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Franco, Alicia Y.; Longart, Marins
Aplicaciones de la protena verde fluorescente (GFP) en la
biologa celular y en la
visualizacin del sistema nervioso
RET. Revista de Estudios Transdisciplinarios, vol. 1, nm. 2,
julio-diciembre, 2009, pp.
84-96
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RET. Revista de Estudios Transdisciplinarios Vol. 1. N 2. Serie
verde | Caracas, julio- diciembre 2009
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Aplicaciones de la protena verde fluorescente (GFP) en la
biologa celular y en la visualizacin del sistema nervioso
Applications of Green Fluorescent Protein (GFP) in Cell Biology
and Visualization of the Nervous System.
Alicia Y. Franco,* Marins Longart*
La medusa bioluminiscente Aequorea victoria provee una
herramienta til para la biologa celular, una protena que tiene la
propiedad de emitir luz verde. La protena verde fluorescente (GFP,
por sus siglas en ingls) ha sido modi-ficada para emitir colores en
muchas y diversas longitudes de onda. La GFP, junto con protenas
derivadas de otros organismos, ofrece nuevas variedades de protenas
fluorescentes. Entre otras caractersticas que la hacen, sin duda,
especial, la protena fluorescente destaca por no necesitar
intermediarios para su expresin en cualquier organismo vivo, ser
susceptible de modificacin para mejorar su intensidad, cambiar
colores de emisin, construir quimeras con otras protenas y servir
de gen reportero, sensor bioqumico y medidor sensible de pH intra e
intercelular, etc. Desde su descubrimiento en 1962, la protena ha
sufrido muchos cambios y sus aplicaciones involucran todas las reas
de la biologa. La neurociencia ha sido una de las ms beneficiadas
por los mltiples usos de la GFP. Uno de ellos ha sido marcar
neuronas in vivo hasta con 90 colores fluorescentes, lo que ha
permitido visualizar las redes de la arquitectura neural de un
mismo organismo de una manera sin precedentes. La presente revisin
bibliogrfica se enfoca en la descripcin de parte del descubrimiento
de la protena GFP, as como de sus variantes, principales
aplicaciones y su actual utilizacin en la visualizacin de neuronas
del sistema nervioso central.
Palabras claveGFP, GFP supereclptica, GFP fotoactivable,
aquorina
KeywordsGFP, supereclptic GFP, fotoactivable GFP, aequorin.
The bioluminiscent jelly fish Aequorea victoria provides a
powerful tool to cell biology, a protein that fluo-resces with the
emission of green light. The green fluorescent protein (GFP) has
been modified to emit in many different wavelengths. The GFP,
together with other proteins derived from different organisms,
of-fers an immense variety of fluorescent proteins. This protein
shows features that make it special; no other factors are needed
for its expression in any living organism, it can be modified to
improve its intensity, to change emission colors, to construct
chimera with other proteins, it can also be used as a reporter
gene, biochemical sensor, sensitive intra and intercellular pH
meter, etc. Since the discovery of the protein in 1962 it has
experienced many changes and its applications extend to all areas
in biology. Neuroscience is one of the areas more benefited with
the application of GFP. One of these applications involves the in
vivo labeling of neurons with multiple fluorescent colors which
allow visualizing the neural network architecture as never seen
before, up to 90 different colors in a same organism. In the
present work, we performed a review that goes from the discovery of
GFP, its variants, main applications and to its use in the
visualiza-tion of neurons in the central nervous system.
Universidad Simn Bolvar, Decanato de Estudios Profesionales.
Unidad de Neurociencias, Centro de Biociencias y Medicina
Molecular, Instituto de Estudios Avanzados, Caracas, Venezuela
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ALICIA Y. FRANCO Y MARINS LONGART.
Historia de la GFP
En el ao 1962, Shimomura, Johnson y Saiga publicaron sus
hallazgos sobre el aislamiento de un extracto obteni-do de la
medusa bioluminiscente Aequorea victoria, del que lograron obtener
a su vez dos protenas: la aquorina (nombre derivado de la especie
con que trabajaban) y la protena verde (Shimomura et al., 1962;
Shimomura, 2005). Aunque el objetivo principal de esa investigacin
era la obtencin de aquorina, protena dependiente del calcio, estos
investigadores identificaron de manera accidental una segunda
protena de color verde (Shimomura et al., 1962; Shimomura, 2005).
Se determin que la protena verde tena un pico en el espectro de
emisin a 508 nm, cercano al que emite el tejido vivo de la medusa,
mien-tras que la aquorina pura lo tena a 470 nm en la zona azul del
espectro visible; esto indicaba cierta interaccin entre las dos
protenas. De estas observaciones se deter-min que la protena verde
converta la emisin azul de la aquorina en verde brillante mediante
un proceso de transferencia de energa, sin emisin y reabsorcin de
radiacin (Tsien, 1998; Fernandez et al., 2006).En 1969, Morin y
Hastings (citado por Shimomura, 2005) la llamaron por primera vez
protena verde fluorescen-te (GFP) por sus caractersticas
luminiscentes emitidas en cierta longitud de onda. En 1974 esta
protena fue fi-nalmente purificada y cristalizada (Morise et al.,
1974; Tsien, 1998). En el ao 1992 fue secuenciada por primera vez
mediante tcnicas de cDNA (Prasher et al., 1992); pero no fue hasta
1994 que Chalfie (Chalfie et al., 1994), por un lado, e Inouye y
Tsuji (citado por Tsien, 1998), por otro, lograron conservar su
fluorescencia en un cul-tivo con otros organismos procariticos y
eucariticos. Con ello demostraron que el gen de la GFP por s solo
contiene toda la informacin necesaria para sintetizar el cromforo
postraduccionalmente y que no requiere la accin de enzimas
especficas de la medusa Aequorea victoria.
