Appl. Environ. Microbiol. 1990 Lauff 3346 53

7/27/2019 Appl. Environ. Microbiol. 1990 Lauff 3346 53

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1990, 56(11):3346.Appl. Environ. Microbiol.

BreitfellerJohn J. Lauff, D. Bernie Steele, Louise A. Coogan and James M.

Pure Culture of an Agrobacterium spDegradation of the Ferric Chelate of EDTA by a

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2/9

Vo l . 5 6 ,N o . 1 1

D e g r a d a t i o no f t h e F e r r i c C h e l a t eo f EDTA b y a P u r e C u l t u r e o f anA g r o b a c t e r i u ms p .

JOHN J . L A U F F, 1 * D . BERNIE STEELE,2 LOUISE A . COOGAN,' AND JAMES M. B R E I T F E L L E R ' t

G e n e n c o rI n t e r n a t i o n a l ,1 8 7 0 W i n t o nR o a d , S o u t h , R o c h e s t e r ,New Yo r k 1 4 6 1 8 , 1and D e p a r t m e n to f B o t a n ya n d M i c r o b i o l o g y ,A u b u r nU n i v e r s i t y ,A u b u r n ,Alabama 3 6 8 9 9 2

R e c e i v e d7 Ma y 1 9 9 0 / A c c e p t e d1 9A u g u s t1 9 9 0

A pure c u l t u r e o f an A g r o b a c t e r i u ms p . ( d e p o s i t e das AT C C 5 5 0 0 2 )t h a t m i n e r a l i z e st h e f e r r i cc h e l a t e o fEDTA ( f e r r i c - E D T A )was i s o l a t e db y s e l e c t i v ee n r i c h m e n tf r o ma t r e a t m e n tf a c i l i t yr e c e i v i n gi n d u s t r i a l w a s t ec o n t a i n i n g f e r r i c - E D T A .T h e i s o l a t egrew on f e r r i c - E D T Aas t h e s o l ec a r b o n source a t c o n c e n t r a t i o n se x c e e d i n g1 0 0m M . A s t h e d e g r a d a t i o np r o c e e d e d ,c a r b o nd i o x i d e ,a m m o n i a ,a n d an u n i d e n t i f i e dm e t a b o l i t e ( s )were p r o d u c e d ;t h e pH i n c r e a s e d ,a n d i r o n was p r e c i p i t a t e df r o ms o l u t i o n . Th e max i mu m r a t e o f d e g r a d a t i o no b s e r v e dw i t h s o d i u mf e r r i c - E D T Aas t h e s ub st r a te wa s 2 4 m M / d a y .A t a s u b s t r a t e c o n c e n t r a t i o no f 3 5 m M,90% o f t he s u b s t r a t e was d e g r a d e di n 3 d a y sa n d 7 0 % o f t h e a s s o c i a t e dc h e m i c a loxygen demand wa s r e m o v e df r o ms o l u t i o n .L e s s t h a n1 5 % o f t h e c a r b o ni n i t i a l l yp r e s e n t was i n c o r p o r a t e di n t ot h e c e l lm a s s . S i g n i f i c a n tg r o w t ho f t h i ss t r a i nwas n o t o b s e r v e dw i t h u n c o m p l e x e dEDTA as t h e s o l ec a r b o n source a t c o m p a r a b l ec o n c e n t r a t i o n s ;h o w e v e r ,t h e f e r r i cc h e l a t e o f p r o p y l e n e d i a m i n e t e t r a a c e t i ca c i d ( f e r r i c - P D TA )d i d s u p p o r tg r o w t h .

Th e f e r r i cc h e l a t eo f EDTA ( f e r r i c - E D T A )a n d o t h e r m e t a lc h e l a t e s o f EDTA are n o t r e a d i l yb i o d e g r a d a b l e( 4 ) . Th ec h e l a t o rh a s b e e n r e p o r t e dt o pass t h r o u g hs e c o n d a r yt r e a t -ment f a c i l i t i e sw i t h o u tn o t a b l ed e g r a d a t i o n( 1 5 ) .T h is h a sl e dt o concerns a b o u t t h e p o s s i b l e a c c u m u l a t i o no f EDTA i n t h ee n v i r o n m e n tas w e l l as t h e p o ss i bl e t r a n s p o r t o f h e a v ym e t a l s b y r e l e a s eo f h i g h c o n c e n t r a t i o n si n t o r i v e r sors e d i m e n t sp o l l u t e dw i t h m e t a l s . EDTA h a s a l s o b e e n i m p l i -c a t e d i n t h e m o b i l i z a t i o no f r a d i o n u c l i d e sf r o m n u c l e a r -waste d i s p o s a l s i t e s( 1 2 ) .

P r e v i o u s s t u d i e sh a v e i n d i c a t e d t h a t a c c u m u l a t i o no ff e r r i c - E D T Ai n t h e e n v i r o n m e n tover years i s u n l i k e l y .When f e r r i c - E D T Ai s p r e s e n t a t r e l a t i v e l yl o w c o n c e n t r a -t i o n s( 2 t o 1 , 0 0 0p , g / gi n s o i l ) ,i t i s b i o l o g i c a l l yr e m o v e df r o ms o i l sa n d s e d i m e n t s( 1 6 ,1 7 ) .I n t h e s e s t u d i e s ,t h e d i s a p p e a r -an ce o f l o w c o n c e n t r a t i o n so f E D TA a n d i t s m e t a l c h e l a t e swas shown t o o c c u r i n 1 5 t o 4 5 w e e k si n a w i d e v a r i e t yo fs o i l s .No s i n g l eb a c t e r i a lt y p e was i s o l a t e dt h a twas c a p a b l eo f m e t a b o l i z i n gEDTA or i t s m e t a l c h e l a t e s ;r a t h e r ,come-t a b o l i s mb y a m i x e dp o p u l a t i o nwas p o s t u l a t e das t h e mostp r o b a b l em e c h a n i s mo f d e g r a d a t i o n .

I n l i q u i dc u l t u r e a t . 2 mM EDTA, m i x e d c u l t u r e so fa e r o b i c b a c t e r i a d e g r a d e d more t h a n 90% o f t h e f e r r i cc h e l a t e i n 5 d a y s ( 2 ) .A g a i n ,no pure c u l t u r ewas i s o l a t e dt h a tw o u l dgrow on t h i ss u b s t r a t e as t h e s o l ec a r b o n source .

A l t h o u g ht h e r e ar e no p u b l i s h e dr e p o r t s o f s i n g l ec u l t u r e so f m i c r o o r g a n i s m sc a p a b l eo f d e g r a d i n gf e r r i c - E D T A( 5 ) ,ap a t e n t c l a i m s t h a tt h e r e are P s e u d o m o n a sa n d A l c a l i g e n e ss t r a i n sc a pa b l e o f d e g r a d i n gEDTA u n d e ra e r o b i cc o n d i t i o n s( N a g a s e S e i k a g a k u Kogyo K . K . , J a p a n e s e L a i d - O p e nP a t e n t A p p l i c a t i o n[ K o ka i ] 5 8 04 3 7 82 ,1 9 8 3 ) .Th e maximums u b s t r a t e c o n c e n t r a t i o nc l a i m e dwas 5 mM a n d r e q u i r e d 5d a y s f o r 80% d e g r a d a t i o n .

B e s i d e s b i o l o g i c a ld e g r a d a t i o n , t h e f e r r i cc h e l a t e can b ed e g r a d e db y UV i r r a d i a t i o n( 6 ,8 ) ,w h i c hmay b e an a l t e r n a -

* C o r r e s p o n d i n ga u t h o r .t P r e s e n t a d d r e s s : A n a l y t i c a l T e c h n o l o g yD i v i s i o n ,E a s t m a n

Kodak C o . , R o c h es te r ,NY 1 4 6 5 0 .

t i v em e c h a n i s mf o rr e m o v a lo f t h e s ub st r a te f r o m t h e e n v i -r o n m e n t .L o c k h a r ta n d B l a k e l e y( 1 0 ,1 1 )h a v ed e m o n s t r a t e dd e g r a d a t i o ni n b r i g h ts u n l i g h tu n d e r s i m u l a t e de n v i r o n m e n -t a l c o n d i t i o n s .T h e d e g r a d a t i o nwas f o u n d t o vary f r o m1 - 2d a y s f o r r e m o v a l o f t h e p a r e n t compound a t an i n i t i a lc o n c e n t r a t i o no f 1 . 6mM a n d pH 4 . 9 t o more t h a n 1 0 d a y s a tan i n i t i a lc o n c e n t r a t i o no f 9 . 8 mM a n d pH 6 . 9 . I n t h e s es t u d i e s ,a l t h o u g ht r a n s f o r m a t i o no f f e r r i c - E D T Awas d e m -o n s t r a t e d , e x t e n s i v em i n e r a l i z a t i o nd i d n o t occur.

I n t h e p r e s e n t s t u d y, we d e s c r i b e t h e a b i l i t yo f a purec u l t u r e o f A g r o b a c t e r i u ms p . t o grow on f e r r i c - E D T Aas t h es o l ec a r b o n sou rce a t c o n c e n t r a t i o n se x c e e d i n g1 0 0 m M .T h e maximum o b s e r v e dr a t e o f d e g r a d a t i o n ,2 4 m M / d a y ,i sa n o r d e r o f m a g n i t u d ef a s t e rt h a n t h a tp r ev i o us l y r e p o r t e df o rt h e d e g r a d a t i o no f EDTA or i t s m e t a l c h e l a t e s .

M AT E RI A L S AND METHODS

C h e m i c a l s .Ammonium f e r r i c - [ 2 - 1 4 C ] E D TAa n d u n l a b e l e dammonium f e r r i c - E D T Awere s y n t h e s i z e da n d p u r i f i e dasd e s c r i b e dp r e v i o u s l y( 2 )f r o mE D TA - [ 2 - 1 4 C ] a c e t a t e( A m e r -s h a m , A r l i n g t o nH e i g h t s , I l l . )a n d f e r r i cc h l o r i d e or b o t hu n l a b e l e dprecursors.

S o d i u mf e r r i c - E D T Awas o b t a i n e df r o m Kodak L a b o r a -t o r y C h e m i c a l s , R o c h es t e r ,N . Y. , a n d S i g m aC h e m i c a lC o . ,S t . L o u i s , Mo. F e r r o z i n e , h y d r o x y l a m i n eh y d r o c h l o r i d e ,ammonium a c e t a t e , ammonium h y d r o x i d e , n i t r i l o t r i a c e t ia c i d ( N T A ) , a n d g l a c i a la c e t i ca c i d were r e a g e n t g r a d e( K o d a kL a b o r a t o r yC h e m i c a l s ) .T r i e t h y l a m i n e( F i s h e r ,F a i rL a w n ,N . J . ) a n d a c e t o n i t r i l e( J . T . B a k e rI n c . ,P h i l l i p s b u r gN . J . ) were h i g h - p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h yg r a d e .F e r r i c ammonium s u l f a t ed o d e c y l h y d r a t ewas p u r c h a s e df r o m J . T . B a k e r , a n d 1 , 2 - d i a m i n o p r o p a n e - N , N , N ' , N ' - t e t -r a a c e t i c a c i d (PDTA) was p u r c h a s e df r o mA l d r i c hC h e m i c a lC o . , I n c . ,M i l w a u k e e ,W i s .

