08/05/2019 Ragusa, 3 Ottobre 2015 Antibiogramma e rilevazione dei meccanismi di resistenza nei gram positivi Maria Lina Mezzatesta [email protected]Dipartimento di Scienze Biomediche e Biotecnologiche – Microbiologia Università degli Studi di Catania
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Antibiogramma e rilevazione dei meccanismi di resistenza ......08/05/2019 Ragusa, 3 Ottobre 2015 Antibiogramma e rilevazione dei meccanismi di resistenza nei gram positivi Maria Lina
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Brazilian ST239-HAMRSA-IIIA hVISA 0 Italian ST228-HAMRSA-I hVISA 18 é
Veterinary ST398-LAMRSA-IV hVISA 2 é
EMRSA15(GentaS) ST22-HAMRSA-IV hVISA 4 éUSA100-like ST5-HAMRSA-II hVISA 5 éDNS-VISA-MRSA ST1-HAMRSA-IV VISA 1 é
Current MRSA epidemiology
Sometimes they come back….or disappear!
Prevalence and epidemiology of MRSA: molecular features
Principali problemi di resistenzetests diagnostici
Ragusa, Ottobre 2015
Penicillina:meccanismo inducibile
Misurare Oxacilllina con cefoxitin
hVISA/VISA
VRSA
Linezolid R
Daptomycin non susceptibility
Ragusa, ottobre 2015
08/05/2019 Ragusa, ottobre 2015
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Ragusa, ottobre 2015
08/05/2019 Ragusa, ottobre 2015
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Ragusa, Ottobre 2015
S.aureus è uno dei maggiori patogeni umani e rappresenta una delle principali cause di infezioni nosocomiali.
MRSA
(Methicillin Resistant Staphylococcus aureus)
1882 – Dr. Oston lo descrisse per la 1° volta
1940 – Penicillina
1950 – Penicillino-resistenti
1960 – Meticillina
1961 – MRSA (UK)
Prima dell’avvento degli antibiotici, il tasso di mortalità dovuto aquesto batterio era abbastanza alto e l’incalzante diffusione diceppi di S.aureus resistenti alle penicilline portò, nel 1960,all’introduzione nella pratica clinica della meticillina, un derivatosemisintetico della penicillina.
La resistenza alla meticillina è dovuta all’acquisizione del gene
mecAche codifica una penicillin-binding- protein addizionale(PBP2 o
PBP2a) a bassa affinità per i B-lattamici.La PBP2a, non venendo saturata, sostituisce le funzioni delle
normali PBPs, producendo resistenza. Il gene mecA si trova
inserito in una particolare regione genica dettalocus mec
che rappresenta il cosidetto “mec complex”, costituito dai geni mecA, mecI e mecR
Ragusa, ottobre 201508/05/2019
MRSA
Crescita confluente fino
al dischetto
Espressione omogenea
Sfumatura interna all’alone
di inibizione
Espressione eterogenea
• mecA viene espresso a livelli più alti in presenza di
Cefoxitin rispetto a Oxacillina
• L’alone di Cefoxitin è più netto (migliore leggibilità)
• Leggere a luce riflessa
Cos’è questo?
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Ragusa, Ottobre 2015
Evaluation of discrepancies between oxacillin and cefoxitin in CoNS
• Many studies have reported that 30-ug cefoxitin disk is more sensitive than 1-ug oxacillin disk for the detection of oxa-resistance in CoNS.
• Conflicting results were published:
• 2.2% of CoNS with mecA displayed cefoxitin disk inhibition zone >25 mm;
• 1.5% of CoNS on a large sample (9017 strains)
Ragusa, Ottobre 2015
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I nuovi mec: mecB mecC
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Metodo “gold standard”:
presenza del gene mecA
Rilevazione della resistenza alla meticillina
Test rapido per PBP2a
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CLSI EUCAST
Susceptible (VSSA) 2 2
Intermediate (VISA) 4-8 -
Resistant (VRSA) 16 > 2
Clinical and Laboratory Standards Institute - CLSI, 2015;
European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing – EUCAST, 2015
• Intermediate resistance with 100% of the populationgrowing at 4 mg/L of vancomycin, and also sub.populationat 8 mg/L
• Mechanism: unknown, thickned cell wall is a commonfeature
VRSA
• Vancomycin MIC: 16 mg/L
• Omogeneous resistance
• Mechanism: plasmid mediated vanA gene
hVISA
• Vancomycin MIC: 1 to 2 mg/L
• Heterogeneouse resistance Subpopulations ofcells with varying levels of resistance to VAN;subpopulations of vancomycin intermediate cellswith growth at 8 mg/L at a low frequency of
10-6 CFU/ml.
