i “Inducción de respuesta morfogenética en Abies religiosa (Kunth) Schltdl. & Cham. y A. hickelii Flous & Gausen de la región del Cofre de Perote, Veracruz.” TESIS QUE PARA OPTAR POR EL GRADO DE MAESTRO EN ECOLOGÍA FORESTAL PRESENTA Víctor Elías Luna Monterrojo DIRIGIDA POR MC. Virginia Rebolledo Camacho Dr. Martín Mata Rosas Xalapa, Veracruz, México Octubre de 2002
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“Inducción de respuesta morfogenética en Abies …última como en peligro de extinción según la Norma Oficial Mexicana NOM-059-Ecol-2001 (Anónimo, 2002). Ambas especies se localizan
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“Inducción de respuesta morfogenética en Abies religiosa
(Kunth) Schltdl. & Cham. y A. hickelii Flous & Gausen de
la región del Cofre de Perote, Veracruz.”
T E S I S
QUE PARA OPTAR POR EL GRADO DE
MAESTRO EN
ECOLOGÍA FORESTAL
PRESENTA
Víctor Elías Luna Monterrojo
DIRIGIDA POR
MC. Virginia Rebolledo Camacho
Dr. Martín Mata Rosas
Xalapa, Veracruz, México Octubre de 2002
i
CONTENIDO
CONTENIDO ............................................................................................................................... i
ÍNDICE DE FIGURAS Y TABLAS .......................................................................................... iii
de Martínez-Pulido et al., 1990), a este tratamiento se le denominó de ácido sulfúrico
concentrado;
4) Solución de Benlate (Bayer) 2.5 g/l, adicionado con Bactericida (Mycrodin) 2-3
gotas/100 ml por 12 h; alcohol 70% 1 minuto; NaOCl comercial al 30% (v/v) 30
minutos, a este tratamiento se le llamó solución de benlate.
Finalmente, en todos los casos se aplicaron, bajo condiciones asépticas (campana de
flujo laminar), tres enjuagues con agua destilada y esterilizada. Con la ayuda de microscopio e
instrumental de disección se extrajeron los embriones cigóticos y se sembraron en los medios de
cultivo WP y MB.
El periodo de incubación fue de 30 días; se evaluó la presencia de contaminación por
hongos y bacterias, registrándose como porcentaje de explantes contaminados por repetición en
cada tratamiento; tomándose datos semanalmente.
Los 4 tratamientos de desinfección fueron distribuidos conforme a un diseño
completamente al azar, con 6 repeticiones para cada especie, de las cuales 3 repeticiones se
sembraron en medio MB y 3 en medio WP; las unidades experimentales, fueron las mismas
repeticiones, conformadas por lotes de 20 embriones. El análisis estadístico se realizó con los
datos obtenidos a los 30 días de desarrollo. Se realizó, con la ayuda del programa Statistica (Stat-
Soft, 1998), un análisis de varianza de una clasificación por rangos de Kruskal-Wallis con un
diseño completamente al azar para cada tratamiento: especie, medio y tratamiento de
desinfección; y se utilizó la prueba de U de Mann-Whitney para la comparación de medias.
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4.4.2. Desinfección de semillas de conos en diferentes estados de maduración
Se utilizaron semillas A. religiosa y A. hickelii de conos de las tres etapas de
maduración: conos inmaduros, conos maduros con escamas cerradas y conos maduros con
escamas abiertas. Las semillas se lavaron en una solución de detergente líquido comercial
(Axion) a una concentración del 5% y se enjuagaron con abundante agua destilada;
posteriormente se mantuvieron en agua destilada durante 36 h con el fin de separar por flotación
las semillas vanas.
Las semillas provenientes de los tres tipos de cono (Tabla 2) fueron sometidas al
procedimiento de desinfección utilizado por Mata (2000): alcohol al 70% por 1 minuto; solución
al 30% de hipoclorito de sodio (NaOCl) comercial (6% de cloro activo) por 30 minutos.
Posteriormente, se dieron tres enjuagues con agua destilada y esterilizada bajo condiciones
asépticas (campana de flujo laminar). Con la ayuda de microscopio e instrumental de disección se
extrajeron los embriones cigóticos y se sembraron en medio de cultivo WP y MB.
El diseño experimental utilizado fue completamente al azar, los tratamientos se
conformaron por los embriones de las semillas provenientes de los tres tipos de conos (tabla 2),
con 6 repeticiones cada uno, las unidades experimentales, fueron las mismas repeticiones,
conformadas por lotes de 20 embriones.
Tabla 2. Tratamientos aplicados en la etapa de desinfección de embriones.
Tratamiento Repeticiones
Factor Nivel
Madurez del cono
Embriones de conos inmaduros 6
Embriones de conos maduros con las escamas
cerradas 6
Embriones de conos con las escamas abiertas 6
La variable a evaluar fue, al igual que en el experimento anterior, la presencia de
contaminación por hongos y bacterias, registrándose el porcentaje de explantes contaminados por
repetición en cada tratamiento. El periodo de incubación fue de 30 días, tomándose datos
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semanalmente. Para determinar la existencia de diferencia significativa se realizó un análisis de
varianza de una clasificación por rangos de Kruskal-Wallis con un diseño completamente al azar.
Se utilizó la prueba U de Mann-Whitney para la comparación de medias, en el programa
Statistica (Stat-Soft, 1998). Los análisis estadísticos se realizaron con los datos obtenidos a los 30
días de incubación.
4.5. Comparación de medios y reguladores de crecimiento en la inducción de
respuestas morfogenéticas en Abies religiosa
Los medios de inducción empleados para el cultivo de los embriones cigóticos de A.
religiosa fueron WP y MB, adicionado con todas las combinaciones de 6-Benciladenina (BA) con
ácido 2,4-Diclorofenoxiacético (2,4-D) o ácido naftalen-acético (ANA), las concentraciones se
presentan en la tabla 3. El periodo de cultivo en los medio de inducción fue de 35 días,
posteriormente se realizaron subcultivos periódicos cada 15 días a sus respectivos medios
básales, es decir, sin reguladores de crecimiento.
El material biológico empleado para la implementación de este ensayo fueron los
embriones provenientes de semillas obtenidas de conos maduros con las brácteas cerradas, ya que
fueron los que pudieron ser desinfectados con el tratamiento convencional utilizado por Mata
(2000) presentando altos porcentajes de desinfección.
Se utilizó un diseño experimental completamente al azar con una distribución factorial
completo (2 x 4 x 8) con un total de 16 a 20 repeticiones por tratamiento.
Tabla 3. Concentraciones de BA, auxinas y medios evaluados en la inducción de respuestas morfogenéticas de Abies
religiosa.