Caractersticas de la GFP
La protena verde fluorescente presenta dos picos de excitacin:
el primero, cercano a los 395 nm; el segun-do, de 475 nm, y tambin
dos picos de emisin: si es excitada a los 395 nm su pico de emisin
ser a los 508 nm, y si, por el contrario, es excitada a 475 nm,
entonces la emisin ocurrir a 503 nm (Tsien, 1998), cuando esto
ocurre la protena capta mayor luz fuera del espectro vi-
Introduccin
La fluorescencia es la emisin de radiacin electromag-ntica en la
regin visible por parte de una molcula o tomo luego de la absorcin
inicial de un fotn. (Chang, 2002). El descubrimiento de protenas
que tienen capaci-dad fluorescente (protenas fluorescentes, en
ingls, fluo-rescent proteins o FP), nativas de organismos acuticos
que poseen bioluminiscencia, ha sido una revolucin en la biologa
celular. Existen protenas fluorescentes natu-rales que emiten su
fluorescencia en rangos de distintos colores, como verde y rojo;
ste ltimo proveniente del coral Discosoma sp. (Shaner et al.,
2003). Otras protenas verdes fluorescentes se atribuyen a
organismos como el cnidario Renilla reniformis (Ward et al., 1979;
Loening et al., 2007). Sin embargo, la protena proveniente de la
medusa Aequorea victoria, que han denominado protena verde
fluorescente nativa (Green Fluorescent Protein, GFP, por sus siglas
en ingls), ha sido la que ms impacto dentro de la comunidad
cientfica ha tenido; de hecho, en octubre de 2008, los
investigadores Osamu Shimo-mura, Martin Chalfie y Roger Tsien
fueron galardona-dos con el Premio Nobel de Qumica por sus trabajos
con la protena verde fluorescente. El descubrimiento tuvo gran
impacto cuando se observ que la GFP con-servaba su propiedad
fluorescente incluso dentro de or-ganismos distintos al de la
medusa, lo que representaba una gran ventaja respecto a otros tipos
celulares (Chalfie et al., 1994; Shaner et al., 2007).En la biologa
celular, estas protenas permiten obtener datos sobre localizacin,
dinmica y redes de interaccin molecular con otras protenas de gran
resolucin tem-poral y espacial (Tsien, 1998). A estas protenas se
les considera marcadores de localizacin (genes reporteros) porque
permiten el monitoreo de los cambios bioqu-micos dentro y entre las
clulas, o de cualquier otro fe-nmeno dinmico que se desee observar
sin necesidad de tincin o fijacin de la clula. Para la neurociencia
es relevante, entre muchas otras razones, porque favorece el
estudio de las redes neuronales y de las conexiones sinpticas in
vivo. El presente trabajo tiene como objetivo desarrollar una breve
historia de la protena verde fluorescente y descri-bir algunas de
sus aplicaciones, especialmente las utili-zadas para visualizar
clulas del sistema nervioso.
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RET. Revista de Estudios Transdisciplinarios Vol. 1. N 2. Serie
verde | Caracas, julio- diciembre 2009
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absorbancia y fluorescencia (Heim et al., 1994).Al analizar la
estructura cuaternaria se hizo patente que las altas
concentraciones de GFP resultan de un fen-meno de agregacin de
subunidades de la misma prote-na y de otras protenas de la
membrana, conocido como dimerizacin, que inhibe la fluorescencia o
la reduce por debajo de la intensidad mnima requerida para ser
visible. Es necesario 1 M (aproximadamente 105 copias en un volumen
celular de 1-2 pL) de GFP correctamente plegada (Tsien, 1998) para
que la protena pueda emitir luz. En el ao de 1996, Yang y sus
colaboradores (Yang et al., 1996) establecieron que en la formacin
de la interfase de dimerizacin intervienen residuos hidrofbicos
como Leu (206), Leu (221) y Phe (223), y residuos hidroflicos como
Tyr (39) y Glu (142), entre otros. El fenmeno de dimerizacin pudo
ser solventado al crear una mutacin en el residuo 206. En la figura
3 se muestran las imge-nes del GFP dimerizado y del GFP monmero
(Zhang et al., 2002). Otra caracterstica de capital importancia de
la GFP fue la observada por Chalfie y colaboradores, quienes al
in-sertar ADN complementario en un vector de expresin en clulas
procariotas (Escherichia coli) y eucariticas (Caenorhabditis
elegans), pudieron comprobar que la
sible y la convierte en luz visible verdosa. La protena est
conformada por 238 aminocidos, cuya secuencia, descifrada por
Prasher y sus colaboradores (Prasher et al., 1992), se muestra en
la figura 1.
La estructura terciaria de la protena consiste en un ba-rril
beta de 40 , formado por once hojas antiparalelas, acompaadas de
una hlice con el cromforo al centro de dicha estructura, tal como
se muestra en la Figura 2 (Ormo et al., 1996).La GFP presenta un
cromforo p-hidroxibenzilidenei-midazolinona (Prasher et al., 1992),
sujeto a la hlice dentro del barril. Dicho cromforo se forma por la
ci-clizacin espontnea y la oxidacin de los residuos 65 67,
correspondientes a los aminocidos Ser 65 Tyr 66 Gly 67 (subrayados
en la figura 1) de la protena nativa, y es el responsable de la
emisin de luz verde. Las se-ries de residuos de aminocidos estn
acompaados de grupos polares que propician la presencia de molculas
de agua, adyacentes al cromforo (Heim et al., 1994). La sntesis del
cromforo comienza con el plegamiento de la protena en su
conformacin inicial y la formacin de imidazolina por un ataque
nucleoflico del grupo amino de Gly-67 sobre el carbonilo del
residuo 65, para produ-cir deshidratacin. Al final, el oxgeno
molecular quita el hidrgeno del enlace C-C del residuo Tyr 66 y
crea un anillo fenlico con el imadazlico, el cual producir
!
MSE SER LYS GLY GLU GLU LEU PHE THR GLY
VAL VAL PRO ILE LEU VAL GLU LEU ASP GLY
ASP VAL ASN GLY HIS LYS PHE SER VAL SER
GLY GLU GLY GLU GLY ASP ALA THR TYR GLY
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VAL THR THR PHE SER TYR GLY VAL GLN CYS
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!FIGURA 1. Secuencia aminoacdica de la GFP nativa. Los
aminocidos subrayados son los que conforman el cromforo (Tomado de
Prasher et al., 1992).