• Mechanism: unknown, subpopulation of cells withVISA features
VISA traits
Phenotypic alteration
Slower growth
Smaller colony size
Thickened cell wall
Cell wall thickening
Genotypic alteration
Reduced agr activity
Reduced autolytic activity in part due to lower activity of VISA autolysin
Mutations, inactivation, and altered expression of graRS
VISA RANGE 2-4 2-4 8 0.5-4 0.25-0.5MIC50 4 2 8 8 0.25*MIC90 4 4 8 8 0.25*
hVISA behaviour against new drugs
0.12 0.25
1
0.50
0.25
0.120.50
1 1
0.25
VSSA
0.121 1
0.50 0.50
0.25
2 2
4
1
hVISA
4
2
8 8
0.25
4 4
8 8
0.25
VISA
* Possible seesaw effect: Werth BJ, et al., AAC 2013
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Ragusa, Ottobre 2015
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Daptomycin: mechanisms leading to attenuated daptomycin activity against S.aureus
Increased Daptomycin MICs in S.aureus:
1. Mutations in genes involved in the regulation of bacterial membranesurface charge: mprF (lysylphsphatidylglycerolsynthetase), yycFG (histidine kynase),rpoB/C, have also been identified in later stage of progression ofdaptomycin resistance in lab derived strains1,2.
2. Several dapto-R clinical isolates, lack these mutations!3. Dapto-non susceptible MRSA have emerged in parallel with VISA via
vancomycin exposure, raising the hypothesis that this mechanisms ofresistance might be due to impaired diffusion through thicker, lesscross-linked cell-wall, possible changes in membrane charge3,4,5
4. MORE WORK IS NEEDED TO FURTHER UNDERSTAND THE MECHANISMSOF THIS LOSS OF SUSCEPTIBILITY TO DAPTOMYCIN
1) Friedman L et al AAC 2006; 50:2137; 2) Mwangi MM et al – PNAS 2007; 104: 9451; 3) Pillai S
et al AAC 2007; 51: 2223; 4) Julian Ket al – AAC 2007; 51: 3445; Jones T et al – AAC 2008; 52:
269
Daptomycin resistance induced by vancomycin therapy
Isolates Dapto MIC Mprf mutations
S.aureus n.1 0.5 mg/L No
S.aureus n.2 1 mg/L No
S.aureus n.3 4 mg/L yes
Ragusa, ottobre 2015
-Autolytic and cell wall charges genes (mprf and dlt) involved
-Both drugs (vancomycin and daptomycin) exerted influence on increasing positive
charges on the cell wall (less binding of drugs)1;
-RpoB mutations involved2.
1) Stefani et al – personal data; 2) Cui L. et al AAC 2010; 54: 5222
In tutti i casi in cui sia
necessario confermare un
fenotipo di R inusuale,
inviare il ceppo ad un centro
di riferimento per la
conferma del fenotipo.
Ragusa, Ottobre 2015
Bacterial resistance to linezolid
• The first reports started to appear shortly after linezolid’s
introduction into the clinic1,2.
• Although the number of strains resistant to linezolid is still
low3,4 there are several reports about linezolid resistance
involving different clinical settings5,6,7.
• In almost all cases, resistance to linezolid affects the large
rbosomal subunit (50S) via a nucleotide mutation resulting in
G2576U (E.coli numbering) for one or more alleles of 23S
rRNA8 . After the first mutation arises, homologous
recombination and gene conversion of the other alleles can
take place.
• Gene dosage effect9, impairment of the biological fitness,
and cross-resistance to quinopristin/dalfopristin and
chloramphenicol.
