“Microarrays” Reais e Virtuais: Passo a Passo...“Microarray” virtual: passo a passo O tapete Pode fabricar o seu próprio tapete ou pode escrever-nos ([email protected]) e encomendar

“Microarrays” Reais e

Virtuais: Passo a Passo

Versão 2.3

Anastasios KoutsosAlexandra ManaiaJulia Willingale-Theune

ELLS – European Learning Laboratory for the Life Sciences

VersãoPortuguesa

“Microarrays” Reais e Vir-

tuais: Passo a Passo

Versão 2.3

Anastasios Koutsos, Alexandra Manaia e Julia Willingale-Theune

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“Microar rays” Rea is e V i r tua is

“Microarrays” reais: passo a passo

Produção dos fragmentos de ADN

Para produzir os microarrays os cientistas:

- usam a “PCR (polymerase chain reaction)”,

técnica de amplificação de ADN que produz

milhares de pequenos fragmentos de ADN em

cadeia dupla.

- ou, caso conheçam a sequência nucleotídica

do gene, podem encomendar a produção de

fragmentos em cadeia simples com idêntica

composição nucleotídica.

“Microarray” virtual: passo a passo

O tapete

Pode fabricar o seu próprio tapete ou pode

escrever-nos ([email protected]) e encomendar a

versão do tapete em plástico (1x2.5 m),

especialmente concebida para ser utilizada na

sala de aula por 40 Euros (não incluindo custos

de envio).

Impressão ou “spotting”

Os microarrays de ADN podem ser facilmente

produzidos no laboratório usando lâminas de

vidro, como as que são correntemente utilizadas

em microscopia. Imprimir 20 000 pequeníssimos

“spots ” de ADN (cada “spot” contendo biliões

de cópias de ADN de um mesmo gene) numa

pequena superfície é uma tarefa muito difícil.

Os “spots” têm de ser exactamente da mesma

forma e equidistantes uns dos outros. Estas

dificuldades conseguem ser ultrapassadas

graças à utilização de robots no fabrico dos

“microarrays”.

Impressão ou “spotting”

No “Microarray Virtual”, um tapete de tecido

representa a lâmina de vidro contendo 10 spots.

Cada “spot” contém fragmentos de ADN em

cadeia simples, específicos de um destes 10

genes: Alexandre Fleming, Jacques Monod,

Thomas Morgan, Barbara Mcclintock, Leo

Szilárd, John Kendrew, Francis Crick, Rosalind

franklin, Maurice Wilkins e James Watson. As

moléculas de ADN são representadas por Velcro

colorido. Por exemplo, para o gene John

Kendrew, os fragmentos de Velcro são

vermelhos. Terá que colocar os fragmentos

de Velcro correspondentes a cada gene, no

respectivo “spot” (círculo), no seu tapete de

“microarray”.

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O braço do robot transporta um conjunto

especial de 48 tubos capilares em ouro até

aos reservatórios, onde se encontram as várias

soluções de fragmentos de ADN que vão ser

impressos nas lâminas. Como estes capilares

são muito sofisticados, delicados e caros, o

robot está equipado com apenas 48, que são

utilizados inúmeras vezes. O braço do robot

mergulha os capilares nas amostras, retira-as e

posiciona-se sobre uma fila de lâminas de vidro

pré-tratadas. Então, pressiona ligeiramente os

capilares, de modo a que cada capilar deposite

200nl de amostra na lâmina de vidro. Quando

uma linha de “spots” fica impressa na primeira

lâmina, o braço move-se para a segunda lâmina

e assim sucessivamente, de modo a que

todas as lâminas possuam uma fila equivalente

de “spots”. Quando uma fila está completa em

todas as lâminas, o braço lava os capilares,

mergulhando-os depois num novo conjunto de

amostras. Regressa então à primeira lâmina

onde imprime uma nova fila de spots. O

processo é repetido muitas vezes até à produção

de uma série de lâminas- cada lâmina é um

“microarray” com 20,000 spots. Após impressão

as lâminas são aquecidas para fixar o ADN ao

vidro.

Extracção de mARN

O mARN é representado por lanternas de bolso.

Cada lanterna corresponde a mARN de cadeia

simples específico de um determinado gene (Velcro

vermelho para o mARN correspondente ao gene

John Kendrew). Cada lanterna tem também uma

etiqueta de identificação.

Extracção de mARN

Para realizar uma experiência com microarrays,

os cientistas extraem mARN das células que

querem estudar. A extracção é um processo

relativamente simples.

Para cada experiência, é necessário utilizar

mARN proveniente de dois tipos de células:

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células controlo e do tipo celular que se está a

estudar. Por exemplo, cientistas interessados em

estudar células cancerosas, utilizariam mARN de

células normais (não-cancerosas) como controlo

e mARN proveniente de células cancerosas do

mesmo tipo de tecido.