Factores Niveles
BA
Auxina
Medio
0, 1, 3, 5 (mg l-1)
0, 0.1, 0.5 y 1 de 2,4-D; 0, 0.1, 0.5 y 1 de ANA (auxina/ mg·L-1)
WP, MB
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Las variables que se evaluaron es este ensayo fueron:
a) Formación de callo y tamaño del callo, registrándose con cero la ausencia de éste,
cuando el callo estaba presente se tomó el diámetro mayor aproximado de cada uno de los
explantes.
b). Aspecto físico del callo: compacto, desmenuzable, la presencia de vellos y la
oxidación. También se evaluó sobrevivencia, vivos se le llamó a los explantes que formaron
callos y que presentaron segmentos con signos de vitalidad a los seis meses de cultivo.
Los datos se tomaron bimestralmente y el análisis estadístico se realizó con los datos
obtenidos a los seis meses de desarrollo. Para el tamaño del callo se realizó un análisis de
varianza para determinar la existencia de diferencia significativa entre los factores;
posteriormente se realizó una ordenación de medias, con un nivel de significancia de p0.05,
cabe señalar que debido a la presencia de valores de cero se utilizó la transformación (X+3)0.5
(Compton, 1994), para lograr la homogeneidad de varianzas y normalidad de los residuales de los
datos. Los análisis se realizaron en el programa Statistica (Stat-Soft, 1998).
El modelo estadístico empleado en el análisis de varianza fue:
Yijkl = + Mi + Bj + Dl + (MBD)ijl + ijkl
Donde:
Yijlk = Tamaño del callo.
U = Media general de los factores constantes controlables en el experimento.
Mi = Efecto i-ésimo nivel del factor medio empleado.
Bj = Efecto de j-ésimo nivel del factor de nivel de concentración de BA.
Dl = Efecto de l-ésimo nivel del factor auxina.
(MBD)ijl = Efecto del i-ésimo nivel del factor medio empleado y el j-ésimo nivel del
factor de nivel de concentración de BA y el l-ésimo nivel del factor auxina.
ijlk = Error experimental
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Posteriormente, con los resultados de la ordenación de medias y una vez identificados
los mejores tratamientos en cuanto al tamaño del callo se realizó un análisis de varianza no
paramétrico complementario tomando en cuenta la presencia y aspecto físico del callo, para
seleccionar nuevamente el o los mejores tratamientos. El análisis de varianza no paramétrico se
realizó utilizando la chi-cuadrada de máxima verosimilitud (CCMV) y el valor absoluto de t (|t|)
para realizar una ordenación de porcentajes; con la siguiente formula:
|t|=Sqrt[(N1*N2)/(N1+N2)]*|p1-p2|/Sqrt(p*q)
Donde:
p = (p1*N1+p2* N2)/(N1+N2)
q = 1-p.
Los grados de libertad (gl) son calculados como
gl = N1 + N2 –2
4.6. Comparación de reguladores de crecimiento en la inducción de respuestas
morfogenéticas en Abies hickelii
El medio de inducción empleado para el cultivo de los embriones cigóticos de A. hickelii
fueron el medio MB adicionado, con todas las combinaciones de BA con 2,4-D o ANA (Tabla 4).
El periodo de cultivo en los medio de inducción fue de 35 días, posteriormente se realizaron
subcultivos periódicos cada 15 días a sus respectivos medios básales, sin reguladores de
crecimiento.
El material biológico empleado para la implementación de este ensayo fueron los
embriones provenientes de conos maduros con las brácteas cerradas, ya que son los que
presentaron las más altas tasas de desinfección en el tratamiento utilizado por Mata (2000).
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Se utilizó un diseño experimental completamente al azar con un arreglo factorial
completo (4 x 8) con un total de 16 a 20 repeticiones por tratamiento.
Tabla 4. Concentraciones de BA y auxinas evaluados en la inducción de respuestas morfogenéticas de A. hickelii.
Factores Niveles
BA
Auxina
0, 1, 3, 5 (mg l-1)
2,4-D 0, 2,4-D 0.1, 2,4-D 0.5, 2,4-D 1, ANA 0, ANA 0.1, ANA 0.5, ANA 1 (auxina mg·L-1)
Las variables que se evaluaron es este ensayo y la estrategia de análisis fueron las
mismas que en el experimento anterior, únicamente que con sólo 2 factores, esto es, sin la
presencia de medios de cultivo.
4.7. Comparación de antioxidantes en el control de la oxidación
Se sembraron los embriones cigóticos provenientes de conos maduros con las brácteas
cerradas de A. religiosa y A. hickelii; desinfectadas con el tratamiento utilizado por Mata (2000).
Los cuales se colocaron en medio MB adicionado con 5 mg·L-1
de BA y con 1 mg·L-1
de 2,4-D,
así como, con diferentes antioxidantes. Los antioxidantes y concentraciones utilizados fueron:
ácido ascórbico a una concentración de 250 mg·L-1
; ácido cítrico a 250 mg·L-1
;
polivinilpirrolidona a 3000 mg·L-1
y carbón activado a 1000 mg·L-1
; además, se agregó un testigo
al que no se le adicionó ningún antioxidante. El periodo de cultivo en los medio de inducción fue
de 35 días, posteriormente se realizaron subcultivo a sus respectivos medios básales, sin
reguladores de crecimiento con los mismos antioxidantes respectivos.
Se utilizó un diseño experimental completamente al azar con un total de 25 repeticiones
por tratamiento.
Las variables que se evaluaron es este ensayo fueron:
a). Presencia o ausencia del callo.
b). Porcentaje de oxidación del callo, tomado por observación directa del explante.
c). Tamaño del callo.
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Los datos se tomaron quincenalmente y el análisis estadístico se realizó con los datos
obtenidos a los 2 meses de desarrollo. Se realizó un análisis de varianza con el porcentaje de
oxidación y el tamaño del callo para determinar diferencia significativa entre especies y
tratamiento, así como, la comparación de medias de acuerdo al algoritmo de Tukey utilizando el
programa Statistica (Stat-Soft, 1998). Se utilizó la transformación de arcoseno recomendada para
valores de porcentaje y la raíz cuadrada para la variable tamaño de callo por presentar valores
iguales a cero (Compton, 1994).
El modelo empleado en el análisis estadístico fue:
Yijk= μ +Ei+Τj +ijk
Donde:
Yijk= Valor observado en la variable respuesta
μ = Media general del ensayo
Ei = Efecto de la i-esima especie
Τj = Efecto del j-ésimo tratamiento
ijk = Error experimental
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5. RESULTADOS
5.1. Desinfección de semillas
5.1.1. Desinfección de semillas de conos maduros abiertos
El porcentaje de semillas que se precipitaron después del periodo de remojo fue
aproximadamente del 18%. Es importante destacar que las semillas que flotaron, en general eran
vanas, encontrándose vacías o el megagametófito presentaba una coloración blanquecina,
traslúcida de aspecto seco y duro, con depósitos de resina. En otros casos cuando se encontraba
turgente, el embrión no se había desarrollado. De las semillas que se precipitaron, el 12% no eran
viables; en algunas ocasiones las semillas estaban vanas y en otras ocasiones se encontraban
parasitadas por la larva de un lepidóptero, por lo que el porcentaje de semillas viables se redujo
aún más.
