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Profesor Patrocinante
Dr. Jaime Figueroa V.
Instituto de Bioquímica y
Microbiología
Facultad de Ciencias
ANÁLISIS DE EXPRESIÓN DE LOS RECEPTORES TIPO
TOLL: TLR1, TLR9 Y TLR22 FRENTE A INFECCIÓN CON
Piscirickettsia salmonis EN CULTIVO PRIMARIO DE RIÑÓN
ANTERIOR DE TRUCHA ARCOIRIS (O. mykiss)
Tesis de Grado presentada como
parte de los requisitos para optar al
grado de Licenciado en
Bioquímica y Título Profesional de
Bioquímico
BÁRBARA DANIELA PEÑA SAYAGO
VALDIVIA – CHILE
2013
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“El miedo es la más grande
discapacidad de todas”
Nick Vujicic
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AGRADECIMIENTOS
En primer lugar quiero agradecer al Dr. Jaime Figueroa por su ayuda, guía y
entretenidas historias. A Coty por tener la mejor disposición para enseñarme cada cosa que
necesité. A Tamy por ser mi mentora, por su buena onda, amistad y paciencia desde mis
inicios en el laboratorio, además, por estar siempre presente, ayudándome, apoyándome y
aconsejándome. A Clara y Alexei, por su compañía, consejos y risas. A Pablo por su
amistad y por sobre todo, por la prolactina salvadora. A los integrantes del LabBMP
Denise, Adolfo, Mary, Maty, CC, Fran, Conchita, Nato y Profe Gudy por la buena onda,
entretenida compañía, amenas conversaciones que hacían que los días fueran más que sólo
rutina y por todos los HH que arreglaban cualquier problema. Fueron y serán un gran
apoyo, cada uno de ellos colaboró en mi tesis, quizás no en experimentos, pero si con una
sonrisa o una palabra de apoyo o simplemente con alguna canción adecuada para alegrar la
vida.
Muy en especial a mis queridos amigos, Willy por ser mi cómplice, Nano por
quererme tal cual soy y Andrés por estar siempre conmigo, incluso en la distancia. A los
tres les doy gracias por su compañía, cariño y amistad durante toda esta travesía, y por
hacer de ésta etapa la mejor de toda la universidad, les deseo todo el éxito del mundo.
A la Esme por ser tan especial, una gran persona y amiga.
A mi familia, mis padres por estar a mi lado apoyándome y alentándome siempre. A
mi hermanita adorada por ayudarme, apoyarme, comprenderme y acompañarme.
Esta tesis fue financiada por el proyecto INNOVA Chile Código 07CN13: IBM-259
y el proyecto FONDAP 15110027: “Interdisciplinary Center for Aquaculture Research”
(INCAR).
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INDICE GENERAL
Página
1. RESUMEN 1
1.1. Summary 2
2. INTRODUCCIÓN 3
2.1. Generalidades del Sistema inmune 3
2.2. Sistema inmune de peces Teleósteos 4
2.2.1. Órganos del sistema inmune de peces 5
2.2.2. Sistema Inmune Innato de peces 6
2.3. Receptores tipo Toll 8
2.3.1. TLR en peces 17
2.4. Prolactina 22
2.5. Piscirickettsia. Salmonis 25
2.6. Relación TLR, P. salmonis y PRL 26
3. MATERIALES Y MÉTODOS 30
3.1. Materiales 30
3.1.1. Equipos e instrumentos 30
3.1.2. Reactivos 32
3.1.3. Soluciones 34
3.1.4. kit de reactivos 35
Page 5
ii
3.1.5. Material Biológico 35
3.1.6. Animales de experimentación 35
3.2. Métodos 36
3.2.1. Extracción de órganos 36
3.2.2 Extracción de RNA total de distintos órganos de O. mykiss 36
3.2.2.1. Cuantificación y evaluación de pureza del RNA 37
3.2.3. Transcripción reversa 37
3.2.4. Diseño de partidores 38
3.2.5. Amplificación de segmentos del cDNA de los genes en estudio 38
3.2.6. Fraccionamiento electroforético en gel de agarosa 40
3.2.7. Siembra de células SHK-1 40
3.2.7.1. Cuantificación de las células SHK-1 41
3.2.8. Cultivo de P. salmonis 41
3.2.8.1. Cuantificación de P. salmonis por el método de Mc Farland 43
3.2.8.2. Verificación de P. salmonis 43
3.2.9. Extracción de proteínas totales de P. salmonis 43
3.2.9.1. Cuantificación de proteínas 44
3.2.10. Inactivación de P. salmonis 44
3.2.11. Estandarización de Prolactina 45
3.2.11.1. Electroforesis en gel de poliacrilamida 45
3.2.11.2. Western blot confirmatorio de Prolactina 46
3.2.11.3. Ensayo de actividad de prolactina 47
Page 6
iii
3.2.12. Ensayos de cinéticas de expresión de TLR1, TLR22 y TLR9 47
en cultivo primario
3.2.12.1. Cultivo primario y purificación de leucocitos 47
de riñón anterior de trucha
3.2.12.2. Conteo y evaluación de células 48
3.2.12.3. Cinéticas de expresión 49
3.2.12.4. Infección con P. salmonis 49
3.2.12.5. Estimulación con prolactina 49
3.2.12.6. Recolección de los puntos de la cinética y 49
extracción de RNA
3.2.12.7. Cuantificación de la expresión génica de 50
las cinéticas mediante RT-qPCR
4. RESULTADOS 52
4.1. Análisis semi-cuantificación de la expresión de TLR1, TLR22 y MyD88 en 52
distintos órganos de trucha arcoíris .
4.2. Evaluación de Prolactina 54
4.2.1. Electroforesis en gel de poliacrilamida y western blot confirmatorio 54
4.2.2. Ensayo de actividad de prolactina 54
4.3. Inactivación P. salmonis cepa IB-40 56
4.4. Cinéticas de expresión 59
4.4.1. Evaluación de la cinética de expresión de TLRs 67
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iv
4.4.1.1. Evaluación de la cinética de expresión frente 68
a infección con P. salmonis IBM-40 viva________________________________
4.4.1.2. Evaluación de la cinética de expresión frente 70
a infección con P. salmonis LF-89 viva_________________________________
4.4.1.3. Evaluación de la cinética de expresión de TLR 70
frente a infección IBM-40 inactivada por calor____________________________
4.4.1.4. Evaluación de la cinética de expresión frente 73
a estimulación con proteínas totales de IBM-40_________ __________________
4.4.1.5. Evaluación de expresión de TLR en la cinética 75
con prolactina y prolactina más IBM-40 viva_____________________________
4.4.1.6. Evaluación de expresión en la cinética infectada 78
con IBM-40 respecto a infectada con LF-89____________________
4.5. Clonamiento de TLR2 80
5.- DISCUSIÓN 82
5.1. Evaluación semi-cuantitativa de la expresión de TLR1, 82
TLR22 y Myd-88 en distintos órganos de trucha arcoíris
5.2. Inactivación P. salmonis cepa IBM-40 84
5.3. Clonamiento de TLR2 85
5.4. Cinéticas de expresión 86
5.4.1. Evaluación de Cinéticas por receptor 86
5.4.1.1. Cinéticas de expresión de TLR1 88
5.4.1.2. Cinéticas de expresión de TLR22 89
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v
5.4.1.3. Cinéticas de expresión de TLR9 90
5.4.1.4. Cinéticas de expresión de Myd88 91
5.4.1.5. Cinéticas de expresión de IL-1β 92
5.4.2. Evaluación de Cinéticas por desafíos de infección 95
5.4.2.1. Evaluación de la cinética de expresión frente a infección 95
con IBM-40 viva
5.4.2.2. Evaluación de la cinética de expresión frente a infección con 96
la cepa LF-89 viva
5.4.2.3. Evaluación de la cinética de expresión de TLR frente a 96
infección con la cepa IBM-40 inactivada por calor
5.4.2.4. Evaluación de la cinética de expresión frente a 97
estimulación con proteínas totales de IBM-40
5.4.2.5. Evaluación de expresión de TLR en la cinética con prolactina 98
e infección con IBM-40 viva previa estimulación con PRL
5.4.2.6. Evaluación de expresión en la cinética infectada con IBM-40 99
respecto a infectada con LF-89
6. REFERENCIAS 102
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vi
INDICE DE FIGURAS
Página
Figura 1 Estructura de un Receptor Tipo Toll, TLR 10
Figura 2 Esquema comparativo de las vías dependiente e 16
independiente de MyD88 _______ _______ __________________________ __
Figura 3 Esquema de los dominios de organización de TLRs de O. mykiss 21
Figura 4 Esquema representativo de las moléculas de la señalización 23
de TLR descubiertas en peces ______ ___________________________________
Figura 5 Análisis de expresión de TLR1, TLR22 y Myd-88 en distintos 53
órganos de O. mykiss _____ ______ ____________________________________
Figura 6 Western blot confirmatorio para prolactina 55
Figura 7 Evaluación de actividad de prolactina 57
Figura 8 Curva de inactivación de IBM-40 a distintas temperaturas 58
Figura 9 PCR convencional para β-actina de cDNA de riñón anterior 60
infectado con LF-89 viva_____ .________________
Figura 10 Estandarización de partidores para la amplificación de TLR1 61
Figura 11 Estandarización de partidores para la amplificación de TLR9 62
Figura 12 Estandarización de partidores para la amplificación de TLR22 63
Figura 13 Estandarización de partidores para la amplificación de Myd-88 64
Figura 14 Estandarización de partidores para la amplificación de IL-1β 65
Figura 15 Estandarización de partidores para la amplificación de EF1-α 66
Figura 16 Gráficos de cinéticas de expresión frente a IBM-40 viva 69
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vii
Figura 17 Gráficos de cinéticas de expresión frente a LF-89 viva 71
Figura 18 Gráficos de cinéticas de expresión frente a la cepa IBM-40 inactivada 72
Figura 19 Gráficos de cinéticas de expresión frente a proteínas totales 74
de la cepa IBM-40_____________ ___________________ _________________
Figura 20 Gráficos de cinéticas de expresión de células infectadas con 76
IBM-40 viva e inmuno-estimuladas previamente con PRL .
Figura 21 Comparación de Cinéticas de expresión frente a infección con 79
una cepa patógena respecto a una no patógena de P. salmonis .
Figura 22: Esquema representativo del entrecruzamiento en las vías de señalización 100
de TLR y receptor de Prolactina .
