linked to various infections during the neonatal
period, such as late-onset neonatal sepsis,(8) impetigo,(16) arthritis and osteomyelitis.(17)
Virulence antigens of S. aureus are predominantly related to bacterial surface, such
as capsular polysaccharides, teichoic acid, peptidoglycans, adhesins, protein A, and
toxins.(18) Klebsiella pneumoniae is an opportunistic pathogen that causes
pneumonia, bacteremia and urinary tract infections(19) and has been reported as a
common agent in cases of neonatal sepsis.(20) It is also associated with high mortality,
often through strains multiresistant to antibiotics associated to the production of beta-
lactamase.(20)
After birth, with the interruption of IgG transfer via the umbilical cord, the
mother is able to offer to the newborn another form of passive protection,
represented by breastfeeding, which has indisputable protective attributes associated
to reduction of the risk of neonatal infection(3,21) because it contains several immune
components such as secretory IgA (IgAS).(22) The presence of IgAS represents the
first line of defense of the mucous membranes, conferring protection against
infections and coating mucosal surfaces, preventing the adhesion and invasion of
microorganisms in the tissues.(3,21,23)
Although exclusive breastfeeding is recommended and practiced, some
newborns that are breastfeeding can develop bacterial infection during the neonatal
period. There is evidence that children, although being breastfed, can develop
diarrhea by Campylobacter due to a lack of specific antibodies against virulence
antigens for this bacterium in colostrum.(23) Thus, it is necessary to determine, in
samples of colostrum, the presence and specificity of IgA against bacteria commonly
involved in neonatal infections, such as S. aureus, K. pneumoniae, S. enteritidis and
E. coli.
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OBJECTIVE
To evaluate, in samples of healthy Brazilian parturients’ colostrum, the presence or
absence of IgA antibodies against species involved in neonatal infections such as S.
aureus, K. pneumoniae, S. enteritidis and E. coli.
METHODS
A total of 48 mothers were enrolled in this study upon consent. The Ethical
Committee approved this study (CAAE: 02166713.4.0000.5145). Only healthy
mothers, 12 hours after delivery, were included in standard collection. Information on
maternal and gestational background was obtained through interviews with the
mothers. Samples of colostrum were collected by manual expression into sterile
polypropylene Falcon Tubes. After collection, the maternal samples were transported
in ice to the laboratory, centrifuged at 1300 g for 7 min to remove lipid components
and stored at -80ºC until use.
Western blotting of colostrum IgA against bacteria
Extracts of S. aureus (ATCC 25923), K. pneumoniae (ATCC 13883), S. enteritidis
(ATCC 13076) and E. coli (ATCC 11303) were obtained from fresh culture as
previously described.(20) Seventeen micrograms of extracts were separated by 6%-
SDS-page and transferred to nitrocellulose membranes. The membranes were
incubated with colostrum (1:1000) samples. After washing, they received a solution of
antibody HRP- goat anti-human IgA (Sigma) revealed by the ECL system (Amersham
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Biosciences Little Chalfont, Buckinghamshire, United Kingdom) and exposed in
biofilm for five minutes. The developed X-ray films were scanned in a scanning
densitometer (Bio-Rad GS-700 Imaging Densitometer) and the images were
evaluated with ImageQuant Software (Amersham Biosciences) to analyze patterns of
antigen recognition, including the number and intensity of reactive bands. Signals
were converted to absolute counts by comparison with the standards on the same
membrane. Failure to detect a signal was recorded as zero. A film blank value was
subtracted from the value of the reactive band. Some membranes were incubated
with blocking buffer without samples to obtain negative control. As positive control,
membranes were incubated with a saliva sample whose pattern of reaction with
antigen extracts had been previously measured. The reactive bands represent the
presence of IgA specific to proteins separated by the SDS page from each bacterium
extract.
Statistical analysis
The mean number of IgA bands and densitometry values of reactive Ags were
determined and compared between the bacteria by ANOVA. The frequencies of
positive IgA reactive to antigens were assessed by the chi-square test. The
correlations between IgA antibodies and specific to antigens were tested by Pearson
analysis. A p value < 0.05 was considered statistically significant.
RESULTS
The mothers were healthy and no complication during or after delivery was reported.
Their mean age was 25.2 ± 3.3 years. There were no differences in racial profile
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(p >0.05). All babies were born full term (> 37 weeks of gestation). No associations
were found between immunoglobulin levels and racial, maternal age, type of birth
and socioeconomic data (Pearson, p>0.05). There were also no statistically
significant differences between immunoglobulin levels and types of delivery:
cesarean or vaginal (p > 0.05).
Specificity of IgA response against bacterial extracts
Examples of immunoassays of samples with positive IgA response against the
bacterial antigens are represented in Figure 1. The frequencies of samples with
positive (with at least one detectable band) and negative responses to the four
strains are represented in Table 1. The majority of samples showed reactive IgA
against S. aureus, followed by S. enteritidis, E. coli and K. pneumoniae (Table 1).