La contaminación se presentó de manera diferencial dependiendo del tratamiento de
desinfección. De manera general la contaminación por hongos y bacterias fue evidente al tercer
día de cultivo y a los 5 días ya cubría la totalidad del explante. También se presentó
contaminación al parecer por organismos sistémicos, debido a que cerca del 20% de los explantes
no manifestaron contaminación en los primeros días de cultivo, sino que ésta se presentó hasta
que el explante inicio su desarrollo, alrededor de la segunda semana de cultivo.
Se logró establecer diferencia significativa entre los tratamientos de desinfección
empelados; sin embargo, no se encontró diferencia significativa entre especies y medios
utilizados. En la tabla 5 se puede observar que en el tratamiento con H2SO4 fue donde se obtuvo
el menor porcentaje de contaminación 43.37%, y se pudo establecer una diferencia significativa
con el resto de los tratamientos, en donde la contaminación fue mayor.
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Tabla 5. Porcentaje de contaminación obtenido después de aplicar diferentes tratamientos de desinfección a las
semillas maduras de A. religiosa y A. hickelii, sembradas en medio de cultivo.
Tratamiento Porcentaje de contaminación EE
A. religiosa A. hickelii Total
1) Cloro 30%; 90.89 3.79 b 89.23 3.61 b 90.06 3.69 b
2) Peróxido de hidrógeno; 94.44 5.55 b 93.34 4.50 b 93.89 2.72 b
3) Acido Sulfúrico concentrado 43.37 7.34 a 40.90 6.52 a 42.13 3.71 a
4) Solución de Benlate 89.38 3.58 b 91.67 2.00 b 90.52 2.26 b
Medias con las mismas letras no presentan diferencia significativa (p<0.05)
EE = error estándar
5.1.2. Desinfección de semillas de conos en diferentes estados de maduración
Debido a que el porcentaje de contaminación del ensayo anterior fue todavía alto, se
aplicó el método de desinfección propuesto por Mata, (2000) a embriones cigóticos provenientes
de conos en diferentes estados de maduración (tabla 2), con la finalidad de probar si con otros
tipos de explantes se puede mejorar el porcentaje de desinfección.
Las semillas de los conos inmaduros fueron mucho más difíciles de extraer, son de un
color blanquecino, muy suaves y las bolsas de resina aún no se encuentran desarrolladas. Los
embriones son una masa blanca pequeña, difícil de distinguir sin la ayuda del microcopio de
disección, miden aproximadamente 0.5 mm y no están todavía diferenciados los cotiledones. Es
importante destacar que el 98% de los conos inmaduros las semillas presentaron embrión (Figura
6).
La contaminación de los embriones de las semillas de los conos inmaduros fue baja
(tabla 7), solo el 5.42% en promedio se contaminaron, encontrándose diferencia significativa
(p0.05) con respecto a los otros dos estados de madurez del cono. El principal agente
contaminante fueron bacterias, manifestándose a las dos semanas de la siembra. Estos explantes
generalmente presentaron poco desarrollo. Se murieron de los dos a los tres meses de cultivo;
independientemente del tipo del medio que se empleó, ya que no mostraron diferencia
significativa entre los dos tipos de medio.
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Figura 7. a) Embrión cigótico inmaduro de A. hickeli, b) embrión cigótico inmaduro de A. religiosa, c)
embrión cigótico maduro de A.hickeli, d) embrión cigótico maduro de A.religiosa.
Las semillas de los conos maduros con las escamas cerradas fueron mucho más fáciles
de extraer; la coloración que presentó fue blanco-amarillento y relativamente duras, las bolsas de
resina se encontraron desarrolladas. Los embriones ya estaban desarrollados y se distinguieron
fácilmente a simple vista; midieron aproximadamente 1.3 cm, el suspensor prácticamente no se
distinguió y los cotiledones ya estaban desarrollados en la mayoría de los casos.
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Aproximadamente el 20% de las semillas presentaron embrión, el resto eran vanas o estaban
parasitadas.
La contaminación de los embriones de los conos maduros con las escamas cerradas fue
también baja, en promedio el 14.78% de los embriones presentaron algún tipo de contaminación
(tabla 6), encontrándose diferencia significativa (p0.05) con respecto a los otros dos estados de
madures del cono. El principal agente contaminante fueron hongos y en menor proporción
bacterias presentándose en los primeros 7 a 10 días de la siembra. Estos explantes, en ausencia de
reguladores de crecimiento presentaron las primeras etapas del proceso normal de germinación;
es decir, los embriones se tornaron de color rosa en la base, se alargó la radícula, y los cotiledones
adquirieron un color verde claro, abriéndose en forma de roseta.
Tabla 6. Contaminación obtenida después de aplicar diferentes tratamientos de desinfección a las semillas maduras
de A. religiosa y sembradas en medio de cultivo WP y MB.
Tipo de cono empleado Porcentaje de contaminación EE
Embriones de conos inmaduros 5.42% 2.76 a
Embriones de conos maduros con las escamas cerradas 14.78% 3.21 b
Embriones de conos con las escamas abiertas 91.47% 6.98 c
Medias con las mismas letras no presentan diferencia significativa (p<0.05)
EE = error estándar
Finalmente, los embriones de conos con las escamas abiertas presentaron en promedio
un porcentaje de contaminación alto (91.47%), aunque también en ausencia de reguladores de
crecimiento presentaron las primeras etapas de germinación.
5.2.Comparación de medios y reguladores de crecimiento en la inducción de
respuestas morfogenéticas en Abies religiosa
Los embriones cigóticos de Abies religiosa presentaron un buen desarrollo durante el
primer mes en el medio de inducción; los embriones se hincharon ligeramente, toman una
coloración rosada e inmediatamente se tornan verdes, los cotiledones se definen y en la mayoría
de las ocasiones abren en forma de roseta. El 89% de éstos embriones sobrevivieron durante este
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periodo y el 11% murió sin ninguna causa aparente; aunque lo más probable es que se deba a un
mal manejo durante la disectación de los mismo, o tal vez, su desarrollo no estaba completo. Sólo
un pequeño porcentaje de embriones se tuvo que eliminar por que se contaminaron.
En el segundo mes, ya en medio de expresión, es decir, en los mismos medios basales
sin reguladores de crecimiento, generalmente se manifestaron cuatro tipos de desarrollo. 1) El
primero se caracterizó por seguir un proceso de germinación, en el que los embriones se
alargaron junto con los cotiledones, este tipo de desarrollo se presentó en muy pocas ocasiones.
2) En otros casos los embriones se hincharon tomando una forma ovoide, a lo largo aumentaron
poco su tamaño, lo que incrementaron fue su diámetro. Este fue el más común de los cuatro. 3) El
tercer tipo de desarrollo fue una combinación de los dos anteriores; es decir, el embrión y los
cotiledones se alargaron en el extremo basal, que generalmente quedó en contacto con el medio,
se hinchó formando un callo el cual fue por lo regular pequeño, aunque en ocasiones pudieron
llegar a crecer tanto como en los embriones que solo formaron callo. 4) Por último, los embriones
que a pesar de haber permanecido vivos durante el primer mes, no manifestaron ningún cambio
posterior. Los explantes y callos empezaron un proceso de oxidación leve, que se caracterizó por
la presencia de zonas cafés, siendo más frecuente en los callos.