Uma vez extraídas, as moléculas de mARNs

precisam de ser marcadas com moléculas

fluorescentes1, de modo a poderem ser

detectadas mais tarde, na superfície do

microarray. O mARN das células controlo é

geralmente marcado com uma molécula

fluorescente verde e o mARN das células em

estudo é marcado com um marcador

fluorescente vermelho.

O número exacto e os nomes das lanternas será

discutido adiante. Por agora basta saber que

existem umas lanternas correspondentes ao

mARN das células controlo e outras

correspondentes ao mARN das células em

estudo.

As lanternas precisam de ser marcadas com

papel transparente autocolante verde ou

vermelho representando o mARN dos tipos

celulares: vermelho para o mARN das células

cancerosas e verde para o mARN das células

controlo.

Hibridação

Trata-se agora de hibridar os mARNs marcados

com as moléculas fluorescentes (lanternas) com as

moléculas de ADN (Velcro), presentes no

microarray (tapete). Coloca-se a mistura de

lanternas em contacto com o “microarray” (tapete).

Apenas as lanternas com Velcro de cores

apropriadas irão hibridar com as moléculas de

ADN em cadeia simples, presentes no

“microarray”. Por exemplo: as lanternas com

Velcro vermelho vão hibridar com o Velcro

vermelho no “microarray” e as lanternas com

Velcro amarelo hibridarão com o Velcro amarelo no

“microarray”.

As lanternas com uma cor de Velcro que não

exista no “microarray” (tapete) não se ligarão. As

moléculas de Velcro que apresentam mais do que

uma cor (ver na figura abaixo, a lanterna que está

na mão), representam a situação em que apenas

Hibridação

Neste passo, o mARN controlo (marcado a

verde) é misturado com o mARN teste (marcado

a vermelho). A mistura é vertida sobre a

superfície da lâmina de vidro que é então

incubada a 42°C, de modo a que as cadeias

simples mARN da mistura se liguem (hibridem)

ao ADN complementar no microarray. Após

12 horas, o “microarray” é lavado de modo a

remover as moléculas de mARN que não tenham

encontrado alvos complementares nas lâminas.

O “microarray” está então pronto a ser

digitalizado –“scanneado”.

1 As cores não são vísiveis à luz normal.

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Scanning do “microarray”—aquisição de

imagem

Chegou o momento de identificar quais os

mARN que hibridaram com as moléculas alvo de

ADN. Para tal, utiliza-se um “scanner laser”,

segundo um princípio semelhante ao “scanner”

que digitaliza as imagens para uso, num

computador. O laser faz o “scanning” da lâmina

e combina as imagens, produzindo uma imagem

final que se assemelha à figura abaixo:

Reparando atentamente na figura acima,

notamos que não há só “spots” vermelhos e

verdes mas também “spots” amarelos e laranja.

uma porção do mARN é complementar ao ADN

presente no “microarray”. Nestes casos, a

hibridação é muito fraca e as moléculas de

mARN fracamente ligadas, são eliminadas

durante a lavagem.

Colocar as lanternas no tapete, ligando-as ao

Velcro da mesma cor, no tapete. Neste ponto

deve ligar-se a luz das lanternas.

Scanning do “microarray”—aquisição de

imagem

Para fazer o “scanning” do microarray virtual, ligar

todas as lanternas que se encontram sobre o

tapete do microarray, não as retirando dos seus

lugares. Desligar então as luzes da sala e observar

o microarray. Ir analisando o microarray “spot” a

“spot” (círculo a círculo).

O que se pode dizer acerca da intensidade de

cores? É de notar que no “microarray” virtual não

é possível reproduzir os “spots” amarelos. No

entanto, os spots vermelhos e verdes são

fácilmente distinguíveis. Convém anotar o número

de lanternas vermelhas e verdes para cada gene.

Estes dados serão necessários para a análise dos

resultados.

Tal como para os microarrays reais, os círculos

mostram uma gradação de cores. Num círculo

onde só há lanternas vermelhas, só o mARN de

células cancerosas hibridou com as moléculas de

ADN. Do mesmo modo, os círculos verdes

correspondem a uma hibridação exclusivamente

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Os spots vermelhos contêm apenas mARN de

células cancerosas, e os “spots” verdes apenas

mARN das células controlo, não cancerosas.

Mas o que acontece se quantidades idênticas de

mARN das células controlo e das células

cancerosas hibridarem com o mesmo ADN alvo?

Da sobreposição dos sinais verde e vermelho

resulta um sinal amarelo! É preciso não esquecer

que o mARN hibrida com o ADN no

“microarrray” que lhe é complementar, e que um

“spot” no microarray representa biliões de cópias

de ADN de UM único gene. Por outras palavras,

quando um “spot” é amarelo, quer dizer que

existem quantidades aproximadamente iguais de

mARN desse gene nas células cancerosas e nas

células controlo.

