Anticuerpos Monoclonales Daniel Goicochea Universidad Nacional Mayor de San Marcos Facultad de Ciencias Biológicas Escuela Académico Profesional de Microbiología y Parasitología
Anticuerpos Monoclonales
Daniel Goicochea
Universidad Nacional Mayor de San MarcosFacultad de Ciencias BiológicasEscuela Académico Profesional de Microbiología y Parasitología
• Anticuerpos policlonales resultantes de un animal inmunizado pueden reconocer una variedad de epítopes sobre el antígeno
Anticuerpos monoclonales (Köhler y Milstein, 1975, 1976).
• Tecnología de hibridomas: fusionar un linfocito B (información codificante para el anticuerpo) con una célula de mieloma (célula plasmática cancerosa: capacidad de multiplicación y crecimiento ilimitado), para obtener un híbrido: síntesis y secreción de un anticuerpo y crecimiento perpetuo
Características de las células de mieloma
• Haber perdido la capacidad de secretar inmunoglobulina propia (Ig-neg)
• Carecer de alguna de dos enzimas requeridas para el crecimiento en un medio de cultivo selectivo denominado HAT– Hipoxantina-guanosina fosforibosil-transferasa
(HGPRT) -> HGPRT-neg – Timidina kinasa (TK) -> TK-neg
Medio Selectivo HAT
• Contiene hipoxantina, aminopterina y timidina• Aminopterina actúa como inhibidor de la vía
principal de síntesis de ácidos nucleicos• La ruta alterna utiliza la hipoxantina y la
timidina como precursores, y que requiere de las enzimas HGPRT y TK
Producción de hibridomas murinos
• ↑ inmunogenicidad - ↑ expansión clonal y ↑ probabilidad de hallar hibridomas con la especificidad deseada
• no importa si la inmunización despertó una respuesta contra posibles contaminantes de la preparación de antígeno
Producción de hibridomas murinos
• Inmunización de ratón singénico (cepa BALB/c) con antígeno de interés
• Se sacrifica al animal para obtener Linfocitos esplénicos
• Mezcla de Linfocitos con células de mieloma por Polietilénglicol (PEG) que promueve la fusión de membranas celulares.
Hibridomas
Cepa BALB/c
semanas
• Se obtiene una cantidad de hibridomas al azar• Se siembran las células distribuidas en placas
de 96 hoyos, en medio HAT• Sobreviven los hibridomas y proliferan (12-
16h)• Se prueba los sobrenadantes de los cultivos
mediante ELISA u otra técnica inmunológica
Producción de hibridomas murinos
• Se identifican cultivos con Ab de interés• Se separan células en nuevo cultivo
(clonación)• Obtención de cultivo monoclonal de
hibridoma, cuyas células se pueden conservar congeladas en nitrógeno líquido a -196°C
Producción de hibridomas murinos
Separación de células en nuevo cultivo
nitrógeno líquido a -196°C
Producción de AcM
• In vitro: cultivos masivos (concentraciones desde µg/ml hasta mg/ml de medio de cultivo)
• Material más fácilmente purificable, pero más costoso por requerimiento de equipos, medios y suplementos.
Producción de AcM
• In vivo: células del hibridoma inyectadas en cavidad peritoneal de ratones singénicos con respecto a la cepa que origino los LB y al mieloma
• Se produce un tumor ascítico del cuál se obtiene grandes volúmenes con alta concentración de AcM (mg/ml)
• Contiene proteínas contaminantes. Se requiere de purificación.
• Se sacrifican animales.
Producción de AcM
• Determinación de isotipos empleando antisueros que reconocen distintas subclases de cadenas pesadas
• Técnicas: IDD, ELISA• Evaluación de reacciones cruzadas,
especificidad molecular a nivel de epítopo, probando la capacidad de unión a péptido.
Características AcM
• Moléculas únicas e idénticas entre sí.• Especificidad y afinidad constante (reproducible)• La capacidad de reconocer solo a un epítopo
disminuye la posibilidad de reacciones cruzadas con otros Ag.
• Desventaja en precipitación: al solo reconocer un epítopo de un Ag, no forma complejos multimoleculares adecuados.
• Ventaja en aglutinación: reconoce un solo epítopo, pero que está disponible repetidamente en la superficie
Usos de Ab monoclonales
• Su especificidad los hace útiles para usar como Ab primarios en inmunoensayos.
• La especificidad también los hace eficiente para unión a antígeno en mezcla de moléculas (como en purificación por afinidad)
AcM Humanizados
• AcM murinos no son útiles en humanos, ya que el sistema inmune los detecta como extraños (HAMA: human anti-murine Ab)
• Obtención de AcM humanos: transformación de linfocitos B mediante infección in vitro virus Epstein-Barr, manipulación directa de ADN, producción de Ab quiméricos y humanizados.
• Epstein–Barr virus (EBV) es un virus de herpes que, in vitro, inmortaliza eficientemente casi todoas los LB.
• Las líneas celulares linfoblastoides (LCL’s) preservan las características iniciales de las células: producen y secretan Ig y expresan dichas moléculas, que pueden ser aisladas en líneas celulares que secreten Ab específicos
• Este método permite la producción de IgM, IgG, IgA, y IgE anticuerpos monoclonales
• Human monoclonal antibodies are promising reagents for passive immunization.
Humanización de Ab
• A schematic representation of the advancement from fully mouse antibodies, represented by red domains, to fully human antibodies, represented by blue domains.
Humanización de Ab
• Aplicación de ingeniería genética para reducir la inmunogenicidad de Ab de ratón.
• Se produjo Ab quiméricos conteniendo dominios constantes de Ab humanos y los dominios variables de ratón para mantener la especificidad.
Dominio variable de ratón
Dominio constante humano
Mouse Fab spliced to human Fc
Humanización de Ab
• Posteriormente se produjo Ab humanizados conteniendo solo los CDR de ratón (región determinante de complementaridad), que es la responsable de la unión a Ag
CDR de ratón
Dominio constante humano
Humanización a partir de quimeras de ratón