Hacia el tercer mes, los callos tomaron, en su mayoría, forma compacta y en muy pocas
ocasiones adquirieron un aspecto desmenuzable. En los explantes que no manifestaron ningún
cambio posterior, la oxidación avanzó rápidamente, provocando su muerte, evidente por el
necrosamiento del tejido. Prácticamente el 100% de los explantes presentaron oxidación en
diferentes grados, aun de los que respondieron favorablemente.
Aunque fue una respuesta aislada, es necesario destacar la formación de brotes, en dos
explantes. Uno formó cinco brotes bien definidos, en el tratamiento con 5 mg·L-1
de BA y 1
mg·L-1
de ANA y el otro formo tres brotes con la misma concentración de BA y 0.5 mg l-1
de
ANA; aunque este último se oxido y murió. En ambos casos el medio empleado fue el MB.
Durante el periodo de inducción los cotiledones presentaron un alargamiento de los cotiledones y
se hinchó todo el explante, fue evidente la formación de pequeños nódulos en la superficie en la
base de los cotiledones, lo que le confirió un aspecto rugoso a la superficie. La presencia de los
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nódulos ocurrió en ambos medios de cultivo y en varios tratamientos. Los nódulos eran
numerosos, sin embargo, la mayoría no logro desarrollar brotes adventicios, se oxidaron y
finalmente se necrosaron (figura 8).
Figura 8. Brotes adventicios en embriones cigóticos de Abies religiosa a los seis meses de cultivados en medio
MB. a) cultivado con BA (5 mg·L-1) y ANA (1 mg·L-1), b) cultivado con cultivado con BA (5 mg·L-1) y ANA
(0.5 mg·L-1).
En los dos explantes que lograron la formación de brotes adventicios, los nódulos
incrementaron su tamaño con el subcultivo a medio basal, en donde después de dos meses
empezó la formación de los brotes adventicios en los que el domo meristemático y la formación
de los primordios de hojas se distinguieron fácilmente. Posteriormente adquirieron una
coloración más intensa y a los seis meses de cultivo el brote más grande alcanzó una talla de
centímetro y medio. No todos los nódulos lograron desarrollarse en brotes adventicios, la
mayoría fueron absorbidos por brotes adventicios de mayor tamaño.
5.2.1. Formación de callos por tipo de medio
De los tipos de medio empleados, encontramos que en el medio MB se presentaron los
callos de tamaño más grande que en el medio WP (p< 0.05; Tukey); los cuales fueron compactos
y en muy pocas ocasiones se presentan de tipo desmenuzable.
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El porcentaje de explantes vivos después de la inducción fue mayor en el medio MB
(87.02%); así mismo, en este medio el 100% de los explantes que respondieron formando callo
(tabla 7).
Tabla 7. Resultados del Análisis de varianza no paramétrico de las variables cualitativas por tipo de medio en
embriones de Abies religiosa.
Medio Total explantes vivos después
de la inducción (p 0.05)
explantes que formaron
callo. (p 0.05)
Callos vivos a los 6
meses de cultivo(NS)
MB 478.000 416 / 478
(87.02%) a
416 / 416
(100.00 %) a
130 / 416
(31.25%)
WP 413.000 319 / 413
(77.23%) b
307 / 319
(96.23%) b
88 / 307
(28.66%)
Porcentaje con la misma letra no presentan diferencia significativa (p0.05)
5.2.2. Formación de callos con BA
Al analizar el efecto de las cuatro concentraciones de BA sobre el tamaño callo no se
pudo establecer diferencia significativa entre ellas. En el análisis de varianza no paramétrico con
las variables cualitativas, el porcentaje de explantes que formaron callo, al parecer está
relacionado a la concentración de BA empleado, ya que se pudieron establecer diferencia
significativas entre ellos. A los seis meses de cultivo la mayor proporción de callos formados que
continuaron con vida se registró en el testigo (42.50%), es decir cuando el medio se encuentra
libre BA, estableciéndose una diferencia significativa (p0.05) con respecto a las demás
concentraciones empleadas (tabla 8); al parecer los medios sin BA son los mejores para mantener
el explante vivo; sin embargo, en las concentraciones de BA de 1 y 5 mg·L-1
se presentaron los
mayores porcentajes de explantes vivos después de la inducción, 90.62 y 84.27%
respectivamente; además los mayores porcentaje (100%) de explantes que formaron callo se
presentaron cuando se adiciona el medio con cualquier concentración de BA (1, 3, 5 mg·L-1
)
difiriendo significativamente con respecto al testigo.
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Tabla 8. Resultados del Análisis de varianza no paramétrico de las variables cualitativas por concentración de BA en
embriones cigóticos de Abies religiosa.
Concentraciones
de BA (mg l-1) Total
Explantes vivos después de
la inducción
(p 0.05)
Explantes que formaron
callo (p 0.05)
Callos vivos a los 6 meses
de cultivo (p 0.05)
0 222 172/222 (78.48%) b 160/172 (93.02%) b 68/160 (42.50 %) a
1 213 193/213 (90.62%) a 193/193 (100.00%) a 42/193 (21.76 %) b
3 227 177/227 (77.98%) b 177/177 (100.00%) a 52/177 (29.37 %) b
5 229 193/229 (84.27%) ab 193/193 (100.00%) a 56/193 (29.01 %) b
Porcentaje con la misma letra no presentan diferencia significativa (p0.05)
5.2.3. Formación de callos con auxinas
Las auxinas juegan un papel más activo en la formación y tamaño de callo. Los callos
con los tamaños en promedios más altos se desarrollaron en las concentraciones de 0 y 1 mg l-1
de 2,4-D y 0.5 y 1 mgl-1
de ANA determinándose diferencia significativa (p 0.05) con respecto a
las demás concentraciones de auxinas empleados (tabla 9).
Tabla 9. Efecto del tipos y concentración de auxinas empleadas para la formación de callos a partir de embriones
cigóticos maduros de A. religiosa.
Auxina Concentración
(mg·L-1) Total N
Explantes vivos después
de la inducción. Tamaño del callo* EE
2,4-D
0 107 69/107 (64.48%) 1.05 0.06 a
0.1 81 51/81 (62.96%) 0.85 0.06 c
0.5 97 86/97 (88.65%) 0.86 0.04 c
1 123 100/123 (81.30%) 0.97 0.04 a b c
ANA
0 114 91/114 (79.82%) 0.90 0.04 c
0.1 125 106/125 (84.80%) 0.88 0.03 c
0.5 121 113/121 (93.38%) 1.02 0.05 a
1 123 119/123 (96.74%) 1.00 0.04 a b
Medias con las mismas letras no presentan diferencia significativa (p0.05)
EE = error estándar
* se presentan los datos sin transformar
Para discernir entre estos cuatro tratamientos, y seleccionar uno con mayor desarrollo de
callos nos apoyamos en las características cualitativas (tabla 10). Las proporciones mayores de
explantes que formaron callos se encuentra ligada al tipo de auxina empleado. Los tratamientos
40
con ANA presentan la mayor proporción de explantes que sobrevivieron después de la inducción
con respecto a aquellos en los que se utilizó 2,4-D; así mismo, en lo que respecta a la formación
de callo, ya que en las concentraciones de 0.5 y 1 mg·L-1
de ANA se presentaron los mayores
porcentajes de explantes con formación de callos, diferentes estadísticamente con respecto a los
demás tratamientos con 2,4-D (tabla 10).