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viii
INDICE DE TABLAS
Página
Tabla I TLR en mamíferos, sus ligandos, localización y señalización 12
Tabla II TLR en peces teleósteos: especies que los poseen y ligandos descritos 18
Tabla III: Resumen partidores utilizados para RT-qPCR, producto esperado 39
y referencia
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ix
Lista de Abreviaturas
ABSA albúmina de suero de bovino
DAB 3,3’-diaminobencidina
DAMP Patrones moleculares asociados a daño
IFN Interferón
IL Interleuquina
LPS Lipopolisacárido
LRR Regiones ricas en leucina
LRR-CT Regiones ricas en leucina C-terminal
MHC Complejo mayor de histocompatibilidad
MyD88 Myeloid differentiation primary response 88
NF-ƙB Factor nuclear ƙB
O. mykiss Oncorhynchus mykiss
P. salmonis Piscirickettsia salmonis
PAMP Patrones moleculares asociados a patógenos
PBS Tampón fosfato salino
PMSF Fosfometilsulfonilfosfato
PRL Prolactina
rPRL Receptor de prolactina
RRP Receptor de Reconocimiento de Patrones
SDS Dodecil sulfato de sodio
SHK-1 Salmon Head Kidney-1
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x
Temed N, N, N´, N´-tetrametildiamina
TIR Dominio del receptor Toll/IL-1
TLR Receptores tipo Toll
Tris Tris (hidroximetil)aminometano
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1
1.- RESUMEN
El Sistema Inmune Innato, es la primera barrera de defensa de los organismos frente a
patógenos, los receptores tipo Toll (TLR) son parte fundamental de este sistema, siendo los
encargados de reconocer patrones moleculares asociados a patógenos (PAMPs) y desencadenar
una respuesta en el hospedero. Existen varios TLR, cada uno de ellos es capaz de reconocer uno o
más PAMPs de diversos patógenos, como virus, bacterias u hongos, y desencadenar una
respuesta inmune mediante una cascada de señales. En peces teleósteos se han descrito algunos
TLR y además se han descubierto otros específicos de peces.
Piscirickettsia salmonis es uno de los principales patógenos que afecta a cultivo de
salmónidos, produce una infección sistémica, caracterizada por la colonización de varios órganos
incluyendo riñón, hígado, bazo, intestino, cerebro y las branquias.
Debido a que el mecanismo de reconocimiento de las células blanco, los mecanismos de
invasividad y los tipos de respuesta generada frente a P. salmonis, son hasta ahora prácticamente
desconocidos, es importante el estudio del mecanismo de acción involucrado en una infección
bacteriana. Se estudiaron algunos de los TLR involucrados en la respuesta inmune de trucha, a
distintos tiempos, ante la infección de P. salmonis viva, P. salmonis inactivada y proteínas totales
de P. salmonis, además de evaluar el rol inmunoestumulador de Prolactina. Para ello se realizaron
cinéticas en cultivo primario de riñón anterior de O. mykiss, y se analizaron mediante RT-qPCR
la expresión de TLR1, TLR22 y TLR9 ante los distintas tratamientos.
Con los resultados obtenidos se puede concluir que O. mykiss expresa los receptores TLR1,
TLR22 y MyD88en distintos órganos. Los receptores estudiados modulan su expresión
dependiendo de la forma de exposición de P. salmonis sugiriendo que reconocen algún PAMPs
de éste patógeno.
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2
1.1 SUMMARY
The innate immune system is the first line of defense of organisms against pathogens, Toll-
like receptors (TLR) are a key part of this system, being responsible for recognizing pathogen-
associated molecular patterns (PAMPs) and triggering the host response. Each TLR can
recognize one or more PAMPs of various pathogens, such as viruses, bacteria or fungi, and
trigger an immune response through signaling cascade. Some TLR were described in teleost fish
and some of them are fish specific.
Piscirickettsia salmonis is one of the main pathogens that affect salmonid farming, produces a
systemic infection, characterized by colonization of several organs including kidney, liver,
spleen, intestine, brain and gills.
Because, the mechanism of recognition of target cell and response generated, invasion
mechanisms and type of response generated against P. salmonis, are virtually still unknown, it is
important to study the mechanism of action involved in a bacterial infection. We studied the
response of the TLR in time, involved in the immune response of trout to infection by live P.
salmonis, inactive P. salmonis and total protein P. salmonis. In addition, we evaluate the
inmunostimulator role of prolactin, using primary culture kinetics from O. mykiss anterior kidney,
and analyzing the expression of TLR1, TLR22 and TLR9 by RT-qPCR in response to
P.salmonis.
Our results suggest that O. mykiss express receptors TLR1, TLR22, TLR9 in different organs.
Studied receptors modulate their expression in response to P. salmonis, suggesting a recognition
of some PAMPs of this pathogen.
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3
2.- INTRODUCCIÓN
2.1 Generalidades del Sistema Inmune
El sistema inmune provoca una reacción coordinada ante sustancias extrañas, ya sea
microbiológicas (virus, bacterias, hongos, protozoos y parásitos multicelulares) o contra
macromoléculas (proteínas y polisacáridos), sin implicar una consecuencia patológica de tal
reacción (Abbas et al., 2001). Los tipos celulares, tejidos y moléculas que conforman el sistema
inmune, ante un agente o sustancia extraña al organismo, median una respuesta coordinada y
colectiva, la cual se denomina respuesta inmunitaria. La respuesta inmunitaria comienza con el
reconocimiento del patógeno o del material extraño y finaliza con el desarrollo de un mecanismo
capaz de eliminarlo (Male et al., 2007). Existe una gran diversidad de agentes infecciosos,
requiriendo una gran variedad de respuestas para así poder combatir cada tipo de infección (Male
et al., 2007).
Las respuestas inmunitarias pueden ser divididas en dos categorías: Respuesta inmune
innata (natural o inespecífica) y Respuesta inmune adaptativa (adquirida o específica), ambas se
diferencian en la especificidad y el tiempo que tardan en provocar su efecto. La respuesta innata
no se modifica tras la exposición reiterada a un determinado patógeno, sin embargo, es capaz de
discriminar entre una variedad de patógenos y lo propio, deduciéndose que no es completamente
no específica como se pensaba (Randon-Barragan, 2009). La habilidad de la respuesta innata, de
reconocer rasgos comunes a los patógenos más frecuentes sin necesidad de haber estado
previamente expuestos a los mismos (Rubio-Godoy, 2010) genera una respuesta inmune más
rápida (Randelli et al., 2008). Además, carece de memoria inmunológica y sus componentes
humorales y celulares juegan un rol importante en activar e instruir la respuesta inmune
adaptativa (Janeway et al., 2002; Imler et al., 2004). Por su parte, la respuesta adaptativa,
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4
responde de manera específica a cada patógeno, por lo tanto es más lenta en su desarrollo,
además posee la capacidad de crear memoria inmunológica (Rubio-Godoy, 2010). En resumen,
las dos características claves de la respuesta adaptativa son especificidad y memoria (Male et al,
1996).
Las respuestas innata y adaptativa actúan de forma integrada y coordinada, de tal forma
que la respuesta inmunitaria innata representa el proceso inicial e instructor en la defensa del
hospedero en mamíferos (Bautista et al., 2005). La respuesta inmune innata, constituye la primera
línea de defensa que controla los primeros pasos de la respuesta inmune, está conformada por
barreras físicas, células fagocíticas, eosinófilos, células citotóxicas naturales (NK) y diversas
moléculas que circulan en la sangre (complemento y proteínas de la fase aguda) (Male y Roitt,
1996; Abbas et al., 2001).
La respuesta inmune adaptativa puede ser humoral, mediada por anticuerpos, donde
juegan un rol crucial los linfocitos B, o celular, mediada principalmente por linfocitos T
(Janeway et al., 2002). Los linfocitos son capaces de reconocer un patógeno específico, tanto si
están dentro de las células hospedera, como si se encuentran en el torrente sanguíneo o fluidos
(Male y Roitt, 1996).
2.2 Sistema inmune de peces teleósteos
El sistema inmune de peces teleósteos muestra características similares al de aves y
mamíferos, presentando respuestas celulares y humorales que poseen características de ser
específicas y de tener memoria (Van Muiswinkel et al, 1995). Dentro de la repuesta humoral
están: las barreras físicas (piel, mucosas y escamas) y secreciones (lisozima, proteasas, factores
del complemento, entre otros) (Du Pasquier et al., 2000; Rubio et al., 2010). Por su parte, el
componente celular está conformado por: macrófagos, granulocitos, células eosinófilas y las
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5
células citotóxicas no específicas. La inmunidad celular no específica comprende tres mecanismo
defensivos: inflamación, fagocitosis y citotoxicidad no específica; en cambio, la inmunidad
celular específica depende de que células portadoras de receptores del MHC clase I sean capaces
de presentar antígenos a los linfocitos T CD8+ (Ohta et al., 2006; Rubio, 2010). Los diferentes
tipos celulares que trabajan en cada sistema, conocidos en mamíferos, se han reconocido en peces
teleósteos, incluyendo células que son morfológica y funcionalmente equivalentes a las de
mamíferos como: neutrófilos, macrófagos, monocitos, trombocitos, células B, células
plasmáticas, células T, células natural killer y eosinófilos (Alvarez-Pellitero, 2008).
Pese a las similitudes entre el sistema inmune de teleósteos y el de otros vertebrados,
existen claras diferencias. La más clara es que los peces dependen en mayor grado de los
mecanismos de respuesta innata que los mamíferos. Al ser los peces organismos poiquilotermos,
no son capaces de activar adecuadamente algunas funciones inmunitarias adaptativas a bajas
temperaturas, como la producción de anticuerpos, asociado a una lenta proliferación de linfocitos
(Rubio-Godoy, 2010), debido a que la respuesta inmune adaptativa es dependiente de la
temperatura (Abruzzini et al., 1982; Clem et al., 1991). En consecuencia, en peces prevalece la
respuesta inmunataria innata, que es relativamente independiente de la temperatura (Magnadóttir,
2006).
2.2.1 Órganos del sistema inmune de peces
Peces teleósteos carecen de médula ósea y nódulos linfáticos, de hecho, todos los órganos
y tejidos del sistema inmune de especies de teleósteos presentan un carácter mixto, no habiéndose
encontrado órganos exclusivamente linfoides.
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6
Los órganos principales del sistema inmune en peces teleósteos son el timo, el bazo y el
riñón (Alvarez-Pellitero, 2008; Rubio-Godoy, 2010; Zapata et al., 2006). En peces el riñón consta
de dos partes, la anterior con función hematopoyética y la porción posterior con función
excretora. En los peces, la hematopoyesis se produce en el riñón anterior, que es la ubicación para
la producción de todos los tipos de células hematopoyéticas y comparable a la médula ósea de
mamíferos (Sepulcre et al., 2002), también se ha visto que está implicado en el aclaramiento de
antígenos en circulación, además de ser el principal sitio de producción de anticuerpos.