B a s a l m e d i u m .A l lg r o w t hm e d i ac o n t a i n e dm i n e r a l s a l t sa n d b i o t i n a t t h e f o l l o w i n gc o n c e n t r a t i o n s :N H 4 C l ,5 m M ;M g S O 4 ,0 . 1 m M ; C a C l 2 , 0 . 0 7 m M; H 30 3, 0 . 0 2 5 m M ;MnSO4 * 7 H 2 0 , 0 . 0 0 3 m M ; ZnSO4 - 7 H 2 0 , 0 . 0 0 2 m M ;

3 3 4 6

A P P L I E DAND ENVIRONMENTALM I C R O B I O L O G Y,N o v . 1 9 9 0 ,p . 3 3 4 6 - 3 3 5 30 0 9 9 - 2 2 4 0 / 9 0 / 1 1 3 3 4 6 - 0 8 $ 0 2 . 0 0 / 0C o p y r i g h tC 1 9 9 0 ,A m e r i c a nS o c i e t yf o rM i c r o b i o l o g y


3/9

MICROBIAL D EGRA D AT IO N O FEDTA FERRIC CHELATE

CUSO4 - 7 H 2 0 ,0 . 0 0 0 3 5m M; ( N H 4 ) 6 M o 7 0 2 4* H 2 0 , 0 . 0 0 0 2m M; CoS04 * 7 H 2 0 ,0 . 0 0 0 0 4m M; a n d b i o t i n ,0 . 0 0 2 m M.

B a c t e r i a li s o l a t i o n s .S a m p l e so f s l u d g ew e r eo b t a i n e df r o ma s e c o n d a r yw a s t e t r e a t m e n tf a c i l i t yt h a th a d b e e nr e c e i v i n gw a s t e s c o n t a i n i n gf e r r i c - E D T Af o r s e v e r a l y e a r s .S a m p l e sw e r ec o l l e c t e di np l a s t i cb o t t l e s ,t r a n s p o r t e do n i c e ,a n d t h e nh e l d a t 4 Cp r i o rt o u s e . A n e n r i c h m e n tmedium c o n s i s t i n go f

5 0 mM c i t r a t e - p h o s p h a t eb u f f e r ,4 0 mM s o d i u mt h i o s u l f a t e ,5 mM ammonium f e r r i c - E DT A , a n d2 4 mM s o d i u mb i c a r -b o n a t ei n b a s a lmedium a n d a d j u s t e d t o pH 5 . 5( E DTA E M)w a s i no c u l at ed w i t h1 0 0 p L io f s a m p l ea n d i n c u b a t e da t 3 0 Cf o r 2 w e e k s . G r o w t hf r o m t h i s i n i t i a le n r i c h m e n twass t r e a k e d o n t o a g a r p l a t em e d i u m( a g a ra d d e da t 1 7g / l i t e rt oED TA EM ) a n d i n c u b a t e d a t 3 0 C u n t i lg r o w t h w a s o b -s e r v e d . To s e l e c tf o rc o l o n i e st h a tu s e f e r r i c - E D T Aa s t h ec a r b o n s o u r c e , b a c t e r i a lc o l o n i e sf r o m t h e s e p l a t e sw e r er e p e a t e d l y t r a n s f e r r e da n d t e s t e d f o rg r o w t ho n s t r i n g e n ta g a r m e d i ac o n s i s t i n go f t h e same c o m p o n e n t sa s E D TA EMe x c e p tt h a tb i c a r b o n a t ewas o m i t t e df r o mt h em e d i aa n d t h eb u f f e rwas e i t h e r5 0 mM 2 - ( N - m o r p h o l i n o ) e t h a n e s u l f o n i ca c i d( M E S )( p H 6 ) o r 5 0 mM p h o s p h a t e( p H 6 ) i n s t e a do fc i t r a t e - p h o s p h a t e .C o l o n i e si s o l a t e do n t h e s e m e d i u mweret h e n t r a n s f e r r e dt o a e r o b i cl i q u i dc u l t u r em e d i ac o n t a i n i n g3 5mM s o d i u mf e r r i c - E D T Aa s t h ec a r b o ns o u r c e a n d 1 0 0 mMp h o s p h a t eb u f f e ri n b a s a lmedium a t pH 7 . 4 .

C e l lh a r v e s t a n d s t o r a g e .A f t e rg r o w t h i n f e r r i c - E D T Am e d i u m ,c e l l sw e r e h a r v e s t e db y c e n t r i f u g a t i o na t 4 C .T h eb r o t h was c e n t r i f u g e da t 4 , 2 0 0x g f o r2 0 m i n , a n d t h e n t h es u p e r n a t a n tf l u i dw a sd e c a n t e da n d c e n t r i f u g e da t 1 3 , 0 0 0x gf o r2 0 m i n . T h e c e l lp e l l e twas s u s p e n d e di n s t e r i l ed i s t i l l e dw a t e r a n d c e n t r i f u g e da g a i na t 1 3 , 0 0 0x g t o w a s ht h ec e l l s .T h ec e l lp e l l e twas r e s u s p e n d e di n s t e r i l ed i s t i l l e dw a t e ra t a no p t i c a ld e n s i t ya t 6 0 0 nm ( O D 1 6 . )o f > 5 . F o r l o n g - t e r ms t o r a g e ,g l y c e r o lwas a d d e d( 1 0 %b y v o l u m e)t o t h es u s p e n -s i o na n d 2 - m l a l i q u o t swere s t o r e di n a l i q u i d - n i t r o g e nf r e e z e r .

B a c t e r i a lc o u n t i n g .A s a n a p p r o x i m a t emeasure o fg r o w t h ,t h eO D 6 .was m e a s u r e dw i t h a S p e c t r o n i c2 0 s p e c t r o m e t e r( M i l t o nRoy C o . ,R o c h e s t e r ,N . Y. ) .F o r a more a c c u r a t ee s t i m a t i o no fc e l lg r o w t h ,s a m p l e swere d i l u t e di n0 . 1M HClt o d i s s o l v et h ep r e c i p i t a t ew h i c h f o r m edd u r i n gg r o w t honf e r r i c - E D TA .A f t e r t h ea c i d - d i l u t e ds a m p l e sh a d s t o o d f o r5m i n , t h e i rO D 6 .was m e a s u r e d .

CF U w e r ed e t e r m i n e db y d i l u t i o ni n s t e r i l es a l i n eo r w a t e ra n d p l a t i n go n T r y p t i c a s es o y a g a r p l a t e s( B B L2 1 1 8 5 ;B e c t o n D ic k i ns o nM i c r o b i o l o g yS y s t e m s , C o c ke ys v i l l e ,M d . ) , w h i c hw e r e i n c u b a t e df o r1 t o 3 d a y sa t 3 1 C .

S t r a i n i d e n t i f i c a t i o n .R e p r e s e n t a t i v es a m p l e swere s u b c u l -t u r e d on b l o o da g a r p l a t e sa n d M a c C o n k e ya g a r p l a t e s .A f t e ri n c u b a t i o n ,s a m p l e swere p r e p a r e df o ri d e n t i f i c a t i o no fb a c -t e r i ab y a n a l y s i so f b i o c h e m i c a lr e a c t i o n sb y V i t e k A M Sw i t h t h eGNI C a r ds y s t e m( Vi t e kS y s t e m sI n c . ,H a z e l w o o d ,M o . ) a n d A P I 2 0 E w i t h t h e A P I R a p i d NF T s y s t e m ( A P IA n a l y t a bP r o d u c t s ,P l a i n v i e w ,N . Y. ) .I n a d d i t i o n ,g a s - c h r o -m a t o g r a p h i ca n a l y s i so fw h o l e - c e l lf a t t ya c i d s( 3 )wa s u s e d t oc o n f i r mt h ei d e n t i f i c a t i o n .

R a d i o l a b e l e da s s a y .I n c u b a t i o n s w i t h r a d i o l a b e l e ds ub -s t r a t e were c a r r i e do u t i n s t e r i l et e s t t u b e s i n i n c u b a t o r -s h a k e r sa t 3 1 C .A r a d i o l a b e l e ds o l u t i o no f f e r r i c - E D T Awasp r e p a r e d b y d i l u t i o no f 0 . 5m l o f f e r r i c - [ 2 - 1 4 C ] E D TA( a m -monium s a l t ;1 . 2 31 i C i / m g ,0 . 8 7m g / m l )a n d 1 5 m l o f u n l a -b e l e d f e r r i c - E D T A( s o d i u ms a l t ,1 0 0 mM) w i t h d i s t i l l e dw a t e r i n a 2 5 - m lv o l u m e t r i cf l a s k .B a s a l m e d i u mwa s a d d e dt o a l lt e s t t u b e s .P h o s p h a t eb u f f e r( 1M ;pH 7 . 4 ) ,r a d i o l a b e l e df e r r i c - E D T As o l u t i o n ,s t e r i l ew a t e r , a n d a v o l u m eo f con-c e n t r a t e d ,f r e s h l yh a r v e s t e d c e l l swere a d d e d t o t h e t e s t

t u b e s t o p r o d u c ean i n i t i a lv o l u m eo f 1 . 6m l ,O D 6 0o f 0 . 7 ,femc-EDTA c o n c e n t r a t i o no f 3 8 m M, a n d b u f f e rc o n c e n t r a -t i o no f 3 3 m M.

E v o l v e d1 4 C O 2wa s t r a p p e d c o n t i n u o u s lye a c h d a y i n 1 m lo f a 1 M KOH s o l u t i o ni n s e p a r a t e t e s t t u b e s c o n n e c t e dt ot h ef i r s tb yT y g o nt u b i n g .A t t h e e n d o f t h e e x p e r i m e n t ,c e l l sa n d p r e c i p i t a t ewere s e p a r a t e df r o mb r o t h b y c e n t r i f u g a t if o r5 m i n i n an E p p e n d o r fm o d e l5 4 1 5c e n t r i f u g ea t 1 4 , 0 0 0rpm ( B r i n k m a nI n s t r u m e n t sI n c . ,We s t b u r y,N . Y. ) .

F o r c o u n t i n go f r a d i oa c t i vi t y , l i q u ids a m p l e swere a d d e dt o 1 6 m l o fB e c k m a nR e a d y - S a f es c i n t i l l a t i o nc o c k t a i l( B e c k -m a n I n c . ,F u l l e r t o n ,C a l i f . )i n g l a s sv i a l s( W h e a t o nS c i e n -t i f i c ,M i l l v i l l e ,N . J . ) .C e n t r i f u g e dc e l l p e l l e t swere f i r s ts u s p e n d e di n 1 m l o f w a t e r a n d t h e n a d d e d t o t h e s a m es c i n t i l l a t i o nc o c k t a i l .A l ls a m p l e swere a l l o w e dt o s t a n d f o r2 4 h t o a l l o wf o rt h e d e c a yo f c h e m i l u m i n e s c e n c ea n d t h e nwere c o u n t e di n an LKB 1 2 1 9l i q u i ds c i n t i l l a t i o ns p e c t r o m -e t e r ( P h a r m a c i aLKB B i o t e c h n o l o g yI n c . ,G a i t h e r s b uM d . ) .