El mayor porcentaje de callos vivos después de seis meses de cultivo lo presentan los
explantes cultivados con ANA con una diferencia significativa (p0.05) con respecto a los demás
tratamientos presentados (Tabla 10).
Tabla 10. Características cualitativas de las respuestas morfogenéticas de los embriones maduros de A. religiosa; solo aparecen los 4 tratamientos (auxina/concentración) con los callos más grandes (ver tabla 10).
Auxina /
Concentración
(mg l-1)
Total
Explantes vivos después
de la inducción
(p 0.05)
Explantes que
formaron callo
(p0.05)
Callos vivos a los 6 meses
de cultivo
(p0.05)
ANA /0.5 121 113/121 (93.38 %) a 113/113 (100.00 %) a 37/113 (32.74 %) a b
ANA /1 123 119/123 (96.70 %) a 119/119 (100.00 %) a 119/119 (43.69 %) a
2,4D /0 107 69/107 (64.50 %) c 69/69 (100.00 %) c 14/69 (20.28 %) b
2,4D /1 123 100/123 (81.30 %) b 97/100 (97.00 %) b 23/97 (23.71 %) b
Porcentajes con las mismas letras no presentan diferencia significativa (p0.05)
5.2.4. Formación de callos de los embriones de Abies religiosa en los tratamientos
completos (medio, BA y auxina)
De los 64 tratamientos conformados por la interacción de los diferentes niveles de los
factores: medios, BA y Auxinas; se determinó diferencia significativa entre los tratamientos (p
0.05) y a través de la ordenación de medias de Tukey se identificaron 10 tratamientos con los
valores promedios más altos con respecto al tamaño del callo (tabla 11). Con el análisis de
varianza no paramétrico, podemos considerar, que de los 10 tratamientos seleccionados, el mejor
tratamiento es con el medio MB en ausencia de reguladores de crecimiento, ya que el 100% de
los callos formados permanecieron vivos a los seis meses de cultivo, y difieren
significativamente con respecto a los demás tratamientos presentados (tabla 11); así mismo,
41
también es uno de los porcentajes más altos con sobrevivencia de explantes después de
permanecer en el medio de inducción (92.85 %).
Tabla 11. Análisis de las variables cualitativas de los 10 tratamientos con los mejores promedios en cuanto a tamaño
del callo y diferentes (p<0.05) a los otros 54 tratamientos propuestos.
Medio
Concentra
ción BA
(mg·L –1)
Auxina/
Concentración
(mg·L–1)
Total
N
Explantes vivos después de
la inducción
(p 0.05)
Explantes que
formaron callo
(NS)
Callos vivos a los 6
meses de cultivo
(p 0.05)
MB 0 ANA /0 14 13/14 (92.85 %) a 100 % 13/13 (100.00 %) a
MB 0 2,4-D /1 14 14/14 (100.00 %) a 100 % 3/14 (21.42 %) c
MB 1 2,4-D /0 16 16/16 (100.00%) a 100 % 2/16 (12.25 %) c
MB 1 ANA /0.1 17 17/17 (100.00 %) a 100 % 5/17 (29.41 %) c
MB 3 ANA /0.1 16 16/16 (100.00 %) a 100 % 5/16 (31.25 %) bc
MB 5 2,4-D /0 16 5/16 (31.25 %) c 100 % 0/5 (0 %) d
MB 5 2,4-D /1 8 8/8 (100.00 %) a 100 % 4/8 (50.00 %) b
WP 0 ANA /1 13 12/13 (92.30 %) a 100 % 5/12 (41.66 %) b
WP 1 ANA /0.5 19 17/19 (89.47 %) a b 100 % 5/17 (29.41 %) c
WP 3 2,4-D /0 10 6/10 (60.00 %) b 100 % 1/6 (16.66 %) c
Porcentajes con las mismas letras no presentan diferencia significativa (p 0.05)
5.3. Comparación de reguladores de crecimiento en la inducción de respuestas
morfogenéticas en Abies hickelii
Los embriones cigóticos de Abies hickelii, al igual que los embriones de A. religiosa,
presentaron un buen desarrollo durante el primer mes en el medio de inducción. Debido a que el
21% de los embriones murieron por un mal manejo en el momento de la disectación y el 7% se
contaminó; sólo 72% de los embriones de A. hickelii fueron subcultivados a los medios de
expresión (medios sin reguladores de crecimiento). Los cambios observados fueron que el
embrión se hinchó ligeramente, tomó una coloración rosada e inmediatamente se torna verde, los
cotiledones se desarrollan y en la mayoría de las ocasiones abren en forma de roseta, éstas
mismas características se presentaron en A. religiosa.
En medio de expresión, generalmente se presentaron los mismos cuatro tipos de
desarrollo que en el ensayo anterior con A. religiosa. Con la particularidad de que hacia el tercer
mes, los callos tomaron forma compacta o desmenuzable, siendo esta última la que se presentó en
42
menor medida. La oxidación se incrementó; siendo más severa en los explantes que no
presentaron ningún cambio posterior, provocando su muerte, evidente por el franco
necrosamiento del tejido. Prácticamente el 100% de los explantes presentaron oxidación en
diferentes grados, en algunos casos hasta provocar su muerte, iniciándose a partir del tercer mes,
aún de los que respondieron formando callo.
5.3.1. Formación de callo con BA
El análisis de varianza de la única variable cuantitativa, tamaño del callo, mostró
diferencia significativa entre las concentraciones (p 0.05), lo que justificó la ordenación de
medias, donde se identificó al testigo como el poseedor de los callos de mayor tamaño, es decir,
cuando no se empleó BA, difiriendo significativamente (p 0.05) con respecto a los tratamientos
donde se adicionó BA.
El análisis de varianza no paramétrico de los aspectos cualitativos considerados, ratificó
al medio carente de BA como uno de los mejores tratamientos; ya que presentó los porcentajes
más altos de callos vivos a los seis meses de cultivo (29.03%), aunque, en lo que respecta al
porcentaje de formación de callo, el porcentaje más bajo se reportó en éste (54.86%) (tabla 12).
Tabla 12. Análisis de las variables cualitativas de Abies hickelii cultivado con 4 concentraciones diferentes de BA.