El riñón anterior y el bazo son reconocidos como órganos linfoides secundarios, órganos
donde se localizan poblaciones de macrófagos y linfocitos capaces de iniciar una respuesta
inmune adquirida (Rubio-Godoy, 2010). En peces no existen ganglios linfáticos, por lo que el
órgano linfoide secundario más importante es el bazo, ha sido implicado en el aclaramiento de
antígenos y complejos inmunes de la circulación sanguínea, también tiene un papel en la
presentación de antígenos y el inicio de la respuesta adaptativa.
El timo, representado por masas de tejido linfo-mieloide que aparecen junto a las
branquias, puede ser considerado como agregación de macrófagos que procesan la proliferación
de células T (Alvarez-Pellitero, 2008).
2.2.2 Sistema inmune innato de peces
El sistema inmune innato desempeña un papel significativo en todos los organismos
multicelulares. La característica clave del sistema es su capacidad para reconocer y responder a
los microorganismos invasores, reconoce y detecta patógenos potencialmente nocivos y
rápidamente desencadena mecanismos apropiados de defensa que previenen o minimizan el daño
tisular.
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7
Los vertebrados, incluidos los peces teleósteos, han desarrollado una serie de receptores
de reconocimiento de patógenos (RRP) para detectar y responder a diversos patrones moleculares
asociados a patógenos (PAMP). RRPS reconocen (PAMP), que incluyen proteínas, lípidos y
nucleótidos, y como resultado la activación de la respuesta inmune innata del huésped (Pichlmair
y Reise Sousa, 2007). Después de detectar los PAMPs, las células del sistema inmune innato del
huésped inician un amplio espectro de respuestas de defensa que resultan en el desarrollo de la
inflamación y la defensa del huésped frente a la infección (Akira et al., 2006). Se han
identificados tres clases principales de RRPs: i) Los receptores de tipo Toll (TLRs) que
reconocen ligandos tanto en la superficie extracelular como dentro del endosoma, ii) receptores
tipo NOD (NLRs) que son receptores citoplasmáticos, y iii) receptores tipo RIG-I (RLRs), un
grupo de receptores intracelulares que reconocen virus (Akira et al., 2006, Meylan et al., 2006,
Chen et al., 2009, Franchi et al., 2010 y Hansen et al., 2011). De estos receptores, los TLR fueron
los primeros caracterizados y más ampliamente estudiados en vertebrados e invertebrados
(EwaSnaar-Jagalska et al., 2004, Jault et al., 2004 y Hansen et al., 2011). Las células de la
respuesta inmunitaria adquirida que expresan RRPs son: macrófagos, células dendríticas,
mastocitos, neutrófilos, eosinófilos, células NK entre otras (Janeway et al., 2002).
La inmunidad innata inicia los mecanismos de defensa inmediatos basados en RRPs que
reconocen Patrones Moleculares Asociados a Patógenos, PAMPs y también Patrones Moleculares
asociados a Daño, DAMPs, que son estructuras endógenas liberadas de tejidos dañados (Randon-
Barragan, 2009). Todos los RRPs son expresados constitutivamente por el hospedero y pueden
detectar al patógeno independiente del ciclo de vida en el que se encuentre ya que reconocen
PAMPs, son expresados en todas las células de un tipo celular, independientes de memoria
inmunológica dando lugar a distintas respuestas contra patógenos (Akira et al., 2006).
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8
Los PAMPs son estructuras moleculares que sólo están presentes en patógenos
microbianos y no se encuentran en el organismo hospedero, son estructuras esenciales para la
supervivencia de los patógenos, es decir, sus mutaciones son letales para el patógeno (Moreno et
al., 2003), además, son estructuras compartidas por un gran número de patógenos. Las
características antes mencionadas, permiten que un número limitado de RRPs logre discriminar lo
propio de lo ajeno y puedan reconocer una gran variedad de patógenos. Esta información permite
identificar el tipo de patógeno que está invadiendo y permite evaluar el tipo de respuesta contra él
(Medzhitov et al., 2000; Bautista et al., 2005).
Los RRPs se pueden encontrar en la membrana celular, en compartimentos dentro de la
célula (Medzhitov et al., 2000) o pueden ser secretados al torrente sanguíneo y fluidos de tejidos
(Janeway et al., 2002). Las funciones de estos receptores son: i) opsonización de la bacteria o
virus, por fagocitosis o activación de la vía de las lectinas, además de producción de mediadores
de la inflamación, con el fin de impedir la diseminación del patógeno antes de que se desarrolle la
inmunidad adquirida (Moreno et al., 2003); ii) captación de agentes patógenos por los fagocitos y
células dendríticas; iii) activación de las vías de señalización que dan lugar a la inducción de la
transcripción de genes de respuesta inmune, tales como los péptidos antimicrobianos y citoquinas
inflamatorias (Medzhitov et al., 2000; Akira et al., 2006).
2.3 Receptores tipo Toll
Los TLR son los principales receptores de reconocimiento de patrones (PRR) de la
superficie celular en el reconocimiento de los componentes microbianos y la inducción de
respuestas inmunes (Akira y Takeda, 2004). Los TLR son expresados en células como:
neutrófilos, macrófagos, células dendríticas, células epiteliales mucosas, células B, células T,
células trofoblásticas, plaquetas y células megacariocíticas (Randon-Barragan, 2009; Takano et
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9
al., 2010). También se encuentran en algunas células no inmunitarias como fibroblastos y células
epiteliales (Takano et al., 2010).
Los TLR se encuentran en vertebrados e invertebrados (Imler et al., 2004), son
glicoproteínas transmembrana de tipo 1, con tamaños moleculares entre 90-115 kDa. Se
distinguen por poseer un dominio extracelular de unión al ligando compuesta de repeticiones
ricas en leucina (LRR), así como uno intracelular, dominio del receptor Toll/IL-1, llamado
dominio TIR, por su homología con el dominio citoplasmático del receptor de IL-1 (Akira y
Takeda, 2004; Takano et al., 2010). La estructura de un receptor tipo Toll se puede observar en la
figura 1.
Las LRRs se encuentran en tándem y consisten entre 20-40 aminoácidos de largo, los que
contienen una secuencia consenso de 10 aminoácido, XLXXLXLXXN, característica de las LRR
en todos los TLR (Bell et al., 2003; Matsushima et al., 2007). Además de una secuencia
consenso, XɵXXɵXXXXFXXLX (ɵ corresponde a un aminoácido hidrofóbico), que sólo la
poseen algunas LRR en los TLR. También contienen una secuencia consenso, la LRR-CT,
LxxLxLxxNP(F/L)xCxCxxxx (F/L)xxxx, importante para mantener el dominio extracelular cerca
de la membrana plasmática (Bell et al., 2003; Matsushima et al., 2007). Las LRRs en su conjunto
forman una estructura tipo “herradura” para el dominio extracelular del receptor (Bell et al.,
2003). La estructura tipo herradura es característica de estos dominios, las variaciones en la
secuencia y el largo de la inserción de las LRR generan diferentes conformaciones y se cree que
esto está relacionado con el reconocimiento especifico de los PAMP (Bell et al., 2003).
El dominio intracelular, TIR, está compuesto de aproximadamente 200 residuos de
aminoácidos (Jault et al., 2004), se pueden distinguir tres regiones importantes funcionalmente:
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Figura 1: Estructura de un Receptor Tipo Toll, TLR. A) Esquema de los dominios
característicos de un TLR. Dominio extracelular (morado) que contiene repeticiones ricas en
leucina (LRR); TM: Región transmembrana (rosado) y Región intracelular que contiene el
dominio TIR (Dominio citoplasmático del receptor IL-1/Toll) en verde. B) Esquema basado en la
cristalización de TLR9 humano (Figura 3 de Brandl et al, 2012).
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box1, box2 y box3, importantes en la interacción con proteínas de señalización y conservados
entre los TLR de mamíferos y peces teleósteos (Takano et al., 2010).
Los ligandos para TLRs son motivos estructurales conservados de los microbios,
denominado PAMP, éstos incluyen lipopolisacárido (LPS), flagelina, lipoproteínas, glicolípidos,
y los ácidos nucleicos de origen bacteriano, viral, parasitario o fúngica. En la Tabla I se muestra
un resumen de los TLR que se han encontrado en mamíferos junto con los PAMPs que reconocen
cada uno de ellos.
Los TLR una vez unidos a su ligando se dice que están activados, formando dímeros con
otros TLRs, ya sean homodímero o heterodímeros. Se ha sugerido que una vez que los TLR se
activan, desencadenan la señalización induciendo dimerización de los dominios TIR, lo que
provee una plataforma para el reclutamiento de las proteínas adaptadoras de la cascada de
señalización (O´neill et al., 2007; Jin et al., 2007). Este grupo de moléculas adaptadoras, se
caracteriza por poseer un dominio TIR. Las interacciones TIR-TIR entre la molécula adaptadora
y el dominio intracelular del TLR desencadenan la cascada de señalización. Los adaptadores que
se han descrito, hasta el momento, en mamíferos son Factor de diferenciación mieloide 88
(MyD88), proteína adaptadora con un dominio TIR (TIRAP), adaptador con dominio TIR que
induce IFN-β (TRIF), y molécula adaptadora relacionada a TRIF (TRAM) (Kumar et al., 2009).
El descubrimiento de varios adaptadores que contienen TIR, llevaron a la comprensión que tipos
individuales de TLR reclutan distintos adaptadores citosólicas que pueden desencadenar
respuestas específicas a microbios determinados (Akira et al, 2006; Kawai etal., 2010). Además,
el tipo de señalización celular específicas definidas por sus propiedades inmunológicas pueden
alterar la respuesta desencadenada por la señal de un mismo TLR en diferentes tipos de células
(Barbalat et al., 2009).
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Tabla I: TLR en mamíferos, sus ligandos, localización y señalización.