The number of samples with positive response to S. aureus was statistically higher
than for other bacteria (Table 1, p<0.05, q>15.00).
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Figure 1. Patterns of IgA reactive against antigens from S. aureus, K.
pneumoniae, S. enteriditis and E. coli in samples of colostrum. Identities of antigen
extracts are above each lane. Standard molecular sizes (kDa) are indicated to the left
of the immunoblots.
Usuário, 06/05/17,
Esta em baixa qualidade?substitui por outra
Marina Chagas Oliveira, 04/26/17,
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Table 1. Intensity and frequency of IgA reactive to S. aureus, K. pneumoniae, S.
enteriditis and E. coli and antigens detected in colostrum samples
Bacterial extracts and molecular weight (kDa)
Numbers of samples with response:
Mean of total intensity of colostrum IgA reactivity ± SD
Positive n(%)
Negative n(%)
Staphylococcus aureus
45 (93.8)*#† 3 (6.2)*#† 410.7 ± 186.3$≠π
230 26 (57.8) 48.5 ± 41.9
221 18 (40.0) 33.6 ± 41.6
208 25 (55.6) 46.7 ± 42.2
185 17 (37.8) 31.7 ± 41.2Salmonella enteritidis 30 (62.5) † 18 (37.5) † 217.8 ± 186.3$≠π
244 16 (53.4) 31.6 ± 30.3
220 16 (53.4) 30.2 ± 29.7
176 14 (46.7) 27.0 ± 29.4
144 15 (50.0) 28.4 ± 29.6Klebsiella pneumoniae
27 (56.3)# 21 (43.7)# 133.2 ± 101.9≠ ¶
244 10 (37.0) 16.7 ± 22.2
229 7 (25.9) 12.0 ± 20.7
203 7 (25.9) 10.9 ± 19.6
194 7 (25.9) 12.5 ± 21.9
73 8 (29.6) 13.9 ± 22.4
46 8 (29.6) 13.3 ± 20.9
Escherichia coli 29 (60.4)* 19 (39.6)* 251.8 ± 129.9π ¶
238 12 (41.4) 27.7 ± 33.6
216 15 (51.7) 34.6 ± 34.0
202 15 (51.7) 32.7 ± 23.8
Page 11
162 13 (44.8) 30.0 ± 33.9
*chi-square: p = 0.001, q = 15.10; #chi-square: p = 0.001, q = 18.00; †chi-square: p = 0.001, q=17.10; $ANOVA: p < 0.001; ≠ANOVA: p < 0.001; πANOVA: p < 0.05; ¶ANOVA: p < 0.05.
Complexity of the IgA response against bacterial antigens
The number of IgA bands reactive against S. aureus ranged from 2 to 11 (mean:
4.89±2.19), K. pneumoniae, from 1 to 11 (mean: 2.93 ± 2.19), S. enteritidis from 1 to
11 (mean: 3.73 ± 2.21) and against E. coli from 1 to 8 (mean: 3.76 ± 1.911). Mean
number of IgA-reactive bands to microbial antigens from S. aureus, E. coli, K.
pneumoniae and S. enteritidis are represented in Figure 2. The mean number of
bands reactive to S. aureus was elevated and there were statistically significant
differences in comparison to other bacteria (Figure 2, p < 0.05). There were no
differences in the mean number of bands between K. pneumoniae, S. enteritidis and
E. coli (p > 0.05).
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Figure 2. Mean numbers of bands of IgA reactive with the bacterial antigens of S.
aureus, E. coli, K. pneumoniae and S. enteritidis in colostrum
IgA specific against the bacterial extracts bands separated by SDS-PAGE
IgA bands recognized and detected in bacterial extracts were analyzed, and their
molecular weight (kDa) was calculated by the equation obtained by the analysis of
the molecular weight standard bands. The number of samples with positive IgA to
antigens and their respective molecular weight with S. aureus. K. pneumoniae, S.
enteritidis and E. coli are represented in Figure 3. There was a great variation in the
bands recognized by IgA for each bacterial extract, and the majority of them showed
a high molecular weight ranging between 247-109 kDa. Approximately 59 bands of
different molecular weights were detected. A 244-kDa band was common in samples
of S. aureus, K. pneumoniae and S. enteritidis but there was no correlation between
them (p > 0.05, r < 0.28).
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Figure 3. Number of samples with IgA reactive to specific bacterial antigens
and their molecular weights (kDa)
The most detected frequencies of samples with positive response to antigens
are represented in Table 1. The IgA response against S. aureus showed the greatest
diversity; more than 20 types of different bands were detected (p < 0.05). The
reactivity of IgA against S. aureus showed a prevalence of bands with high molecular
weight (p < 0.05, Figure 3). Over 55% of samples with positive response to S. aureus
showed IgA reactive to 230 kDa and 208 kDa. Twelve different bands were found
among samples with positive IgA to S. enteritidis (n = 30). Bands of 244 and 220 kDa
were recognized in 53.4% of samples and were statistically more detected than the
others (Table 1, p < 0.05).