F e r r i c - E D T Aa s s a y .C e l l swere s e p a r a t e df r o ms a m p l e sb yc e n t r i f u g a t i o ni n an E p p e n d o r fm o d e l 5 4 1 5 c e n t r i f u g ea t1 4 , 0 0 0rpm f o r2 m i n . S a m p l e swere t h e n d i l u t e ds o t h a tt h emaximum f e r r i c - E D T Ac o n c e n t r a t i o nwas l e s st h a n

0 . 9m M.H i g h - p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h ya n a l y s e swere

p e r f o r m e db yu s i n ga m o d u l a rW a t e r s A s s o c i a t e s s y s t e m( M i l l i p o r eC o r p . ,M i l f o r d ,M a s s . )w i t h d e t e c t i o no f t h ef e r r i c - c h e l a t eb y A 3 6 0 .S a m p l e s( 3 0, u l )were i n j e c t e do n t o ar e v e r s e d - p h a s eh i g h - p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g rc o l u m n( 1 5cm b y 4 . 6mm [ i n n e rd i a m e t e r ] )( L C 1 8 ;S u p e l cI n c . ,B e l l e f o n t e ,P a . )a n d s e p a r a t e db yi s o c r a t i ce l u t i o na t1 . 0m l / m i n( t h em o b i l ep h a s ec o n s i s t e do f 1 g o f ammoniuma c e t a t e p e r l i t e r ,0 . 5g o f P D TA p e r l i t e r ,1 . 5m l o f g l a c i aa c e t i ca c i dp e r l i t e r ,0 . 5m l o fammonium h y d r o x i d ep e r l i t e r ,0 . 1m l o f t r i e t h y l a m i n ep e r l i t e r ,a n d 5 m l o f a c e t o n i t r i l ep e rl i t e ri n d e i o n i z e dw a t e r ) .A f t e r 2 . 5m i n , a s t e pg r a d i e n tt o af i n a lm o b i l e p h a s e( 0 . 5g o f P D TA p e r l i t e r ,0 . 1 m l o ft r i e t h y l a m i n ep e r l i t e r ,a n d 6 0 0m l o f a c e t o n i t r i l ep e r l i t e ri n

d e i o n i z e d w a t e r )w a s h e dr e t a i n e d c o m p o n e n t sf r o m t h ec o l u m nf o r5 . 5m i n . T h ec o l u m nwas r e e q u i l i b r a t e dw i t h t h ei n i t i a lm o b i l ep h a s ef o r4 m i n b e t w e e ni n j e c t i o n s .P r e c i s i oa n d a c c u r a c ywere b e t t e rt h a n 5% r e l a t i v eover t h ec a l i b r a -t i o nr a n g e .

A m m o n i a / a m m o n i u ma s s a y .To t a l ammonia was d e t e r -m i n e db y u s i n gan O r i o nm o d e l9 5 - 1 2a m m o n i ae l e c t r o d ea n da B r i n k m a n nm o d e l6 8 2 t i t r a t o re q u i p p e dw i t h a m o d e l6 2 4s a m p l ec h a n g e r ,m o d e l 6 5 7 c o n t r o lu n i t ,a n d m o d e l6 6 5D o s i m a t . J u s tp r i o rt o measurement o f t h e m i l l i v o l tr e -s p o n s e s , a l i q u o t s( 2 m l )o f a c i d - d i l u t e ds a m p l e s( 1 : 1w i t h0 . 1 4 4 M H 2 S O 4 )were a u t o m a t i c a l l yd i l u t e dw i t h 3 8 m l o fw a t e r a n d 0 . 4m l o f 1 0 N NaOH. T h e m i l l i v o l tr e s p o n s e swere c o n v e r t e dt o c o n c e n t r a t i o nb yc o m p a r i s o nw i t h a l i n e a rl e a s t - s q u a r e sc a l i b r a t i o n( m i l l i v o l t sversus l o g 1 oc o n c e n t r a -t i o n )d e t e r m i n e dd a i l yf r o ms t a n d a r d so f N H 4 C l( 0 . 2mM t o1 . 0M ) .T h e p r e c i s i o no f t h e a s s a y was b e t t e rt h a n 5 % overt h ec a l i b r a t i o nr a n g e .

COD a s s a y .F o r t h e e s t i m a t i o n o f c h e m i c a loxygen d e -mand ( C O D ) ,t h e t e s t t u b e c o l o r i m e t r i cp r o c e d u r eo f t h eHach C h e m i c a lC o . ,L o v e l a n d ,C o l o . ,w h i c hi s s i m i l a rt om e t h o d5 0 8 Ci n S t a n d a r dM e t h o d sf o rt h eE x a m i n a t i o no fW a t e r a n d W a s t e w a t e r( 1 ) ,was u s e d . I n t h i sp r o c e d u rs a m p l e swere d i l u t e dw i t h water i n t ot h e c a l i b r a t i o nr a n g ea n d t h e n a l i q u o t s( 2m l )were a d d e dt o t h e p r e m i x e dr e a g e nt u b e s ( H a c hC o . ) ,w h i c hwere s e a l e d a n d h e a t e d f o r2 h a t1 5 0 0 C .T h e CO D r e s p o n s e was m e a s u r e da t 6 2 0 nm . F o rs a m p l e so f d i p o t a s s i u mED TA b e t w e e n2 a n d 1 0 mM, t h e

V O L . 5 6 , 1 9 9 0 3 3 4 7


4/9

3 3 4 8 L A U F F ET A L .

COD m e a s u r e db y t h i sp r o c e d u r egave t h e o r e t i c a lrecover-i e s f r o m 1 0 1 t o 1 0 7 %w i t h p r e c i s i o n sb e t w e e n2 a n d 1 0 % .

BOD assay. B i o l o g i c a loxygen demand ( B O D )a s s a y s werec a r r i e do u t b y s t a n d a r d m e t h o d s( 1 ) . I n a d d i t i o nt o t h en o r m a l 5 - d a y i n c u b a t i o n , s a m p l e s were i n c u b a t e d f o r 2 8d a y s t o asse ss l o n g - t e r mb i o d e g r a d a b i l i t y .A l l t e s t s werep e r f o r m e dw i t h a p p r o x i m a t e l y1 1 mg o f c a r b o h y d r a t eperl i t e r .

I r o n assay. F o r t h e e s t i m a t i o no f t o t a li r o n ,a m o d i f i c a t i o no f S t o o k e y ' sf e r r o z i n ep r o c e d u r e( 1 4 )was u s e d . To r e l e a s et h e i r o nc a t i o n f r o m f e r r i c - E D TA ,5 0 - p . ls a m p l e swere d i -g e s t e d b y u s i n g a p r o c e d u r ea d a p t e d f r o m m e t h o d3 0 2 E i nS t a n d a r dM e t h o d sf o r t h e E x a m i n a t i o no f W a t e ra n d W a s t e -water ( 1 ) . S a m p l e s( 5 0 p . l ) ,f o l l o w e db y c o n c e n t r a t e dn i t r i ca c i d ( 5 0 p . l )a n d s u l f u r i ca c i d s ( 1 0 0 p . 1 ) ,were a d d e d t oa c i d - c l e a n e d ,t h i c k - w a l l e d ,s c r e w - c a p t e s t t u b e s ( e q u i v a l e n tt o Hach COD t e s t t u b e s ) ,w h i c hwere t i g h t l yc a p p e d a n dh e a t e d t o r e f l u xa t 1 5 0 Cf o r1 5 m i n i n a COD r e a c t o r . A f t e rc o o l i n g ,t h e t e s t t u b e s were u n c a p p e da n d r e p l a c e d i n t h eh e a t e dr e a c t o r f o ra maximum o f 1 0 m i n , b u t n o t l o n ge n o u g hf o r t h e m t o t h o r o u g h l yd r y .A f t e r c o o l i n g ,2 0 0 o f a c i d -f e r r o z i n er e a g e n t ( 0 . 5 1 4g o f f e r r o z i n e ,1 0 g o f h y d r o x y l -

a m i n eh y d r o c h l o r i d e ,a n d 5 0 m l o f c o n c e n t r a t e dh y d r o c h l o -

r i c a c i d d i l u t e dt o 1 0 0 m l w i t h d i s t i l l e dw a t e r ) , 1 . 5m l o fb u f f e r ( 4 0g o f ammonium a c e t a t e a n d 3 5 m l o f c o n c e n t r a t e dammonium h y d r o x i d ed i l u t e dt o 1 0 0 m l w i t h d i s t i l l e dw a t e r ) ,a n d 5 . 4m l o f d i s t i l l e dwater were a d d e dt o d i l u t ea n d b u f f e rt h e s a m p l e sb e t w e e npH 5 a n d 9 . T h e a s s a y was c a l i b r a t e db y l i n e a rl e a s t - s q u a r e sa n a l y s i so f t h e A 5 6 2v a l u e s ( m e a s u r e di n a Hach m o d e lD R / 3s p e c t r o m e t e r )a n d c o n c e n t r a t i o n so fs t a n d a r d s (NH4FeSO4 * 1 2 H 2 0 ;t o t a li r o n ,2 0 t o 1 , 0 0 0 m g /l i t e r ) .A t c o n c e n t r a t i o n so f t o t a li r o n g r e a t e r t h a n 5 0 m g / l i t e r ,t h e o b s e r v e dp r e c i s i o na n d accuracy f o rs a m p l e sc o n t a i n i n gf e r r i c - E D T Awere b e t t e r t h a n 5 % .

T e s t t u b e i n c u b a t i o n s . F o r t e s t t u b e e x p e r i m e n t s ,a l i q u o t so f i n d i v i d u a l l yf i l t e r - s t e r i l i z e dc o n c e n t r a t e s o f t h e b a sa l-medium components, s o d i u m f e r r i c - E D T A( 1 0 0 a n d 2 0 0mM ), p h o s p h a t eb u f f e r( 1 M ) , a n d d e i o n i z e dwater werea d d e dt o s t e r i l et e s t t u b e s ( 1 3b y 1 0 0 m m ) a n d a d j u s t e d t o t h ef i n a lpH b y t h e a d d i t i o n o f KOH or H C I .

C h e l a t o r sas g r o w t hs u b s t r a t e s . G r o w t ho f t h e A g r o b a c t e -r i u m s p . on s e v e r a l i r o n c h e l a t o r s as c a r b o n sources wasa s s e s s e d b y i n c u b a t i o n i n t e s t t u b e s . B a s a l medium a n dp h o s p h a t eb u f f e rwere a d d e d t o a l l t e s t t u b e s t o a f i n a lv o l u m eo f 3 . 5 m l a n d b u f f e r c o n c e n t r a t i o no f 7 1 mM.C h e l a t o r swere a d d e da t f i n a lc o n c e n t r a t i o n so f 4 a n d 2 0 mMt o d u p l i c a t e s e t s o f t e s t t u b e s . F or s a m p l e s c o n t a i n i n gm e t a l s , a m o l a ramount e q u i v a l e n tt o t h a t o f t h e c h e l a t o rwasa d d e d f r o mc o n c e n t r a t e so f F e C l 3 , N i C l 2 , or C U S O 4 .A f t e ra d d i t i o no f a l l components except t h e i n o c u l u m ,t h e pH wasa d j u s t e d t o 7 . 4 .F o r c o n t r o l s , 0 . 2 5 m l o f a 2 . 5 - g / l i t e rs o l u t i o no f H g C l 2was a d d e dt o one o f t h e d u p l i c a t es e t s o f t e s t t u b e s .A l l t u b e s were i n o c u l a t e d w i t h f r e s h l y h a r v e s t e d c e l l s to

p r o d u c ean

i n i t i a lOD o f a p p r o x i m a t e l y0 . 4 a n d were i n c u -

b a t e d i n a b e n c h t o p s h a k e r f o r 2 4 d a y s a t 3 0 + 1 C .S h a k ef l a s ki n c u b a t i o n s . F or s h a k ef l a s ks t u d i e s , t h e pH o f

m e d i ac o n t a i n i n ga l l components a t f i n a lc o n c e n t r a t i o n swasa d j u s t e d w i t h KOH or HCl a n d t h e n f i l t e r e dt h r o u g h0 . 2 - p . mf i l t e r s .To s p e e d f i l t r a t i o n ,t h e p r e c i p i t a t e t h a t formed i n t h em e d i a a f t e ra d j u s t m e n t o f pH was p a r t i a l l y removed b yc e n t r i f u g a t i o n a t 4 , 0 0 0 x g. F o r i n o c u l a t i o n , c e l l s fromf r o z e n s t o c k s were a d d e dor c e l l swere h a r v e s t e dfrom s e e df l a s k si n t h e l a t e rs t a g e s o f g r o w t h .