FIGURA 2. Esquemas de la forma terciaria de la protena nativa
GFP: A) Esquema original tomado de Ormo et al., 1996, obsrvese la
forma de
barril (cilndrica) de la protena; B) Se observan las hojas
(color verde) dispuestas diagonalmente para formar la estructura
cilndrica y el cro-mforo en el centro del barril (color naranja);
C) Vista superior de la GFP
donde se observa la hlice (fucsia) y las hojas (mostaza).
Esquemas tomados de la pgina web del laboratorio del Dr. Tsien,
disponible en: http://www.tsienlab.ucsd.edu/Default.htm
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ALICIA Y. FRANCO Y MARINS LONGART.
Muchas otras FP que exhiben tonos desde el anaranjado hasta el
rojo no derivan de la GFP de A. victoria, sino de una protena
fluorescente roja obtenida de un coral no bioluminiscente (Matz et
al., 1999), por lo que no se desarrollarn en el presente trabajo.De
todas las variantes hasta ahora obtenidas, la de ma-yor uso
(actualmente producida por la casa comercial Clontech) es la EGFP
(por sus iniciales en ingls, en-hanced green fluorescent protein),
la cual es una versin mejorada de la GFP nativa. Este fue el primer
grupo de FP que combinaba un alto brillo con slo un pico de
excitacin (Tsien, 1998). La mutacin ms comn, que causa ionizacin
del fenol en el fluorforo, es el rempla-zo de Ser 65 por Thr,
tambin llamada S65T. El pico de absorbancia ocurre a 489 nm y el de
emisin a 509 nm, de ah su fluorescencia verde (Patersonn et al.,
1997). Las variantes EGFP muestran un decremento paulatino del
fotoblanqueamiento, en contraste con la GFP nativa que muestra un
incremento inicial y luego un rpido descen-so en la fluorescencia
(Patterson et al., 1997). Dentro de las ventajas que presenta la
variante EGFP, se encuen-tran una oxidacin cuatro veces ms rpida
que la de la GFP nativa, una formacin del cromforo mucho ms rpida y
una produccin de fluorescencia tambin ms rpida y con mayor
estabilidad, cuando el plegado se ex-presa a temperatura ambiente y
a 37 C (Tsien, 1998). La protena fluorescente azul BFP (del ingls,
Blue Fluorescent Protein) fue la primera variante creada y re-sult
de una mutacin del aminocido 66 Tyr por His (Y66H). Presenta un
pico de excitacin a los 384 nm y de emisin a los 448 nm. Esta
variante inicialmente re-port problemas con la velocidad de
plegamiento y bajo rendimiento cuntico (Sharner et al., 2007). Esta
variante tambin tiene versiones mejoradas, como EBFP (del in-gls,
enhanced BFP), con mayor brillo y fotoestabilidad, obtenida por una
mutacin de la Y145F (Tsien, 1998), y SBFP2 (del ingls, strongly
enhanced BFP), con aun me-jor brillo y estabilidad que la EBFP,
que, sin embargo, permite monitorear las clulas vivas durante un
tiempo considerablemente mayor que el que ofrecen el resto de las
protenas (Shaner et al., 2007). Dentro de las ventajas que presenta
esta familia de FP azules est su utilidad como marcadores dobles
(Sharner et al., 2007).La variante protena fluorescente azul-verde
CFP (del ingls, Cyan Fluorescent Protein) presenta un espectro de
emisin de fluorescencia entre los 470 y los 500 nm,
aproximadamente. Dentro de las mutaciones introduci-das se
encuentran N146I, M153T y V163A, como versio-nes mejoradas (ECFP),
con un pico de excitacin a los 452 nm y de emisin a los 505nm, las
cuales presentan
Aequorea victoria no requera sustratos exgenos ni co-factores
para producir fluorescencia. El trabajo de Chal-fie y su equipo
fue, adems, el primero atribuir a esta protena la cualidad de
marcador gentico y localizador de protenas en organismos vivos
(Chalfie et al., 1994).
Variantes de la GFP
Se conocen decenas de protenas mutadas derivadas de la GFP de
Aequorea victoria (nativa), cuyas alteraciones producen propiedades
fsico-qumicas distintas a la ori-ginal, y en las cuales se ha
mejorado su expresin (ma-yor fluorescencia, cambios en el rango de
excitacin y emisin; cintica de oxidacin del cromforo,
fotoesta-bilidad, etc), pero sin modificar el comportamiento
ge-neral de la protena (Knee et al., 1998). La clasificacin de las
variantes de la GFP son diversas porque toman en cuenta distintas
caractersticas, como la estructura del cromforo (Zacharias et al.,
2006), el rango de emisiones en el espectro visible (Sharner et
al., 2007) y las aplicacio-nes como sondas intracelulares
(Miyawaki, 2003). La creacin de estas mutantes fue originada por la
ne-cesidad de frenar la tendencia de la protena a dimerizar, porque
esa propensin limitaba sus aplicaciones in vivo (Fernandez et al.,
2006). De esta manera, la GFP nativa fue modificada para obtener
variantes con emisin en diferentes rangos espectrales y estabilidad
en la forma cuaternaria de la protena (Heim 1994; Ormo, 1996). A
continuacin se mencionan las mutantes ms impor-tantes y, en el
Anexo 1, se muestra un cuadro resumen.
FIGURA 3. El dmero de GFP se forma por altas concentraciones de
dicha protena y el monmero fue producido por una mutacin en el
aminocido 206, que suprime la tendencia a dimerizar. Tomado y
modi-ficado de Zhang et al., 2002.