The analysis of IgA against K. pneumoniae revealed 14 distinct bands (Figure
3 and Table 1). The frequency of positive response against the most detected bands
(Table 1) did not differ (p > 0.05). The immunoblots of IgA against E. coli showed 13
different bands (Figure 3 and Table 1), but there were no differences in the frequency
of IgA response between these bands (p > 0.05).
There were variations in the intensities of IgA antibody reactions with the
recognized bands among children in both groups. Table 1 shows the sums of
intensities of IgA reactions with all bands detected for each species (total intensities).
In general, the intensity of IgA response was higher to S. aureus than other bacteria
(p < 0.05). In addition, the total intensity of IgA response to E. coli was decreased in
comparison to K. pneumoniae (p < 0.05).
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DISCUSSION
Results showed that the majority of colostrum samples had IgA reactive to bacterial
antigens, thus corroborating several studies that emphasize the importance of breast
milk, which provides protection against infection by Haemophilus influenzae and
Escherichia coli, (21) and enteric infections caused by E. coli, Vibrio cholerae,
Campylobacter, Shigella spp and Giardia lamblia. (24-26) Thus, breastfeeding can
protect neonates against the oral invasion of a large number of microorganisms.(21)
The majority of samples (94%) had antibodies IgA reactive against S. aureus
accompanied by intense and complex responses, since the number of reactive bands
was higher than for other bacteria. This high frequency of reactive IgA probably
occurred because this bacterium is part of the normal human microbiota in various
regions of the human body, which does not exclude the possibility of this
microorganism causing disease under immunosuppression, or when epithelial
barriers are violated, which can be limited to the mucosal surface or spread
throughout the body.(9)
Although the majority of samples had reactive IgA against these bacteria,
about 40% of samples did not present IgA reactive to K. pneumoniae, S. enteritidis or
E. coli, which suggests that some newborns may develop infections from these
microorganisms even though they are breastfed. One of the reasons suggested to
explain breastfed children with diarrhea by Campylobacter is a lack of specific
antibodies against common antigens of virulence of Campylobacter in samples of
colostrum.(23) Thus the importance of not only of studying the presence of IgA against
bacteria, but also of evaluating and identifying immunodominant antigens of these
species in the natural immune response.
Page 15
The reasons for lower or higher detection of antibodies in the samples may be
associated to the antigenic stimulation. Thus, it is necessary to implement a strategic
stimulation to enhance the immune protection of newborns in their neonatal period
against such microorganisms, and increase immunogenic antigens, which occurs in
meningococcal infection. Prenatal women immunization, with a single dose of
meningococcal vaccine, results in an increase in specific IgG levels in the newborn
serum for 2 to 3 months after birth, and an increase of the specific IgA levels to the
microorganism in the milk for at least 6 months.(23)
The results showed a great diversity of the antigen species tested, with a
predominance of high molecular weight protein. The most common bands can be
related to the pathogenic action and/or antigenic stimulation of these bacteria, such
as 230 and 289 kDa S. aureus; and the four most prevalent bands of S. enteritidis
and E. coli are shown in Table 1. K. pneumoniae showed a great variability in IgA
response, but did not show a specific pattern of response. The literature provides
some information about several antigens of these bacteria that are involved in their
pathogenic capacities, but little is known about the high molecular weight antigens
widely recognized by the samples of this study.
An antigen of 94 kDa called “intimin” and other antigens recognized by IgA of
70, 80 and 110 kDa were associated in the injury process “attaching and effacing” by
enteropathogenic E. coli in human milk.(6) Also, Rck is a 17-kDa outer membrane
protein, expressed in E. coli and S. enteritidis, which inhibits complementary
pathways, thereby preventing opsonization through this route.(27) No sample showed
IgA reactive to intimin (94 kDa) and 17 kDa band, but about 38 and 17% of samples
responded to a band of 72 and 117 kDa, respectively, probably the same as
Page 16
previously reported.(6) K. pneumoniae antigens of 35 and 36 kDa opsonizing induce
antibodies(28) and were recognized by 29% of the present study samples.
The 106 kDa antigen (fibronectin type A) is one of the most important
molecules involved in the adhesion in the early stages of infection by S. aureus.(29) In
addition to those, protein constituents of S. aureus membrane of 30 and 36 kDa may
play an important role in infections caused by this bacterium.(30) These antigens were
detected in 17% of samples with positive responses.
The present study shows evidence that the majority of colostrum samples can
protect newborns against neonatal bacterial infection. It is important to understand
how those antibodies provided by breastfeeding could help the mucosal immune
system against the colonization and the challenge offered by those species, in order
to develop prevention strategies to avoid such infections. The natural response to
bacterial extracts tested shows a promising way for the development of vaccines
containing antigens that could be applied during pregnancy, increasing the specific
IgA levels in colostrum.