I n c u b a t i o n sa t t h e 1 - l i t e rs c a l e .A M u l t i g e n2 - l i t e rf e r m e n -t o r (New B r u n s w i c kS c i e n t i f i cI n c . ,E d i s o n , N . J . ) was u s e df o r i n c u b a t i o n sa t t h e 1 - l i t e rs c a l e .Medium was p r e p a r e das

f o rt h es h a k e f l a s ke x p e r i m e n t s .A f t e r t h emedium w a s f i l t e rs t e r i l i z e d ,a d d i t i o n a li r o n( 1 mM a s F e C I 3 )w a s a d d e dt o t h ef e r m e n t o r .T h r o u g h o u tt h ei n c u b a t i o n ,t h et e m p e r a t u r ew a sc o n t r o l l e da t 3 0 + 1 C ,t h epH w a s m a i n t a i n e db e t w e e n7 . 4a n d 7 . 7 b y t h e a u t o m a t i c a d d i t i o n o f H C I , a n da i r w a ss u p p l i e d a t 1 l i t e r / m i nt h r o u g ha 0 . 2 - p . mf i l t e r .F o r i n o c u l a -t i o n ,c e l l sw e r e h a r v e s t e d b y c e n t r i f u g a t i o na t 1 3 , 0 0 0x gf r o ma s e e d f l a s ko f t h es a m emedium a f t e rg r o w t ho v e r n i g h ti n a s h a k e r - i n c u b a t o ra t t h e s a m e t e m p e r a t u r e .

I n c u b a t i o n sa t t h e7 . 2 - l i t e rs c a l e .L a r g e r - s c a l ei n c u b a t i o n s( 7 . 2l i t e r s )w e r e r u n i n a c o m p u t e r - c o n t r o l l e d ,1 4 - l i t e rCF3 0 0 0 f e r m e n t o r ( C h e m a pA G, Vo l k e t s w i l , S w i t z e r l a n d )B r o t h ( 6 l i t e r s )c o n t a i n i n gb a s a l medium ( w i t h o u t b i o t i n ) ,s o d i u mf e r r i c - E D T A( 3 5mM), a n d p h o s p h a t eb u f f e r( 1 0 0m M ; pH 7 . 4 )w a s h e a t s t e r i l i z e di n s i t u i n t h e f e r m e n t o r .A d d i t i o n a li r o n( 1 m M ) a n d b i o t i n( 0 . 0 0 2m M ) w e r e a d d e df r o m s e p a r a t e s t o c k s o l u t i o n sw h i c hh a d b e e n f i l t e rs t e r i l -i z e d .

W h o l e - c e l lb r o t h ( 1 . 2l i t e r s )g r o w no v e r n i g h ti n t h e s a m emedium i n s h a k ef l a s k sw a s a d d e dt o i n o c u l a t et h e 6l i t e r so fm e d i u m .A i r w a s s u p p l i e d a t a f l o w r a t eo f 6 l i t e r s / m i n ,a n dt h e t e m p e r a t u r e w a s h e l d a t 2 8 C . A u t o m a t i ca d d i t i o n o fs o d i u mh y d r o x i d ew a s u s e d t o m a i n t a i nt h e pH b e t w e e n7 . 2a n d 7 . 4 .

F o r s u p p l e m e n t a t i o nw i t h a d d i t i o n a lc a r b o n s o u r c e s , as o l u t i o nc o n t a i n i n g s u c r o s e a n d y e a s t e x t r a c t( 2 5 0g / l i t e re a c h ) w a s d e l i v e r e da t a c o n s t a n tr a t e( 0 . 2g / m i n ) .T h i s f e e dc o m p o s i t i o nw a s b a s e d o n p r e v i o u sw o r ko n t h e c u l t i v a t i o no f a g r o b a c t e r i a( 7 , 9 ) .

RESULTS

S t r a i ni d e n t i f i c a t i o n .When g r o w ne i t h e ro n T r y p t i c a s es o ya g a r p l a t e so r o n a g a r p l a t e sc o n t a i n i n gf e r r i c - E D TA ,c e l l so ft h ei s o l a t ew e r e g r a m - n e g a t i v er o d s ,a p p r o x i m a t e l y0 . 6t o 1p . mi n d i a m e t e ra n d 2 t o3 p . m i n l e n g t h .On b l o o da g a r p l a t e s ,t h ec o l o n i e s w e r e s m o o t h ,w h i t e , e n t i r e ,r a i s e d ,a n d - y - h e -m o l y t i c .O n M ac Con key a g a r p l a t e s ,t h e c o l o n i e s w e r es m o o t h ,e n t i r e ,r a i s e d ,a n d l a c t o s ep o s i t i v e .T h e i s o l a t ew a si d e n t i f i e da sA g r o b a c t e r i u mr a d i o b a c t e rb y t w o c o m m e r c i a ls y s t e m s f o r t y p i n g b a c t e r i a ,V i t e k AMS ( 9 9 %p r o b a b i l i t ya n d A P I R a p i d NF T ( 9 9 . 9 %p r o b a b i l i t y ) .G a s - c h r o m a t o -g r a p h i ca n a l y s i so f t h ef a t t ya c i d c o m p o s i t i o no f t h e i s o l a t ec o n f i r m e dt h e g e n u s a s A g r o b a c t e r i u m .I n a d d i t i o n ,t h ei s o l a t ew a s t y p e d i n d e p e n d e n t l y( A m e r i c a nT y p e C u l t u r eC o l l e c t i o n ,R o c k v i l l e ,M d . ) a s a n A g r o b a c t e r i u ms p . ,w i t hd i s t i n c t i o nb e t w e e nb i o v a r 1 a n d b i o v a r 2 n o t d e t e r m i n e d .

C o r r e l a t i o no f O D w i t h p l a t ec o u n t s .To m e a s u r eg r o w t ho ft h ei s o l a t eo n f e r r i c - E D T Am e d i a , we i n i t i a l l ya t t e m p t e dt oc o r r e l a t ep l a t ec o u n t s w i t h O D 6 0 0 .When s a m p l e s w e r ed i l u t e di n t ot h e p r o p e rr a n g e o f t h e s p e c t r o m e t e rw i t h w a t e r ,t h e c o r r e l a t i o nb e t w e e np l a t ec o u n t sa n d OD w a s p o o r ( F i g .1 ) .When d i f f e r e n ta l i q u o t so f t h e s a m es a m p l e sw e r ed i l u t e di n 0 . 1M H C l ,a g o o dc o r r e l a t i o nw a s o b s e r v e d . I t a p p e a r e dt h a ta c h e m i c a lp r e c i p i t a t ew h i c hf o r m sd u r i n g t h e b i o d e g -r a d a t i o no f f e r r i c - E D T Aw a s s o l u b i l i z e db y a c i d .T h e r e f o r e ,m e a s u r e m e n t so f OD w i t h o u ta c i d i f i c a t i o na r e i n d i c a t i v eo ft h e e x t e n t o f b i o d e g r a d a t i o no f f e r r i c - E D T Ab y t h e i s o l a t e ,b u t a r e n o t l i n e a r l yp r o p o r t i o n a l t o c e l l d e n s i t y .F o r a ne s t i m a t i o n o f c e l l d e n s i t y ,m e a s u r e m e n to f OD a f t e rt h es a m p l e sh a v eb e e n d i l u t e dt o 0 . 1M H C lw a s m o r ea c c u r a t e .

G r o w t hs t u d i e s .When g r o w t ho f t h e i s o l a t ew a sm o n i t o r e di nb a t c hc u l t u r ei n f e r r i c - E D T Am e d i a ,t h e i n i t i a lpH a f f e c t e dt h ee x t e n t o f b o t h g r o w t ha n d r e m o v a lo f f e r r i c - E D T Af r o ms o l u t i o n .I n F i g .2 g r o w t ho f t h e i s o l a t e ,a s m e a s u r e db y t h ei n c r e a s e i n OD a f t e rd i l u t i o ni n a c i d ,i s p l o t t e df o ri n c u b a -

A P P L .ENVIRON. M I C R O B I O L .


5/9

MICROBIAL D EG RA D ATIO N O F ED TA FERRIC C H E L AT E

A

0

0 00

0 0 oO

0

o 3 0 0 0c ~ 00

0 0

0

0 E

0( 000

0 2 0 4 0 6 0 8 0 1 0 0 1 2 0Time ( h )

F I G . 2 . C h a r a c t e r i s t i c s o f t h e g r o w t h o f A g r o b a c t e r i u ms p .s t r a i nAT C C 5 5 0 0 2i n s h a k ef l a s k sc o n t a i n i n gs o d i u mf e r r i c - E D T A .M e d i ac o n t a i n i n gb a s a l m e d i u m ,3 5 mM s o d i u mf e r r i c - E D T A ,a n d1 0 0 mM p h o s p h a t ewere a d j u s t e d t o pH 6 . 2a n d 7 . 4 b y t h e a d di t io n

o f HC l a n d NaOH, r e s p e c t i v e l y .Th e i n c u b a t i o n s p r o c e e d e di ns h a k e r i n c u b a t o r s a t 2 9 C. ( A)Th e O D 6 .i s p l o t t e df o r a l i q u o t sd i l u t e d i n 0 . 1 N H C l . Th e p l o t t e dv a l u e s are c o r r e c t e d f o r t h ed i l u t i o n f a c t o r .( B ) Th e f e r r i c - E D T Ac o n c e n t r a t i o ni s p l o t t e di nm i l l i m o l a ru n i t s ,a n d t h e m e a s u r e dpH i s g i v e n a b o v e t h e d a t u mp o i n t s .

s o l u t i o n s t h r o u g h o u tt h e e x p e r i m e n t .With t h e i n o c u l a t e ds a m p l e s an i n i t i a lb u r s t o f r a d i o a c t i v i t ywas o b s e r v e d ,f o l -l o w e db y a d e c l i n i n gg e n e r a t i o no f C O 2 . I n t h e s e e x p e r i -ments t h e t o t a lamount o f r a d i o a c t i v i t yt r a p p e d i n KOH waso n l y20 % o f t h a t i n i t i a l l ya d d e d . A t t h e e n d o f t h e e x p e r i m e n t5 6% r e m a i n e di n s o l u t i o n a n d a n o t h e r 1 0% was a s s o c i a t e dw i t h t h e c e l lp e l l e t .T h e r e f o r e ,8 6% o f t h e r a d i o a c t i v i t yi n t h ei n o c u l a t e d s a m p l e s was r e c o v e r e d . I n t h e u n i n o c u l a t e dc o n t r o l ,1 0 0 % o f t h e r a d i o a c t i v i t ywas r e c o v e r e di n s o l u t i o na t t h e e n d o f t h e e x p e r i m e n t . I n t h e s e e x p e r i m e n t sn oa t t e m p t was mad e t o measure , or t o a d j u s t ,t h e pH o f t h es o l u t i o n s d u r i n g t h e i n c ub a t i o ns .