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RET. Revista de Estudios Transdisciplinarios Vol. 1. N 2. Serie
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nativa es poco sensible a los cambios de pH en el rango cercano
al fisiolgico (Ward, 1988, citado por Ashby et al., 2004) y que no
desarrolla fluorescencia en organelas cidas como lisosomas,
endosomas o el aparato de Gol-gi, si los valores de pKa son
cercanos al 4,5 (Tsien, 1998). Las versiones mutadas de EGFP
presentan mejoras con respecto al fotoblanqueado (disminucin hasta
de un 50%), pero an insuficientes para aquellos estudios que
requieran mayor sensibilidad (Ashby et al., 2004)El proceso de
sensibilidad al pH por parte de la GFP fue propuesto y probado a
finales de 1997 por dos grupos de investigadores (Kneen et al.,
1998 y Palm et al., 1997, citado por Ashby, 2004), los cuales
propusieron que la sensibilidad al pH es consecuencia de la
protonacin y desprotonacin de importantes residuos aminoacdi-cos en
el centro del cromforo, el cual es crticamente sensible y, en
consecuencia, susceptible de emitir o no fluorescencia, incluso al
variar un protn, sobre todo en condiciones acdicas (Ashby,
2004).Nuevas mutaciones, con sensibilidad diferenciada al pH,
pueden ser utilizadas para medir los ambientes in-tracelulares, el
trfico de protenas (tanto por comparti-mentos subcelulares como en
el citosol) y las cercanas de la membrana celular. De hecho, en el
ao 1998, fue-ron creadas dos variantes de GFP, llamadas pHluorins
(Miensenbock et al., 1998). La primera, denominada pHluorins
radiomtrica, muestra cambios reversibles de excitacin entre pH 7.5
y 5.5, y la otra, pHluorins eclp-tica, decrece su absorbancia
cuando el pH disminuye y, por debajo de 6.0, con el pico de
excitacin a 475 nm, no est presente y la protena pierde su
fluorescencia, mien-tras que a pH 7,4 se observa el mximo de su
fluorescen-cia (Miensenbock et al., 1998). La pHluorin eclptica
est
altos niveles de brillo, fotoestabilidad y poca sensibilidad a
los cambio de pH, muy tiles para algunas estrategias de microscopia
de fluorescencia, como FRET (que expli-caremos ms adelante) y
marcajes dobles. (Tsien, 1998; Sharnert et al., 2007). La protena
fluorescente amarilla YFP (del ingls, Yellow Fluorescent Protein)
fue diseada luego de dilucidar la estructura cristalizada de la
GFP, que revel que el re-siduo Thr 203 estaba cerca del cromforo
(Ormo et al., 1996). La mutacin de este residuo a Tyr otorg mayor
estabilidad al cromforo en su estado excitado, con un pico a los
514 nm y un pico de emisin a los 527 nm (Patterson et al., 1997).
Sin embargo, la YFP presenta sensibilidad a cambios de pH y a los
haluros, por lo que las versiones ms utilizadas de esas PF son la
mCitrine, mVenus, SYFP y YPet (en ingls,Yellow fluorescent pro-tein
for energy transfer; en espaol, Protena Fluores-cente Amarilla para
Transferencia de Energa), las cua-les presentan ms brillo que YFP y
mayor resistencia a los ambientes cidos (Patterson et al., 1997).
Las variantes de la GFP no slo establecen cambios en los espectros
de emisin y absorcin (al proporcionar distintos colores), o mejoras
en la estructura del crom-foro para darle mayor estabilidad a la
protena, tambin aportan otras caractersticas fsicas que permiten
eva-luar las actividades celulares, como sensibilidad al pH,
concentraciones de calcio, etc. (Miyawaki, 2003). La GFP
fotoactivable posee la particularidad que lue-go de una radiacin
intensa a 413 nm, que le produce apagamiento, incrementa su
fluorescencia 100 veces cuando es activada con luz a 488 nm y
prolonga su es-tabilidad por das bajo condiciones aerbicas
(Patterson et al., 2002). Al estudiar algunas variantes, como
indica-dores no invasivos de pH intracelular, Kneen y
colabo-radores, en 1998, observaron, por medio de mediciones con
microscopios de fluorescencia acoplados a cmaras CCD, que la GFP es
sensible a cambios en la acidez del medio en una unidad de pH, en
aproximadamente el 50% de las clulas. Tambin observaron que la
fluores-cencia responde de forma reversible a cambios rpidos de pH
tanto in vivo como in vitro, lo que constituye la nica ventaja de
las mutaciones estudiadas (GFP-S65T; Y66H; T203I; F64L). Comparada
con otros indicadores qumicos, la GFP fotoactivable tiene baja
toxicidad para la clula por su inercia qumica y por su
procedimiento no invasivo. Segn estos autores, un indicador de pH
fluorescente ideal debe tener alta sensibilidad, una respuesta
rpida ante los cambios de pH y buenas propiedades pticas (Kneen, et
al., 1998). Tambin se conoce que la GFP
FIGURA 4. Espectro de pHluorins ecliptico a pH mayores y menores
de 6.0. Eje de las X, longitud de onda de excitacin. Eje de las Y,
intensidad de fluorescencia. Consultado en Enero del 2009, en World
Wide Web: http://www.bristol.ac.uk
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ALICIA Y. FRANCO Y MARINS LONGART.
protenas. Esta capacidad se ha denominado Transfe-rencia de
energa de resonancia fluorescente (del ingls, Fluorescence
Resonance Energy Transfer, FRET. Zacco-lo, 2004). El FRET es un
fenmeno mecnico cuntico que ocurre cuando existe transferencia de
energa entre dos fluorforos prximos, generalmente a distancias
menores de 100 , y el espectro de emisin de uno, el fluorforo
donador, se superpone con la emisin del segundo, que acta como
receptor. De esta manera, la excitacin del donador produce la
emisin del receptor con la transferencia de energa (Tsien, 1998), y
la fluo-rescencia del donador (molcula excitada) disminuye,
mientras que la del receptor aumenta (Takanishi et al., 2006).
