UNIVERSIDADE FEDERAL DO PAR CENTRO DE CINCIAS DA SADE
DEPARTAMENTO DE FARMCIA LABORATRIO DE FITOQUMICA
(Edio Revisada)
Wagner Luiz Ramos Barbosa Colaboradores: Etienne Quignard Isabel
Ceclia de Castro Tavares Lucianna do Nascimento Pinto Francielda
Queiroz de Oliveira Rodson Martins de Oliveira
Belm - PA 2001
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2004
Dedicado aos povos das florestas, se de alguma valia for...
INTRODUOBrevssimo histrico da Fitoterapia
Desde pocas imemoriais os seres humanos utilizam-se dos recursos
naturais para a sua sobrevivncia. Os vegetais so, ainda nos dias
atuais, usados na construo de casas, no fabrico de vestimentas e na
saciedade da fome. Na poca pr-colombiana, antes da invaso e subjugo
do continente americano pelas monarquias ibricas, as sociedades que
aqui viviam, construam suas casas, em harmonia com o clima da regio
que habitavam, usando folhas e troncos de rvores, as quais tambm
lhes forneciam seu meio de transporte. Sobre alimentao no necessrio
falar, a no ser para inferir que, pelo fato de terem uma dieta
bastante rica e variada, j faziam uso medicinal dos vegetais. Os
doentes eram tratados pelos chamans, pelos pajs, pelos curandeiros,
estes sim, donos da arte e da cincia da cura, que associam o
conhecimento da flora curativa com a capacidade de comunicarem-se
diretamente com seus deuses e com os elementos da natureza, agindo
assim em duas frentes contra a doena e a favor do paciente. Com a
sistematizao da pilhagem dos recursos naturais, a chamada
colonizao, os europeus e quase extinguiram alguns produtos como o
ouro e prata nos pases andinos e o pau-brasil aqui, e quase
aniquilaram esta fonte de conhecimento, que so os pajs, isso porque
o invasor por pouco conseguiu transformar o indgena em mais uma
espcie extinta. Nos sculos que se seguiram, no Brasil, a Medicina e
a Farmcia acompanharam os moldes europeus utilizando o acervo
curativo e as tcnicas importadas. Entretanto, na cozinha, o
processo era bem mais dinmico e variado. Acrescida dos
conhecimentos trazidos pelos negros, contrabandeados e
vilipendiados numa situao degradante e abenoada de escravos, a
farmacopia nativa, que j misturava a flora indgena e europia,
enriqueceu-se com as espcies trazidas da frica. Com isso muitas
formulaes passaram a incluir espcies vegetais que cresciam
originalmente em diferentes continentes. Com o aparecimento das
sulfas, dos antibiticos e com o incremento da sntese orgnica,
comeou a presso dos produtos sintticos sobre os de origem natural.
Sem dvida este avano trouxe alguma melhoria na qualidade de vida
das pessoas, mas o que as indstrias no contavam era que uma
catstrofe estava em gestao nos seus laboratrios. Uma substncia
milagrosa que agia sem causar reaes adversas, o ideal dos produtos
sem efeitos colaterais graves: a talidomida. E deu no que deu.
Utilizada por gestantes, a substncia apresentou um efeito
teratognico que fez com que milhares de bebs nascessem sem braos ou
com membros deformados. Isso custa, at hoje, muito caro para alguns
pases que tiveram que investir altas somas para integrar esses
deficientes s suas sociedades. A isso some-se o movimento hippie
que, na mesma poca, contestava a ganncia dos capitalistas, o
materialismo da sociedade e o reacionarismo da igreja, propondo uma
volta aos valores mais elevados da vida, com mais liberdade, mais
amor e com alguns outros ingredientes que no devem ser mencionados
aqui, mas que so tambm de origem vegetal! Assim como o capitalismo
e o socialismo, a industrializao tambm mostrou o seu lado mau. As
solues revolucionrias e definitivas como a energia nuclear, o
neoliberalismo, a quimioterapia, entre outras, j criaram uma gama
muito vasta de problemas, para serem hoje aceitas sem crticas; por
isso essa tentativa de se sair em busca de novos caminhos para as
vrias crises que enfrentamos, ainda. Com a realizao da Conferncia
Mundial sobre Meio Ambiente em 1992 no Rio de Janeiro pde-se trazer
de volta ao debate a questo de preservao da biodiversidade. Novas
estratgias foram lanadas para, a mdio prazo, poder-se alcanar nveis
de qualidade no
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meio ambiente, que possam adiar o dia do juzo final, ou seja,
postergar o caos ambiental. Paralelamente, pretendeu-se incentivar
o desenvolvimento das naes mais pobres do planeta. Entretanto, nada
disso ter uma mnima chance de ocorrer se as regras do jogo
continuarem as mesmas. Nenhum pas industrializado aceitar abrir mo
de seu status quo em benefcio de um mais pobre. Da mesma forma,
nenhum governo neoliberal do chamado terceiro mundo ter fora, ou
mesmo interesse, para defender os legtimos direitos de sua populao.
Mas h uma sada! A educao, quando dirigida aos menos favorecidos,
quando alia formao e informao; a educao uma arma mais forte do que
a guerrilha ou uma nova constituio. Por isso de capital importncia
sabermos trabalhar e explorar nossas potencialidades, defender
nossa riqueza ambiental, cultural, e principalmente aquela que est
dentro das pessoas. Por meio da educao devemos fazer florescer essa
riqueza interior dos estudantes, pois eles que vo definir o rumo
que o futuro ir tomar. E nesse futuro, no que diz respeito s mais
diferentes terapias que andam en vogue neste final de sculo, est
includa a fitoterapia, no mais aquela emprica dos tempos da
Pharmcia, ou aquela que proclama que o que natural no tem
contra-indicao. Com a utilizao consciente e crtica dos recursos
naturais, escolhendo bem os parceiros e as formas de com eles
interagir, pode-se contribuir para reduzir o sofrimento de um
doente, o atraso de uma sociedade ou at mesmo a pobreza de um pas.