C u l t i v a t i o na t t h e 1 - l i t e rs c a l e .To p e r m i t t h e c o n t r o lo f p H ,t h e i s o l a t ewas grown i n a 2 - l i t e rf e r m e n t o rc o n t a i n i n g1 l i t e ro f medium i n i t i a l l ya t pH 7 . 4 ( F i g .3 ) .Th e pH o f t h e s o l u t i o nwas m a i n t a i n e db e t w e e n7 . 4 a n d 7 . 7 b y t h e a d d i t i o no f a c i d .I n t h i s case, f e r r i c - E D T Ad e g r a d a t i o nwas e x t e n s i v e . A sf e r r i c - E D T Awas d e g r a d e d ,s o l u b l e i r o n d e c r e a s e di n s o l u -t i o na n d t h e c o n c e n t r a t i o no f ammonia s t e a d i l yi n c r e a s e d .A l s o , as d e g r a d a t i o np r o c e e d e d ,t h e COD o f t h e b r o t h , both

B

E

F-

0

w

a )

4C F U / n m l , 10 9

8

F I G . 1 . C o r r e l a t i o no f OD w i t h b a c t e r i a lcounts d e t e r m i n e db yd i l u t i o np l a t i n g .E x p e r i m e n t swere c o n d u c t e db y u s i n g s h a k ef l a s k sw i t h a d d e dc o n c e n t r a t i o n so f 3 5 mM s o d i u m f e r r i c - E D T A a n d5 0mM p h o s p h a t eb u f f e ra t pH 7 . 4 .I n i t i a lO Ds were v a r i e d f r o m0 . 2t o2 . 0 .Th e f l a s k swere s a m p l e dp e r i o d i c a l l yd u r i n g i n c u ba t i o nf o r2 4 ha t 3 1 C .T h ee n t i r ee x p e r i m e n twas r e p e a t e d ,a n d t h e d a t a s e t s were

c o m b i n e d .A t no t i m e d id t he pH i n any o f t h e s a m p l e se x c e e d8 . 0 .( A ) T h eOD o f s a m p l e si s p l o t t e da f t e rd i l u t i o nw i t h H 2 0 .T h ed a t aare c o r r e c t e df o r t h e d i l u t i o nf a c t o r .( B ) T h eOD o f s e p a r a t e a l i q u o t so f t h e same s a m p l e si s p l o t t e da f t e rd i l u t i o ni n 0 . 1N HCl f o r5 m i n .

t i o n si n m e d i ai n i t i a l l ya t pH 6 . 2a n d 7 . 4 .A t f i r s t ,t h e i s o l a t egrew a t t h e same r a t e i n b o t h m e d i a ;h o w e v e r , as t h ei n c u b a t i o nc o n t i n u e d ,g r o w t hs t o p p e dsooner a n d a t a l o w e rd e n s i t y i n t h e f l a s kt h a th a d s t a r t e d a t pH 7 . 4 .A s b i o d e g r a -d a t i o n p r o c e e d e d ,t h e pH i n c r e a s e d . I n t h e f l a s ks t a r t e d a tpH 7 . 4 ,g r o w t ha n d r e m o v a lo f f e r r i c - E D T As t o p p e dwhent h e pH i n c r e a s e d t o 8 . 2 . A t s u c c e e d i n gt i m e p o i n t s ,t h ea p p a r e n t i n c r e a s e i n t h e f e r r i c - E D T Ac o n c e n t r a t i o ni n t h i sf l a s kwas d u e t o c o n c e n t r a t i o no f t h e m e d i aas a r e s u l to fe v a p o r a t i o nd u r i n gt h e course o f t h e e x p e r i m e n t .

F o r t h e f l a s ks t a r t e d a t pH 6 . 2 ,t h e pH d u r i n g i n c ub a ti o n ,a l t h o u g hs t e a d i l yi n c r e a s i n g , never e x c e e d e d8 . Th e i s o l a t ec o n t i n u e d t o d e g r a d e f e r r i c - E D T Au n t i lt h e e n d o f t h ee x p e r i m e n t ,when 8 5 % o f t h e i n i t i a lc o n c e n t r a t i o nh a d b e e nr e m o v e df r o m s o l u t i o n .Th e maximum c e l ld e n s i t y f o r t h i sf l a s kwas more t h a n t w i c e t h a t f o r t h e f l a s ks t a r t e d a t pH 7 . 4 .

R a d i o r e s p i r o m e t r i c e x p e r im e n t s.Th e i s o l a t ewas added t om e d i ac o n t a i n i n gf e r r i c - E D T Ar a d i o l a b e l e dw i t h c a r b o n 1 4i n t h e 2 - a c e t a t e p o s i t i o n a n d i n c u b a t e d i n t e s t t u b e s f o r 6d a y s a t 3 1 C . Th e g e n e r a t i o no f 1 4 C O 2was measured d a i l yb y t r a p p i n g i n K O H . F o r u n i n o c u l a t e dc o n t r o l s ,n o r a d i o a c -t i v i t ya b o v e b a c k g r o u n dl e v e l s was f o u n d i n t h e KOH

A7 r

6

-5E

o 40C D-3c o S00 2

( 1 l

7

6

5

4

B

E00( 0o

a )

: 0

0c 0

0

3-0

2 - 0 0 80

10

0 -

VOL. 5 6 , 1 9 9 0 3 3 4 9

0 2 6


6/9

3 3 5 0 L A U F FET A L .

c,)

70

-

0)

E

0

0

E

0

CM

-,

c

0c U0c )

9

8

78t o COD ( w c e l l s )7 \ , A COD ( s u p e r n a t a n t )

6

5

4 _- .

3 A

2 _J L L

J

Time ( h )

F I G . 3 . I n c u b a t i o no f A g r o b a c t e r i u ms p . s t r a i nAT C C 5 5 0 0 2a tt h e 1 l i t e rs c a l ew i t h pH c o n t r o l l e d a t 7 . 4 a n d t e m p e r a t u r em a i n -t a i n e d a t 3 0 + 1 C .T h e i n i t i a lb r o t h was p r e p a r e dt o c o n t a i n3 5 mMs o d i u m f e r r i c - E D T Aa n d 1 0 0 mM p h o s p h a t ei n b a s a l m e d i u m .A l i q u o t s o f t h e w h o l eb r o t h were t a k e n f o r COD measurements[COD ( w c e l l s ) ]a n d a f t e rc e n t r i f u g a t i o na t 1 3 , 0 0 0x g t o remove c e l lmass a n d an y c h e m i c a lp r e c i p i t a t e[COD ( s u p e r n a t a n t ) ] .

w h o l ea n d c e l lf r e e ,d e c r e a s e du n t i l93% o f t h e f e r r i c - E D T A

i n i t i a l l yp r e s e n t h a d b e e nd e g r a d e d .A l t h o u g ht h e s ub st r a t ewas n e a r l yc o m p l e t e l yr e m o v e df r o ms o l u t i o n ,t h e f i n a lCODi n s o l u t i o na m o u n t e dt o 30 % o f t h a ti n i t i a l l yp r e s e n t .

C o m p a r i s o no f BO D a n d COD a f t e rd e g r a d a t i o no f f e r r i c -EDTA. S a m p l e so f u n in o c u l a t e d m e d i a ,t h e c e l l - f r e eb r o t hf r o m t h e e n d o f t h e 1 - l i t e ri n c ub at i o n ( a bo v e ),a n d t h e f i n a lc e l l - f r e eb r o t h f r o m a r e p l i c a t ei n c u b a t i o n t h a th a d b e e ns t o p p e da f t e r1 1 0 hwere t e s t e d f o rBOD. F o r t h e 5 - d a yBODt e s t ,t h e r a t i oo f BOD t o COD was 2 . 7 %f o rt h e u n i n o c u l a t e db r o t h a n d n e a r l y t h e same ( 3 . 7a n d 6 . 1 % )f o r t h e s p e n tb r o t h s . F o r t h e 2 8 - d a yBOD t e s t t h e r a t i oo f BOD t o CODwas 1 4 . 6 %i n t h e u n i n o c u l a t e db r o t h , b ut c o n s i de r a bl yl a r g e rf o r t h e s p e n t b r o t h s ( 5 2 . 3a n d 6 0 . 6 % ) .

I n c u b a t i o n sa t t h e 7 . 2 - l i t e rs c a l e .To d e t e r m i n et h e c a r b o na n d n i t r o g e nmass b a l a n c ed u r i n gb i o d e g r a d a t i o nw i t h f e r r i c -EDTA as t h e s o l ec a r b o n source, we ra n i n c u b a t i o n si n ac o m p u t e r - c o n t r o l l e df e r m e n t o r w h i c h was c o n t i n u o u s l ym o n i t o r e df o r t h e p r o d u c t i o n o fCO 2 ( a b o v e b a c k g r o u n dl e v e l s )b y a mass s p e c t r o m e t e r . A s d e gr a da t io n p r o c e e d e d ,b o t h f e r r i c - E D T Aa n d s o l u b l e i r o nd e c r e a s e da t n e a r l y t h esame r a t e as f o rt h e 1 - l i t e ri n c u b a t i o n . A s t h e f e r m e n t a t i o np r o c e e d e d ,b o t h ammonia a n d CO 2 were g e n e r a t e di n par-a l l e las t h e COD d e c r e a s e d .A t t h e e n d o f t h e f e r m e n t a t i o n ,COD h a d d e c r e a s e db y 6 1 % ,t h e ammonia c o n c e n t r a t i o nh a di n c r e a s e de q u i v a l e n t t o c o n v e r s i o no f 59% o f t h e n i t r o g e nf r o mf e r r i c - E D T A ,a n d t h e CO 2 r e l e a s e d a c c o u n t e df o r 65 %o f t h e c a r b o n f r o m f e r r i c - E D TA .S i n c e t h e c o n c e n t r a t i o nmeasurements ( N H 3 a n d COD) were n o t c o r r e c t e d f o r

e v a p o r a t i o n , t h e c a l c u l a t e dp e r c e n t a g e sf o r COD d e c r e a s eu n d e r s t a t et h e amount o f b i o d e g r a d a t i o nt h a t h a d o c c u r r e d .