Otros autores proponen que la distancia para que se produzca la
transferencia de energa puede variar en-tre 2 a 6 nm, si los dos
cromforos estn adecuadamente orientados en el espacio con una
eficiencia mayor al 30% (Zaccolo, 2004). La eficiencia de esta
tcnica del FRET va a depender de la diferencia de energa entre los
fluorforos donante y receptor, lo que implica que la velocidad de
la transferen-cia de energa es proporcional al solapamiento entre
el espectro de emisin del donante y el espectro de absor-cin del
receptor (Fernandez et al., 2006). Al medirlo, la eficiencia de la
transferencia de energa es inversamente proporcional a la sexta
potencia de la distancia entre los dos fluorforos (Takanishi et
al., 2006).Los primeros pares de fluorforos usados para estudiar la
transferencia de energa entre protenas pertenecen a las familias de
las GFP y a las de BFP; sin embargo, las BFP tienen poca duracin ya
que presentan blanquea-miento (Zaccolo, 2004). Actualmente, la
pareja que pre-senta mayores ventajas para este tipo de anlisis son
las mutantes de las familias de las CFP y las YFP, mucho ms
estables que las BFP (Heim et al., 1994). La fuerte dependencia con
la distancia y la ventaja que presenta el poder utilizar el sistema
de medicin en or-ganismos in vivo y en tiempo real han hecho de
FRET una herramienta muy til en estudios biolgicos de proximidad
molecular y de cambios conformacionales (Takanishi et al., 2006).
Tambin ofrece una alta resolu-cin temporal y espacial en el
seguimiento de la interac-cin protena-protena, en cualquier lugar
de la clula, y la cuantificacin del grado de disociacin o de
asocia-cin in situ (Tsien, 1998). Entre las desventajas, podemos
mencionar la necesidad de la correcta orientacin espa-cial de los
fluorforos para que sea eficiente la transfe-rencia de energa, y la
necesidad de controles positivos y negativos (Tsien, 1998).Para
cuantificar FRET se han descrito varias estrategias.
fusionada a un receptor N-terminal de glutamato que le permite
eliminar su fluorescencia al encontrarse con un pH menor de 6.0
(dentro de vesculas intracelulares, por ejemplo), mientras que si
la protena se acerca a la membrana celular, el pH aumenta y se
observa una gran fluorescencia (Miensenbock et al., 1998).
Aplicaciones de las Protenas Fluorescentes (FP)
Son mltiples las aplicaciones de las FP en la ciencia. Dentro de
las ms comunes est su utilizacin como marcador fusionado a
polipptidos o como indicador de estados qumicos-fisiolgicos
intracelulares, en todo tipo de clulas, subcompartimentos celulares
y organis-mos, desde procariotas hasta mamferos. La FP tambin es
til a diversas disciplinas de la biologa y la medicina. Esto se
puede verificar simplemente mediante un bus-cador de artculos
cientficos reconocido, en donde con slo introducir GFP en la
palabra clave, miles de publi-caciones saldrn a la vista.Si la FP
es usada como marcador fusionada a otra prote-na, Tsien la
clasifica como una aplicacin pasiva que slo refleja los niveles de
expresin de la protena diana o la ubicacin subcelular de dicha
protena. Se debe recordar que la FP, al no ser una enzima, resulta
un excelente indicador porque no interfiere con el mecanismo
fisiol-gico de la clula (Tsien, 1998; Fernndez et al., 2006).Si la
FP es unida a otras protenas, en donde la fluores-cencia depende de
las condiciones del medio, se pueden crear sensores capaces de
monitorear procesos comple-jos intracelulares, como actividad y
visualizacin de las seales en cascadas, cambios de pH, calcio,
voltaje, po-tasio, dinmica de segundos mensajeros, activacin
en-zimtica, interaccin protena-protena y cambios con-formacionales,
por lo cual, entonces, seran clasificados como indicadores activos
(Tsien, 1998; Miyawaki, 2003; Zaccolo, 2004). Aplicaciones ms
avanzadas son posibles si se unen las propiedades de las FP a otras
tcnicas, como las de mi-croscopia de fluorescencia para los
estudios en clulas vivas. Estas tcnicas confieren acertadas
ventajas sobre los estudios en tejidos fijados, en los que no se
aprecia la dinmica del sistema que se desea estudiar.
Aplicaciones de las FP en la microscopia de fluorescencia
De todas las aplicaciones mencionadas, la ms frecuen-temente
utilizada es la de sensor bioqumico, que mues-tra la transferencia
de energa por resonancia entre dos
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RET. Revista de Estudios Transdisciplinarios Vol. 1. N 2. Serie
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mtodos cuantitativos o cualitativos de FRAP. Si se de-sea
determinar el coeficiente de difusin de la prote-na, la cantidad de
movimiento aleatorio de la molculas no blanqueadas, la capacidad de
recuperacin mole-cular en una fraccin determinada o la viscosidad
del microambiente en donde est la protena se utilizan los mtodos
cuantitativos de FRAP; pero si lo que se desea observar es el
proceso de difusin de la protena en una nica clula, o si la protena
de inters es parte de un gran complejo proteico, se utilizan los
mtodos cualita-tivos, que requieren imgenes de alta calidad. (Snapp
et al., 2003)La tcnica del FLIP (del ingls, Fluorescence Loss In
Photobleaching) est estrechamente relacionada con el FRAP, con la
diferencia que FLIP sigue la ruta del fluo-rforo fotoblanqueado,
mientras que el FRAP sigue la recuperacin de la fluorescencia en la
regin fotoblan-queada. Esta tcnica puede ser utilizada para
examinar el movimiento o difusin de molculas dentro de las clulas o
membranas. Tpicamente, una membrana ce-lular est marcada con un
marcador fluorescente (pue-de ser expresin de una protena de fusin
con GFP), y un rea especfica de la membrana es fotoblanquea-da con
el lser del microscopio confocal. La intensidad de la fluorescencia
de esa regin se mide a lo largo del tiempo. Ocurre un movimiento de
molculas fluores-centes dentro del rea fotoblanqueada, la cual
restaura lentamente la fluorescencia en dicha rea mientras se
extingue la fluorescencia en otras regiones. En estas l-timas
regiones se calcula la prdida de fluorescencia a lo largo del
tiempo, a travs de la medicin de la inten-sidad de fluorescencia
(Lippincott-Schwartz et al., 2001). Esta tcnica revela
principalmente las conexiones entre diferentes regiones y
compartimentos celulares y el es-tudio de flujo proteico entre
ellos (Snapp, 2003). Para los anlisis con FLIP es necesario obtener
imgenes antes e inmediatamente despus del primer blanqueado, y as
sucesivamente con los blanqueados posteriores, hasta que desaparece
la fluorescencia (Snapp et al., 2003). Por ltimo, en iFRAP (FRAP
inversa) toda la regin de fluorescencia, por lo general toda la
clula, excepto la zona de inters, es blanqueada. En las imgenes
post-blanqueamiento se mide la disminucin de la fluo-rescencia de
la regin no blanqueada (Goldman et al., 2004).