Concentración de
BA (mg l-1)
Total
N
Explantes vivos después de la
inducción (NS)
Explantes que formaron
callo (p 0.05)
Callos vivos a los 6 meses
de cultivo (p 0.05)
0 127 113/127 (88.97 %) 62/113 (54.86 %) b 18/62 (29.03 %) a
1 123 109/123 (88.61 %) 103/109 (94.49 %) a 11/103 (10.67 %) b
3 120 98/120 (81.66 %) 91/98 (92.85 %) a 10/91 (10.98 %) b
5 122 108/122 (88.52 %) 108/108 (100.00%) a 9/108 (8.33 %) b
Porcentajes con las mismas letras no presentan diferencia significativa (p 0.05)
Cuando los embriones de Abies hickelii, son sometidos a medio sin BA, un alto
porcentaje de ellos sólo desarrollaron un proceso de germinación, produciendo como respuesta
morfogenética un callo visible. Generalmente estos embriones se alargaron y desarrollaron los
cotiledones, en el extremo inferior se forma el callo.
43
5.3.2. Formación de callo con Auxina
En el análisis de varianza se pudo determinar diferencias significativas entre los ocho
tratamientos en cuanto al tamaño del callo; al comparar los promedios resaltaron cuatro de ellos
como los más altos, en cuanto al tamaño del callo. Estos tratamientos se presentan en la tabla 14,
que muestra los resultados del análisis con las variables cualitativas; encontrándose diferencia
significativa en el número de explantes que formaron callo y que sobrevivieron a los seis meses
de cultivo, reportándose que en 2,4-D 0 (82.50%), 0.1 (76.74%) y 0.5 (74.00%) presentan los
porcentajes más altos de explantes que formaron callo; y en ANA 0 y 2,4-D 0.1 presentaron los
porcentajes más altos de callos vivos a los seis meses de cultivo, con porcentaje de 15.90 y 12.12
% respectivamente (tabla 13).
Tabla 13. Análisis de las variables cualitativas en los tratamientos con los promedios más altos del tamaño del callo.
Auxina
/concentración
(mg·L-1)
Total
Explantes vivos después
de la inducción
(p 0.05)
Explantes que formaron
callo
(p 0.005)
Callos vivos a los 6 meses
de cultivo
(p 0.05)
2,4D_0.1 60 43/60 (71.66 %) b 33/43 (76.74 %) ab 4/33 (12.12 %) a
2,4D_0.5 61 50/61 (81.96 %) b 37/50 (74.00 %) ab 3/37 (8.10 %) ab
ANA_0 65 64/65 (98.46 %) a 44/64 (68.75 %) b 7/44 (15.90 %) a
2,4D_0 58 40/58 (68.96 %) b 33/40 (82.50 %) a 0/33 (0.00%) b
Porcentajes con las mismas letras no presentan diferencia significativa (p 0.05)
5.3.3. Formación de callos de los embriones cigóticos de Abies hickelii en las
combinaciones de BA con Auxinas
Con el análisis de varianza se pudo establecer diferencia significativa en lo que respecta
al tamaño de los callos; y en la ordenación de medias se destacaron 6 tratamientos con los
mejores promedios iguales estadísticamente entre ellos y diferentes significativamente de los
otros 26 tratamientos propuestos. En la tabla 14 se muestran las proporciones y los resultados del
análisis no paramétrico de las variables cualitativas. Entre los mejores tratamientos se encuentra
BA 0 en combinación con ANA 0.1 y 2,4-D 0.5 ya que presentan altos porcentajes de explantes
vivos a los 6 meses, con 40.00 y 22.22%, respectivamente; el porcentaje más altos de explantes
que formaron callos se registró en el testigo, es decir, cuando al medio no se adiciona ni con BA
44
ni con auxinas. El 100% de los explantes vivos después de la inducción se presentó en el testigo y
en medios adicionados con BA 0 y ANA 0.1 mg·L-1
.
Tabla 14. Análisis de las variables cualitativas en los tratamientos con los promedios más altos del tamaño del callo.
Regulador
(mg·L-1) Total
Explantes vivos después de
la inducción
(p 0.05)
Explantes que formaron
callo
(p 0.05)
Callos vivos a los 6 meses
de cultivo
(p 0.05)
BA 0; ANA 0 17 17/17 (100.00%) a 16/17 (94.11 %) a 0/16 (0.00%) b
BA 0; ANA 0.1 17 17/17 (100.00%) a 10/17 (58.82 %) b 4/10 (40.00 %) a
BA 0; 2,4-D 0 16 12/16 (75.00%) ab 7/12 (58.33 %) b 0/7 (0.00%) b
BA 0; 2,4-D 0.1 16 10/16 (62.50 %) b 7/10 (70.00 %) ab 0/7 (0.00%) b
BA 0; 2,4-D 0.5 15 14/15 (93.33 %) a 9/14 (64.28 %) ab 2/9 (22.22 %) a
BA 3; 2,4-D 0.5 16 12/16 (75.00 %) ab 9/12 (75.00 %) ab 0/9 (0.00%) b
5.4. Comparación de antioxidantes en el control de la oxidación
En los primeros 35 días de cultivo, durante la fase de inducción, el desarrollo de los
embriones fue más lento en los medios suplementados con ácido cítrico y ácido ascórbico que los
otros tratamientos. En el carbón activado, la mayoría de los embriones, empezaron un proceso de
germinación, alargándose y desarrollando los cotiledones, posteriormente desarrollaron un callo
en el extremo basal del explante, que generalmente estaba en contacto con el medio. El testigo,
aunque tiende a la oxidación, los callos fueron más vigorosos. En el PVP los embriones se
hincharon, se desarrollaron los callos de manera rápida y fueron más grandes y vigorosos.
En el medio de expresión, sin reguladores de crecimiento, después del periodo de
inducción, el incremento en el tamaño de los callos fue notorio. El alargamiento de los embriones
del tratamiento de carbón activado se detuvo y se desarrolló callo en la base y los cotiledones en
algunos casos mostraron un considerable desarrollo. Los explantes del testigo incrementaron su
tamaño y el proceso de oxidación disminuyó.
El efecto de los antioxidantes en los explantes de A. religiosa (tabla 15) mostraron
diferencia significativa (p0.005). De acuerdo con la ordenación de medias el carbón activado, el
PVP y el testigo fueron los que presentaron los promedios más bajos de oxidación, que van de
45
68.3 al 81.2% de superficie oxidada. Sin embargo, el carbón activado es el único que presentó
diferencia significativa (p0.05) con respecto a los demás tratamientos.
Tabla 15. Efecto de los antioxidantes en el porcentaje de oxidación de los expantes de A. religiosa a los dos meses
de incubación.