A d u p l i c a t e f e r m e n t a t i o nwas r u n p a r a l l e lt o t h e o n ea b o v e ,b u t w i t h t h e a d di t io no f a s t e a d y f e e d o fs u c r o s e a n dy e a s t e x t r a c t a s s u p p l e m e n t a lc a r b o ns o u r c e s . A t t h e e n d o ft h e f e r m e n t a t i o n ,37 % o f t h e i n i t i a lf e r r i c - E D T A h a db e e nd e g r a d e dc o m p a r e dw i t h more t h a n 85% when f e r r i c - E D T A

w a s p r e s e n t a s t h e s o l ec a r b o ns o u r c e .C h e l a t o r sa s g r o w t hs u b s t r a t e s .G r o w t ho f A g r o b a c t e r i u ms p . s t r a i nAT C C 5 5 0 0 2o n o t h e r c h e l a t o r sa n d m e t a l s w a sa s s e s s e d i n t e s tt u be i n c ub a t i o n sf o r2 4 d a y s w i t h s u b s t r a t e si n o c u l a t e da t a n i n i t i a lO D o f 0 . 4 .T h e e x t e n t o f g r o w t hwasd e t e r m i n e db y c o m p a r i n gt h e f i n a lOD o f e a c h i n o c u l a t e ds a m p l ew i t h t h a to f a r e p l i c a t et o w h i c hm e r c u r i cc h l o r i d eh a d b e e na d d e da s a b a c t e r i o c i d e .T h i s p r o c e d u r ec o r r e c t e df o ra n y p h y s i c a lo r c h e m i c a lp r o c e s s e s t h a tm ay c a u s e a ni n c r e a s e i n O D d u r i n g t h e i n cu ba t io n .T h e a s s u m p t i o nwasm a d e t h a t a n y i n c r e a s e d O D r e l a t i v et o t h e r e s p e c t i vm e r c u r y - t r e a t e dc o n t r o lw o u l d b e c au s e d b y b a c t e r i a lg r o w t ho n t h es u b s t r a t e .S u b s t r a t e s t h a tp r o d u c e da n O Df i v e f o l dg r e a t e r t h a n t h er e s p e c t i v ec o n t r o l sa t t h e e n d o f t h ee x p e r i m e n tf o rb o t h c o n c e n t r a t i o n st e s t e dw e r e c l a s s i f i e da sp o s i t i v e( T a b l e1 ) .

A s d e f i n e d a b o v e , n o u n e q u i v o c a lg r o w t hwas o b s e r v e dw i t h a n y o f t h e f r e ec h e l a t o r s .O n l yEDTA a n d PDTA, whenc h e l a t e dw i t h i r o n ,s u p p o r t e dv i g o r o u sg r o w t h .

E f f e c to f f e r r i c - E D T Ac o n c e n t r a t i o no n d e g r a d a t i o n b yA g r o b a c t e r i u ms p . s t r a i nAT C C 5 5 0 0 2 . To d e t e r m i n e t h emaximum i n i t i a lf e r r i c - E D T Ac o n c e n t r a t i o nt h a tt h e i s o l a t ew o u l dt o l e r a t e ,a s e r i e so f t e s tt u b e i n c u b a t i o n su s i n g b a s a lmedium b u f f e r e dw i t h p h o s p h a t ea t 1 0 0 mM w e r ec a r r i e do u tf o r4 8 h . T h e i n i t i a lf e r r i c - E D T Ac o n c e n t r a t i o nwas v a r i e df r o m 2 . 9 t o 1 4 0 m M. T h e v a l u e s f o r t h e c o n c e n t r a t i o nr e m o v e d( c a l c u l a t e db y s u b t r a c t i n gt h e c o n c e n t r a t i o nr e -m a i n i n ga t 4 8 h f r o m t h e c o n c e n t r a t i o ni n i t i a l l ya d d e d )a r ep l o t t e di n F i g .4 .

T h ee x t e n t o f d e g r a d a t i o nwas r e l a t e dt o t h ei n i t i a lp H . A tt h el o w e ri n i t i a lp H , more f e r r i c - E D T Awas d e g r a d e df o ra l lc o n c e n t r a t i o n st e s t e d .T h e d e g r a d a t i o np r o c e e d e dt o c o n -sume a n a v e r a g emaximum o f 4 8mM o f s u b s t r a t ea t a n i n i t i a lpH o f 6 . 2a n d 2 8 mM a t pH 7 . 4 .I n b o t h s e t so f d a t a t h emaximum d e g r a d a t i o ne x t e n d e dt o t h e h i g h e s tc o n c e n t r a t i o nt e s t e d .

DISCUSSION

T h ep u r e c u l t u r eo f A g r o b a c t e r i u ms p .s t r a i nAT C C 5 5 0 0 2t h a twe h a v ei s o l a t e di s c a p a b l eo f d e g r a d i n gf e r r i c - E D T Aa tr a t e s a n d s u b s t r a t ec o n c e n t r a t i o n ss i g n i f i c a n t l yg r e a t e r t h a na n y r epo r te dp r e v i o u s l y .P r e v i o u ss u b s t r a t e c o n c e n t r a t i o n ss t u d i e dh a v e b e e n l i m i t e dt o 5 mM o r l e s s i ne i t h e rl i q u i dc u l t u r e( 2 ;N a g a s eS e i k a g a k uKogyo K . K . , p a t e n t a p p l i c a -t i o n )o r s o i l( 1 6 ,1 7 ) .R a t e s f o rd e gr a d a ti o n o ft h e c h e l a t e o ri t sm e t a l c o m p l e xi n l i q u i dc u l t u r ew e r e r e p o r t e d t o b e l e s st h a n 1 m M / d a y .I n t h e p r e s e n t s t u d y ,we h a v e d e mo n s t r a t edd i s a p p e a r a n c eo f f e r r i c - E D T Aa t c o n c e n t r a t i o n sa b o v e1 0 0mM a t r a t e s a s h i g h a s 2 4 m M / d a y .

T h a t t h i sd e g r a d a t i o ni s p r i m a r i l yb i o l o g i c a li s c l e a rf r o ms e v e r a ll i n e so f e v i d e n c e .F i r s t ,i n r a d i o r e s p i r o m e t r i ce x p e r -i m e n t s ,n o r e l e a s eo f 1 4 C O 2was o b s e r v e dd u r in g i n c ub a ti o n sw i t h t h eu n i n o c u l a t e dc o n t r o l s ,n o r was a n y s u b s t r a t e r e -moved f r o ms o l u t i o n .I n a d d i t i o n ,u n i n o c u l a t e dc o n t r o l s i nn o n r a d i o l a b e l e de x p e r i m e n t sd i d n o t i nc r e as e i n OD o rd e c r e a s e i n f e r r i c - E D T Ac o n c e n t r a t i o nd u r i n g i n c u b a t i o nC o n v e r s e l y , i n i n o c u l a t e d s a m p l e s , a s d e g r a d a t i o np r o -c e e d e d , a d e c r e a s e i n f e r r i c - E D T Ac o n c en t r a t io n d ur in g

A P P L .E N V I R O N .M I C R O B I O L .


7/9

MICROBIAL DEGRADATIONO F ED TA FERRIC C H E L AT E 3 3 5 1

TA B L E 1 . G r o w t hs u b s t r a t e sf o rA g r o b a c t e r i u ms p .s t r a i nAT C C 5 5 0 0 2S u b s t r a t e a G r o w t h b S u b s t r a t e G r o w t h

E D TA ............................................. - EDDA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . -F e 3 +ED TA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . + F e 3 +EDDA.N i 2 +EDTA. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - Ethylenediamine.C u 2 +EDTA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - F e 3 "e t h y l e n e d i a m i n e

.TA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - Triethanolamine.

F e 3 +N T A .............................................. -e 3 triethanolamine.N i 2 +N T A. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .C u 2 +N T A ............................................. - Citrate.

F e 3 +citrate.P D TA . . . . . . . . . . . .................................. -F e 3 +P D TA. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . + F e 3 +propionate.N i 2 +P D TA ............................................. - A c e t a t e

.u 2 + P D TA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .- F e 3 +acetate.

IMDA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - Lysine.F e 3 +IMDA ............................................. - F e 3 l y s i n e

.A b b r e v i a t i o n s :NTA, n i t r i l o t r i a c e t i ca c i d ;IMDA, i m i n o d i a c e t i ca c i d ;EDDA, e t h y l e n e d i a m i n e - N , N ' - d i a c e t i ca c i d .

b + d e n o t e sv i g o r o u sg r o w t h ;s e e t h et e x tf o rc l a s s i f i c a t i o nc r i t e r i a .

i n c u b a t i o nw a s a l w a y sa c c o m p a n i e db y a n i n c r e a s ei n ODa n d p H .

A l t h o u g ht h e d e g r a d a t i o ni s b i o l o g i c a l ,t h e r e m ay b e s o m ei n f l u e n c eo f l i g h t ,s i n c ei t w a s n o t r i g o r o u s l ye x c l u d e df r o mo u r e x p e r i m e n t s .M o s te x pe r i me n t s w e r ec o n d u c t e di n i n c u -b a t o r - s h a k e r sw i t h o n l y f l u o r e s c e n troom l i g h tf i l t e r e dt h r o u g ht h eg l a s sw i n d o w so f t h es h a k e r sa n d t h eg l a s sf l a s k so r t e s tt u b e s .From t h ed a t a g i v e nb y L o c k h a r ta n d B l a k e l e y( 1 0 ) ,t h emaximum p h o t o d e g r a d a t i o nr a t e i nb r i g h ts u n l i g h ts h o u l db e l e s st h a n 1 . 5m M / d a y ,w h i c hi s c o n s i d e r a b l yl o w e rt h a n t h er a t e so b s e r v e dh e r e ,w i t h c o n s i d e r a b l yl e s si n t e n s el i g h t i n g .I n a d d i t i o n ,t h e 7 . 2 - l i t e ri n c u b a t i o n sw e r e c o n -d u c t e di n s t a i n l e s ss t e e lf e r m e n t o r sw i t h g l a s sw i n d o w sl e s st h a n 0 . 2 5 f t 2( 2 3 2c m 2 )i n a r e a .F i n a l l y ,a l t h o u g hp h o t o d e g -r a d a t i o nr e s u l t si nt h ed i s a p p e a r a n c eo f f e r r i c - E D TA ,i t d o e sn o t r e s u l ti n e x t e n s i v em i n e r a l i z a t i o n ,a s o b s e r v e di n o u rs t u d i e s .

60

In i t i a lpH = 6 . 2E 5 0

> 4 0 _0E0 D 3 0 I n t a H

0

L J 20 - /

1 1 1 0 _,zo ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ U n i n o c u l a t e dC o n t r o l s

0 2 0 40 6 0 8 0 1 0 0 1 2 ) 1 4 0F e r r i c - E D TA - i n i t i a l( m M )

F I G . 4 . E f f e c to f i n i t i a lpH a n d f e r r i c - E D T Ac o n c e n t r a t i o nont h eg r o w t ho f A g r o b a c t e r i u ms p . s t r a i nATC C 5 50 02 . T e s tt u b e sc o n t a i n e db a s a l m e d i u ma n d 1 0 0 mM p h o s p h a t eb u f f e r .S o d i u mf e r r i c - E D T Awas a d d e d f r o m a s t o c k s o l u t i o n( 2 0 0m M) t o t h ed e s i r e d c o nc e nt ra t i o ns . T e s t t ub eswere i n o c u l a t e da t a c a l c u l a t e di n i t i a lOD o f 1 . 0f r o ma c o n c e n t r a t eo f f r e s h l yh a r v e s t e da n d w a s h e dc e l l sa n d w e r ei n c u b a t e da t 3 0 1 0 Cf o r4 8 h . E r r o rb a r s i n d i c a t et h es t a n d a r dd e v i a t i o nf o rt r i p l i c a t ee x p e r i m e n t s( p H7 . 4 )a n d d u p l i c a t ee x p e r i m e n t s( p H 6 . 2 ) .C o n t r o l sw e r e n o t r un i n r e p l i c a t e .