Una de ellas consiste en la medicin de la disminucin de la
fluorescencia del donante respecto al aumento de la fluorescencia
del receptor (con mediciones basadas en el aumento de la emisin del
donante si se destru-ye el aceptor; por ejemplo, por
fotoblanqueamiento). Tal cuantificacin permite determinar la
eficiencia absoluta de FRET, mtodo que se conoce como acceptor
photo-bleaching. Otra estrategia contempla la medicin de la
separacin espectral de las imgenes del donante de energa (en el
caso de CFP) y la de la emisin del aceptor (en el caso de YFP),
mediante algoritmos establecidos por la contribucin de cada protena
en los dos canales de deteccin (emisin y recepcin); a este mtodo se
le conoce como emisin sensibilizada (Fernndez et al., 2006). La
cantidad de fluorescencia que emite el donador y la velocidad con
la que las protenas se unen y se separan (reaccin que generalmente
es muy rpida) tambin pueden ser medidas por medio de la
microscopia. La tcnica FLIM (por las siglas en ingls, Fluorescence
Li-fetime Imaging Microscopy) permite saber la vida media de la
fluorescencia de un cromforo. (Bastiaens, 2006). La imagen
microscpica es capaz, entre otras cosas, de evaluar FRET en tiempo
real, al medir la intensidad de la fluorescencia que la seal emite
y estudiar las reaccio-nes bioqumicas que ocurren en una
localizacin parti-cular dentro de una clula (Bastiaens et al.,
1999).Otro conjunto de tcnicas avanzadas, que unidas a las FPs
presentan mltiples aplicaciones, son las tcnicas de fotoblanqueado.
El fotoblanqueamiento es una alte-racin fotoinducida que destruye
la fluorescencia de un cromforo (Snapp, 2003). Estas tcnicas
difieren por el tamao de la regin a blanquear, el nmero de even-tos
blanqueadores y la forma de analizar la fluorescen-cia. Las tcnicas
de blanqueamiento ms comunes son FRAP, FLIP e iFRAP (Goldman et
al., 2004)FRAP es una tcnica que permite la recuperacin de la
fluorescencia despus del fotoblanqueamiento (FRAP, del ingls
Fluorescence Recovery After Photobleaching). Cuando se aplica un
rayo lser de alta intensidad sobre cierta zona celular, que
presenta una protena unida a una FP, la fluorescencia desaparece de
la zona y es ne-cesario recurrir a la microscopia confocal para
seguir el movimiento de las molculas no blanqueadas hacia la zona
blanqueada. Con el uso de una luz de menor in-tensidad como la que
provee el microscopio, es posible observar la recuperacin paulatina
de la fluorescencia, que se haba perdido debido a la migracin
lateral de los fluorforos no blanqueados (Snapp et al.,
2003).Dependiendo de lo que se desee estudiar, se utilizarn
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ALICIA Y. FRANCO Y MARINS LONGART.
guieron, adems, crear un ratn doble transgnico que expresaba dos
PF simultneamente (YFP y CFP o GFP y RFP) (Feng et al., 2000).Los
ratones transgnicos fueron generados por DNA pu-rificado del
complejo Thy 1, asociado a cada variante de la FP (especficamente
EGFP, EYFP, ECFP y DsRed1 de clontech), dentro de oocitos
fertilizados. Para seleccio-nar los ratones positivos visualizaron
las uniones mus-culares in vivo y con estos ratones positivos
estabilizaron la lnea de animales transgnicos (Feng et al., 2000).