O uso de plantas no tratamento de males do corpo e do esprito
continua sendo objeto da curiosidade leiga e cientfica. Wagner Luiz
Ramos Barbosa Rio de Janeiro, dezembro de 1992.
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ASPECTOS EXPERIMENTAIS DA FITOQUMICA Importncia da identificao
do material vegetal Escolher o material vegetal a ser estudado , a
princpio, uma tarefa ingrata, se considerarmos que, apesar da
destruio sistemtica e insensata das florestas tropicais, ainda
existem milhares de diferentes espcies vegetais. Para orientao da
escolha existem a literatura especializada e as farmacopias
humanas, ou seja, os muitos homens e mulheres que acumularam
conhecimento emprico sobre medicina tradicional. Essas pessoas
sabem que planta cura que mal! Baseando-se na informao dessas
pessoas ou dos botnicos, dos farmaclogos, e de um nmero crescente
de farmacuticos que fazem o trabalho de campo, pode-se determinar
que planta ser investigada, geralmente segundo seu nome popular. A
classificao taxonmica, a qual ocorre, quase sempre, com o concurso
de um especialista, a determinao de um txon como idntico ou
semelhante a uma descrio j existente, por comparao do
material-problema com exsicatas dispostas em herbrios ou com
monografias especializadas, levando a obteno da denominao cientfica
do material. A anlise de um indivduo com fins de sua identificao
baseia-se na prospeo, no indivduo em anlise, de caractersticas
comuns a uma famlia, ficando as diferenas restritas a certos
limites. Observando-se a anatomia, macro e microscpica, e a
constituio qumica deste indivduo pode-se chegar a uma identificao
positiva da espcie a que ele pertence. A identificao segura do
vegetal empregado no preparo de fitoterpicos garante o efeito
teraputico pretendido, pois este est relacionado com as
propriedades farmacodinmicas da droga indicada, caracterstica de
uma determinada espcie. No caso de uma identificao positiva, tambm
o grau de pureza da droga deve ser controlado, avaliando-se no s os
princpios ativos como tambm as possveis adulteraes, falsificaes e
impurezas. Tais anomalias, apesar de freqentes, no devem ser
encaradas como acontecimentos triviais, pois podem acarretar
conseqncias altamente danosas, at fatais, para os usurios do
produto. No mbito de pesquisa em fitoqumica, a identificao positiva
e segura da planta medicinal sob investigao garante a padronizao
dos mtodos e a reprodutibilidade dos resultados, os quais podem vir
a ter aplicao prtica. Deve-se, ainda, atentar para o fato curioso
de que uma mesma espcie botnica pode possuir diferentes nomes
populares ou, ao contrrio, diferentes espcies botnicas com um mesmo
nome no - sistemtico, segundo a regio ou populao que as usa. Este
fato s faz aumentar a importncia de uma identificao positiva e
segura da droga a ser cientificamente investigada ou
farmaceuticamente utilizada. Procedimentos na coleta Muitas pessoas
encarregadas da coleta de vegetais para uso farmacutico possuem
largo conhecimento emprico sobre plantas medicinais, entretanto
cabe ao especialista acompanhar a coleta do material e proceder as
anlises necessrias para corroborar ou no com a identificao
intuitiva do coletor. Ao coletar-se uma planta para anlise botnica
imediata, ou seja, quando se pode contar com especialistas prximo
ao local de coleta, pode-se dispensar cuidados especiais com o
preparo do espcime a ser analisado. Entretanto, deve-se coletar o
material o mais completo possvel, com pelo menos um ramo florido
com 20 a 30 cm de altura. Ao que devese anexar informaes sobre o
local e data de coleta, nome e uso popular, o porte do vegetal,
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a colorao das flores e outras informaes importantes como a
freqncia e o tipo de vegetao associada.
Fig. 1: Material coletado com etiqueta.
Na maioria dos casos o material vegetal precisa ser remetido
para outro local a fim de ser identificado e se isso demandar mais
de 24 horas, faz-se necessrio tomar certos cuidados. Os ramos
floridos coletados devem ser distendidos e colocados entre folhas
de papel absorvente - papel jornal, por exemplo - o conjunto deve
ser ento acondicionado entre placas de papelo para ser em seguida
prensado. Tambm aqui, como acima, deve-se anexar informaes
relativas coleta dos espcimes. O material coletado para estudos
qumicos deve ser etiquetado com os dados necessrios sua identificao
no laboratrio, como no incio deste item. As partes suculentas devem
ser conservadas abaixo de 10C ou dessecadas, aps fragmentao. Cascas
e lenhos podem ser secos ao tempo, reduzidos a pedaos pequenos para
serem triturados em moinho mecnico, aps o que so submetidos a nova
secagem. O material modo deve ser acondicionado de forma a
evitar-se contaminao e infestao de quaisquer tipos. Para a
herborizao do material vegetal deve-se utilizar duas tbuas de 45 x
30 cm, papelo canelado e papel absorvente nas mesmas medidas. Um
espcime, o mais completo possvel, deve ser acondicionado entre
folhas de papel absorvente, o conjunto deve ser colocado entre as
folhas de papelo e por fim entre as tbuas. A prensa deve ser
firmemente amarrada com cordas (figuras 2 e 3). A secagem deve
acontecer em estufa a 37C por um ou dois dias ou temperatura
ambiente, por um tempo mais longo. Material suculento necessita de
mais tempo para secagem.
Fig. 2: Elementos necessrios para a herborizao de material
vegetal.
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Fig. 3: Conjunto amarrado.
As seguintes informaes devem constar em uma etiqueta que
acompanha a exsicata: Nome da Instituio, Nmero da Amostra e Data da
Coleta; Classificao Botnica; Famlia, Nome Cientfico (espcie) e Nome
Popular; Procedncia, Observaes, Nome do Coletor e Nome do
Especialista que identificou.
Fig. 4: Uma exsicata com etiqueta.