TLR Localización Ligando Exógeno Ligando Endógeno Adaptador Factor de
transcripción
Efector
TLR1 Membrana
plasmática
Tracil-Lipopéptidos;
factores solubles; Modulina
NC TIRAP;
MyD88
NF-ƙB Citoquinas
inflamatorias
TLR2 Membrana
plasmática
Lipoproteínas/lipopéptidos;
Peptidoglican; Ácido
lipoteitoico; Porinas;
Lipopolisacáridos atípicos;
Factores solubles;
Glicolípidos; Proteina A
membrana externa;
Glicoinositolfosfolípidos;
Proteínas de estructura viral;
Hemaglutininas; Zymosan;
Lipoarabinomanano
HSP60; HSP70;
HSP96;HMGB1;
Ácido hialurónico
TIRAP;
MyD88
NF-ƙB Citoquinas
inflamatorias
TLR3 Endolisosoma ssRNA; dsRNA mRNA TRIF NF-ƙB; IRF3,7 Citoquinas
inflamatorias;
IFNs tipo I
TLR4 Membrana
plasmática
LPS; HSP60 bacterino;
Proteínas envoltura viral;
Proteínas fusión viral;
Glicoinositolfos-folípidos;
Taxol
HSP22-60-70-96;
HMGB1; β-efensin2;
Fibronectina; Ácido
hialurónico; Heparan
sulfato; Fibrinógeno
TIRAP;
MyD88;
TRAM;
TRIF
NF-ƙB; IRF3,7 Citoquinas
inflamatorias;
IFNs tipo I
NC: No se conoce; Citoquinas inflamatorias: TNF-α, IL1β, etc. Basado en Manavalan et
al, 2011; Moreno et al, 2003; Janssens et al, 2003; Kumar et al, 2009.
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Tabla I: TLR en mamíferos, sus ligandos, localización y señalización (continuación).
TLR Localización Ligando Exógeno Ligando
Endógeno
Adaptador Factor de
transcripción
Efector
TLR5 Membrana
plasmática
Flagelina NC MyD88 NF-ƙB Citoquinas
inflamatorias
TLR6 Membrana
plasmática
Diacil-lipopéptidos;
Ácido lipoteitoico;
Zymosan
NC TIRAP; MyD88 NF-ƙB Citoquinas
inflamatorias
TLR7 Endolisosoma ssRNA (Virus) RNA endógeno MyD88 NF-ƙB; IRF7 Citoquinas
inflamatorias;
IFNs tipo I
TLR8 Endolisosoma ssRNA (Virus) RNA endógeno MyD88 NF-ƙB; IRF7 Citoquinas
inflamatorias;
IFNs tipo I
TLR9 Endolisosoma Motivos CpG no
metilados
DNA endógeno MyD88 NF-ƙB; IRF7 Citoquinas
inflamatorias;
IFNs tipo I
TLR10 Extracelular NC NC NC NC NC
NC: No se conoce; Citoquinas inflamatorias: TNF-α, IL1β, etc. Basado en Manavalan et
al, 2011; Moreno et al, 2003; Janssens et al, 2003; Kumar et al, 2009.
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14
En un comienzo sólo fue descrita MyD88 como proteína adaptadora, por lo que las vías
de señalización han sido categorizadas dentro de dos vías mayores: la vía dependiente de MyD88
y la vía independiente de MyD88 (o vía dependiente de TRIF) (Kawai y Akira., 2007).
Vía Dependiente de MyD88: Es utilizada por todos los TLR menos el TLR3. La
estimulación de TLR por su ligando recluta MyD88 a su dominio TIR lo que desencadena
una cascada de señalización que finaliza con la activación de los factores de transcripción
AP-1, por medio de la activación de MAPK y NF-ƙB, por medio de la fosforilación de
IƙB (Takeda et al., 2005; Kumar et al., 2009). Se ha descubierto que TIRAP actúa como
adaptador entre el dominio TIR y MyD88, siendo esencial para la activación de esta vía
en los receptores TLR2 y TLR4 en mamíferos (Janeway et al., 2002; Takeda et al., 2005).
Los receptores TLR7, TLR8 y TLR9 activados, en células dendríticas aumenta la
transcripción de IFN tipo 1 a través de la activación del factor de transcripción IRF7
(O´neill et al., 2007; Kumar et al., 2009).
Vía Independiente de MyD88: También llamada Vía dependiente de TRIF. La
inician TLR3 y TLR4 activados, desencadenando una inducción en la transcripción de
citoquinas proinflamatorias e interferones tipo I, mediante la activación de los factores de
transcripción IRF3 y NF-ƙB (Kumar et al., 2009). En mamíferos, TRAM participa
selectivamente en la activación de esta vía en TLR4 pero no en TLR3 (Takano et al.,
2010) actuando como proteína adaptadora a TRIF.
Las dos cascadas de señalización respectivamente, implican la activación de factores de
transcripción: NF-ƙB, AP-1 e IRFs. Por su parte, NF-ƙB regula la expresión de genes
codificantes para citoquinas inflamatorias, como por ejemplo IL-1β, IL-2, TNF-α e IL-12 entre
otras (Tripathy et al., 2006) y quimioquinas como MCP-1 (Pasare et al., 2004). AP-1 regula la
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expresión de TNF-α e IL-6 entre otras, además de moléculas coestimuladoras, como CD80 y
CD86 en células dendríticas (Randon-Barragan, 2009). Se ha visto la activación de los factores
de transcripción IRF3 e IRF7 activan la transcripción de IFNβ e IFNα respectivamente (Kumar et
al., 2009). En la Tabla I un resumen de las moléculas involucradas para la señalización en los
TLR descritos en mamíferos. En la Figura 2 se observa un esquema representativo de cada vía.
La fagocitosis, junto con el producto de los genes activados por los TLR, instruye el
desarrollo de la inmunidad adaptativa, relacionando así a los TLR con esta última. La activación
de los TLR en las células presentadoras de antígenos (macrófagos y células dendríticas), induce
la producción de citoquinas y la expresión de moléculas co-estimulatorias de superficie,
ayudando en la elaboración de la respuesta inmune adaptativa. La señalización por TLR activa
principalmente a las células dendríticas a promover una regulación positiva de la expresión de los
MHC, de citoquinas inductoras de respuestas tipo Th-1 tales como la IL-12 o IL-18 (Pasare et al.,
2004; Randon-Barragan, 2009), y moléculas estimuladoras como CD80, CD86 necesarias para la
expansión clonal de células T (Abdelsadik et al., 2011). Las células dendríticas maduras migran a
los nódulos linfáticos donde presentan los antígenos a células T inmaduras (Medzhitov, 2001),
generando principalmente una respuesta tipo Th-1, que permite activar la propiedad microbicida
de los macrófagos e induce a los linfocitos B a producir IgG, efectivos para la opsonización de
patógenos extracelulares (Moreno et al., 2003). Algunas citoquinas expresadas, por la activación
de los TLR, son importantes para superar la supresión de linfocitos T reguladores (Pasare et al.,
2004). Algunos TLR se expresan en los linfocito B y T activando la proliferación celular,
diferenciación y afectando la memoria celular y la producción de anticuerpos (Abdelsadik et al.,
2011).
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Figura 2: Esquema comparativo de las vías dependiente e independiente de MyD88. Se
ilustran los distintos adaptadores descritos en estas vías de señalización: MyD88, TIRAP, TRIF y
TRAM. Vía Dependiente de MyD88: se observa como ejemplo TLR2 y todos los receptores TLR
excepto TLR3. Vía Independiente de MyD88: se observa TLR3 y TLR4. TLR4 es capaz de
activar ambas vías. La activación de cada una de ellas logra la activación de diferentes factores de
transcripción: NF-ƙB, AP-1, IRF3, IRF7, que ingresan al núcleo, excepto AP-1 que es activado
dentro del núcleo, y activan la transcripción de distintas moléculas de la respuesta (Figura 2
modificada de Seya et al, 2006).
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El reconocimiento de los PAMPs por los TLR ocurre en varios compartimientos celulares,
como la membrana plasmática, endosomas, lisosomas y endolisosomas (Kawai et al., 2010).
TLR3, TLR7, TLR8 y TLR9 son expresados en vesículas intracelulares como endosomas y
retículo endoplasmático, en cambio otros como TLR1, TLR2, TLR4 y TLR6 son expresados en
la membrana plasmática. La apropiada localización celular de los TLR es importante para la
accesibilidad al ligando, requiriendo internalización a la célula de algunos de ellos, para mantener
la tolerancia a las moléculas propias como ácidos nucleicos (Kawai et al., 2010). Se han
identificado 21 miembros de TLR en distintas especies (Palti, 2011), de los cuales 10 han sido
identificados en humanos (Randon-Barragan, 2009; Kawai et al., 2010).
2.3.1 TLR en peces
Se han descubierto 21 TLR en peces teleósteos, estos pueden diferir entre especies de
peces, los cuales son: TLR1, 2, 3, 4, 5, 5S, 7, 8, 9, 11, 12, 13, 14, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 25 y 26.
Diversos informes indican que TLR6 y TLR10 no existen en los peces teleósteos (Roach et al.,
2005; Rebl et al, 2010; Palti, 2011); mientras que TLR25 y TLR26 sólo han sido identificados en
el Ictalurus punctatus (Zhang et al., 2013).
Se han descrito TLRs 'específicos de pez' entre ellos TLR18, TLR19, TLR20, TLR21,
TLR22 y TLR23 (Roach et al., 2005; Huang et al, 2008; Oshiumi et al, 2008; Rebl et al, 2010;
Hansen et al, 2011; Palti, 2011). Sin embargo, todos estos TLRs de peces y sus cascadas de
señalización representan una alta semejanza estructural a los factores del sistema de TLR
mamíferos (Palti, 2011). En la Tabla II se encuentra un resumen de los TLR que se encuentran en
peces teleósteos junto con la especie en que se han descrito y los PAMPs que reconocen. En
trucha arcoiris, Oncorhynchus mykiss, se han sido descrito hasta el momento: TLR1, 3, 5M, 5S,
7, 8, 9, 20 y 22.
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Tabla II: TLR en peces teleósteos: especies que los poseen y ligandos descritos.
TLR Ligando Especies de peces
TLR1 Triacil-
lipopéptidos
T. rubripes; D. rerio; T. negroviridis*;O. mykiss; I. punctatus
TLR2 Lipopéptidos;
Lipoproteínas;
Pam3CSk4
T. rubripes; D. rerio; C. carpio; T. negroviridis;
P. olivaceus; I. punctatus
TLR3 dsRNA; poly
I:C;
componentes
bacterianos
T. rubripes; D. rerio; C. carpio; T. negroviridis; O. mykiss;
P. olivaceus; I. punctatus; G .rarus
TLR4a/b NC D. rerio*; G. rarus; ; I. punctatus; C. carpio
TLR5M Flagelina T. rubripes; D. rerio*; T. negroviridis; O. mykiss;
I. punctatus; S. salar
TLR5S Flagelina T. rubripes; O. mykiss; S. salar; I. punctatus
TLR7 ssRNA T. rubripes; D. rerio; C. carpio; O. mykiss; ; I. punctatus
TLR8 ssRNA T. rubripes; D. rerio*; O. mykiss*; T. negroviridis; S. salar; I.
punctatus
TLR9 CpG DNA no
metilado
T. rubripes; D. rerio; T. negroviridis; S. salar; O. mykiss;
P. olivaceus; S. aurata*; P. crocea* ; I. punctatus
NC: No se conoce; *: Se observa duplicación génica. Basado en Rebl et al, 2010; Palti,
2011; Takano et al, 2010; Boltaña et al, 2011; Jianjian, 2012; Zhang et al., 2013.