El gen thy1 es un miembro de la superfamilia de las
in-munoglobulinas y codifica una glicoprotena de la su-perficie
celular, que se expresa en varios tipos celulares que incluyen
fibroblastos, clulas de cncer de ovario, clulas endoteliales,
clulas hematopoyticas, linfocitos T y neuronas (Rege y Hagood,
2006; Lewis, 2008).Feng y colaboradores (2000) lograron expresar
las FP en uniones neuromusculares (mostradas en la figu-ra 5) y
probaron la no toxicidad de las protenas GFP, YFP y CFP en sus
experimentos. La RFP mostr me-nor porcentaje de efectividad en la
produccin de ra-tones transgnicos (14% vs 84% de las otras tres
FP).El marcaje con dos colores en neuronas fue posible en un mismo
ratn al cruzar thy1-CFP con thy1-YFP o thy1-GFP con thy1-RFP. Los
colores muestran algunas zonas del sistema nervioso perifrico (SNP)
y central (SNC), en donde las neuronas expresan las FP en pares
(figura 6).La desventaja de la aplicacin del marcaje con dos
colo-res fue que en algunas zonas del sistema nervioso que debieron
colorearse y mostrar la actividad de la zona no lo hicieron. Aunque
lograron marcar selectivamente neuronas, estos marcajes no se
expresaron en todo el sistema nervioso (Feng et al., 2000).En un
estudio realizado en el 2005, que utiliz mtodos
Expresin de protenas fluorescentes en el sistema nervioso
Desde hace ms de un siglo, el estudio del sistema ner-vioso ha
atrado a un gran nmero de investigadores ansiosos de dilucidar su
arquitectura y dinmica, para lo cual se hizo necesario poder
visualizar la disposicin de las neuronas. Hasta finales del siglo
XIX no existan tcnicas que lo permitieran. Golgi plante entonces la
tcnica reazione nera (reaccin negra), que permiti observar por
primera vez una preparacin histolgi-ca del Sistema Nervioso al teir
varias clulas a la vez. Luego, Santiago Ramn y Cajal, al utilizar
esta tcnica y otras que desarroll en sus estudios, dilucid la teora
de la conexin nerviosa y descubri que la neurona es la unidad
anatmico-funcional del sistema nervioso, teora que an es vlida en
nuestros das. Otras tcnicas que desarroll fueron la tincin de las
clulas del sistema nervioso con azul de metileno y con plata, que
tuvo ma-yor acogida que la realizada con azul. (Cajal, 1907 citado
por Jones, 2007). Aunque estas tcnicas de tincin fueron muy tiles,
la informacin obtenida resultaba bastante limitada. Con la llegada
de las FP, algunos investigadores comenzaron a marcar neuronas de
diversas formas, con el fin de es-tudiar la arquitectura del SNC
con ms detalle, e incluso lograron obtener imgenes de clulas in
vivo (Niel et al., 2004). Dentro de las estrategias de marcado, se
encuen-tran aquellas que involucran la expresin permanente de
protenas fluorescentes en mamferos, con la cons-truccin de animales
quimricos. Entre los mamferos, el ratn es el que se ha usado de
manera ms extensiva como modelo experimental, debido a que sus
genes son homologables a los de los humanos, y porque los rato-nes
representan un organismo nico como modelo para el estudio de la
organognesis, inmunologa, neurobio-loga y reproduccin (Branda et
al., 2004).En el ao 2000, un grupo de investigadores (entre ellos
Feng, Mellor, Berstein, entre otros) logr marcar selec-tivamente,
con varias protenas fluorescentes, neuronas en el ratn.
Posteriormente, generaron ratones transg-nicos que expresaban GFP,
RFP, YFP y CFP, y con ello alcanzaron a etiquetar la totalidad de
la morfologa de algunas neuronas, como los axones, y de las
termina-ciones nerviosas, dendritas y espinas dendrticas. Estos
investigadores lograron que cada una de las variantes de las FP
mencionadas se expresara en neuronas in vivo y demostraron que la
expresin de todas estas prote-nas fluorescentes no afecta la funcin
de la neurona ni presenta toxicidad en las estructuras sinpticas.
Consi-
!
FIGURA 5. Uniones Neuromusculares en ratones transgnicos que
expresan diversas PFs. a) Expresando thy1-YFP, b) Expresando
thy1-GFP, c) Expresando thy1-CFP y d) Expresando thy1-RFP. (Tomado
de Feng et al., 2000).
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DNA para catalizar su recombinacin. La tcnica tiene la
particularidad de que la expresin de Cre est controlada por un
promotor especfico de la clula diana. Slo en el momento y en el
lugar donde el promotor est activo, la enzima Cre tambin lo estar.
(Lodish et al., 2005). Los resultados de la investigacin se
muestran en la figura 7. Basados en las investigaciones hasta ahora
comenta-das, cientficos de la Universidad de Harvard, a finales de
2007, lograron obtener imgenes sin precedentes al marcar
diferencialmente neuronas hasta con 90 colores, con una tcnica a la
cual denominaron Brainbow (Livet et al., 2007). Brainbow (juego de
palabras que combina brain, cerebro, y rainbow, arco iris) es un
transgn crea-do con mtodos de clonacin estndar que usan XFPs y el
sistema de recombinacin Cre/lox. Las XFP son poli-pptidos
compuestos por 3 o ms FP, entre las cuales se encuentran las EGFP,
EYFP, CFP y otras FP derivadas del coral Discosoma sp. (Livet et
al., 2007). Estos autores tambin usaron recombinacin aleatoria por
medio de sitios Lox (loxN, loxp y lox2272) e incorporaron
secuen-cias de algunas FP, ya mencionadas, con lo cual slo una
genticos de mosaico, Zong y otros colaboradores gene-raron y
marcaron, por recombinacin de cromosomas homlogos de clulas
somticas de ratn, a las clulas progenitoras de los grnulos
cerebelares de la capa mo-lecular de la corteza cerebelar. Con una,
dos y hasta tres protenas fluorescentes lograron marcar
diferencial-mente parte del sistema nervioso de los ratones
genti-camente modificados. Estos investigadores modificaron un
sistema de gen knockout condicional al utilizar la estrategia Cre
loxP (Zong et al., 2005). A esta modifica-cin metodolgica la
denominaron MADM (Anlisis de mosaico con marcadores doble) y
bsicamente consis-ti en introducir dos genes quimricos, cada uno
con-teniendo el extremo N terminal de un marcador (GFP, color
verde) y el C Terminal del otro marcador (ds Red, rojo),
interrumpidos por un intrn conteniendo el sitio loxP. De esta
manera es posible obtener los dos colores en las neuronas de los
ratones.La estrategia Cre-loxP, que permite inactivar genes dia-na
en tipos especficos de clulas somticas, o en mo-mentos particulares
de su desarrollo, consiste en la apli-cacin de la enzima llamada
Cre en sitios especficos del
!!!
FIGURA 6. Doble marcaje de PF en un mismo ratn transgnico. Izq.:
Neuronas del ganglio espinal dorsal (SNP) provenientes del cruce
entre rato-nes thy1-GFP y thy1-RFP. Centro: Neuronas del ganglio
espinal dorsal (SNP) que expresan thy1-CFP con thy1-YFP. Der.:
Neuronas de la corteza (SNC) provenientes del cruce entre ratones
thy1-GFP y thy1-RFP (Tomado de Feng et al., 2000).
FIGURA 7. Izquierda. Corte sagital de cerebro de ratn adulto que
muestra la expresin de la GFP uniforme (1mm). Centro. Corteza
cerebral de ratn adulto que muestra distincin entre neuronas
verdes, rojas y con el doble coloreado (50 m). Derecha. Grupo de
clulas de los grnulos cerebelares que expresan la GFP y la RFP,
pero no su combinacin (100 m). (Tomado de Zong et al., 2005)
! ! !