Parte integrante de uma identificao precisa e segura do material
a ser utilizado na pesquisa fitoqumica, a determinao da poca da
coleta e da procedncia do material pode evitar divergncias na sua
anlise qumica, condicionada sazonalidade e s condies do solo e do
ar onde o vegetal cresce.Preparao de extratos anlise fitoqumica
Considerando-se que uma determinada espcie vegetal seja
recomendada para tratar determinada sintomatologia e por esse
motivo deseja-se investig-la, o prximo passo a ser dado nessa
investigao, aps a caracterizao botnica, a abordagem farmacolgica do
material, o qual j deve ter sido botanicamente classificado. Atravs
de dados etnofarmacolgicos, que fornecem informaes sobre a utilizao
da planta, pode-se, pois, processar a sua extrao segundo a maneira
tradicional e proceder-se, assim, a testes de atividade, com o
concurso de um/a farmaclogo/a. Plantas que so usadas como chs, so
extradas com gua a quente e o extrato aquoso deve ser, o mais rpido
possvel, remetido para os testes, a fim de evitar-se o
desenvolvimento de fungos ou a degradao de substncias pela ao da
gua. Pode-se evitar estes contratempos conservando-se o extrato sob
refrigerao por um curto perodo em atmosfera estril, evaporando-o
sob presso reduzida ou procedendo-se liofilizao aps congelamento,
sendo este o mtodo de escolha, quando possvel. Para obter-se o
extrato seco, no caso da planta ser extrada com gua, deve-se secar
o em um liofilizador. Este aparelho composto, basicamente, de uma
bomba de alto vcuo e de uma cmara fria. Ele retira a gua do
extrato, sem aquecimento. O extrato congelado introduzido num
reservatrio que evacuado at em torno de 10-3cm de mercrio,
nesta
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condio a gua sublima, isto , passa do estado slido - gelo - para
a fase de vapor, para ser de novo convertida em gelo na cmara fria
(figuras 5 e 6).
Fig. 5: Construo esquemtica do equipamento.
Fig. 6: Liofilizador de bancada.Fonte: Catlogo da Empresa
AMSCO/FINN-AQUA Hrth, Alemanha
Os outros extratos, alm do aquoso, devem tambm ser evaporados
baixa presso at secura, evitando-se assim, a presena de resduos de
solventes orgnicos que podem mascarar a atividade intrnseca do
extrato. Em geral, extratos tradicionais no aquosos desta natureza
com fins teraputicos so preparados com vinho ou aguardente, o que
corresponde a um extrato hidroalcolico entre 10% e 40%. tambm
importante atentar para a preparao de extratos que apresentem uma
razovel hidrossolubilidade, pois a maioria dos testes biolgicos se
faz com solues aquosas de extratos ou fraes secas. Caso a amostra
no apresente esta propriedade ser necessrio o uso de agentes
dispersantes ou emulgentes, o que pode dificultar a avaliao da
atividade ou mesmo a execuo dos testes. Uma vez detectada ou
confirmada a atividade farmacolgica do material em estudo e, caso
se objetive isolar o princpio ativo, procede-se a uma extrao por
solvente orgnico, no qual ser pesquisada a bioatividade j
detectada, levando-se em conta o que se afirmou antes para este
tipo de extrato, quanto a presena de resduos de solventes. O
extrato orgnico deve ter seu perfil cromatogrfico determinado por
cromatografia em camada delgada ou cromatografia lquida de alta
eficincia e deve ser analisado quanto composio qumica. A atividade
deve ser pesquisada tambm nas fraes brutas, que so preparadas a
partir do extrato inicial. A frao ativa poder ser tratada para
fornecer a substncia ativa. Este o caso ideal! No transcorrer deste
procedimento pode-se isolar outras substncias que podem, da mesma
forma, apresentar outro tipo de bioatividade, ou serem aproveitadas
como marcadoras nos mtodos usuais de controle qualidade. A fim de
se interromper os processos enzimticos correntes no vegetal
deve-se, aps coleta, colocar o material vegetal em uma estufa,
pr-aquecida temperatura de 60C a 80C, durante quinze a trinta
minutos ou proceder-se sua extrao imediata com lcool etlico, caso
se preconize a extrao do material fresco. Caso a extrao deva ser
efetuada no material seco, recomendvel deix-lo desidratar em
ambiente ventilado e climatizado para que no ocorra infestaes e
degradaes indesejadas ou que interfiram negativamente nos
resultados esperados.
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Anlise cromatogrfica de um extrato e determinao das condies para
o seu fracionamento e para o isolamento de substncias
O extrato obtido a partir do vegetal seco ou fresco deve ser
analisado cromatograficamente, tenha ele sido preparado para teste
farmacolgico ou para anlise qumica propriamente dita. Aps a
evaporao do solvente tem-se um extrato seco que deve ser pesado
para determinao do rendimento. Uma pequena poro deste material
redissolvida num mnimo de solvente orgnico; metanol, clorofrmio ou
acetato de etila, por exemplo. A soluo aplicada na forma de barras
sobre placas cromatogrficas, sendo desenvolvidos cromatogramas com
eluentes adequados de diferentes polaridades. Estes cromatogramas
devem ser observados sob luz natural, luz ultravioleta e revelados
com reativos especficos para determinadas classes de metablitos
secundrios. As observaes feitas so anotadas e os cromatogramas
(figura 7) reproduzidos sobre papel para posterior comparao.
Fig. 7: Cromatograma e clculo do Rf.Fonte: Deutsche Apotheker
Zeitung, 49, 2705, 1992.