ACKNOWLEDGMENTS:
This study was supported by the National Council for Scientific and Technological
Development (CNPq), process no. 472928/2007-4.
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AO-3958 – TRADUÇÃO PARA PORTUGUÊS – SUZANA GONTIJO
Analysis of colostrum IgA against bacteria involved in neonatal infections
Análise de IgA do colostro contra bactérias envolvidas em infecções neonatais
Título curto: Análise de IgA do colostro contra bactérias envolvidas em infecções
neonatais
1 Elizabeth Moreira Dias, 1Denise Bertulucci Rocha Rodrigues, ,1 Vinicius Rangel
Geraldo-Martins,1 Ruchele Dias Nogueira,
1 Universidade de Uberaba, Uberaba, MG, Brasil.
Autor para correspondência: Ruchele Dias Nogueira - Avenida Nene Sabino, 1801 -
Universitário – CEP: 38055-500 – Uberaba, MG, Brasil - Tel: (55 34) 3319-8800 - E-
mail: [email protected]
Data de submissão: 06/12/2016 – Data de aceite: 04/05/2017
Conflitos de interesse: não há.
DOI: XXX
Usuário, 05/06/17,
A da carta de submissaõ
Marina Chagas Oliveira, 04/06/17,
AutorDe acordo com a carta de submissão a ordem dos autores é: Elizabeth, Denise, Vinicius e Ruchele.Qual ordem devemos seguir?A da carta de submissão
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ABSTRACT
Objectives: To describe e compare the specificity of IgA antibodies against bacteria
extract of Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, and
Salmonella enteritidis. Methods: Colostrum samples were aseptically collected in the
first 12 hours after C-section delivery. The specificity of IgA against bacteria extracts
was analyzed by the Western blot. Results: The findings showed proteins of high
molecular weight frequently detectable in the samples. S. aureus was the most
frequently found bacterium in the samples (p<0.05). Approximately 93.8, 56.3, 62.5 e
60.4% of samples presented IgA reactive to S. aureus, K. pneumoniae, S. enteritidis,
and E. coli, respectively. Roughly 40% of samples showed no IgA reactive to K.
pneumoniae, S. enteritidis and E. coli. Conclusions: Clinical evidence of the
importance of breastfeeding for the immune protection of neonates was consistent
with the observed immunological findings, since most samples showed IgA reactive
against the species tested. The application and development of immunotherapies
during pregnancy, focused on frequently detected antigens, could be an important
tool to enhance the presence of IgA in colostrum.
KEYWORDS: Enterobacteriaceae; Staphylococcus aureus; Colostrum;
Immunoglobulin A; Infection
RESUMO
Objetivos: Descrever e comparar a especificidade de anticorpos IgA de amostras de
colostro contra extratos bacterianos de Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus
aureus, Escherichia coli, and Salmonella enteritidis. Métodos: As amostras de
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colostro foram coletadas assepticamente nas primeiras 12 horas após o nascimento
por cesariana. A especificidade de IgA contra extratos de bactérias foi analisada por
Western blot. Resultados: Os achados mostraram proteínas de alto peso molecular
frequentemente detectáveis nas amostras. S. aureus foi a bactéria mais encontrada
nas amostras (p<0,05). Cerca de 93,8, 56,3, 62,5 e 60,4% das amostras
apresentaram IgA reativa a S. aureus, K. pneumoniae, S. enteritidis e E. coli,
respectivamente. Aproximadamente 40% das amostras não apresentaram IgA
reativa contra K. pneumoniae, S. enteritidis e E. coli. Conclusões: A evidência
clínica da importância da amamentação para proteção imunológica ao recém-
nascido foi consistente com os achados imunológicos observados, uma vez que a
maioria das amostras mostrou IgA reativa contra as espécies testadas. A aplicação e
o desenvolvimento de imunoterapias durante a gestação, focada nos antígenos
frequentemente detectados, poderia ser um importante instrumento para aumentar a
presença de IgA no colostro.