Tratamiento N Vivos después de la inducción % de Oxidación DE
Carbón activado 40 31/40 (77.50%) 68.39 5.08 a
PVP 40 34/40 (85.00%) 76.18 0.40 a b
Testigo 40 31/40 (77.50%) 81.30 3.92 a b
Ácido cítrico 40 27/40 (67.50%) 88.51 3.44 b
Ácido ascórbico 40 24/40 (60.00%) 89.17 3.72 b
Media con las mismas letras no presentan diferencia significativa (p 0.05)
EE = error estándar
* se presentan los datos sin transformar
En A. hickelii también se logró establecer diferencia significativa entre los diferentes
tratamientos de antioxidantes utilizados, en lo que respecta al porcentaje de oxidación de los
explantes según el antioxidante. Al igual que en A. religiosa, en la ordenación se obtuvo que el
carbón activado con un promedio de 81.2% de oxidación es diferente significativamente (p0.05)
con respecto a los demás tratamientos, seguido por PVP y el testigo, con promedios de oxidación
de 92.5 y 94.2 de porcentaje de oxidación de los callos, respectivamente, aunque sólo en los
medios suplementados con PVP se pudo establecer diferencia significativa con respecto a los
demás tratamientos (tabla 16). Aunque es esta especie se obtuvieron porcentajes más altos de
oxidación con respecto a A. religiosa.
Tabla 16. Efecto de los antioxidantes en el porcentaje de oxidación de los expantes de A. hickelii a los dos meses de
incubación.
Tratamiento N Vivos después de la inducción % de Oxidación (media) DE
Carbón activado 40 24/40 (60.00 %) 81.25000 3.96 a
PVP 40 36/40 (90.00 %) 92.50000 2.04 b
Testigo 40 40/40 (100.00 %) 94.25000 1.47 b c
Ácido ascórbico 40 37/40 (92.50 %) 97.56757 1.05 c
Ácido cítrico 40 40/40 (100.00 %) 97.67442 1.04 c
Media con las mismas letras no presentan diferencia significativa (p 0.05)
DE = desviación estándar
46
Al igual que en los otros ensayos, se evaluó el tamaño del callo, como indicador de
vigor. Tanto en A. religiosa como en A. hickelii; de acuerdo con el análisis de varianza realizado
se determinaron diferencias significativa entre los tratamientos, en ambas especies. En la
ordenación de medias de A. religiosa (tabla 17) se observó que el carbón activado y el PVP
conforman un grupo con medias significativamente iguales, presentando los tamaños promedios
de callo más altos, pero únicamente el tamaño promedio de las callos que se desarrollaron en los
medios con carbón activado es significativamente diferente con respecto a los demás tratamientos
(tabla 18).
Tabla 17. Efecto de los antioxidantes en el tamaño de los callos de A. religiosa a los dos meses de incubación.
Tratamiento N Vivos después de la inducción Tamaño del callo* (media) EE
Carbón activado 40 31 / 40 (77.50 %) 1.12 0.08 a
PVP 40 34 / 40 (85.00 %) 0.89 0.07 a b
Testigo 40 31 / 40 (77.50 %) 10.79 0.08 b
Cítrico 40 27 / 40 (67.50 %) 0.68 0.07 b
Ácido ascórbico 40 24 / 40 (60.00 %) 0.38 0.06 c
Media con las mismas letras no presentan diferencia significativa (p 0.05)
EE = error estándar
* se presentan los datos sin transformar
En Abies hickelii también se logro, con el análisis de varianza, establecer diferencia
significativa (p0.05) entre los tratamientos; en la ordenación de medias, el grupo homogéneo
con los tamaños de callo promedio mayores se conformo, con los tratamientos de carbón
activado, PVP y el testigo, significativamente iguales entre ellos (p0.05); pero sólo en el carbón
activado y el testigo se pudo establecer diferencia significativa (p0.05) con respecto a los demás
tratamientos (tabla 18).
47
Tabla 18. Efecto de los antioxidantes en el desarrollo de los callos de A. hickelii a los dos meses de incubación.
Tratamiento N Vivos después de la inducción Tamaño del callo* (Media) DE
Carbón activado 40 24/40 (60.00 %) 0.95 0.11 a
Testigo 40 40/40 (100.00 %) 0.94 0.06 a
PVP 40 36/40 (90.00 %) 0.82 0.07 a b
Ácido ascórbico 40 37/40 (92.50 %) 0.72 0.06 b
Ácido cítrico 40 40/40 (100.00 %) 0.71 0.04 b
Medias con las mismas letras no presentan diferencia significativa (p 0.05)
EE = error estándar
* se presentan los datos sin transformar
48
6. DISCUSIÓN
En la horticultura tradicional el ácido sulfúrico se ha utilizado con el fin de alterar
mecánicamente o ablandar la cubierta de las semillas para hacerlas permeables al agua y a los
gases (Hartmann y Kester, 1989). Con el ácido se logró un menor porcentaje de contaminación en
los explantes, debido al rompimiento de las bolsas de resina de las semillas, lo que facilitó la
penetración de H2O2 y la solución al 30% de NaOCl. Otra ventaja de tratar las semillas con
H2SO4 es que éste ablandó la testa, facilitando la extracción del embrión, logrando el
establecimiento aséptico de cultivos in vitro en embriones cigóticos de A. religiosa y A. hickelii.
Debergh y Zimmerman (1991) mencionan que para cualquier intento de establecer cultivos in
vitro, es necesario contar con un buen método de desinfección.
El uso de ácido sulfúrico en las técnicas del cultivo de tejidos de coníferas es poco
frecuente. Sin embargo, en Pinus canariensis se utilizó ácido sulfúrico concentrado para
escarificar la semilla (Thorpe y Harry, 1991). Así como, en especies de otros grupos, como por
ejemplo en cactáceas (Moebius, 2000) y Diospyros riojae (Sánchez, 2002) con el mismo fin.
En el primer ensayo de desinfección, la contaminación obtenida en la mayoría de los
explantes se puede deber a que la muestra se tomó de individuos que presentaban conos, que en
la mayoría de los casos, ya se encontraban en la etapa de liberación de semilla, es decir, las
escamas ya se habían abierto exponiendo las semillas al medio ambiente y ocasionando el
almacenamiento de una gran cantidad de agentes contaminantes difíciles de eliminar. Esta
contaminación se redujo colectando conos que todavía no estaban abiertos, como se pudo
observar en el segundo ensayo de desinfección.
Los embriones provenientes de conos maduros cerrados fueron la mejor opción, para el
establecimiento de cultivos asépticos tanto de Abies religiosa como para A. hickelii, ya que
presentan un bajo porcentaje de contaminación y alta sobrevivencia para la inducción de
respuestas morfogenéticas. Los embriones inmaduros han sido empleados en otras especies como
49
Abies alba (Hristoforoglu et al., 1995; Schuller et al., 1989), Picea abies, P. mariana, P. glauca,
Pinus caribae y P. taeda (Atree y Fowke, 1991) con respuestas favorables.
Aunque la formación de brotes adventicios, fue una respuesta aislada en A. religiosa, es
necesario destacar que su formación se presentó en la misma concentración de BA (5 mgl-1
) que
en otras especies forestales; como en Pinus caribaea var. hondurensis (Go et al., 1993); Pinus
ponderosa (Ellis y Bildercack, 1989) y Picea chihuahuana (Mata et al., 2001).
