Aplicações da Proteômica em diversas linhas de pesquisa na área Biomédica Aplicações: - Descoberta de novas drogas, - Estudos em patologia, - Diagnóstico, - Terapias, - Microbiologia, - Bioquímica, - Fisiologia de plantas, - Controle de qualidade.
Aplicações da Proteômica em diversas linhas de pesquisa na
área BiomédicaAplicações:
- Descoberta de novas drogas, - Estudos em patologia, - Diagnóstico, - Terapias, - Microbiologia,- Bioquímica, - Fisiologia de plantas, - Controle de qualidade.
Abordagens em ProteômicaAbordagens em Proteômica
• Proteômica de ExpressProteômica de Expressãoão– EExpressão Diferenxpressão Diferenccialial
• Proteômica FuncionalProteômica Funcional– Interação Proteina-ProteinaInteração Proteina-Proteina– Vias de SinalizaçãoVias de Sinalização– Modificação PósModificação Pós- traducional- traducional
• Proteômica QuantitativaProteômica Quantitativa
-
Caracterização de
proteínas
BIOINFORMATICA
LABIOS IQ-UFRJ
UMGIBf-UFRJ
LQPPUENF
DBqMEDUFRJ
LTFIOCRUZ
2D
2D
2D
2D
2D
REDE PROTEÔMICA DO RIO DE JANEIROCONFIGURAÇÃO ATUAL - 2005
LBFPUERJ
BIOQUERJ
2D
2DGENUFRJ
2D
Q-TOF - IBqM
MALDI TOF -IBf
Q-TOF - UENF
LABORATORIOS. ASSOCIADOSRMN
ESPEC MASSA – PUCAGROBIOLOGIA-EMBRAPA
INCa
MALDI TOF-TOFIOC
Análise proteômica comparativa de diferentes extratos proteicos
isolados de cepas mutantes e selvagem de C. glabrata
Penha, C. V. L., Bouchara, J. F., Lopes-Bezerra, L. M.
Candida glabrata
Maior obstáculo nas infecções por C. glabrata
resistência adquirida a terapias por azólicos Espécies mais comuns causadoras da candidíase invasiva
Espécies Frequência
Candida albicans 50%
Candida tropicalis 15-30%
Candida glabrata 15-30%
Candida parapsilosis 15-30%
Candida krusei ~1%
Candida lusitaniae ~1%
Potenciais mecanismos moleculares de resistência aos antifúngicos
Alterações no processamento intracelular do antifúngicoModificaçãoDegradação
Alterações da enzima alvoMutação pontualSuperexpressãoAmplificação gênicaConversão gênica ou recombinação mitótica
Alterações de outras enzimas na via da biossíntese do ergosterol
Bombas de efluxoTransportadores ABC“Major” Facilitadores
Objetivo
Contribuir para o entendimento das prováveis modificações envolvidas nas respostas adaptativas dos
fungos frente aos medicamentos antifúngicos
Cepa 1085 S = selvagem Cepa 178 = mutante, resistente a azolicos
Candida glabrata
Parede celular
Microssoma
Citoplasma
Proteínas
Cepa 1085 S = selvagem
Cepa 178 = mutante, resistente a azolicos
Culturas
Cepa 1085 s = selvagem
Cepa 178 = mutante
PMSFEDTAPepstatinaRNAse
Candida glabrata
braunBilhas de
vidro
“ ’’
Centrifugação:
2’ 500 g eliminação das bilhas de vidro
5’ 1000 g pellet - C1 = parede
30’ 12000 g pellet - C2 = mitocôndria
60’ 75000 g pellet - C3 = microssoma
Sobrenadante = proteínas do citosol C4
Solubilização de proteínasC1
C3
“ ’’
on
Sonificação - 3 ciclos de 15’
Chaps
Uréia
DTT
Dosagem de Proteínas = Bradford
C1, C3 e C4
C2
(Strip 18 cm -Gel 12%)
A) 1085-S
IEF
S
DS
3,0 11,0 pI
Mr(kDa)250150
100
37
25
B) 1085-BET
S
DS
IEF
3,0 11,0 pI
Mr(kDa)250150
100
37
25