Para evaporao de solventes orgnicos a baixa presso, utiliza-se o
evaporador rotativo sob vcuo mediano de 60 at 20 cm de mercrio
(presso normal: 760mmHg); podese utilizar uma trompa de jato dgua
ou bomba de membrana de Teflon (presso em torno de 15 miliPascal),
ideal para solventes orgnicos menos volteis ou mesmo gua. De posse
da anlise cromatogrfica do extrato, quanto a sua composio por
classes de substncias, seleciona-se qual substncia deve ser
isolada, de acordo com o plano de investigao a ser seguido. Devido
a complexidade de um extrato bruto, muitas vezes essa tarefa no to
fcil, ou seja, muitas vezes torna-se necessrio dividir o extrato
bruto em fraes grosseiras, para, a sim, poder-se visualizar a
mancha que interessa. A denominao mancha d-se quela zona do
cromatograma ocupada pelas substncias que so coradas, absorvem ou
fluorescem no ultravioleta, ou ainda quelas que mostram colorao
tpica (e s vezes no to tpicas tambm) de uma ou outra classe ao
reagirem com um reativo especfico (ver figura 7). A obteno das
fraes brutas, o fracionamento, uma estratgia que visa descomplicar
o extrato bruto, possibilitando a identificao de manchas que
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mascaradas por corantes naturais (clorofilas, carotenides ou
flavonides e s vezes alcalides) ou encobertas por substncias
majoritrias (cidos graxos, esterides ou flavonides). Para o
fracionamento pode-se utilizar diferentes tcnicas: a partio lquido
lquido, que explora a imiscibilidade de alguns solventes orgnicos
com gua; a desadsoro seletiva, que est baseada na capacidade de um
solvente em deslocar substncias adsorvidas a um suporte inerte ou
ainda; a cromatografia de coluna, s vezes sob presso (freqentemente
dispensvel), que est fundamentada na capacidade de um eluente (uma
mistura de solventes em propores definidas) de deslocar, arrastando
sucessivamente, substncias, que se adsorvem ao suporte inerte
segundo suas polaridades.
Fig. 8: Funil de decantao na separao lquido - lquido
Fig. 9: Cromatografia em coluna.
Em alguns casos, durante o fracionamento pode ocorrer a
precipitao ou mesmo a cristalizao de uma substncia, que na maioria
dos casos, pode tratar-se de uma substncia majoritria, geralmente
ubiqitria. Para que determinada a mancha, leia-se a substncia,
possa ser isolada de um extrato bruto, ou de uma frao bruta,
deve-se adequar as condies cromatogrficas at poder-se visualizar a
mancha escolhida numa altura superior a um quarto e inferior a um
tero do caminho percorrido pelo eluente na placa. Isso o que se
chama Rf timo (do ingls Retention factor) da substncia, ou seja, a
razo entre as distncias percorridas pela mancha e pelo eluente na
placa. Uma vez conseguida a combinao de solventes (eluente)
adequados, passa-se ao isolamento propriamente dito da substncia
que mostrar o Rf entre 0,25 e 0,33 nas dadas condies (ver figura
7).Cromatografia em camada delgada, preparativa, de coluna,
automatizada gasosa ou de alta performance
A cromatografia o mtodo analtico bsico da fitoqumica. Na
Alemanha, os qumicos sintticos costumam dizer, como piada, que eles
fazem qumica verdadeira e ns fitoqumicos, somente cromatografia.
Eles se esquecem, porm, que todo o desenvolvimento da qumica
orgnica est baseado nos estudos dos compostos naturais. Os mtodos
para
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sntese e de anlise estrutural so, em grande parte, desenvolvidos
e aperfeioados, por exigncia da Fitoqumica. Para se proceder anlise
de extratos vegetais, para o seu fracionamento e para o isolamento
de seus constituintes qumicos poder-se-ia utilizar somente a
cromatografia. A anlise cromatogrfica de um extrato faz-se
aplicando-se uma pequena quantidade deste sobre uma placa,
geralmente de vidro, coberta com um material inerte. A
cromatografia de adsoro o tipo mais comum e til, de uso geral,
sendo outras variantes e desenvolvimentos aplicados a casos
especficos. Deve-se registrar ainda a cromatografia de partio, a de
troca inica e a filtrao em gel. O desenvolvimento do cromatograma,
diagrama que mostra os constituintes qumicos do extrato distribudos
sobre a placa cromatogrfica segundo suas polaridades, faz-se com o
uso de um eluente, uma combinao de solventes. A posio dos compostos
sobre a placa e dada pelo seu Rf (ver figura 7). O termo placa
cromatogrfica se aplica a qualquer material recoberto de suporte
quimicamente inerte para fins cromatogrficos, podendo ser de vidro,
de alumnio ou de polmeros sintticos. Cada tipo tem suas limitaes e
vantagens, mas as placas de vidro so as mais difundidas. O suporte,
material que cobre a placa cromatogrfica, com uma espessura de 0,25
mm forma o que se chama de fase estacionria. Atualmente, trs tipos
de suportes para cromatografia em camada delgada (CCD) atendem s
necessidades dos fitoqumicos: slica gel, ou xido de silcio (SiO2).
Trata-se de um mineral, cujo gro apresenta a propriedade de
adsorver substncias superfcie, a qual, por apresentar muitos poros,
possui uma superfcie de contato extremamente grande para a dimenso
do gro. Estas substncias adsorvidas podem ser seletivamente
deslocadas por um solvente orgnico ou por uma mistura deles, que
flui pelo suporte; a presena de gua no eluente pode desativar a
slica gel, o que s vezes necessrio; o xido de alumnio (Al2O3),
tambm conhecido como alumina, pode ser empregado na forma cida ou
neutra. O eluente pode conter gua. A alumina bsica e a neutra so
usadas, geralmente, para a separao de alcalides; slica gel de fase
reversa (Reversed phase - RP), neste caso tem-se um resduo de
cadeia longa (C8 ou C18) ligado ao oxignio do xido de silcio.
Adequado para separao de substncias muito polares, como por exemplo
de glicosdeos, este suporte requer como eluente lcoois hidratados.