W i t ht h i sA g r o b a c t e r i u ms p .t h e e q u i v a l e n to f 6 4 a n d 5 9 % ,r e s p e c t i v e l y ,o f t h e t h e o r e t i c a lCO 2 a n d NH 3 p o s s i b l e f r o mt h e c o m p l e t em i n e r a l i z a t i o no f t h e s u b s t r a t e was m e a s u r e da f t e ra 3 - d a y i n c u b a t i o n .A t t h e same t i m e , t h e COD o f t h es o l u t i o nh a d d e c r e a s e db y 6 1 % .T h i s i n d i c a t e sn o t o n l y as u b s t a n t i a lm i n e r a l i z a t i o no f t h e s u b s t r a t e ,b u t a l s o a c o n -v e r s i o n w h i c hd o e s n o t r e s u l ti n e x t e n s i v ec o n v e r s i o nt o c e l lm a s s . S i n c e 64% o f t h e c a r b o nw a s m e a s u r e da s C 0 2 , o n l y36 % r e m a i n e df o rc o n v e r s i o nt o c e l lm a s s a n dm e t a b o l i t e s .From t h e f i n a lCOD m e a s u r e m e n t ,39 % o f t h eo x i d i z a b l ec a r b o nr e m a i n e di n s o l u t i o na s m e t a b o l i t e sa n d n o n d e g r a d e ds u b s t r a t e .S i n c e COD was n o t c o r r e c t e df o r t h e unknowna m o u n to f e v a p o r a t i o nw h i c ht o o k p l a c e d u r i n g t h e f e r m e n -t a t i o n ,t h e m e a s u r e dCOD w a s a c o n s e r v a t i v ee s t i m a t e o ft h e t r u e e x t e n t o f COD r e m o v a l .T h e t r u e COD r e m o v e dr e l a t i v et o t h a ti n i t i a l l yp r e s e n t m u s t h a v eb e e n g r e a t e r t h a nt h i s m e a s u r e dv a l u e . T h u s , l e s s t h a n t h e c a l c u l a t e d 39 %r e m a i n e d i n s o l u t i o n .S t i l l ,e v e n i f a g e n e r o u s 1 0 % / d a yd e c r e a s ei n v o l u m ea s a r e s u l to f e v a p o r a t i o n( e q u i v a l e n tt oa n i n c r e a s e i n c o n c e n t r a t i o no f 1 0 % / d a y )i s a s s u m e d ,t h eminimum COD r e m a i n i n gi n s o l u t i o na f t e r3 d a y s s h o u l db e27 % o f t h e i n i t i a la m o u n t .I f o n e c o n s i d e r s t h a tt h e e r r o r si n h e r e n t i n m e a s u r i n gt h e i n i t i a lf e r r i c - E D T Ac o n c e n t r a t i o na n d COD a r e e s t i m a t e dt o b e 5 % , t h e maximum amount o fc a r b o nw h i c hc o u l d b e i n c o r p o r a t e di n t oc e l lmass i s l e s st h a n 20 % ( 3 6- 2 7 + 1 0 = 1 9 )o f t h e i n i t i a lc a r b o np r e s e n tf r o mf e r r i c - E D TA .

M e a s u r e m e n to f t h e CO Df r o mi n c u b a t i o ns a m p l e s ,b e f o r ea n d a f t e rr e m o v a lo f c e l lmass a n d p r e c i p i t a t eb y c e n t r i f u -g a t i o n ,c o n f i r m st h e r e l a t i v e l ys m a l l amount o f c e l l

m a s sp r o d u c e db y t h e d e g r a d a t i o n .A t t h e e n d o f t h e 1 - l i t e ri n c u b a t i o n( F i g .3 ) ,t h e d i f f e r e n c eb e t w e e nt h e two m e a s u r e -m e n t so f COD a m o u n t e dt o a COD e q u i v a l e n tt o 1 0% o f t h ef e r r i c - E D T Ai n i t i a l l yp r e s e n t . S i n c e 70 % o f t h e COD h a db e e n r e m o v e db y t h e b i o d e g r a d a t i o na t t h e e n d o f t h ef e r m e n t a t i o n ,a t most 1 4% ( 1 0 / 7 0= 0 . 1 4 )o f t h e c a r b o nf r o mt h e f e r r i c - E D T Ac o n c e n t r a t i o nt h a t wa s d e g r a d e dc o u l dh a v e b e e n c o n v e r t e di n t o c e l lm a s s .

I n a d d i t i o nt o m i n e r a l i z a t i o na n d p r o d u c t i o no f c e l lm a s s ,a p p r o x i m a t e l y3 0 t o 35 % o f t h e i n i t i a lCOD f r o m f e r r i c -EDTA r e m a i n si n s o l u t i o na t t h e e n d o f b i o d e g r a d a t i o n .Toa s s e s s t h e r e l a t i v er e c a l c i t r a n c et o b i o d e g r a d a t i o no f t h eu n i d e n t i f i e dm e t a b o l i t e ( s )t h a t c a u s e t h i sr e s i d u a l COD, we

V O L .5 6 ,1 9 9 0


8/9

A P P L .E N V I R O N .M I C R O B I O L .

m e a s u r e dt h eBO D o f d e g r a d e db r o t h f r o mr e p l i c a t ei n c u b a -t i o n s .T h e a s s u m p t i o nwas made t h a tt h e r a t i oo f BO D t oCOD i s p r o p o r t i o n a lt o b i o d e g r a d a b i l i t y .T h u s , a h i g hr a t i oi n d i c a t e st h a t m o s t o f t h e c a r b o n c a n b e b i o d e g r a d e d .C o n v e r s e l y,a l o wr a t i o ,a s f o rf e r r i c - E D T Ai t s e l f ,i n d i c a t e st h a tt h ec o m p o u n di s n o t s u s c e p t i b l et o b i o l o g i c a lo x i d a t i o na n d

i s t h e r e f o r er e c a l c i t r a n tt o b i o d e g r a d a t i o n .A f t e ri n c u -b a t i o n f o r5 d a y s i n t h e s t a n d a r d BO D t e s t , n o s i g n i f i c a n ti n c r e a s ei n t h i sr a t i ow a so b s e r v e df o rt h es um o f m e t a b o l i t e si n t h ed e g r a d e db r o t h c o m p a r e dw i t h t h a tf o ra f r e s hb r o t hc o n t a i n i n gf e r r i c - E D TA .H o w e v e r ,w h e nt h et e s tw a s c a r -r i e do u t f o r 2 8 d a y s ,t h e r a t i of o r t h e s p e n t b r o t h s w a ss i g n i f i c a n t l yg r e a t e rt h a n t h a tf o r t h e i n i t i a lf e r r i c - E D T Am e d i u m .T h i s i n d i c a t e st h a t f o rl o n g e r b i o l o g i c a le x p o s u r et h em e t a b o l i t e sm ay b e m o r e r e a d i l yb i o d e g r a d e dt h a n t h ep a r e n t c o m p o u n d .

A l t h o u g ht h ei s o l a t ew i l lr a p i d l yd e g r a d eh i g hc o n c e n t r a -t i o n so f f e r r i c - E D TA ,we h a v e n o t b e e n a b l et o d e m o n s t r a t ed e g r a d a t i o no f t h ef r e ec h e l a t o ra t c o m p a r a b l ec o n c e n t r a -t i o n s .Vi g o r o u sg r o w t h o f t h e m i c r o o r g a n i s mh a v e b e e no b s e r v e dwhen EDTA o r t h e o t h e r r e l a t e da m i n o p o l y c a r -b o x y l i ca c i dc h e l a t o r ,PDTA, i s c o o r d i n a t e dw i t h i r o n .

T h a t i r o nmay b e r e q u i r e df o r v i g o r o u s g r o w t ho f t h ei s o l a t ewas a l s o i n d i c a t e db y s o m e p r e l i m i n a r y g r o w t hs t u d i e s .I no u r n o r m a lp r o c e d u r ef o rp r e p a r i n gm e d i a ,f e r r i c -E D TA was d i s s o l v e di n b a s a lm e d i u mc o n s i s t i n go f m i n e r -a l s ,b i o t i n ,a n d p h o s p h a t eb u f f e r .A f t e ra l l t h ec o m p o n e n t sw e r ed i s s o l v e d ,t h epH o f t h em e d i aw a sa d j u s t e d .A s t h epHwas i n c r e a s e d ,a r e d - o r a n g ef l o c c u l e n tp r e c i p i t a t ec h a r a c t e r -i s t i co fi r o nh y d r o x i d e sf o r m e d .T h e m e d i aw e r e t h e n f i l t e rs t e r i l i z e d ,w h i c hr e m o v e dt h ep r e c i p i t a t e di r o na n d l e f ta ne x c e s s o fE DTA i n s o l u t i o n .T h e e x c e s s b e c o m e sg r e a t e ri ft h epH i s i n c r e a s e df u r t h e rb e f o r ef i l t r a t i o n .I n s o m ee a r l ye x p e r i m e n t s( d a t an o t s h o w n ) ,a v a r i a b l ea n d o f t e nl o n g l a gt i m e ( 3d a y s )w a s o b s e r v e dw h e na t t e m p t i n gt o c u l t i v a t et h es t r a i ni n f e r r i c - E D T Am e d i a ,w h i c hc o n t a i n e da l a r g ee x c e s so f E DTA p r o d u c e di n t h i sw a y . I nf a c t ,t o e n s u r e m i n i m a ll a g

p h a s ei n o u r l a r g e r - s c a l ei n c u b a t i o n s ,we a d d e df e r r i cc h l o -r i d et o t h es t e r i l e - f i l t e r e dm e d i at o r e p l a c es o m eo f t h ei r o nr e m o v e db y t h ef i l t r a t i o n .T h i s s u p p l e m e n t a t i o nc o n s i s t e n t l yp r o d u c e dm i n i m a ll a gt i m e s .

T h e r e q u i r e m e n tf o r i r o nmay b e r e l a t e dt o n u t r i t i o n a lr e q u i r e m e n t so f t h e m i c r o o r g a n i s m s .M i c r o o r g a n i s m st h a ta r e a d a p t e dt o a l o w - i r o ne n v i r o n m e n to f t e nh a v es u b s t a n c e sa s s o c i a t e dw i t h t h e i r- c e l ls u r f a c e( s i d e r o p h o r e s )t h a tc a ns t r o n g l yc h e l a t et r a c ea m o u n t so f i r o nt o p r o v i d e f o r t h en u t r i t i o n a lr e q u i r e m e n t so f t h em i c r o o r g a n i s m .T h e A g r o -b a c t e r i u ms t r a i nwe h a v e i s o l a t e dmay h a v e e v o l v e d a ne n z y m ea n d t r a n s p o r ts y s t e mt h a tr e q u i r e si r o nt o b e b o u n dt o ED TA f o r m e t a b o l i s mt o o c c u r .T h i s w o u l d n o t b eu n r e a s o n a b l es i n c e t h eo r g a n i s mw a s i s o l a t e df r o ma n e n v i -r o n m e n te x p o s e df o r s e v e r a ly e a r s t o a c o n t i n u a la n d s u b -s t a n t i a li n p u to f f e r r i c - E D T Ai n c l u d e d w i t h o t h erw a s t e s .T h e a b i l i t yo f t h e m i c r o o r g a n i s mt o u s e f e r r i c - E D TAf o ri t si r o na n d e n e r g yr e q u i r e m e n t sw o u l dh a v ep r o v i d e di t w i t h as e l e c t i v ea d v a n t a g ei n t h a te n v i r o n m e n t .S i m i l a rs p e c i f i cr e c e p t o r s f o r t h e i r o nc h e l a t eo f c i t r i ca c i dh a v e b e e no b s e r v e d( 1 3 ,1 8 ) .

