Antígenos Recombinantes e suas aplicações em Imunologia · Antígenos Recombinantes e suas aplicações em Imunologia Bióloga Mariana Monezi Borzi Doutoranda em Microbiologia

Antígenos Recombinantes e suas aplicações em Imunologia

Bióloga Mariana Monezi Borzi

Doutoranda em Microbiologia Agropecuária

UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA - UNESP FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E VETERINÁRIAS – FCAV

CAMPUS DE JABOTICABAL

Novo Dogma Central

da Biologia Molecular

• Cópia das sequencias de nucleotídeos de uma molécula de DNAfd parental em duas moléculas filhas de DNAfd

• Semi-conservativa

Replicação

Fita molde

Fita nova

É o processo pelo qual uma molécula de RNA é sintetizada a partir da informação contida na sequência de nucleotídeos de uma molécula

de DNA de fita dupla (gene)

Transcrição

Núcleo

Informação genética

Citoplasma

DNA mRNA

Consiste na transformação da mensagem contida no mRNA, via tRNA, na sequência de aminoácidos que

constituem a proteína

Tradução

Expressão gênica

Polímero de aminoácidos de massa molecular acima de 10 KDa, com cada aminoácido unido ao

seu vizinho por um tipo específico de ligação covalente.

Proteína

Sequencia linear dos

resíduos de aminoácidos

(Ligações peptídicas)

Padrões estruturais:

conformação helicoidal ou

lado a lado

(Pontes de hidrogênio)

Arranjo 3D

(Pontes de hidrogênio,

Forças de Van der Wall,

Interações iônicas)

Arranjo entre

cadeias/subunidades

(Ligações dissulfeto)

Produção em larga escala de proteínas heterólogas a partir da expressão de uma molécula de DNA recombinante em um

sistema de expressão adequado.

DNA recombinante: sequencia de DNA artificial que resulta da combinação

de diferentes sequencias de DNAs

Tecnologia do DNA recombinante

Estudos bioquímicos Análises estruturais

Dificuldades de obtenção Produção de Anticorpos

Imunodiagnóstico

Tecnologia do DNA recombinante

Clonagem gênica: isolamento,

amplificação e purificação de um ou

mais genes a partir do material genético

de um dado organismo.

• Antígenos: substâncias (moléculas) estranhas ao SI que são reconhecidas por receptores específicos em linfócitos B e T e também por anticorpos.

• Antígenos recombinantes: proteínas específicas do agente infeccioso, produzidas artificialmente a partir da clonagem gênica

Tecnologia do DNA recombinante

Células hospedeiras: Leveduras, Células de insetos, Células de mamíferos, Células bacterianas

Taxa de crescimento

celular;

Complexidade do meio de

cultura;

Custo do meio de cultura;

Nível de expressão;

Capacidade de expressão

extracelular.

Capacidade de produzir as

modificações pós-

traducionais:

- enrolamento correto;

- formação das pontes

dissulfeto;

- glicosilação;

- fosforilação;

- acetilação.

• Crescimento rápido

• Pouco espaço físico

• Genética bem compreendida

• Aceita material genético estranho

Escherichia coli

Vetor: molécula de DNA usada como um veículo para carregar sequências de DNA estrangeiras dentro de uma célula hospedeira.

Plasmídeos:

• Mais simples

• Circulares

• Independentes do cromossomo bacteriano

Vetores de expressão

Expressão de proteína recombinante em E. coli

Clonagem do gene em vetor de expressão

Vetor linearizado Preparo do inserto

Reação de ligação

Plasmídeo recombinante

Transformação de E. coli

competente

Plaqueamento e seleção

dos clones recombinantes

Extração do

DNAp e

Sequenciamento

Indução da expressão da proteína recombinante

Tampão

de lise

Sonicação Purificação

Análise da expressão da proteína recombinante

Eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS PAGE)

• Separação de proteínas conforme o peso molecular, as quais migram pelos poros do gel de poliacrilamida

• Quanto menor for o peso molecular da proteína mais facilmente ela migrará em relação às outras proteínas

• Após a corrida das proteínas pelos poros do gel, estas poderão ser visualizadas com a aplicação do corante Coomassie Blue

Preparo da amostra: dodecil-sulfato de sódio e β-mercapto-etanol

Confere carga negativa Separa as cadeias

260 kDa

72 kDa

52 kDa

42 kDa

10 kDa

Caracterização por SDS-PAGE da Nucleoprotéina recombinante do

Vírus da Influenza Aviária expressa em E. coli.

Western blotting

• Técnica bioquímica utilizada para determinar a quantidade relativa e o peso molecular de uma proteína dentro de uma mistura de proteínas ou outras moléculas.

• Detecção de antígenos proteicos - uso de anticorpos específicos

Caracterização por Western Blotting da Proteína NP recombinante do VIA expressa

em E. coli após purificação em resina de níquel-agarose.

1 2 3

260 kDa

72 kDa

52 kDa

42 kDa

Análise (mapeamento) dos epítopos

Epítopo linear ou contínuo

Epítopo conformacional ou

descontínuo

Imunodiagnóstico

• Sorologia - detecção de Acs contra antígenos virais e bacterianos específicos

• Clonagem e expressão da NP do VIA

• Testes de ELISA

• 121 soros testados

• Positivos – Acs presentes no soro reagiam com a NP recombinante

• Negativos – não ocorria reação

ELISA indireto

OXIDAÇÃO DA PEROXIDASE

Peroxidase

Peroxidase

NaIO4

C C

20`

H O

H

H

H

Álcool Ácido

+ 0H -

Aldeído (não conjuga)

DIÁLISE EM PH ÁCIDO

(4.4)

• Apresentam sequencias do material genético do agente infeccioso que codificam antígenos

Vacinas de DNA

Clonagem e expressão do gene (propagação)

Administração ao indivíduo (transfecção)

Células produzem a própria proteína (antígeno)

Resposta imunológica com memória

• Indução da imunidade protetora em camundongos contra o câncer e algumas doenças auto imunes.

• Em humanos:

Vacinas de DNA

Pesquisas direcionadas contra a AIDS, malária, tuberculose,

dengue, hepatite, raiva, leptospirose, teníase etc.

• Seleção do gene alvo

• Construção do vetor de expressão

• Frequência e via de administração

• Idade, saúde e espécie

Vai depender...

• Produção em larga escala – menos custo

• Mais fácil o controle de qualidade

• Estáveis a Tº ambiente

• Podem ser liofilizadas

• Sem necessidade de refrigeração – fácil comercialização, transporte, distribuição em regiões de difícil acesso

Vantagens

OBRIGADA! [email protected]