Neste tipo de cromatografia contra-indicado o uso de qualquer outro
solvente orgnico, mas existem excees. A mistura de solventes
utilizada para o desenvolvimento de um cromatograma tem sua
composio definida na observao da distribuio das substncias sobre a
placa. Caso se esteja buscando o sistema (eluente + suporte,
geralmente a slica gel) ideal para o fracionamento de um extrato
numa coluna cromatogrfica, deve-se utilizar um eluente que abra o
extrato, isto , as manchas devem suceder-se sobre a placa de forma
ntida, sem contornos difusos ou sobreposio, tal feito extremamente
difcil. Um outro critrio para definir uma substncia a isolar
trabalhar o sistema em funo dela desde a anlise do extrato,
buscando sistematicamente a melhor combinao de solventes. Uma
tcnica bastante prtica e rpida para o isolamento de pequenas
quantidades de substncias est embasada no uso da cromatografia de
camada delgada (CCD) preparativa sobre placa de vidro. Aqui se
aplica uma soluo concentrada da amostra (no mais que 5 mg por placa
de 20 cm de largura) e desenvolve-se o cromatograma com o eluente
escolhido. Aps evidenciar-se a posio da substncia a ser isolada,
com o uso de um reagente geral aspergido sobre uma faixa estreita
da placa, ou por observao sob luz ultravioleta, raspa-se a slica
gel que contm a banda relativa substncia procurada. Esta slica ento
lavada com
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um solvente orgnico apropriado, que dissolva a substncia em
questo; o metanol contraindicado, pois arrasta uma quantidade
significativa de slica gel. A soluo obtida concentrada at a secura
e para garantir a ausncia de slica, deve-se, de novo, dissolver o
resduo da evaporao, filtrar e mais uma vez evaporar a secura. Os
solventes empregados no preparo de um eluente devem ser
relativamente volteis; no devem reagir entre si; quando a mistura
desenvolver calor, deve-se esperar o arrefecimento da mesma antes
de seu uso. O benzeno contra-indicado pela sua carcinogenicidade,
deve ser substitudo por tolueno, apesar deste ferver a 110C. O
clorofrmio hepatotxico, assim como o diclorometano, mas ambos so
insubstituveis no isolamento de alcalides. O metanol tambm bastante
txico, ele absorvido pela pele e pode provocar cegueira e morte. Os
solventes clorados e metanol devem ser manuseados sob aspirao (em
capela), com uso de luvas e culos de proteo. O ter etlico forma,
com o tempo, perxidos que podem, ao fim de uma destilao, explodir
de forma bastante violenta, recomenda-se por isso destil-lo na
presena de hidrxido de potssio, antes de seu uso. Todos os produtos
qumicos so nocivos sade, e alguns so muito perigosos, por isso,
exigem do usurio muita ateno e cuidado no seu manuseio. A automao
dos sistemas cromatogrficos levou ao desenvolvimento de aparelhos
destinados a executar a separao de compostos de uma mistura de uma
maneira rpida, eficiente e com alto poder de resoluo. O mtodo
chama-se cromatografia lquida de alta performance. O aparelho
compe-se de uma bomba injetora de eluentes, uma coluna com
adsorventes slidos impregnados de fases lquidas diretas ou
reversas, e um detetor baseado na diferena de ndices de refrao ou
na absoro no ultravioleta, entre outros tipos. Outros acessrios so
a impressora de dados e grficos referentes s condies da colunas e
das fraes obtidas e o coletor automtico de fraes.
Fig. 10: Esquema de um cromatgrafo.
Este aparelho permite a padronizao mais exata das condies de
isolamento de uma substncia. Tal fato levou ao desenvolvimento de
mtodos de anlise (qualitativa) e controle (quantitativo) de
composio de fraes e de extratos vegetais, possibilitando a
identificao de substncias conhecidas e a descoberta de novas, assim
como, e principalmente, o Controle de Qualidade de produtos
farmacuticos, base de insumos vegetais.
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ABORDAGEM FITOQUMICA I. PREPARAO DO EXTRATOTriturar o material
vegetal (50g) em triturador mecnico. Transferir para um recipiente
apropriado onde se deve acrescentar lcool etlico at a completa
submerso do material (anotar o volume usado). Fechar o recipiente
vedando-o com folha de alumnio. Deixar em macerao por, no mnimo, 3
dias. Ao final do prazo, filtrar o material primeiramente sobre
gaze e depois sobre papel filtro. Concentrar o filtrado em
evaporador rotativo para depois, transferir para um frasco
devidamente tarado, que deve ser levado estufa para completa
secagem do extrato. Depois de seco, o extrato deve ter sua massa
medida para posterior clculo do rendimento.
II. REATIVOS E SUA PREPARAO
II.1. Reativo de KEEDE para Glicosdios Cardacos: Soluo A:
dissolver 2g de cido 3,5-dinitrobenzico em 50mL de Metanol. Soluo
B: dissolver 5,7g de Hidrxido de Potssio em 100mL de Metanol.
Adicionar II gotas da sol. A e II gotas da sol. B no momento do
teste. II.2. Reativo de BOUCHARDAT para Alcalides: dissolver 4g de
Iodeto de Potssio 2g de Iodo ressublimado em 100mL de gua
destilada. II.3. Reativo de DRAGENDORFF para Alcalides: Soluo A:
dissolver 8g de Subnitrato de Bismuto (BiONO3.H2O) em 20mL de cido
Actico. Soluo B: dissolver 27,2g de Iodeto de Potssio (KI) em 50mL
de gua destilada. Adicionar aos poucos a soluo A sobre a soluo B.
II.4. Reativo de MAYER para Alcalides: Soluo A: dissolver 1,36g de
Cloreto Mercrico (HgCl2) em 60mL de gua destilada. Soluo B:
dissolver 5g de Iodeto de Potssio (KI) em 20mL de gua destilada. As
solues A e B devem ser misturadas e diludas para 100mL de soluo.
II.5. Reativo de PASCOV para cidos Orgnicos: Soluo A: dissolver em
100mL de Etanol 0,075g de Verde de Bromocresol e 0,25g de Azul de
Bromofenol. Soluo B: dissolver em 100mL de gua destilada, 0,25g
Permanganato de Potssio (KMnO4) e 0,25g de Carbonato de Sdio
(Na2CO3).10H2O. Misturar 9 partes de A para 1 parte de B, somente
no momento de usar. A mistura s estvel durante 5 a 10 min. II.7.
Reativo de FEHLING para Acares Redutores: Soluo A: dissolver 34,65g
de Sulfato de Cobre (CuSO4) em gua destilada e completar o volume
para 500mL. Soluo B: dissolver 173g de Tartarato de Sdio e Potssio
(KNaC4H4O6.4H2O) e 125g de Permanganato de Potssio (KOH) em gua
destilada e diluir para 500mL. Utilizar na proporo de 2mL de A,
para 2mL de B. II.8. LUGOL: dissolver 10g de Iodeto de Potssio (KI)
e 5g de Iodo em 50mL de gua destilada e completar o volume para
100mL.