T h er a t ea n d e x t e n t o f d e g r a d a t i o no f f e r r i c - E D TAb y t h i sA g r o b a c t e r i u mi s o l a t ea r e d e p e n d e n to n t h e c o n t r o lo fh y d r o g e ni o nc o n c e n t r a t i o nd u r i n g t h ed e g r a d a t i o n .A s b i o -d e g r a d a t i o np r o c e e d sa n d f e r r i c - E D TAi s c o n s u m e d ,t h epHi n c r e a s e s .T h e i n c r e a s ei s a t l e a s tp a r t i a l l yc a u s e d b y t h eg e n e r a t i o no f a m m o n i ad u r i n gt h ed e g r a d a t i o n .When t h epHi s a l l o w e d t o i n c r e a s ea b o v e 8 , d e g r a d a t i o n s t o p s .T h i si n h i b i t i o nmay n o t b e d u e s o l e l yt o t h eh i g h e r p H , b u t may

a l s ob e c a u s e db y t h ei n c r e a s e dl e v e lo f a m m o n i at h a tcausest h ei n c r e a s ei n p H . I n a n y c a s e , f o rmaximum d e g r a d a t i oe i t h e rs u f f i c i e n tb u f f e rmust b e p r e s e n t i n i t i a l l yo r a c i dmustb e a d d e dc o n t i n u o u s l yt o m a i n t a i n a pH l e s st h a n 8 .

T h e m a r k e dp r e f e r e n c eo f t h i sm i c r o o r g a n i s mf o rf e r r i c -E DTA a n d i t s e f f e c t i v e n e s sa t r e l a t i v e l yh i g hs u b s t r a t e

c o n c e n t r a t i o n smaym a k e i t u s e fu l f o rw a s t e r e m e d i a t i o n

s t r a t e g i e s .A l t h o u g hwe h a v e o b se r v e dg r o w t ha n d d e g r a d at i o no f f e r r i c - E D T Ab y t h ei s o l a t ei n t h ep r e s e n c eo f co m-p e t i n gc a r b o ns o u r c e ss u c h a s s u c r o s e a n d y e a s t e x t r a c t ,t h er a t e w a s n o t a s h i g ha s w h e n f e r r i c - E D T Awas t h e s o l ec a r b o n s o u r c e . I n a d d i t i o n ,a l l o u r e x p e r i m e n t sh a v e b e e nc a r r i e do u t u n d e r a s e p t i cc o n d i t i o n s .I n t h ef e w i n s t a n c e swhen a c c i d e n t a lc o n t a m i n a t i o nd i do c c u r ( d a t an o t s h o w n ) ,b i o d e g r a d a t i o nd i dn o t p r o c e e dw i t h s u c h r a p i do r c o m p l e tm i n e r a l i z a t i o no f t h e s u b s t r a t e .I t i s n o t k n o w nh ow t h em i c r o o r g a n i s mw o u l db e h a v ei n a c o m p e t i t i v en a t u r a le n v i -r o n m e n t .

ACKNOWLEDGMENTS

We t h a n k D i a n e B r a t m a na n d R o b e r tG u a r d i n of o rt h eb a c t e r i a l

t y p i n g ;B a r b a r aS t e e l ef o ri n i t i a le n r i c h m e n t sa n d i s o l a t i o n s ;M a r yA n d e r s o n ,D e a t r i c eB y r d , A nn S h a e f e r ,a n d S c o t tP e t e r sf o r m e -d i u mp r e p a r a t i o na n d t e c h n i c a ls u p p o r t o f t h em i c r o b i o l o g yf u n c -t i o n s ;E l l e nH a a kf o rc o l o n ym o r p h o l o g ys t u d i e s ;J o h nS t o u tf o rt h ef e r r i c - E D T Ah i g h - p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h ym e t h o d ;A lM i k e l lf o r v a l u a b l e d i s c u s s i o n s ;a n d R o b e r t B e l l ya n d R o b e r tG o o d n o wf o rr e v i e wo ft h em a n u s c r i p t .

LITERATURE CITED1 . A m e r i c a nP u b l i cH e a l t hA s s o c i a t i o n . 1 9 8 5 .S t a n d a r dm e t h o d sf o r

t h ee x a m i n a t i o no f w a t e r a n d w a s t e w a t e r ,1 6 t he d . A m e r i c a nP u b l i cH e a l t hA s s o c i a t i o n ,Wa s h i n g t o n ,D . C .

2 . B e l l y,R .T . ,J . J .L a u f f ,a n d C . T . G o o d h u e .1 9 7 5 .D e g r a d a t i o no f e t h y l e n e d i a m i n e t e t r a a c e t i ca c i db y m i c r o b i a lp o p u l a t i o nf r o ma n a e r a t e dl a g o o n .A p p l .M i c r o b i o l .2 9 : 7 8 7 - 7 9 4 .

3 . D r u c k e r ,D .B . 1 9 7 6 .G a s - l i q u i dc h r o m a t o g r a p h i cc h e m o t a x o n -o m y , p . 5 1 - 1 2 5 .I n J . R .N o r r i s( e d . ) ,M e t h o d si n m i c r o b i o l o gv o l .9 . A c a d e m i cP r e s s ,I n c .( L o n d o n ) ,L t d . ,L o n d o n .4 . G e r i k e ,P . , a n d W . K . F i s c h e r .1 9 7 5 .A c o r r e l a t i o ns t u d yo fb i o d e g r a d a b i l i t yd e t e r m i n a t i o n s w i t hv a r i o u sc h e m i c a l si n v a r i -o u s t e s t s .E c o t o x i c o l .E n v i r o n .S a f e t y3 : 1 5 9 - 1 7 3 .

5 . E g l i ,T . 1 9 8 8 .( A n ) a e r o b i cb r e a k d o w no fc h e l a t i n ga g e n t su s e di n h o u s e h o l dd e t e r g e n t s .M i c r o b i o l .S c i .5 : 3 6 - 4 1 .

6 . H i l l - C o t t i n g h a m ,D . G . 1 9 5 5 .P h o t o s e n s i t i v i t yo f i r o nc h e l a t e s .N a t u r e( L o n d o n )1 7 5 : 3 4 7 - 3 4 8 .

7 . H o f e r ,A .W . 1 9 4 1 .A c h a r a c t e r i z a t i o no fb a c t e r i u mr a d i o b a c t e( B e i j e r i n c ka n d V a nD e l d e n )L o h n i s .J . B a c t e r i o l .4 1 : 1 9 3 - 2 2 4

8 . L a m b e r t ,J . L . ,C .E .G o d s e y,a n dL . M . S e i t z .1 9 6 3 .P r e p a r a t i oa n d p h o t o d e c o m p o s i t i o no f t h ec o m p l e xa c i d ,h y d r o g e na q u o -e t h y l e n e d i a m i n e t e t r a a c e t a t o f e r r a t e( I I I ) .I n o r g .C h e m .2 : 1 2 7 -1 2 9 .

9 . L i p p i n c o t t ,J . A . ,B . B . L i p pi n c o t t ,a n d M . P . S t a r r .1 9 8 1 .T h eg e n u s A g r o b a c t e r i u m ,p . 8 4 2 - 8 4 5 .I n M . P . S t a r r ,H . S t o l p ,H . G . T r u p e r ,A . B a l o w s ,a n d H . G . S c h l e g e l( e d . ) ,T h e p r o -

k a r y o t e s ,v o l .1 . S p r i n g e r - Ve r l a gKG, B e r l i n .1 0 .L o c k h a r t ,H . B . ,J r . , a n d R . V . B l ak e l e y . 1 9 75 .A e r o b i cp h o t o -d e g r a d a t i o no f F e ( I I I ) - ( e t h y l e n e d i n i t r i l o ) t e t r a a c e t( f e r r i cE D TA ) - i m p l i c a t i o n sf o rn a t u r a lw a t e r s .E n v i r o n .S c i .T e c h -n o l .9 : 1 0 3 5 - 1 0 3 8 .

1 1 .L o c k h a r t ,H . B . ,J r . , a n d R . V .B l a k e l e y .1 9 7 5 .A e r o b i cp h o t o -d e g r a d a t i o no f X ( N ) c h e l a t e so f ( e t h y l e n e d i n i t r i l o ) t e t r aa c i d[ E D T A ] :i m p l i c a t i o n sf o r n a t u r a lw a t e r s .E n v i r o n .L e t t .9 : 1 9 - 3 1 .

1 2 .M e a n s ,J . L . ,D . A . C re ra r ,a n dJ . 0 . D u g u i d .1 9 7 8 .M i g r a t i o no fr a d i o a c t i v ew a st e s: r a di o n uc l i d e m o bi l i za t io nb y c o m p l e x i n ga g e n t s .S c i e n c e2 0 0 : 1 4 7 7 - 1 4 8 1 .

1 3 . N e i l a n d s ,J . B . 1 9 8 2 .M i c r o b i a le n v e l o p ep r o t e i n sr e l a t e dt oi r o n .A n n u .R e v . M i c r o b i o l .3 6 : 2 8 5 - 3 0 9 .

1 4 .S t o o k e y , L . L . 1 9 7 0 .F e r r o z i n e - anew s p e c t r o p h o t o m e t r i c

3 3 5 2 L A U F F ET A L .


9/9

MICROBIAL DEGRADATIONO F E D TA FERRIC CHELATE

r e a g e n t f o ri r o n .A n a l . C h e m .4 2 : 7 7 9 - 7 8 1 .1 5 . T h o m ,N . S . ,a n d A . R . A g g . 1 9 7 5 .T h eb r e a k d o w no f s y n t h e t i c

o r g a n i c c o m p o u n d si n b i o l o g i c a lprocesses. P r o c . R . S o c .London S e r .B 1 8 9 : 3 4 7 - 3 5 7 .

1 6 . T i e d j e ,J . M. 1 9 7 5 .M i c o b i a ld e gr a d a t io n o fe t h y l e n e d i a m i n e t e t -r a a c e t a t e i n s o i l sa n d s e di m e nt s . A p pl .M i c ro b io l . 3 0 : 32 7 - 32 9 .

1 7 .T i e d j e ,J . M. 1 9 7 7 .I n f l u e n c eo f e n v i r o n m e n t a lp a r a m e t e r sonE D TA b i o d e g r a d a t i o ni n s o i l sa n d s e d i m e n t s .J . E n v i r o n .Q u a l .6 : 2 1 - 2 6 .

1 8 . W a g e g g , W . ,a n d V . B r a u n . 1 98 1. F e rr icc i t r a t et r a n s p o r t i nE s c h e r i c h i a c o l i r e q u i r e s o u t e r membrane r e c e p t o r p r o t e i nF e c A .J . B a c t e r i o l .1 4 5 : 1 5 6 - 1 6 3 .

V O L. 5 6 , 1 9 9 0 3 3 5 3

Appl. Environ. Microbiol. 1990 Lauff 3346 53

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