1) Auckland C et al – JAC 2002; 50:743; 2) Tsiodras SH et al – Lancet 2001; 358:207;
3) Anderegg TR et al IJAA 2005; 26:13; 4) Jones RN et al – JAC 2006; 57:279; 5) Dobbs TE et al
JCM 2006; 44:3368; 6) Roberts SM. Et al –Ped Inf Dis 2006; 25: 562; 7)Seedat J et al- AAC 2006;
50: 4217; 8) Kloss Pl et al – J.Mol Biol 1999; 294:93; 9) Besier S. et al AAC 2008; 52: 1570
Linezolid resistance
The resistance to this antibiotic has been, until now, entirely associated with
distinct nucleotide substitutions in domain V of the 23S rRNA genes. Mutations in
associated ribosomal proteins also affect linezolid activity. Recently
Clinical mutants
G2576T
E.faecalis
E.faecium
S.aureus
CNS
Lab. mutants
G2447T, G2613T…
Enterococcus spp.
S.aureus
CNS
M, 100 bp; Lanes 1 to 6: 23S rRNA internal region
(V1V2); 7, V1V2-NheI restriction
NheI sequence
5'...G|CTAGC...3'
3'...CGATC|G...5'
322bp
98bp
M 1 2 3 4 5 6 7
Ragusa, Ottobre 2015
08/05/2019 Ragusa, ottobre 2015
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La lettura dell’alone di inibizione del Linezolid
sugli Stafilococchi deve essere effettuata
considerando anche le colonie più piccole visibili
ad occhio nudo presenti all’interno dell’alone
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Mutazionale (proteine ribosomiali )
e non mediato da cfr
PFGE No. of isolates ST SCCmec MECHANISM OF LNZR MIC range (mg/liter)
Meccanismo d’azione e resistenza della vancomicina
• Dal 1950 i glicopeptidi, vancomicina e teicoplanina, sono stati considerati come farmaci “salvavita” per il trattamento delle infezioni da enterococchi multiresistenti.
• Già nel 1988, è stata però riscontrata l’insorgenza di ceppi di E. faecium ed E. faecalis vancomicino-resistenti (VRE)
• La resistenza alla vancomicina si basa sulla produzione di un bersaglio alternativo.
• Normalmente il suo bersaglio è la parte terminale del precursore del peptidoglicano, D-ALA-D-ALA (figura A, in rosso), mentre le cellule resistenti non hanno il terminale appena citato bensì, D-ALA-D-LATTATO (o D-ALA-D-SER per il fenotipo VanC), che riduce di molto la sensibilità agli antibiotici glicopeptidici.
Classificazione fenotipica degli enterococchi resistenti alla vancomicina (VRE)
• Da un punto di vista fenotipico, si distinguono sei diverse classi di VRE ma, VanA e VanB, rappresentano i fenotipi maggiormente analizzati in ceppi di Enterococcus spp. isolati da materiali clinici.
Mics
VANCO
Mics
TEICO
Determinante
genico
mobilità specie
VanA 64->1.000 16-512 acquisito Si
(Tn1546)
E. faecium
E.faecalis
VanB 4-1.024 <0.5 acquisito Si
(Tn1549,
Tn1547)
E. Faecium
E.faecalis
VanC 2-32 <0.5 intrinseco no E.Gallinarum
E.caselliflavus
E.flavescens
VanD 128 4 acquisito No E. faecium
BM4339
VanE 16 <0.5 Acquisito No E. Faecalis
BM4405
VanG 16 <0.5 acquisito no E. Faecalis
WCH19
Il cluster genico vanA risiede su un trasposone coniugativo,Tn1546, appartenente alla famiglia dei Tn3 integrabili sul genomao su plasmidi autotrasferibili.
Tn1546
CEPPO Specie
MICs
vanco
MICs
teico Fenotipo PCR
MICs
dapto
MICs
tgc
MICs
q/d
MICs
lnz
5895 E. faecium 256 64 VanA vanA 4 ≤0,25 0,5 32
5903 E. faecium 16 2 VanB vanB 4 ≤0,25 0,5 16
Impallomeni G. E. faecalis >256 >256 VanA vanA 2 0,25 2 2