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Tabla II: TLR en peces teleósteos: especies que los poseen y ligandos descritos.
TLR Ligando Especies de peces
TLR13 NC S. salar
TLR14 NC T. rubripes; D. rerio
TLR19 NC D. rerio*
TLR20 NC D. rerio*; I. punctatus
TLR21 CpG DNA no
metilado
T. rubripes; D. rerio; T. negroviridis; I. punctatus
TLR22 dsRNA; poly I:C T. rubripes; D. rerio; T. negroviridis; S. salar*; O. mykiss*;
C. aurata*; P. Olivaceus; ; I. punctatus; C. idella
TLR23 NC T. rubripes; T. negroviridis
TL25 NC I. punctatus
TLR26 NC I. punctatus
NC: No se conoce; *: Se observa duplicación génica. Basado en Rebl et al, 2010; Palti,
2011; Takano et al, 2010; Boltaña et al, 2011; Jianjian, 2012; Zhang et al., 2013.
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20
Además, en la base de datos NCBI (HE979560) se encuentra disponible TLR2, pero aún no ha
sido publicado por Brietzke y Rebl. En la figura 3 se muestra los TLR presentes en trucha y sus
respectivos dominios.
Se han encontrado tres grandes diferencias en los TLR descritos en peces con respecto a
los mamíferos:
1) Existe una forma soluble del ortólogo TLR5 en peces y no en humanos. El TLR5S
carece de región transmembrana y dominio TIR (Rebl et al., 2010). TLR5 se ha descrito que
reconoce flagelina, un compuesto del flagelo bacteriano. La flagelina interactúa primero con
TLR5M, facilitando la expresión de TLR5S el cual sirve después para amplificar la respuesta
celular de TLR5M como un feedback positivo (Tsujita et al., 2004), guiando a una activación
fuerte del NF-ƙB en células TLR5 positivas independiente de los tipos celulares. Esto evidencia
un prototipo de inmunidad humoral que se encuentra conservada en peces (Randon-Barragan,
2009).
2) No existe ortólogo de TLR4 en peces salmónidos. Se ha encontrado únicamente en G.
rarus, C. carpio (Palti, 2011), D. rerio e I. punctatus. Hasta el momento no se han encontrado en
ningún pez CD14 o MD2, importantes proteínas para el reconocimiento del LPS por TLR4 en
humanos (Rebl et al., 2010). Además en peces teleósteos no se ha encontrado TRAM, proteína
adaptadora importante en desencadenar la señalización celular en respuesta a la activación de
TLR4 (Takano et al., 2010).
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21
Figura 3: Esquema de los dominios de organización de TLRs de O. mykiss. Los dominios de
organización de TLR1, 3, 5M, 5S, 9 y 22 son predichos desde las secuencias aminoacídicas
usando los programas SMART, TMHMM y SignalP. LRR: región de repeticiones ricas en
leucina. TIR: dominio citoplasmático del receptor IL-1/Toll. NT: N-terminal. CT: C-terminal.
Dominio tansmembrana ( ), Segmentos de baja complejidad conformacional ( ) y péptido
señal ( ) (Figura 1 de Palti, Y., 2011).
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22
3) Existen miembros de TLR llamados “TLR específicos de peces". Corresponden a
TLR18, TLR19, 20, 21, 22 y 23 (Roach et al., 2005, Huang et al, 2008; Oshiumi et al, 2008;
Rebl et al, 2010; Hansen et al, 2011; Palti, 2011). Los roles de estos TLR aún no están definidos
(Palti, 2011). Se cree que TLR22 puede ser un sustituto funcional del TLR3 de humano ya que
actúa contra infecciones de virus dsRNA (Takano et al., 2010).
Se ha visto que los peces teleósteos poseen las proteínas adaptadoras, MyD88, TIRAP y
TRIF, importantes en la cascada de señalización celular que finaliza con la activación de una
respuesta inmune. TRAM no ha sido descubierto hasta el momento en ningún pez (Takano et al.,
2010). También se han descrito moléculas que componen estas cascadas de señalización y
moléculas reguladoras de estas vías en peces teleósteos. La conservación de moléculas envueltas
en la señalización de TLR sugiere que el programa básico de la regulación génica mediada por la
activación de los TLR es conservada entre especies de vertebrados (Purcell et al., 2006). Figura 4
se encuentra un esquema de la activación de los TLR en peces.
2.4 Prolactina
En todos los vertebrados PRL se produce en la glándula pituitaria como una prohormona
y el péptido señal N-terminal se escinde rápidamente después de la biosíntesis para producir la
hormona madura. Se ha informado la producción ectópica de PRL en varias especies de
teleósteos, lo que sugiere que también puede actuar como un factor paracrino en peces (Santos et
al., 1999). PRL circula en los vertebrados principalmente como un monómero y comprende un
polipéptido de cadena simple de entre 177 y 200 residuos de aminoácidos.
Las funciones principales de PRL en mamíferos se refiere con la lactancia y la
reproducción, sino que también influye en otros biológica procesos, incluyendo el crecimiento y
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Figura 4: Esquema representativo de las moléculas de la señalización de TLR descubiertas
en peces. Algunos TLR y moléculas importantes en la señalización a cargo de los TLR con los
respectivos peces teleósteos en los que han sido descubiertos. En recuadrado rojo se señalan los
que se han descubierto en trucha (O. mykiss). Esquema de la Figura 3 de Rebl et al., 2010.
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la diferenciación celular, la síntesis de proteínas y la respuesta inmune (Freeman et al, 2000;
Hovey et al, 2001; Grimm et al, 2002). Es la hormona más versátil en cuanto a su variedad de
acciones en los vertebrados, más de 300 actividades biológicas diferentes han sido atribuidas a
PRL, cifra que supera el total de todas las otras hormonas hipofisarias combinados. Debido al
gran número de actividades de PRL, éstas se han agrupado en 6 áreas: (1) equilibrio hídrico y
electrolítico, (2) crecimiento y el desarrollo, (3) endocrinología, (4) metabolismo, (5)
comportamiento y reproducción, e (6) inmunorregulación y protección. (Bole-Feysot et al., 1998;
Sakamoto et al., 2005).
Estudios evolutivos de genes y proteínas sugieren, basándose en la secuencia, estructura,
conservación de unión, y funcionales, que PRL pertenece a una familia de genes que incluye
hormona de crecimiento (GH), y somatolactina (SL) en teleósteos (Freeman et al., 2000). La
presencia de PRL en pituitarias de teleósteos fue claramente establecida en 1978 (Ensor, 1978) y
fue aislada por primera vez en peces teleósteos en 1983 a partir de la glándula pituitaria de
Oncorhynchus keta (Kawauchi et al., 1983), luego se logró aisladar de Oncorhynchus
tschwytscha (Prunet y Houdebine, 1984). En el salmón del Atlántico (S. salar), PRL fue
localizada por primera vez en 1971 (Aler G., 1971), varios años más tarde, en 1988 fue purificada
y caracterizada biológicamente (Andersen et al., 1988). PRL de S. salar tiene un tamaño
molecular de 23kDa y un largo de secuencia de 210 residuos de aminoácidos, donde los primeros
23 corresponden al péptido señal.
En los peces, varias funciones fisiológicas se han atribuido a PRL, tal como sinergismo
con la producción de hormonas esteroides en las gónadas (Ruiter et al., 1986), una dispersión de
pigmentos en los cromatóforos tegumentarias (Kitta et al., 1993), y la reproducción (Cavaco et
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25
al., 2003). PRL también se conoce para mejorar las funciones inmunes en peces como en
mamíferos (Balm, 1997; Harris et al., 2000).
2.5 Piscirickettsia salmonis
La bacteria Piscirickettsia salmonis, es el agente etiológico causante de la Septicemia
Rickettsial Salmonidea (SRS) o Pisciricketsiosis. Esta es una infección bacteriana sistémica de
diferentes especies salmonideas. Afectando la acuicultura en la zona sur de Chile. Este
microorganismo es el responsable de una mortalidad anual cercana al 10% y causando pérdidas a
la industria chilena cercanas a los $100 millones de dólares (Rojas et al. 2008; McCarthy et al.,
2008).
Piscirickettsia salmonis, es una bacteria aerobia, Gram negativa, inmóvil, no encapsulada,
pleomorfa, predominando la forma cocoide con un diámetro entre 0,2 y 1,5 μm (Bravo y
Campos, 1989). ). Inicialmente se describió como un patógeno intracelular obligado, replicando
en vacuolas citoplasmáticas tanto in vivo como en líneas celulares derivadas de peces (Fryer y col
1990, Garcés y col 1991, Almendras y col 1997, Mauel y Miller 2002, McCarthy y col 2008).
Actualmente es considerado un patógeno intracelular facultativo (Fryer y Hedrick, 2003).
Durante el proceso infeccioso en peces y líneas celulares derivadas de estos organismos, P.
salmonis replica asociado a una envoltura membranosa en el interior de vacuolas citoplasmáticas
(Manuel y Miller, 2002; Fryer y Hedrick, 2003).
Los signos clínicos y mortalidad causados por Piscirickettsia salmonis se desarrollan
entre 6 y 12 semanas luego de que los salmónidos se encuentran en agua salada (Rojas et al.,
2009). La patología que presenta un individuo infectado es coloración obscura en la piel,
inapetencia, nado letárgico superficial y/o en el borde de las jaulas. Los peces que presentan una
infección leve no presentan signos externos. En especímenes de salmón Coho donde se ha
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26
observado nado irregular, se ha aislado cepas de P. salmonis desde el cerebro de estos peces.
También algunos individuos pueden presentar lesiones en la piel que aparecen como pequeñas
manchas blancas que pueden progresar a ulceras (Fryer y Hedrick, 2003).
Algunos de los signos externos más consistentes observados durante una infección por P.
salmonis son decoloración de las branquias, como resultado de una anemia significativa.