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II.9. PAPEL REATIVO DE PICRATO DE SDIO para heterosdio
cianogentico: dissolver 1g de cido Pcrico (C6H3N3O3) em 100mL de
gua destilada; junte depois 10g de Carbonato de Sdio. Seque em
temperatura ambiente. Vlido por at 4 meses se o frasco estiver bem
fechado. II.10. SOLUES PULVERIZADORAS I E II para
sesquiterpenolactonas: Soluo pulverizadora I: Soluo A: dissolver
20g de Cloridrato de Hidroxilamina (NH2OH.HCl) em 50mL de gua
destilada, completar o volume para 200mL com lcool Etlico. Esta
soluo deve ser conservada em lugar fresco. Soluo B: dissolver 50g
de Hidrxido de Potssio (KOH) em gua destilada (pequeno volume) e
completar com Etanol at 500mL. Misturar 1 volume da soluo A com 2
volumes de soluo B. Filtrar o precipitado formado de Cloreto de
Potssio (KCl) (aguardar a formao do sal). Esta soluo deve ser
guardada em refrigerador, nestas condies se mantm estvel por duas
semanas. Soluo pulverizadora II: Dissolver 10g de Cloreto Frrico
FeCl3 em 20mL de soluo de cido Clordrico (HCl) a 36% (concentrado),
adicionar em seguida 200mL de ter Etlico (agitar no momento da
pulverizao). Esta soluo bastante estvel, desde que o frasco esteja
bem vedado. II.11. Anisaldedo cido Actico Reagente Geral Misturar
0,5mL de Anisaldedo a 10ml de c. Actico Glacial. Em outro
recipiente, adicionar a 85mL de Metanol, 5mL de H2SO4 concentrado.
As duas solues devem ser misturadas. II.12. Vanilina - cido
Sulfrico Reagente Geral Soluo. A : Dissolver 1g de Vanilina em
Etanol e completar o volume para 100mL. Soluo. B : Diluir 10mL de
H2SO4 em Etanol e elevar o volume at 100mL Obs.: No momento da
aplicao sobre a placa cromatogrfica, retirar uma alquota de cada
soluo obedecendo a proporo de 1:1. III.TESTES SAPONINAS a) Saponina
espumdica: dissolver alguns miligramas do extrato alcolico seco em
5mL de gua destilada. Em seguida, diluir para 15mL e agitar
vigorosamente durante 2min em tubo fechado. Resultado: se a camada
de espuma permanecer estvel por mais de meia hora, o resultado
considerado positivo para saponina espumdica. Obs.: Existem outros
compostos que ativam e desativam a espuma formada.
b) Saponina hemoltica: dissolver alguns miligramas do extrato
seco, em 2mL de soluo de Etanol a 80% (filtar se necessrio).
Preparar 20mL de suspenso de hemcias a 5%, em soluo de NaCl a
0,85%. Juntar 10mL da suspenso, a 1mL do extrato em sol.
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etanlica, homogeneizar cuidadosamente e deixar em repouso
durante 5min. Repetir o mesmo procedimento para os 10mL de suspenso
restante, porm, substituindo o extrato em soluo por sol. de NaCl a
0,85%.Centrifugar as duas preparaes durante 5min a 3500rpm.
Preparao da suspenso de hemcias a 5%: retirar 5mL de sangue humano
ou de outro animal, transferir para um tubo de ensaio, adotar um
volume padro de soluo salina (sugesto: 5mL), e proceder a lavagem
das hemcias, centrifugando durante 1min a 3000rpm e desprezando o
lquido sobrenadante. Repetir o procedimento de lavagem por pelo
menos 3 vezes. Em seguida, retirar 1mL do concentrado de hemcias e
adicionar 19mL de soluo de NaCl a 0,85% e homogeneizar. Resultado:
uma colorao vermelha ou rsea no lquido sobrenadante, considerada
evidncia de hemlise, quando comparada ao teste em branco. CIDOS
ORGNICOS Dissolver alguns miligramas do extrato seco em 5mL de gua
destilada. Filtrar se necessrio. Transferir 2mL para um tubo de
ensaio, ou 1mL para uma placa escavada, e adicionar gotas do
REATIVO DE PASCOV. Resultado: se houver descolorao do reativo, a
reao positiva. ACARES REDUTORES Tcnica 1: dissolver alguns
miligramas do extrato seco em 5mL de gua destilada. Filtrar se
necessrio. Adicionar 2mL do reativo de FEHLING A e 2mL do reativo
de FEHLING B. Aquecer em BM em ebulio durante 5min. Resultado: o
aparecimento de um precipitado vermelho tijolo, indica presena de
acares redutores. Obs.: caso no haja formao do precipitado,
executar a tcnica 2. Tcnica 2: dissolver alguns miligramas do
resduo em 5mL de gua destilada. Adicionar 1mL de HCl concentrado e
ferver em BM durante 10min. Esfriar e neutralizar com soluo de NaOH
a 20%. Filtrar se necessrio. Adicionar 2mL do reativo de FEHLING A
e 2mL de FEHLING B. Aquecer em BM por 5min. Resultado: o
aparecimento de precipitado vermelho, indica reao positiva para
acares no redutores ou heterosdios. HETEROSDIO CIANOGENTICO Colocar
num erlenmeyer 10g da planta fresca bem triturada, 10mL de gua
destilada e 1mL de H2SO4 concentrado, vedar o erlenmeyer com uma
rolha de cortia onde deve estar preso o papel reativo de Picrato de
Sdio de modo que no entre em contato com as paredes do erlenmeyer,
nem com a mistura. Aquecer a 50C durante 30. Resultado: se o papel
corar de marrom avermelhado, indica reao positiva para cido
Ciandrico.
POLISSACARDIOS Dissolver alguns miligramas do extrato seco em
5mL de gua destilada. Filtrar se necessrio. Adicionar duas gotas de
lugol.