Quando um “spot” é laranja, quer dizer que

existe uma quantidade relativa maior de mARN

desse gene nas células cancerosas do que nas

células controlo (normais).

Os “spots” pretos correspondem a uma ausência

de mARN específico desses genes, quer nas

células controlo quer nas células cancerosas.

de mRNA das células controlo. Os círculos

amarelos correspondem a igual quantidade de

mARN nas células cancerosas e nas células

controlo. Isto é uma simplificação, pois como

vemos, no “microarray” real pode observar-se

grande variação na cor dos “spots” (ver o “ícone”

para esta actividade na página Web!), que só

consegue ser decifrada com auxílio de um

“scanner laser” e de um programa de análise.

Normalização

No “Microarray de ADN” nem sempre a

intensidade do “spot” corresponde à quanti-

dade real de mARN que hibridou. Isto porque o

processo de marcação do mARN é influenciado

pelo tamanho da cadeia do mARN e pelo tipo

de marcador utilizado. Um processo matemático

designado por normalização corrige as

intensidades dos “spots”, de modo a que estas

reflictam a quantidade de mARN presente nas

moléculas hibridadas. Depois da normalização a

análise dos dados pode prosseguir.

Normalização

Segundo o que puderam ler quanto ao fabrico

dos “microarrays” reais, os cientistas conseguem

estimar a quantidade de mARN, a partir da cor do

spot após scanning e análise do “microarray”. Em

paralelo, também podemos estimar o número de

lanternas por círculo, através da intensidade da luz.

Mas consideremos o seguinte exemplo: se

existe uma lanterna num “spot”, e se noutro “spot”

existem duas lanternas, e se todas as lanternas

tiverem o mesmo número de baterias, então será

de esperar que a luz emitida por duas lanternas

seja duas vezes tão intensa quanto a de uma só

lanterna.

Mas o que acontecerá se as baterias das duas

lanternas possuírem apenas metade da

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Análise e “Clustering”

Se os cientistas analisassem os resultados “spot”

a “spot”, levariam anos a analisar um

“microarray”. Assim, os cientistas desenvolveram

uma maneira de associarem os genes que têm

um comportamento semelhante em grupos- os

“clusters”. Existem programas de computador

que permitem executar estes passos

automaticamente.

intensidade? Nesse caso, as duas lanternas num

“spot” serão tão intensas quanto a única lanterna

no outro “spot”. Por outras palavras, a

quantidade de luz das lanternas no

“microarray” virtual não depende apenas do

número de lanternas, mas também do tipo de

baterias que existem em cada lanterna.

Análise e “Clustering”

Este passo será explicado na secção: Exercícios

de clustering para a sala de aula [PDF].

Agradecimentos

Gostaríamos de agradecer a todos os que contribuíram para a elaboração desta

actividade:

- Ao Udo Ringeisen e a toda a equipa do Departamento de Fotografia do EMBL (EMBL

Photolab), pela impressão dos tapetes do “microarray” em tecido, (para demonstração

em cursos ou festivais de ciência) e pela produção da versão em plástico, (para

utilização na sala de aula);

- Ao Thomas Sandmann, na altura estudante de doutoramento no EMBL-Heidelberg,

por várias discussões e sugestões muito úteis e também por nos ter chamado a

atenção para o excelente material sobre “microarrays” intitulado ‚Snapshots of Science

and Medicine‘, produzido pelo “NIH Office of Science Education”, em conjunto com o

“Office of Research on Women‘s Health”;

- Ao Russ Hodge, na altura, no Departamento de Comunicação e Relações Públicas

do EMBL-Heidelberg (“Office of Information and Public Affairs” [OIPA]), bem como a

toda equipa do “European Learning Laboratory for the Life Sciences” [ELLS], por muitas

discussões, sugestões e apoio;

- A Giovanni Frazzetto, Mehrnoosh Rayner e Vassiliki Koumandou por terem lido a

primeira versão desta actividade e por terem contribuído para melhorá-la com as suas

ideias e comentários.

- A vários amigos e colegas do EMBL-Heidelberg com quem partilhámos ideias,

entusiasmo e dúvidas;

- “Os Exercícios para a sala de aula” foram adaptados do material sobre “microarrays”

intitulado “Snapshots of Science and Medicine”, produzido pelo “NIH Office of Science

Education”. Pode ser encontrado no seguinte website:

science-education.nih.gov/snapshots;

Imagem de capa por André-Pierre Olivier;

Traduzido por Alexandra Manaia;

Editado por Corinne Kox e Sonia Furtado.

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