El medio MB no ha sido empleado en otras especies de gimnospermas forestales; sin
embargo, demostró que puede mantener vivos a los explantes por mas de seis meses como
ocurrió en los ensayos para las dos especies (Tabla 8). Aunque mostró una clara superioridad con
respecto al medio WP, es necesario ensayar otros tipos de medios para encontrar el que permita
un mejor desarrollo de las especies de Abies con mejores resultados.
Para la inducción de callo a partir de embriones cigóticos de Abies religiosa y A.
hickelii, respuesta morfogenética expresada en la mayoría de los explantes de ambas especies,
indica que la presencia de BA no es necesaria para la formación de éstos, ya que BA a sido
reportada preferentemente para la formación de brotes adventicios en muchas especies forestales
(Thorpe y Harry, 1991; Kolevska-pletikapic y Buturovic-Deric, 1995; Go et al., 1993; von Arnold
y Eriksson, 1981; Atree y Fowke, 1991) y en algunas especies del mismo género (Schuller et al.,
1989). Sin embargo, existen algunos reportes donde son necesarias las auxinas y las citocininas
para la obtención de callos embriogénicos, como en Picea abies (Von Arnold, 1986).
De las auxinas empleadas en el presente trabajo, no se encontró que alguna de ellas
estimulara en mayor medida la indución de respuestas morfogenéticas; esto concuerda con los
datos obtenidos por Von Arnold (1986). Sin embargo, en A. religiosa ANA demostró ser mas
eficiente, ya que indujo en mayor medida la formación de callos; a pesar de que no siempre se
pudo establecer diferencia significativa.
En Abies hickelii, la presencia de auxina no se encontró indispensable para la inducción
de callo cuando se analizó únicamente esta variable. Sin embargo, en el análisis de los
50
tratamientos de BA con auxinas se determimó que los embriones cigóticos con los mayores
porcentajes de callos con mejores características cualitativas cuando se utilizó BA 0 con ANA 0.1
y 2,4-D 0.5 mg·L-1
.
Es necesario destacar que la presencia de reguladores del crecimiento no es
indispensable para la formación de callo, sin embargo, en ausencia de estos la germinación de los
embriones se presentó en mayores porcentajes que cuando éstos están presentes; esto contrasta
con lo reportado en Pinus pinea (García-Ferriz et al., 1994) en donde el explante muere en la
ausencia de BA.
El mayor deterioro causado a los explantes se debe a la oxidación y en la mayoría de los
casos el necrosamiento avanzó completamente por los explantes, causando su muerte. Sin
embargo, los porcentajes más altos de callos vivos a los seis meses de cultivo se registraron en
ausencia de los reguladores de crecimiento.
De los agentes antioxidantes empleados, el carbón activado presentó los porcentajes de
oxidación más bajos y a su vez los callos más grandes de los ensayos con antioxidantes; el
proceso por el que pasan los embriones se encontró que en el carbón activado incluyeron las
primeras etapas de germinación. A pesar de que el carbón activado es ocupado en muchos
trabajos como agente antioxidantes (Ill-Whan y Koran, 1998); en el presente trabajo observamos
que el carbón deja poco disponible a los reguladores del crecimiento (Weatherhead, et al,.1979
citado por Bonga y von Aderkas, 1992); por consiguiente proponemos que seria mejor utilizar
PVP en A. religiosa; o para A. hickelii el uso de PVP o nada ya que el testigo no presenta
diferencia significativa con el efecto del carbón activado y el PVP, en esta especie.
51
7. CONCLUSIONES
La contaminación está en relación con la madurez de los explantes utilizados; mientras
más maduros sea el cono de donde se obtenga el embrión necesitará protocolos de desinfección
más severos.
Se pudo demostrar que es posible la obtención de brotes adventicios a partir de
embriones maduros de Abies religiosa. Aunque fueron dos explantes los que presentaron
formación de brotes adventicios de manera múltiple; esta respuesta se obtuvo en medio MB
adicionado con altas concentraciones de BA (5 mg·L-1
) y bajas concentraciones de ANA (0.5 y 1
mg·L-1
).
La mejor condición encontrada para la formación de callos en A. religiosa fue con el
medio MB sin reguladores del crecimiento.
En A. hickelii se obtuvo la formación de callo de mayor tamaño en ausencia de BA y
con nulas o bajas concentraciones de ANA o 2,4-D (0.1 y 0.5 mg·L-1
).
En los embriones cigóticos provenientes de conos maduros la oxidación no fue reducida
con la utilización de antioxidantes; por lo que se sugieren 2 hipótesis: 1) para el control de la
oxidación necesita la utilización de otros antixidantes o la utilización combinada de estos; 2) la
segunda hipótesis se refiere a la composición del medio; algún componente en el medio, está
causando la oxidación o bien que la falta de algún elemento indispensable para el desarrollo
exitoso de los explantes.
Debido a que el género Abies es reportado como recalcitrante en el cultivo in vitro y a
que hasta donde sabemos, no existen reportes del cultivo con estas técnicas de A. religiosa y A.
hickelii por lo que los resultados en el presente trabajo son altamente significativos. Sin embargo,
es necesario realizar estudios donde se incremente la muestra y se incluyan variables mas
específicas, sobre todo en lo que se refiere a la composición de medios, y condiciones físicas para
52
la inducción de brotación múltiple de éstas especies, y lograr la obtención de plantas completas
que sirvan la conservación y propagación en masa, de manera que puedan ser utilizadas con fines
comerciales o de reintroducción.
53
8. RECOMENDACIONES
El trabajo con los embriones inmaduros, es importante debido a que el 98% de las
semillas presentan embrión. Es necesario ensayar con otros medios cultivo; sobre todo con
medios ricos en aminoácidos, pueden ser una opción en estructuras poco desarrolladas como
éstas.
En los embriones cigóticos inmaduros, por tratarse de un explante menos desarrollado,
sus requerimientos son más específicos en cuanto a los componentes del medios para su
establecimiento; por lo que se tendrían que probar otros tipos de medios o variar los componentes
de los medios hasta lograr obtener el adecuado para cada especie.
Los reguladores de crecimiento utilizados en el presente trabajo son los más
recomendados y de uso extensivo; pero es necesario realizar otros ensayos utilizando más
reguladores de crecimientos. De las citocininas más utilizadas en la actualidad con buenos
resultados en las gimnospermas es el thidiazuron. Es necesario probarlos de manera aislada, así
como combinada. Otros aspecto que hay que considerar es el tiempo de inducción, para lograr
una competencia óptima de los explantes.
Con respecto a la utilización de los antioxidantes, es necesario ampliar la gama tanto de
productos como de técnicas y además de probarlos de manera aislada, también realizar ensayos
en el que se utilicen de forma combinada, para lograr el control de la oxidación de los embriones
cigóticos de Abies religiosa y A. hickelii.
54
9. LITERATURA CITADA
AHUJA, M.R. 1993. Micropropagation a la carte In: M.R. Ahuja (Ed.) Micropropagation of