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Resultado: o aparecimento de colorao azul, indica resultado
positivo. PROTENAS E AMINOCIDOS 1. Reao de nihidrina: dissolver
alguns miligramas do extrato alcolico em 3mL de gua destilada e
filtrar se necessrio. Adicionar 0,5mL de soluo aquosa de Nihidrina
a 1%, aquecer at a ebulio. Resultado: o aparecimento de colorao
violeta persistente indica reao positiva. FENIS E TANINOS Dissolver
alguns miligramas de extrato seco em 5mL de gua destilada, filtrar
se necessrio e adicionar I a II gotas de soluo alcolica deFeCl3 a
1%. Resultado: qualquer mudana na colorao ou formao de precipitado
indicativo de reao positiva, quando comparado com o teste em branco
(gua + Sol. de FeCl3). Colorao inicial entre o azul e o vermelho,
indicativo da presena de fenis, quando o teste em branco for
negativo. Precipitado escuro de tonalidade azul, indica presena de
taninos piroglicos (taninos hidrolisveis) e verde, presena de
taninos catquicos. FLAVONIDES GERAL: dissolver alguns miligramas do
extrato seco, em 10mL de Metanol, filtrar se necessrio. Adicionar V
gotas de HCl concentrado e raspas de Magnsio. Resultado: o
surgimento de uma colorao rsea na soluo indica reao positiva. POR
CLASSES: dissolver alguns miligramas do extrato seco em 20mL de gua
destilada e filtrar se necessrio. Transferir para trs tubos de
ensaio, 3mL da soluo (para cada tubo). Acidular um a pH 3,
alcalinizar os dois restantes a pH 8.5 e 11.
Resultado:CONSTITUINTES ANTOCIANINAS E ANTOCIANIDINAS FLAVONAS,
FLAVONIS E XANTONAS CHALCONAS E AURONAS FLAVANONIS COLORAO EM MEIO
CIDO pH 3 VERMELHA ________ VERMELHA ________ ALCALINO pH 8.5 LILS
__________ __________ __________ ALCALINO pH 11 AZUL PRPURA AMARELA
VERMELHO PRPURA VERMELHO LARANJA
Obs: a presena de um constituinte pode mascarar a cor indicativa
da presena de outro.
LEUCOANTOCIANIDINAS, CATEQUINAS E FLAVANONAS: em dois tubos
adicione 3mL da soluo preparada anteriormente, acidule o primeiro
com soluo de HCl a pH 1 - 3 e alcalinize o outro a pH 11 com soluo
de NaOH. Aquea-os com auxlio de uma
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lmpada de lcool durante 2 3min, cuidadosamente. Observe
modificaes na colorao, comparando com os tubos utilizados no teste
anterior. Resultados:CONSTITUINTES LEUCOANTOCIANIDINAS CATEQUINAS
(TANINOS CATQUICOS) FLAVANONAS COLORAO EM MEIO CIDO VERMELHA PARDO
AMARELA _____________ ALCALINO __________ __________
VERMELHOALARANJADO
FLAVONIS, FLAVANONAS, FLAVANONIS E XANTONAS: transferir para um
tubo de ensaio, 3mL da mesma soluo extrativa usada no teste
anterior e acrescentar alguns miligramas de Magnsio em raspas, e
0,5mL de HCl concentrado. Aguarde o termino da efervescncia, e
observe por comparao a mudana na colorao em relao aos tubos
acidificados dos testes anteriores. Resultado: o aparecimento ou
intensificao da cor vermelha, indicativo da presena dos metablitos
a cima citados. ALCALIDES Dissolver alguns miligramas do extrato
seco em 5mL de soluo de HCl a 5%, filtrar se necessrio. Separar
quatro pores de 1mL em tubos de ensaio, e adicionar gotas dos
reativos abaixo: a) Reativo de Bouchardat, RESULTADO: precipitado
laranja avermelhado b) Reativo de Dragendorff, RESULTADO:
precipitado vermelho tijolo c) Reativo de Mayer, RESULTADO:
precipitado branco d) Reativo de Bertrand, RESULTADO: precipitado
branco PURINAS Numa cpsula de porcelana, juntar alguns miligramas
do extrato seco, III gotas de soluo de HCl 6N e duas gotas de H2O2
concentrado (30%). Evaporar em BM. Deve haver formao de um resduo
corado de vermelho. Juntar III gotas de soluo de NH4OH 6N.
Resultado: o surgimento de colorao violeta, indica reao positiva.
GLICOSDIOS CARDACOS a) Dissolver alguns miligramas do extrato seco
em 5mL de Metanol. Filtrar se necessrio. Separar em duas pores de
2mL cada e adicionar gotas do reativo de KEEDE. Resultados: Colorao
azul ou violeta indica reao positiva. b) Soluo de nitroprussiato de
sdio a 5% : adicionar III gotas de soluo recente Nitroprussiato de
Sdio e III gotas de soluo de hidrxido de sdio 2N. Resultado:
colorao roxa intensa, indica reao positiva.
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CATEQUINAS Tcnica 1:Dissolver alguns miligramas do extrato seco
em 3mL de Metanol. Filtrar se necessrio. Juntar 1mL de soluo aquosa
de Vanilina a1% e 1mL de HCl concentrado. Resultado: o surgimento
de uma colorao vermelha intensa indica reao positiva. Tcnica 2:
Embeber um palito de fsforo na soluo (extrato seco + Metanol ),
evapore at secar, e umedea em HCl concentrado. Seque ao calor de
uma chama forte, evitando sua carbonizao. Resultado: o aparecimento
de cor vermelha, indica presena de catequinas. DERIVADOS
BENZAQUINONAS; NAFTOQUINONAS E FENANTRAQUINONAS: Dissolver alguns
miligramas do extrato seco em 3mL de Metanol. Filtrar se necessrio.
Adicionar II gotas de Na2CO3 a 25%, II gotas de Formaldeido a 4% e
II gotas de o-dinitrobenzeno a 5%. Aquecer a mistura em BM.
Resultado: colorao violeta, indica reao positiva.