DESCRITORES: Enterobactérias; Staphylococcus aureus; Colostro; Imunoglobulina
A; Infecção
INTRODUÇÃO
Infecções bacterianas neonatais ainda são a principal causa de
morbimortalidade no período neonatal. De acordo com a Organização Mundial de
Saúde, 6,3 milhões de crianças com menos de 5 anos morreram em 2013 – 45%
dos óbitos ocorreram no período neonatal.(1) No Brasil, cerca de 60% da mortalidade
infantil deve-se a infecções bacterianas.(2)
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A maior susceptibilidade a infecções bacterianas neonatais é justificada pela
imaturidade imunológica relativa de recém-nascidos,(3) consequência direta do ajuste
imunológico no período de transição entre as vidas intra- e extrauterina.(4) A
ontogenia do sistema imunológico começa no embrião e continua durante a vida
fetal, mas apenas se completa alguns anos após o nascimento.(5) Porém, certas
práticas hospitalares, maternais e obstétricas podem contribuir para a ocorrência de
contaminação bacteriana, que resulta em infecções gastrointestinais e respiratórias,
(6) sepse neonatal e envolvimento sistêmico.(2)
A sepse neonatal, terceira causa mais comum de morte precoce, é
responsável por 500 mil mortes por ano.(7,8) Os patógenos isolados com mais
frequência, envolvidos em infecções neonatais são a Klebsiella pneumoniae,
Escherichia coli, Salmonella enteritidis e Staphylococcus aureus.(8)
Embora E. coli colonize o trato gastrointestinal no neonato dentro de algumas
horas de vida e desenvolva uma relação mutualista com seu hospedeiro,(9) esta
espécie é a mais frequentemente envolvida na sepse neonatal.(10,11) Alguns sorotipos
de E. coli, como a enteropatogênica, enterohemorrágica, enteroagregativa e
enterotoxigênica, já foram descritas como a principal causa de diarreia em crianças
com menos de 1 ano de idade.(12) O sorotipo O6 da E. coli também já foi detectado
em diversos casos de meningite neonatal (13) e sepse neonatal.(14) Outra relevante
bactéria associada a infecções gastrointestinais neonatais é a S. enteritidis, que
geralmente aparece após a primeira semana de vida e causa gastroenterite aguda, e
portanto sérias complicações para o recém-nascido, como sepse e/ou meningite.(15)
S. aureus também está associada a inúmeras infecções durante o período
neonatal, como sepse neonatal de início tardio,(8) impetigo,(16) artrite e osteomielite.(17)
Antígenos de virulência da S. aureus estão predominantemente relacionados à
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superfície bacteriana, como polissacarídeos capsulares, ácido teicóico,
peptidoglicanos, adesinas, proteína A e toxinas.(18) Klebsiella pneumoniae é um
patógeno oportunista causador de pneumonia, bacteremia e infecções do trato
urinário(19) e já foi relatada como um agente comum em casos de sepse neonatal.(20)
Também está associada a alta mortalidade, muitas vezes por meio de cepas
multirresistentes a antibióticos associados à produção de beta-lactamase.(20)
Após o nascimento, com a interrupção da transferência de IgG via cordão
umbilical, a mãe pode fornecer outra forma de proteção passiva ao recém-nascido
por meio do aleitamento materno, que possui atributos protetores inquestionáveis
associados à redução do risco de infecção neonatal,(3,21) já que contém diversos
componentes imunes, como a IgA secretora (IgAS).(22) A presença de IgAS
representa a primeira linha de defesa das membranas mucosas, oferecendo
proteção contra infecções e revestimento às superfícies mucosas, prevenindo assim
a adesão e invasão de microrganismos nos tecidos.(3,21,23)
Embora a amamentação exclusiva seja recomendada e praticada, alguns
recém nascidos em amamentação podem desenvolver infecções bacterianas
durante o período neonatal. Há evidências de que as crianças, apesar de serem
amamentadas, podem desenvolver diarreia por Campylobacter devido à falta de
anticorpos específicos contra antígenos de virulência para esta bactéria no colostro.
(23) Portanto, é necessário determinar, em amostras de colostro, a presença de IgA
específica contra extratos de bactérias geralmente envolvidas em infecções
neonatais, como S. aureus, K. pneumoniae, S. enteritidis e E. coli.
OBJETIVO
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Avaliar, em amostras de colostro de parturientes brasileiras saudáveis, a presença
ou ausência de anticorpos IgA contra espécies envolvidas em infecções neonatais
como S. aureus, K. pneumoniae, S. enteritidis e E. coli.
MÉTODOS
Um total de 48 mulheres foram incluídas mediante consentimento. O Comitê de
Ética aprovou o estudo (CAAE: 02166713.4.0000.5145). Apenas mães saudáveis,
12 horas após o parto, foram incluídas na coleta amostral. Informações sobre dados
médicos e socioeconômicos sobre as gestantes e sobre o período gestacional foram
obtidas por meio de entrevistas. As amostras de colostro foram coletadas por
expressão manual diretamente em tubos de polipropileno estéreis do tipo Falcon. As
amostras foram obtidas e transportadas em gelo para o laboratório, centrifugadas e
mantidas a -80°C até o momento do uso.
Western blotting da IgA do colostro contra bactérias
Extratos de S. aureus (ATCC 25923), K. pneumoniae (ATCC 13883), S. enteritidis
(ATCC 13076) e E. coli (ATCC 11303) foram obtidos de culturas recentes, conforme
previamente descrito.(20) Dezessete microgramas de extratos foram separados por
SDS-page 6% e transferidos para membranas de nitrocelulose. As membranas
foram incubadas com as amostras de colostro (1:1000). Após a lavagem, receberam
uma solução de IgA anti-humana de cabra conjugada a HRP (Sigma), revelada pelo
sistema ECL (Amersham Biosciences Little Chalfont, Buckinghamshire, Reino Unido)
e exposta em biofilme por cinco minutos. Os filmes de Raio X revelados foram
escaneados em um densitômetro (Bio-Rad GS-700 Imaging Densitometer) e as
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imagens foram avaliadas com o software ImageQuant (Amersham Biosciences) para
analisar padrões de reconhecimento de antígenos, incluindo o número e intensidade
das bandas reativas. Os sinais foram convertidos em contagens absolutas por
comparação com os padrões na mesma membrana. Sinais não detectados foram
registrados como zero. Um valor do filme em branco foi subtraído do valor da banda
reativa. Algumas membranas foram incubadas com tampão de bloqueio sem
amostras para obtenção do controle negativo. Como controle positivo, as
membranas foram incubadas com amostras de saliva, cujos padrões de reação com
extratos de antígeno haviam sido previamente medidos. As bandas reativas
representam a presença de IgA específica para proteínas separadas pela SDS-page
de cada extrato de bactéria.