Internamente, el daño es sistémico, donde los signos más comunes son inflamación y alteraciones
en la coloración en el riñón y bazo. Además pueden presentarse ascitis y hemorragias en tejido
adiposo visceral, estomago, vejiga natatoria y la musculatura corporal. El hígado de los peces
afectados (< 20%) es de color pálido y puede presentar una coloración crema, con nódulos
circulares opacos de 5-6 mm de diámetro (Fryer y Hedrick, 2003).
2.6 Relación TLR, P. salmonis y PRL
Chile, está posicionado como uno de los más importantes productores de salmones a nivel
mundial, siendo la exportación de salmones una de las industrias más importantes en el sur de
nuestro país. Sin embargo, estos cultivos se han visto afectados por diversos patógenos que han
mermado esta producción, por lo que el estudio de la inmunidad de los salmónidos frente a
patógenos es primordial, para así disminuir pérdidas económicas asociadas a la mortandad de
estas especies de cultivo.
Piscirickettsia salmonis es uno de los principales patógenos que afecta los cultivos de
salmón en Chile, SRS, ha sido hasta la fecha la principal causa de pérdidas en la etapa de engorda
del cultivo de las tres especies salmonídeas más importantes en Chile, en su aparición e impacto
coexisten una serie de factores propios del agente, de los mismos peces y de los sistemas de
cultivo a que están sometidas las especies (Leal et al., 2007).
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Los patógenos son reconocidos por los receptores de reconocimiento de patrones (PRR),
de éstos, los principales receptores involucrados en una infección bacteriana es la familia bien
caracterizada de receptores tipo Toll (TLR).
Los peces tienen muchas respuestas humorales específicas y no específicas además de
mecanismos celulares que resisten las enfermedades producidas por bacterias patógenas. Para
infectar al hospedero y multiplicarse en los tejidos, los patógenos bacterianos deben pasar o
evadir esta defensa (Ellis, 1999). P. salmonis es un patógeno bacteriano por lo tanto posee
distintos PAMPs que pueden ser reconocidos por diferentes TLR en trucha arcoiris. Al ser una
bacteria Gram negativa acuática posee LPS, fosfolípidos, proteínas, lipoproteínas, peptidoglicano
(Boltaña et al., 2011), CpG-DNA bacteriano, también se ha descrito que posee la proteína
flagelina (Wilhelm et al., 2006), entre otros. Estos diversos PAMPs pueden ser reconocidos por
distintos TLR como por ejemplo: TLR1 y 2 que reconocen proteínas de la pared bacteriana,
peptidoglicano y lipopéptidos acetilados; TLR3, 7, 8 y 9 reconocen ácidos nucleicos microbianos
(Boltaña et al., 2011); también pueden actuar algunos de los TLR específicos de peces como
TLR20, 21, y 22. Los TLR trabajan en conjunto en el reconocimiento de un patógeno, debido a
que un patógeno puede presentar más de un PAMPs que permita su reconocimiento, por lo tanto
las células pueden reconocer el patógeno por varios TLR simultáneamente (Underhill et al.,
2002).
En los mamíferos, hay evidencia que implica a PRL en la regulación de las respuestas
inmunes humoral y mediada por células (Russell et al., 1985; Pellegrini et al., 1992; Matera,
1996). PRL es una hormona que comparte muchas propiedades con citoquinas, es decir,
homología estructural del receptor, vía de transducción de señales similares, y la acción
inmunomoduladora (Kooijman et al., 1996; Yu-Lee et al., 2002), jugando un rol importante en la
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28
modulación de la respuesta inmune en animales y humanos, este rol depende de la unión del
receptores de prolactina (rPRL) a receptores específicos expresados en la membrana de células
inmunitarias y células hematopoyéticas (De Bellis et al., 2005). Entre los receptores específicos,
secretados por la membrana de células inmunitarias, encontramos a la súper familia de
citoquinas, que incluye a los receptores para IL-2, 3, 4, 6, 7, 9, 12 y 15, por ultimo IFNγ (De
Bellis et al., 2005). De manera similar a las citoquinas, PRL y su receptor son ampliamente
expresado en las células del sistema inmune (Russell et al., 1985; Pellegrini et al.,1992). En
peces, se ha descrito a PRL capaz de aumentar la actividad fagocítica de macrófagos (Sakai et al.,
1996), estimular la producción de inmunoglobulinas (Yada et al., 1999), poseer efecto
mitogénico (Wang et al., 1996), producir anión superóxido e incrementar la producción de
lisozima en salmón (Paredes, 2008), además de aumentar de la actividad citotóxica en células
NCCs (Haussmann, 2011).
Por lo antes descrito, es importante el estudio de la interacción de diversas formas de
exposición de P. salmonis con los TLR, y al mismo tiempo evaluar el rol inmunoestimulador de
PRL, ya que puede llevar a una mejora en conocimiento y entendimiento de la función de los
TLRs en peces y sus especificidades frente a patógenos y de esta forma guiar al desarrollo de
inmunoestimulantes y vacunas para el control y prevención de enfermedades provocadas por
patógenos recurrentes en la industria salmonera.
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29
Con los antecedentes antes descritos se plantea la siguiente hipótesis:
1.- “P. salmonis modula la expresión de los receptores tipo Toll: TLR1, TLR9 y TLR22
en cultivo primario de riñón anterior de trucha arcoíris (Oncorhynchus mykiss)”.
2.- “Prolactina tiene un efecto inmunoestimulante en cultivo primario de riñón anterior de
trucha arcoíris infectado con P. salmonis”.
Objetivo general:
1.- Evaluar la expresión de TLR1, TLR9 y TLR22 y la interacción de éstos con MyD88 e
IL-1β frente a infección con P. salmonis en cultivo primario de riñón anterior de trucha arcoiris.
2.- Determinar si PRL tiene un efecto inmunoestimulante en cultivo primario de riñón
anterior de trucha arcoíris, sobre la infección con P. salmonis.
Objetivos específicos:
1.- Verificar la expresión de mRNA de TLR1, TLR22 y MyD88 en distintos órganos de
trucha arcoiris.
2.- Analizar la expresión de mRNA de los receptores tipo Toll: TLR1, TLR9 y TLR22,
además de IL-1β y MyD88, en cultivo primario de riñón anterior sometido a infección con P.
salmonis cepa IBM-40 viva, IBM-40 inactivada y proteínas de IBM-40.
3.- Analizar y comparar la expresión de mRNA de estos TLRs en cultivo primario
sometido a infección con P. salmonis cepa LF-89 versus la cepa patógena, IBM-40.
4.- Evaluar el rol inmuno-estimulador de Prolactina, analizando la variación en la
expresión de mRNA de TLR1, TLR9, TLR22, IL-1β y MyD88 en cultivo primario de riñón
anterior estimulado previamente con PRL y sometido a infección con P. salmonis cepa IBM-40
viva.
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3. MATERIALES Y MÉTODOS
3.1. Materiales
3.1.1. Equipos e instrumentos
Agitador magnético Ika big-squid, Ikamäleon.
Agitador Orbital: Heidolph polymax 1040.
Autoclave Orthman.
Balanza: Sartorius TE4101.
Baño Termo-regulado: N-Biotec.
Cámara de electroforesis horizontal: Labnet Enduro.
Cámara de electroforesis: Biorad Mini-Protean III.
Cámara de Flujo Laminar: Nuaire NU425-400E.
Cámara de Transferencia: Labnet.
Centrifuga termorregulada, 2-16pk, Sigma
Centrifuga: Sigma 2-16 multigene.
Espectrofotómetro, Vision SP2001, AAHoeffer
Fuente de poder: Bio Rad Powerpac Universal Power Supply.
Fuente de poder: E0303, Enduro.
Incubador: Zhicheng ZSD 1270.
Microcentrifuga: D37520, Sigma.
Microondas: Somela Faney WT1700.
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31
Micropipetas: Axygen, Labnet.
Microscopio confocal: Zeiss (Axiovert 100 M
Microscopio invertido: Olympus CKX41.
Microscopio: LW-Scientific I4 Series.
Microscopio: Olympus BKX41
Nanovue: General Electric.
pH metro WTW (pH 720): InoLab.
Propipeta fastpette v2, labnet.
Refrigerador, Consul 260
Shaker: Zhcheng, ZHWY-200B
Sistema desionizador de agua Cole Palmer
Sonicador: Cole Parmer
Termobloque: Accublock, Labnet
Termociclador en gradiente: Multigene, Labnet.
Termociclador para qPCR: MX 3000 y Mx 300, Stratagene.
Termociclador: Eppendorf Mastercycler personal, Eppendorf.
Transiluminador UV: Syngene, Ingenius.
Vortex: Brarnstead International.
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3.1.2. Reactivos
Merck, Alemania Winkler, Chile Promega, USA
Aceite de Inmersión
Alcohol isoamílico
Acetato de sodio
Ácido acético
Ácido clorhídrico
β-Mercaptoetanol
Cloroformo
Etanol
Glicina
Isopropanol
Perhidrol
SDS
Hidróxido de Sodio
Cloruro de Potasio
Ácido bórico
Acrilamida:Bisacrilamida
Albumina de suero bovino
β-Mercaptoetanol
Chomezynski
Cloruro de sodio
Fosfato de Potasio
monobásico
Hidróxido de sodio
Metanol
Persulfato de amonio
Reactivo de Bradford
Sacarosa
Temed
Tween-20
GoTaq Flexi
M-MLV Transcriptasa
reversa
Nucleótidos (dNTPs)
Inhibidor de RNAsa
GoTaq qPCR Master
Thermo Scientific Rockland Hy Clone
Membrana de
nitrocelulosa
Anti-IgG de conejo
conjugado con peroxidasa
Medio Leibovitz L-15
Azul de tripan
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G.E.Heathcare, USA Quigen Ambion
Percoll DNAeasy Blood &Tissue Agua DEPC
UsBio Sigma Fermentas, USA
Tris base
Ampicilina
L-cisteina
Acido Bórico
DAB
Glucosa
Inhibidor de proteasas
PMSF
Triton X-100
Marcador de peso
molecular para DNA
Marcador de peso
molecular para proteínas
Invitrogen, USA Arquimed Becton Dickinson
Syber-Safe
Tripsina 0,5%
Etanol Tinción de Gram
Lonza. Suiza Cell Signaling
Agarosa Buffer Ripa 10X
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3.1.3. Soluciones
Medio suplementado: Medio L-15 Suplementado con 10 %, 5% y 2 % de suero bovino fetal.