SESQUITERPENOLACTONAS E OUTRAS LACTONAS Dissolver alguns miligramas
do extrato em 3mL de Metanol e filtrar se necessrio. Adicionar XII
gotas de soluo alcolica de Cloridrato de Hidroxilamina a 10% e duas
gotas de soluo metanlica de KOH a 10%. Aquecer suavemente em BM
durante 2min. Em seguida esfriar e acidificar com soluo de HCl a
1N. Adicionar I gota de FeCl 3 1%. Resultado: o aparecimento de
colorao violeta, indica reao positiva. * Outra tcnica (soluo
pulverizadora) Dissolver alguns miligramas do extrato em lcool
Metlico. Aplicar atravs de um capilar, sobre uma folha de papel
filtro, de modo a formar uma pequena mancha. Utilizar a tcnica a
seguir para revelao. PULVERIZAO: pulverizar com a soluo I, secar
brevemente em temperatura ambiente, e em seguida, pulverizar com a
II. Resultado: o aparecimento de colorao violeta, indica reao
positiva. ESTERIDES E TRITERPENIDES Dissolver alguns miligramas do
extrato seco em 10mL de Clorofrmio. Filtrar sobre carvo ativado.
Transferir o filtrado para um tubo de ensaio completamente seco.
Adicionar 1mL de Anidrido Actico e agitar suavemente, em seguida,
adicionar cuidadosamente, III gotas de H2SO4 concentrado. Torne a
agitar suavemente. Resultado: observe se h rpido desenvolvimento de
cores, que vo do azul evanescente, ao verde persistente que indicam
resultado positivo. Obs.: cuidado, pode haver projeo durante a
agitao.
AZULENOS Dissolver alguns miligramas do extrato seco em 2mL de
Clorofrmio. Filtrar se necessrio. Concentrar at 0,5mL em BM e
adicionar 2,5mL da sol. de pdimetilaminobenzaldedo. Aquecer em BM
durante 5min. Aps esfriar, em um funil de
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decantao, agitar com 10mL de ter de Petrleo. Quando as duas
fases estiverem distintas, observe a fase aquosa. Resultado: Quando
h presena de proazulenos, a fase aquosa adquire colorao azul, porm,
quando estes esto em pequena quantidade, a colorao observada
esverdeada. Outra tcnica: Durante o desenvolvimento do perfil
cromatogrfico, borrifar a amostra eluida com a soluo de
p-dimetilaminobenzaldedo, abandonar sob a luz durante 5 min, em
seguida, observe. Resultado: O surgimento de uma mancha azul-claro,
indica reao positiva. CAROTENIDES Tcnica 1: dissolva alguns
miligramas do extrato seco em 3mL de clorofrmio. Filtrar se
necessrio. Juntar 2mL de Clorofrmio saturado com Tricloreto de
Antimnio. Resultado: o aparecimento de colorao azul, indica reao
positiva. Tcnica 2: substitua o clorofrmio saturado, por gotas de
cido Trifluoractico. Resultado: a observao de colorao azul, indica
reao positiva. Obs.: este tratamento serve para dissolver os
pigmentos amarelos que mascaram a cor azul. DEPSDIOS E DEPSIDONAS
Dissolver alguns miligramas do extrato seco em 5mL de ter Etlico.
Filtrar se necessrio. Evaporar todo o ter em BM, juntar ao resduo
3mL de Metanol. Agitar e adicionar III gotas de soluo de FeCl3 a
1%. Resultado: o aparecimento de colorao verde, azul ou cinza,
indica reao positiva. DERIVADOS DA CUMARINA Dissolver alguns
miligramas do extrato seco em 5mL de ter etlico, concentrar em BM
at 0,5mL. Em papel filtro, aplique gotas da soluo etrea, de modo a
formar duas manchas de aproximadamente 1cm de dimetro cada. A uma
destas, juntar 1 gota de soluo de NaOH a 1N. Cubra a metade da
mancha com papel escuro, e exponha a outra metade a luz
ultravioleta. Descubra e compare. Resultado: fluorescncia azul na
parte exposta da mancha, indica reao positiva. ANTRAQUINONAS a)
Tcnica 1: dissolver alguns miligramas do extrato seco em 5mL de
Tolueno. Filtrar se necessrio. Adicionar 2mL de soluo de NH4OH 10%,
agitar suavemente. Resultado: o aparecimento de colorao rsea,
vermelha ou violeta na fase aquosa, indica reao positiva. b) Tcnica
2: ferver durante 15min alguns miligramas do resduo, em 10mL de
soluo aquosa de H2SO4 a 10%. Filtrar o lquido ainda quente.
Transferir o filtrado para um funil de decantao, adicionar mais
10mL de gua destilada, e extrair duas vezes com 10mL de Tolueno.
Reunir os extratos tolunicos, e concentrar at 3mL, adicionar a este
3mL de soluo de NH4OH a 10%. Resultado: o aparecimento de colorao
rsea, vermelha ou violeta na fase aquosa, indica reao positiva. 4.
PERFIL CROMATOGRFICO Dissolver uma pequena quantidade do extrato
seco, em solvente apropriado (metanol p. ex.). Aplicar a amostra
dissolvida com o auxlio de um tubo capilar, na base da placa
cromatogrfica e em dois locais como mostra a figura 1.
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Figura 1
Eluir a amostra com eluentes de polaridades crescente (p/ ex.:
Hexano/Acetona (80:20), Clorofrmio/ Metanol (90:10) ou
Clorofrmio/Metanol/ gua (75:20:05). Desenhar a placa em seu tamanho
natural e com todos os detalhes perceptveis em luz visvel. Desenhar
novamente a placa desta vez anotando as observaes feita em cmara de
luz ultravioleta, e finalmente, revelar as substncias da placa com
um reativo geral (Anisaldeido ou sol. de Vanilina) e um especfico.
A placa deve ser novamente desenhada com detalhes.
Amostra
A revelao com os reativos deve ser feita da seguinte forma:
cobrir a placa cromatogrfica, deixando apenas metade dela exposta,
borrifar primeiramente um reativo observar e desenhar, para depois
borrifar o outro. Calcular os Rf quando possvel, como mostra a
figura 2. Figura 2 Geral Especfico Clculo do fator de Reteno (Rf)
Aaaa = H h Rf = fator de Reteno h= distncia percorrida pela
substncia H= distncia percorrida pelo eluente H Rf = h H
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