Análise estatística
O número médio de bandas de IgA e valores de densitometria da Ags reativa foram
determinados e comparados entre as bactérias por meio de ANOVA. As frequências
de IgA reativa positiva para antígenos foram avaliadas pelo teste do qui-quadrado.
As correlações entre anticorpos IgA e a específica para antígenos foram testadas
pela análise de Pearson. Um valor de p < 0,05 foi considerado estatisticamente
significativo.
RESULTADOS
As mães estavam saudáveis e não houve complicações durante nem após o parto.
A idade média das pacientes era 25,2 ± 3,3 anos. Não houve diferenças entre perfis
raciais (p > 0,05). Todos os bebês nasceram a termo (> 37 semanas de gestação).
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Não foram achadas associações entre níveis de imunoglobulina e dados sobre etnia,
idade da mãe, tipo de parto e de caráter socioeconômico (Pearson, p>0,05).
Também não foram achadas diferenças estatisticamente significativas entre níveis
de imunoglobulina e tipo de parto: cesariana ou normal (p > 0,05).
Especificidade da resposta da IgA contra extratos bacterianos
Exemplos de imunoensaios de amostras com resposta positiva da IgA contra os
antígenos bacterianos estão representados na Figura 1. As frequências de amostras
com respostas positivas (com pelo menos uma banda detectável) e negativas às
quatro cepas estão demonstradas na Tabela 1. A maioria das amostras mostrou IgA
reativa contra S. aureus, seguida de S. enteretidis, E. coli e K. pneumoniae (Tabela
1). O número de amostras com respostas positivas à S. aureus mostrou-se
estatisticamente mais alto do que a outras bactérias (Tabela 1, p<0,05, q>15,00)
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Figura 1. Padrões de IgA reativa contra antígenos de S. aureus, K.
pneumoniae, S. enteriditis e E. coli em amostras de colostro. Identidades dos
extratos de antígeno estão acima de cada coluna. Tamanhos moleculares padrão
(kDa) estão indicados à esquerda dos imunoblots.
Tabela 1. Intensidade e frequência de IgA reativa a S. aureus, K. pneumoniae, S.
enteriditis e E. coli e antígenos detectados nas amostras de colostro.
Usuário, 05/06/17,
troquei a imagm
Marina Chagas Oliveira, 04/06/17,
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Extratos bacterianos
e peso molecular
(kDa)
Número de amostras
com respostas:
Média da intensidade total
da reatividade da IgA do
Colostro ± DPPositiva
n(%)
Negativa
n(%)
Staphylococcus
aureus
45 (93,8)*#† 3 (6,2)*#† 410,7 ± 186,3$≠π
230 26 (57,8) 48,5 ± 41,9
221 18 (40,0) 33,6 ± 41,6
208 25 (55,6) 46,7 ± 42,2
185 17 (37,8) 31,7 ± 41,2
Salmonella enteritidis 30 (62,5) † 18 (37,5) † 217,8 ± 186,3$≠π
244 16 (53,4) 31,6 ± 30,3
220 16 (53,4) 30,2 ± 29,7
176 14 (46,7) 27,0 ± 29,4
144 15 (50,0) 28,4 ± 29,6
Klebsiella pneumoniae
27 (56,3)# 21 (43,7)# 133,2 ± 101,9≠ ¶
244 10 (37,0) 16,7 ± 22,2
229 7 (25,9) 12,0 ± 20,7
203 7 (25,9) 10,9 ± 19,6
194 7 (25,9) 12,5 ± 21,9
73 8 (29,6) 13,9 ± 22,4
46 8 (29,6) 13,3 ± 20,9
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Escherichia coli 29 (60,4)* 19 (39,6)* 251,8 ± 129,9π ¶
238 12 (41,4) 27,7 ± 33,6
216 15 (51,7) 34,6 ± 34,0
202 15 (51,7) 32,7 ± 23,8
162 13 (44,8) 30,0 ± 33,9
*qui-quadrado: p = 0,001, q = 15,10; #qui-quadrado: p = 0,001, q = 18,00; †qui-quadrado: p=0,001, q = 17,10; $ANOVA: p < 0,001; ≠ANOVA: p < 0,001; πANOVA: p < 0,05; ¶ANOVA: p<0,05.