PBS: NaCl 136.89 mM, KCl 2.68 mM, Na2HPO4 10.14 mM, KH2PO4 1.76 mM, pH 7.4.
Reactivo de Bradford: Azul de Coomassie G 0,01%; etanol 4,75%; ácido fosfórico 8,5%.
Ripa+: Tritón X100 10%; Inhibidor de proteasa Mix; RIPA; PMSF 100 μM.
Solución de bloqueo para Western blot: PBS 1X; BSA 1%; leche descremada 5%; Tween-
20 0,3%.
Solución de Chomczynski: Tiocianato de Guanidina 4 M; Citrato de Sodio 25 mM; N-lauril
sarcosina 0,5% p/v; autoclavado y posteriormente se agregó β-mercaptoetanol 0,1 M.
Solución de desteñido para geles de poliacrilamida: Metanol 30%, Ácido Acético 7%.
Solución de lavado, TNT: Tris–HCl 0,1 M pH 7,5; NaCl 0,15 M; Tween 20 0,05%.
Solución de revelado: 40 mL de PBS; 30 μL de perhidrol 30% y 10 mg DAB.
Solución de teñido para geles de poliacrilamida: Azul de Coomassie R-250 0.3%, Metanol
50%, Ácido Acético 10%.
Tampón de carga SDS-PAGE: 62,5 mM Tris-HCl, pH 6,8; 20% glicerol, 2% SDS, 5%
β-mercaptoetanol.
Tampón de corrida SDS-PAGE: 25 mM Tris, 192 mM Glicina, 0,1% SDS; pH 8,3.
Tampón de muestra (5X): Tris-HCl 0,3125 M, pH 6.8, SDS 10%, Sacarosa 50%, Azul de
bromofenol 0.010%.
Tampón de transferencia SDS-PAGE: Tris 25 mM, Glicina 193 mM, 0,1 % SDS, 20%
Metanol.
Tampón espaciador SDS-PAGE: Tris-HCl 0,5 M pH 6,8; 04% SDS.
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Tampón SB (25x): 10 mM NaOH, ajustando pH 8.2 con ácido bórico.
Tampón separador SDS-PAGE: Tris-HCl 1,5 M pH 8,8; 0,4% SDS.
3.1.4. kit de reactivos
GoTaq® qPCR Master Mix, Promega (USA)..
LightCycler® FastStart DNA Marter SYBR Green I, Roche (USA).
Wizard® Genomic DNA Purification, Promega (USA).
3.1.5. Material Biológico
El microorganismo patógeno intracelular facultativo Piscirickettsia salmonis cepa LF-89
y cepa IBM-40, además, línea celular derivada de leucocitos de riñón anterior de Salmo salar,
SHK-1.
3.1.6. Animales de experimentación
Se utilizaron truchas arcoíris de 0,2 kg aproximadamente provenientes de una piscicultura
artesanal de la ribera de Punucapa, en la periferia de la ciudad de Valdivia.
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3.2 Métodos
3.2.1. Extracción de órganos
Los peces fueron anestesiados disolviendo BZ-20 en el agua donde se sumergieron los
peces, y fueron sacrificados por decapitación, se cortaron en forma sagital para visualizar los
distintos órganos de interés: corazón, bazo, intestino, hígado y músculo esquelético, luego se
cortó en forma longitudinal para dejar expuesto el riñón y extraer: riñón anterior, riñón medio,
riñón posterior, finalmente se extrajo: cerebro, branquias y ojo. Los órganos fueron almacenados
a -80 °C para la posterior extracción de RNA. En el caso de requerirse el órgano para cultivo
primario, este fue procesado inmediatamente luego de la extracción.
3.2.2 Extracción de RNA total de distintos órganos de O. mykiss
Las muestras de tejido (1 g), se homogeneizaron en hielo, agregando 1000 μL de solución
de Chomczynski (Chomczynski & Sacchi, 1987) utilizando un potter. Se dejaron en reposo por
5min a temperatura ambiente, se adicionó a cada tubo 200 μL de cloroformo: alcohol isoamílico
24:1, la mezcla se agitó por inversión del tubo y posteriormente se centrifugó a 12.000 xg a 4ºC
durante 15 min. Una vez finalizada la centrifugación, se transfirió la fase acuosa (conteniendo el
RNA) a un tubo estéril de 1,5 mL al cual se agregó 500 μL de isopropanol frío y se dejó
precipitando toda la noche a -20ºC.
Al día siguiente, el RNA precipitado se recuperó centrifugando a 16.600 xg por 13 min a
4ºC, se eliminó el sobrenadante, se lavó el sedimento con 200 uL etanol 70% frio, se secó al aire.
Finalmente se resuspendió el precipitado en 100 μL de agua ultra pura con pipeteo suave. Al
precipitado de RNA proviene de hígado, previo a la resuspensión en agua, se propició la
eliminación de glicógeno re-suspendiendo la muestra en 400 uL de LiCl 4 M, luego se almacenó
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a -20°C durante 4 horas y se precipitó el RNA por centrifugación a 10.000 xg por 30 minutos a
4°C, se descartó el sobrenadante se lavó el sedimento y se resuspendió con agua como se
mencionó anteriormente. Finalmente, las muestras fueron cuantificadas para ser procesadas de
inmediato.
3.2.2.1 Cuantificación y evaluación de pureza del RNA
La concentración del RNA se estimó por espectrofotometría, midiendo la absorbancia de
las muestras a 260 nm utilizando el equipo NanoVue, y luego se calculó la concentración
utilizando la relación 1 OD = 40 μg/mL (Sambrook y Russel, 2001). La pureza del RNA obtenido
se estimó calculando la razón 260nm/280nm para la determinar contaminación por proteínas, y la
razón 260nm/230nm para la contaminación por compuestos fenólicos.
3.2.3 Transcripción reversa
De los RNA recién extraídos, se seleccionó aquellos cuya razón 260nm/280nm era
superior a 1,8. La transcripción reversa se realizó en un volumen total de 20 μL, con la M-MLV
Reverse Transcriptase (Promega) de acuerdo a las instrucciones del fabricante (Sambrook et al.,
1989). Primero se mezclaron 1,6 μL (40 μM) de oligo-dT; 1 μL 10 mM mix dNTP; 3 μg de RNA
total y agua libre de nucleasas hasta un volumen final de 14,9 μL. La mezcla se incubó por 10
minutos a 60ºC, para luego enfriarla directamente en hielo previniendo así la formación de
estructuras secundarias. Paso seguido se le adicionó la segunda mezcla comprendida de 100
Unidades de transcriptasa reversa, 4 μL del tampón de la transcriptasa reversa 5X, 6 Unidades de
inhibidor de RNasa, incubándose 60 min a 42ºC seguido de 10 min a 60ºC. Los cDNA fueron
almacenados a -20°C.
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3.2.4 Diseño de partidores
Basado en las secuencias nucleotídicas de TLR1, TLR22, TLR9, MyD88, IL-1β, EF-1α y
Phox-47 presentes en la base de datos GenBank del National Center for Biotechnology
Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) para O. mykiss, se diseñó partidores para cada uno de
los genes antes mencionados, con el uso del programa Geneious y OligoAnalyser (Tabla III).
3.2.5. Amplificación de segmentos del cDNA de los genes en estudio
Las reacciones de PCR se realizaron usando como templado cDNA de los distintos
órganos de trucha, sintetizado como se describe en transcripción reversa (3.2.3). La reacción se
realizó en un volumen de total de 25 μL, conteniendo 0,5 unidades de Taq DNA polimerasa; 5 µL
de Green GoTaq® Reaction Buffer 5 X; 2 mM de MgCl2; 0,1 mM de cada dNTP; 0,5 µL de cada
oligonucleótido sentido y antisentido (25 μM) y agua estéril DEPC para completar el volumen
final (25 μL). La mezcla fue incubada en el termociclador, se utilizó el siguiente programa:
Ciclo Temperatura Tiempo N° de ciclos
Desnaturalización
inicial 94ºC 5 minutos 1
Desnaturalización 94ºC 30 segundos
Alineamiento 58ºC 30 segundos 35
Extensión 72ºC 30 segundos
Extensión final 72ºC 5 minutos 1
El montaje del análisis RT-qPCR de múltiples genes implicaba optimizarlos para una
misma temperatura de apareamiento y así analizarlos en paralelo en la misma placa en el
termociclador de tiempo real.
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Tabla III: Partidores utilizados para RT-qPCR, producto esperado y referencia.
TLR1 qPCR
Nombre Secuencia Producto esperado (pb) Referencia
TLR1F AAG GGC AGT CAA CAC CAC AC 122 NM_001166101
TLR1R CCA CGT CTG AAG TGC TCA GG 122 NM_001166101
TLR9 qPCR
Nombre Secuencia Producto esperado (pb) Referencia
tTLR9-F TGG TGT TCA CTG CCT TAC CC 123 NM_001129991
tTLR9-R GAC TCT GGA AGT TTG CCC CA 123 NM_001129991
TLR22 qPCR
Nombre Secuencia Producto esperado (pb) Referencia
TLR22F CCA CAA CAG GCT TTC TTC CG 110 NM_001124412
TLR22R TGG AGA AAT CTG AGC AGC CC 110 NM_001124412
MyD88qPCR
Nombre Secuencia Producto esperado (pb) Referencia
tMyD88-F GTT CCT GAC GGT GTG TGA CT 123 NM_001124421
tMyD88-R CCT GTG CTG ATT GGT TGC TG 123 NM_001124421
IL-1β qPCR
Nombre Secuencia Producto esperado (pb) Referencia
tIL-1B-F CTG AAG CCA GAC CTG TAG CC 112 NM_001124347
tIL-1B-R TGA TCC TTG TCC GCA ACC TC 112 NM_001124347
EF1-α qPCR
Nombre Secuencia Producto esperado (pb) Referencia
tEF1aF CTG AAG GCC GGT ATG ATC GT 110 NM_001124339
tEF1aR GCC ATG CCT GGT GAC AAT GT 110 NM_001124339
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40
3.2.6 Fraccionamiento electroforético en gel de agarosa
Para los fragmentos en estudio, que están en el rango menor a 500 pb, se utilizó un gel al
1 % (p/v) de agarosa (Sambrook et al., 1989). Los geles se prepararon fundiendo la agarosa
necesaria en buffer SB 1X (Brody, et al., 2004), se enfrió a temperatura ambiente hasta alcanzar
50°C, se agregó 15 μL de SybrSafe 1x que intercala las bases nitrogenadas y lo hace brillar bajo
luz UV, y así lograr visualizar las moléculas de DNA. Las muestras se cargaron directamente, ya
que el tampón de la reacción de PCR de Promega contiene el tampón de carga. En un gel de 8 cm
de largo se realizó la corrida electroforética a 90V constante y amperaje variable. Una vez
finalizada la corrida, el gel fue expuesto a luz ultravioleta en el transiluminador para visualizar
los productos de PCR y se capturó la imagen digitalizada con una cámara para documentar el
avance electroforético de los fragmentos del DNA.