-
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de las protenas poda expresarse. Construyeron 4 tipos de
constructos que denominaron Brainbow 1.0; 1.1; 2.0; y 2.1. Por
ejemplo, Brainbow 1.0 posee EGFP, EYFP y M-CFP, los cuales, al
expresarse en cada clula, per-mite slo uno de los eventos.
Incorporaron tambin al constructo el gen Cre, que invierte el
segmento de ADN independientemente en cada clula, y cuando este gen
es usado, se obtienen mltiples expresiones de las XFP (Livet et
al., 2007).Inicialmente, para probar sus constructos, utilizaron
c-lulas HeK 293 y luego transfectaron estos mismos trans-genes en
neuronas (Figura 9) y en glias (Fig. 10). Estos autores probaron
que Brainbow es una tcnica muy pro-misoria con mltiples ventajas,
no slo en el trazado de mapas entre conexiones neurales, sino
tambin con las glias y con las clulas postsinpticas musculares
(Livet et al., 2007).
Conclusiones y Perspectivas
- Para expresar GFP no es necesaria la accin de cofac-tores de
la medusa A. victoria. Con tan slo oxgeno (ne-cesario para
sintetizar el cromforo) se puede expresar esta protena en cualquier
organismo eucarionte o pro-carionte.- La GFP est formada por 238
aminocidos y posee un cromforo constituido por 3 residuos
aminoacdicos. Su estructura cuaternaria es de barril b.- Se crearon
variantes (modificadas por unos pocos ami-nocidos) que logran
expresar longitud de ondas dife-rentes y que proporcionan as varios
tonos de fluores-cencia y caractersticas en su intensidad
(fotoactivable) y sensibilidad al pH (pHluorins).- Una de sus
grandes ventajas es que la GFP no presen-ta toxicidad para la clula
y permite su observacin con una mnima alteracin del sistema in
vivo.- Aplicado a la microscopa de fluorescencia, la GFP y sus
variantes pueden ser utilizadas en tcnicas como FRET, FRAP, FLIM y
FLIP.- En su aplicacin a estudios en el Sistema Nervioso, tc-nicas
como Brainbow pueden utilizarse para descifrar el diagrama de
conexiones del sistema nervioso, no slo en personas sanas, sino
tambin en enfermas, pues es til para observar los cambios anatmicos
y fisiolgicos que sufre el cerebro en estados de enfermedad. Sin
duda, las PF tienen un amplio futuro como indica-dores lumnicos que
permiten aplicar sus potenciales fotoqumicos a la biologa celular,
estructural, medici-na, diagnstico, embriologa, biotecnologa,
botnica y muchas otras reas de la ciencia. A pesar de que son
muchos los investigadores que estudian y utilizan estas protenas
actualmente, podramos afirmar, sin temor a equivocarnos, que son
muchas las aplicaciones que an no se han descubierto, pero que en
un futuro prximo nos sorprendern.
!FIGURA 8. Brainbow 1.0 aplicado a clulas Hek 293 donde se
muestra la expresin de las XFP bajo efectos de Cre. Tomado y
modificado de Levit et al., 2007.
FIGURA 9. Se muestran a la izquierda fibras musgosas del
hipocampo que expresan Brainbow 1.1. A la derecha, el giro dentado
del hipocampo que expresa Brainbow 1.1. Tomado de Levit et al.,
2007.
FIGURA 10. Expresin de Brainbow 1.1 en astrocitos. Tomado de
Levit et al., 2007.
! !
!
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Anexo 1
Nombre
comn
Segn la
estructura del
cromforo
Color de
fluorescencia en el
espectro
Pico de
excitacin (nm)
Pico de
emisin (nm)
Ventajas / Desventajas
GFP nativa Clase I:
Equilibrio fenol-
fenolato
Verde Presenta 2
picos 395-397/
475
508 / 503 Aunque requiere uso de filtro, la excitacin
con UV es conveniente porque es invisible; sin embargo, hay que
tomar en
cuenta que la autofluorescencia y la posibilidad de
fotodegradacin de los
tejidos son ms severas con excitacin por UV.
EGFP Clase II: Cromforo
fenolato
Verde 488 507-509 La oxidacin del fluorforo es cuatro veces ms
rpida que en la protena salvaje. Es
estable cuando se expresa a temperatura ambiente y el plegado
fue mejorado a 37
C, pero tiende a plegarse mal y producir agregados no
fluorescentes a
temperaturas mayores
H9 clase III:
Fenol en el cromforo
Verde 399 511 Estas mutantes poseen la ventaja de ser
fotoqumicamente ms simples, carecen del pico de excitacin a
479-490 nm, por
lo que pueden emplearse junto con las GFP clase II para un doble
marcaje.
EYFP / Topaz
Clase IV: Fenolato
en sistema electrnico
! apilado
amarillo 508-512 518-529 Algunas de estas mutantes exhiben un
decaimiento en el rendimiento cuntico
con prdidas de fluorescencia superiores al 90%, por cortos
perodos de vida. Otras
versiones provenientes de PF de coral han sido mejoradas.
ECFP Clase V: Indol en el
cromforo
Turquesa (Cyan)
434-452 476-505 Muy tiles para FRET y marcajes dobles. Una
versin mejorada mTFP1 introduce
una variante monomrica a esta familia con alto brillo y
fotoestabilidad, pero esta
mutacin no es derivada de Aequorea victoria.
BFP /EBFP Clase VI: Imidazol en
el cromforo
Azul 380-384 440-448 Son tiles para marcajes dobles. A pesar de
que mediante mutaciones se ha
mejorado su velocidad de plegamiento, las BFP tenan bajo
rendimiento cuntico,
pero nuevas versiones han sido mejoradas (SBFP2).
TABLA I. Se muestra la clasificacin por familias de las
variantes derivadas de GFP de Aequorea Victoria. Tomado y
modificado de Tsien 1998 y Sharnet et al., 2007.