Complexidade da resposta da IgA contra antígenos bacterianos
O número de bandas de IgA reativas a S. aureus variou entre 2 e 11 (média:
4,89 ± 2,19), K. pneumoniae, entre 1 e 11 (média 2,93 ± 2,19), S. enteretidis entre 1
e 11 (média 3,73 ± 2,21) e contra E. coli entre 1 e 8 (média: 3,76 ± 1,911). O número
médio das bandas reativas a antígenos microbianos de S. aureus, E. coli, K.
pneumoniae e S. enteritidis está representado na Figura 2. O número médio de
bandas reativas a S. aureus mostrou-se elevado, e havia diferenças estatisticamente
significativas em comparação a outras bactérias (Figura 2, p < 0,05). Não houve
diferenças significativas no número médio de bandas entre K. pneumoniae, S.
enteritidis e E. coli (p > 0,05).
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S. aureus K. pneumoniae E. coli S. enteritidis0
1
2
3
4
5
6
Extratos bacterianos
Núm
ero
méd
io d
e ba
ndas
IgA
rea
tivas
_______________*
_________________________________**
___________________________________________________***
*p=0,02 **p=0,02 ***p=0,04
Figura 2. Número médio de bandas reativas de IgA com antígenos bacterianos de
S. aureus, E. coli, K. pneumoniae e S. enteritidis no colostro.
IgA específica contra bandas de extratos bacterianos separados por SDS-
PAGE
As bandas de IgA reconhecidas e detectadas nos extratos bacterianos foram
analisadas, e seu peso molecular (kDa) foi calculado pela equação obtida pela
análise das bandas padrão de peso molecular. O número de amostras com IgA
positiva para antígenos e seu peso molecular respectivo com S. aureus. K.
pneumoniae, S. enteritidis e E. coli estão representados na Figura 3. Foi observada
Page 32
grande variação nas bandas reconhecidas pela IgA para cada extrato bacteriano, e a
maioria delas mostrou grande peso molecular, variando entre 247 e 109 kDa. Cerca
de 59 bandas de diferentes pesos moleculares foram detectadas. Uma banda de
peso molecular de 244 kDa mostrou-se comum em amostras de S. aureus. K.
pneumoniae e S. enteritidis, mas não houve correlação entre elas (p > 0,05, r <0,28).
SUBSTITUIR NA FIGURA ABAIXO: (OK)
Figura 3. Número de amostras com IgA reativa para antígenos bacterianos
específicos e seu peso molecular (kDa).
Peso Molecular (kDa)Peso Molecular (kDa)
Peso Molecular (kDa)Peso Molecular (kDa)
Número de amostras com resposta positiva
Número de amostras com resposta positiva
Número de amostras com resposta positiva
Número de amostras com resposta positiva
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As frequências de amostras com resposta positiva a antígenos mais
detectadas estão representadas na Tabela 1. A resposta da IgA contra S. aureus
apresentou a maior diversidade; mais de 20 tipos de bandas diferentes foram
detectadas (p < 0,05). A reatividade da IgA contra S. aureus demonstrou uma
prevalência de bandas com grande peso molecular (p < 0,05, Figura 3). Mais de
55% das amostras com resposta positiva à S. aureus mostrou IgA reativa a 230 kDa
e 208 kDa. Entre amostras com IgA positiva para S. enteritidis (n = 30), 12 bandas
diferentes foram encontradas. Bandas de 244 e 220 kDa foram reconhecidas em
53,4% das amostras e foram estatisticamente mais frequentemente detectadas do
que as outras (Tabela 1, p < 0,05).
A análise da IgA contra K. pneumoniae revelou 14 bandas distintas (Figura 3
e Tabela 1). A frequência da resposta positiva contra as bandas mais detectadas
(Tabela 1) não diferiu (p > 0,05). Os imunoblots de IgA contra E. coli apresentou 13
bandas diferentes (Figura 3 e Tabela 1), mas não houve diferenças na frequência da
resposta de IgA entre essas bandas (p > 0,05).
Houve variações nas intensidades das reações de anticorpos de IgA com as
bandas reconhecidas entre as crianças dos dois grupos. A Tabela 1 mostra a soma
das intensidades das reações de IgA com as bandas detectadas para cada espécie
(intensidades totais). Em geral, a intensidade da resposta de IgA foi mais alta para
S. aureus do que para outras bactérias (p < 0,05). Além disso, a intensidade total da
resposta da IgA para E. coli estava diminuída em relação à da K. pneumoniae
(p<0,05).