Eletroforese Bidimensional
Spots 1085-S 1085-BET
Matching Spots
187 110 168
Two-dye overlay (1085-S/1085-BET)
1085-S = azul
1085-BET= vermelho
1 2 3 4 5 67 8 9
10 11 12 13 14 15 16 17 61
58
18 19 2021 22 2324 62
2928272625
32
3331305960
5763
34
35
36 37
56
41 42403938
43 44 45 46 47 48
4950
51
52 53 5455
Identificação por MALDI TOF/TOF Piruvato decarboxilase
Fosfohexose isomerase
Enolase
Frutose 1,6 bifosfato aldolase
Gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase
3,0 IEF 11,0
“Expressão diferencial de proteínas da parede celular de leveduras e conídios
do fungo dimórfico Sporothrix schenkii”
In collaboration with the Department of Cellular Biology and Genetics
UERJ
- etiological agent of feline and human sporotrichosis
- most common Latin America mycosis
- can affect tissues and internal organs
- dangerous to immunosupressed individuals
- morphological transition is a key factor in virulence
GOALS
- understand the physiopathology of disseminated sporotrichosis
- identify virulence factors/ molecular biomarkers
PREMISES
2D-PAGE dos CWPs obtidos da parede celular de diferentes formas do S.
schenckii3,0 IPG 10,0 3,0 IPG 10,0kDa
190,0
120,0
60,0
50,0
40,0
25,0
15,0
Morfologia n de spots Percentual de proteí nas por faixa de pH a
pI 3,0 – 5,0 pI 5,0 – 7,0 pI 7,0 – 10,0
Levedura 233 18,4% 58,0% 23,6%
Conídio 112 29,5% 54,5% 16,0%
Tabela 1- Quantificação das proteínas expressas (spots ) na parede celular da forma de levedura e de conídios nos géis 2D, e sua distribuição percentual segundo os respectivos pontos isoelétricos.
a - foram utilizadas tiras de focalização isoelétrica em gradiente de pH de 3,0 a 10,0.
Morfologia n de spots Percentual de proteí nas por faixa de pH a
pI 3,0 – 5,0 pI 5,0 – 7,0 pI 7,0 – 10,0
Levedura 233 18,4% 58,0% 23,6%
Conídio 112 29,5% 54,5% 16,0%
Tabela 1- Quantificação das proteínas expressas (spots ) na parede celular da forma de levedura e de conídios nos géis 2D, e sua distribuição percentual segundo os respectivos pontos isoelétricos.
a - foram utilizadas tiras de focalização isoelétrica em gradiente de pH de 3,0 a 10,0.
141 3232
N de Spots
Lev Con
141 3232
N de Spots
Lev Con
AB
Interseção
4,0 IPG 7,0
SD
S
Two-dye overlay (Levedura/Conídio)
levedura - azul
conídio - vermelho
O QUE FOI ENCONTRADO UTILIZANDO PROTEÔMICA?
O QUE FOI ENCONTRADO UTILIZANDO PROTEÔMICA?
SÓ ISSO?!
Uma visão para o futuro....
produtos metabólicosfragmentos gerados enzimáticamente
SELDI - Surface Enhanced Laser Desorption Ionization
Geração sistemática de anticorpos monoespecíficos para explorar o proteoma humano.
- Análise de padrões de expressão protéica e localização subcelular;
- Investigação de vias de interação;
- Variantes resultantes de splicing;
- Modificações pós-traducionais.
> 400 genes humanos
100-150 aa consecutivos
PERSPECTIVAS
Conjunto de proteínas humanas não-redundantes (proteína representativa por locus genético) estimado em 20 a 25 mil;
Produção de milhares de msAb possível por ano com essa nova técnica;
Previsão para completar o projeto em alguns anos.