Page 34
DISCUSSÃO
Os resultados mostraram que a maioria das amostras de colostro
apresentava IgA reativa a antígenos bacterianos, corroborando diversos estudos que
enfatizam a importância do leite materno, que protege contra infecções por
Haemophilus influenzae e Escherichia coli,(21) e infecções entéricas causadas por E.
coli, Vibrio cholerae, Campylobacter, Shigella spp e Giardia lamblia.(24-26) Portanto, o
aleitamento materno pode proteger neonatos contra a invasão oral de diversos
microrganismos.(21)
A maioria das amostras (94%) apresentava anticorpos IgA reativos contra S.
aureus acompanhados de respostas intensas e complexas, já que o número de
bandas reativas mostrou-se maior do que para outras bactérias. Esta alta frequência
de IgA reativa provavelmente ocorreu porque esta bactéria é parte da microbiota
humana normal em diversas regiões do corpo humano, o que não exclui a
possibilidade desse microrganismo causar doenças sob imunossupressão, ou
quando barreiras epiteliais são violadas, o que pode ser limitado à superfície mucosa
ou espalhado pelo corpo.(9)
Apesar de a maioria das amostras apresentar IgA contra essas bactérias,
cerca de 40% não apresentaram IgA reativa para K. pneumoniae ou E. coli,
sugerindo que alguns recém-nascidos podem desenvolver infecções a partir desses
microrganismos mesmo sendo amamentados. Uma das razões sugeridas para
explicar crianças amamentadas com diarreia por Campylobacter é a falta de
anticorpos específicos contra antígenos de virulência comuns de Campylobacter em
amostras de colostro.(23) Eis então a importância, não apenas de estudarmos a
presença de IgA contra bactérias, mas também de avaliarmos e identificarmos os
antígenos imunodominantes dessas espécies na resposta imune natural.
Page 35
As razões para a maior ou menor detecção de anticorpos nas amostras
podem estar associadas à estimulação antigênica. Portanto, é necessário
implementar uma estimulação estratégica para aumentar a proteção imune de
recém-nascidos em seu período neonatal contra tais microrganismos e aumentar
antígenos imunogênicos, o que ocorre com a infecção meningocócica. A imunização
de mulheres no período pré-natal, com uma dose única de vacina meningocócica,
resulta em um aumento de níveis de IgG específica no soro do recém-nascido por 2
a 3 meses após o nascimento, e um aumento de níveis de IgA específica para o
microrganismo no leite por até 6 meses.(23)
Esses resultados mostram uma grande diversidade das espécies testadas de
antígenos, com predominância de proteínas com alto peso molecular. As bandas
mais comuns podem estar relacionadas à ação patogênica e/ou estimulação
antigênica dessas bactérias, como S. aureus de 230 e 289 kDa, e as quatro bandas
mais prevalente de S. enteritidis e E. coli são mostradas na Tabela 1. A K.
pneumoniae mostrou grande variabilidade na resposta da IgA, mas não apresentou
padrão específico de resposta. A literatura oferece algumas informações sobre
diversos antígenos dessas bactérias que estão envolvidos em suas capacidades
patogênicas, mas sabe-se pouco sobre antígenos de alto peso molecular, que
apareceram expressivamente nas amostras deste estudo.
Um antígeno de 94 kDa chamado “intimina” e outros antígenos reconhecidos
pela IgA de 70, 80 e 110 kDa estavam associados no processo de lesão “attaching
and effacing” (A/E) pelo E. coli enteropatogênico no leite humano.(6) Além disso, a
Rck é uma proteína da membrana externa de 17 kDa, expressa em E. coli e S.
enteritidis, inibidora de vias complementares, que assim impede a opsonização por
essas vias.(27) Nenhuma amostra apresentou IgA reativa para intimina (94 kDa) e
Page 36
banda 17 kDa, mas cerca de 38 e 17% das amostras responderam a uma banda de
72 e 117 kDa, respectivamente, provavelmente, da mesma forma que previamente
reportado.(6) Antígenos de K. pneumoniae de 35 e 36 kDa induzem anticorpos na
opsonização(28) e foram reconhecidos por 29% das amostras do presente estudo.
O antígeno de 106 kDa (fibronectina tipo A) é uma das mais importantes
moléculas envolvidas na adesão em estágios precoces da infecção por S. aureus.(29)
Além dessas moléculas, constituintes protéicos da membrana da S. aureus de 30 e
36 kDa podem cumprir um importante papel em infecções causadas por esta
bactéria.(30) Esses antígenos foram detectados em 17% das amostras com respostas
positivas.
O presente estudo mostra evidências de que a maioria das amostras de
colostro pode proteger os recém-nascidos de infecções bacterianas neonatais. É
importante entender como esses anticorpos proporcionados pelo aleitamento podem
ajudar o sistema imunológico da mucosa contra a colonização e o desafio
apresentado por essas espécies, para desenvolvermos estratégias de prevenção e
evitarmos essas infecções. A resposta natural aos extratos bacterianos testados
mostra um caminho promissor para o desenvolvimento de vacinas contendo
antígenos que poderiam ser aplicadas durante a gravidez, aumentando assim os
níveis de IgA específica no colostro.
AGRADECIMENTOS:
Este estudo teve o apoio do Conselho Nacional de Pesquisa (CNPq), processo
472928/2007-4.
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