Para el análisis semi-cuantificación de la expresión de TLR1, TLR22 y MyD88, la imagen
digitalizada del fraccionamiento de los productos de PCR, fue evaluada de acuerdo a la
intensidad de los pixeles de las bandas utilizando el programa ImageJ.
3.2.7 Siembra de células SHK-1
Para los ensayos de actividad de prolactina como para la propagación de P. salmonis se
trabajó con la línea celular SHK-1 proveniente de salmón.
Se mantuvo un stock de células SHK-1 a 20°C en botellas de cultivo de 175 cm² con
medio de cultivo L-15 10% SBF, pensando que en confluencia una botella de 175 cm² se pueden
encontrar 7x10⁶ células. Luego de tener el stock necesario de células para el ensayo de actividad
de PRL como para propagar P. salmonis, se tripsinizan las células stock, y se cuentan para
sembrar 1x10⁶ células en botellas de cultivo de 25 cm².
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3.2.7.1 Cuantificación de las células SHK-1
Las células fueron soltadas de la botella utilizando tripsina 1 X, la que fue neutralizada
con medio de cultivo en una proporción volumen/volumen. Una vez sueltas las células se
recolectaron para proceder a su cuantificación. Para poder visualizar las células y su viabilidad se
utilizó azul de tripan en una dilución 1:4 y para su cuantificación se utilizó la cámara de
Neubauer. Se contaron las células que se encuentran en 5 cuadrados del cuadrante central de la
cámara y en ambos lados de ésta. Luego se precedió a utilizar la siguiente fórmula que permite
cuantificar las células:
N° de células contadas x dilución x 1000 = X células/mL
Se calculó el volumen a agregar, que contenga 1x106 células, a cada botella de 25 cm², se
agregó medio de cultivo L-15 10% SBF y se almacenaron a 20°C.
3.2.8 Cultivo de P. salmonis
Piscirickettsia salmonis es el agente etiológico del síndrome ricketssial salmonídeo
(SRS), causante de una agresiva infección sistémica en especies salmonídeas de varias partes del
mundo (Bravo y Campos 1989; Rojas et al., 2009), siendo Chile uno de los países más afectados
donde ha causado importantes pérdidas económicas para la industria salmonera (McCarthy et al.,
2008). La cepa LF-89 es la de referencia, aislada en el sur de Chile en el año 1989 desde cultivos
de salmón coho afectados por altas mortalidades (Bravo y Campos, 1989), se encuentra
depositada en la American Type Culture Collection (ATCC), registrada como VR-1361 y
corresponde al primer aislado de P. salmonis. LF-89 es sensible a un amplio rango de
antibióticos, excepto a penicilina G (Fryer et al., 1990; Cvitanich et al., 1991). Pertenece al
genogrupo II, según la genotipificación realizada por el proyecto INOVA IBM-259. Tarda
alrededor de 7 días en provocar efecto citopático en la línea celular SHK-1.
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42
En una tesis en curso se ha hecho un análisis bioinformático de distintas cepas estudiadas
por el proyecto INOVA IBM-259, la información obtenida indica que IBM-40 posee el mayor
número de islas de patogenicidad. La cepa IBM-40, es una cepa de campo aislada en el sur de
Chile. Se determinó, en función de LF-89, que IBM-40 posee 28 islas y mediante BLAST a 3 de
éstas se puede ver que IBM-40 es la que posee el menor porcentaje de cada isla y que el
porcentaje que ella tiene es diferente al que poseen todas las demás cepas (Lagos, 2013). Si a la
información anterior le sumamos que tarda tan solo 3 días en provocar efecto citopático en SHK-
1, se puede decir que es una cepa altamente patogénica.
Para realizar las cinéticas se utilizó P. salmonis cepa IBM-40 y cepa LF-89. Para ello se
descongeló una alícuota de células IBM-40 almacenadas a -80°C. La alícuota se descongeló
rápidamente en la mano, de inmediato se centrifugó a 5.000 xg por 7 minutos, y se eliminó el
sobrenadante. Luego se lavaron las células, para ello se agregó 500µL de medio L-15 10% SBF,
resuspendiéndolo cuidadosamente, posteriormente, se centrifugaron a 4000 xg por 10 min y se
eliminó el sobrenadante. Nuevamente se resuspedió cuidadosamente en 500µL de medio L-15
10% SBF y con esta suspensión bacteriana se infectó una botella de 25 cm² que contenía la línea
celular SHK-1, la botella se incubó a 20°C por 5 días.
Para infectar línea celular SHK-1 con P. salmonis, previamente se sincronizaron las
células en L-15 2% SBF durante 48 h, esto aumenta la proporción de células que se infectan y
disminuye la velocidad de replicación de la línea celular.
Luego de los 5 días, P. salmonis provocó un efecto citopático en las células infectadas y
las bacterias se liberaron al medio de cultivo, se tomó 100 μL, 150 μL y 200 μL del medio y se
mezcló con 7 mL de medio de cultivo líquido, CASO suplementado (Vera et al., 2012), en 3
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tubos de 15 mL distintos. Los tubos fueron almacenados en un incubador shaker protegido de la
luz a 18°C durante 3 días a 150 rpm.
3.2.8.1 Cuantificación de P. salmonis por el método de Mc Farland
Luego de 3 días, las bacterias fueron cuantificadas por turbidimetría, tomando una
alícuota de 1 mL de cada tubo, se midió el DO a 600 nm, utilizando como blanco el medio CASO
suplementado y se aplicó la fórmula de Mc. Farland:
DO600 nm 0,132 1.5x108 CFU/ml
DO600 nm muestra X CFU/ml
3.2.8.2 Verificación de P. salmonis
De las alícuotas tomadas para cuantificar la bacteria, se tomaron los tubos Eppendorf con
el volumen restante, se centrifugaron a 4.000 xg durante 5 minutos, se eliminó el sobrenadante y
el precipitado de bacterias fue resuspendido con PBS 1X para realizar la tinción de Gram, se
corroboró que sean cocos Gram negativos según la clásica tinción de Cristal Violeta, lugol, y
safranina.
Además, se tomó otra alícuota para extraer DNA genómico según el kit Wizard de
Promega, y luego se verificó mediante PCR confirmatorio según Mauel (Mauel et al., 1996). Los
productos del PCR se resolvieron en una corrida electroforética y se visualizaron con luz UV para
corroborar que eran del tamaño deseado.
3.2.9. Extracción de proteínas totales de P. salmonis IBM-40 .
Se tomó uno de los tubos con P. salmonis en medio líquido en fase exponencial de
crecimiento y se centrifugó a 4.000 xg por 10 minutos a 4°C, se eliminó el sobrenadante, el
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sedimento se lavó dos veces con PBS 1 X, luego el sedimento se resuspendió en 100 µL de
RIPA+, se incubó por 20 minutos en hielo, luego se sonicó 3 veces por 5s a potencia 25%, se
mantuvo la muestra en hielo entre cada pulso, después se centrifugó a 4000 xg por 10 minutos a
4°C, finalmente se recuperó el sobrenadante y se cuantificó por el método de Bradford (Bradford,
1976). Para la cinética, la infección se realizó con 10 µg/mL de proteínas totales de IBM-40.
3.2.9.1 Cuantificación de proteínas
Basado en el método de Bradford se fabricó una curva de calibración entre 1 a 20 μg de
proteínas por mL de reactivo, utilizando BSA en agua destilada como estándar. Transcurridos 10
minutos, se realizó la lectura en un espectrofotómetro a una longitud de onda de 595 nm. Para
determinar la concentración de proteínas de las muestras se tomaron alícuotas de 5μL de cada una
en dilución determinada y se le agregó 1 mL de reactivo de Bradford. Luego de 10 minutos, su
absorbancia fue leída de igual manera que la curva de calibración. Todas las lecturas se realizaron
contra blanco de agua destilada más el reactivo. El valor de la muestra se obtuvo interpolando su
valor de absorbancia en la curva de calibración.
3.2.10 Inactivación de P. salmonis IBM-40
La inactivación de la cepa IBM-40 se realizó por calor, intentando alterar lo menos
posible la estructura externa de la bacteria, para ello se realizó una gradiente de inactivación a
distintas temperaturas: 30; 37,5; 45; 52,5; 60 y 67,5°C durante 10 minutos.
Se repicaron 7 tubos estériles de 15mL con 7mL de medio Caso suplementado más 150uL
de IBM-40 en fase exponencial de crecimiento, se incubaron a 18°C durante 2 días, pasado este
tiempo, bajo campana de flujo, se tomó una alícuota de 1mL de cada tubo para cuantificar
suspensión bacteriana por turbidimetría, además, se realizó la tinción de Gram confirmatoria. De
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inmediato, cada tubo fue incubado durante 10min a 200 rpm a una temperatura distinta, luego se
incubó nuevamente a 18°C por 24 horas más. El tubo control se mantuvo siempre a 18°C.
Pasadas 17 horas, se midió nuevamente la DO a 600nm para cuantificar el crecimiento
bacteriano, y se realizó una nueva tinción de Gram a cada muestra para observar y comparar la
estructura de los cocos Gram negativos respecto al control.
3.2.11 Estandarización de Prolactina
La prolactina de salmón utilizada en esta tesis fue purificada según el protocolo descrito
por Andersen et al. (1988), con algunas modificaciones (Olavarría et al., 2010), a partir de
glándulas pituitarias de peces adultos almacenadas a -80°C, procedentes del stock del Laboratorio
de Biología Molecular de Peces. El protocolo consta de múltiples etapas, las cuales incluyen una
extracción ácida, una cromatografía de filtración en gel y una cromatografía de intercambio
iónico.
Para este tesis se entregó el producto final de este protocolo, por lo tanto, se debió
cuantificar y confirmar la presencia y pureza de la hormona, además de realizar un ensayo de
actividad. La muestra fue cuantificada según 3.2.9.1, basado en el método de Bradford.
3.2.11.1 Electroforesis en gel de poliacrilamida
Se preparó un gel con sistema de tampón discontinuo en condiciones denaturantes
(Laemmli, 1970). Las dimensiones del gel fueron 95 x 100 x 0,75mm, organizados entre dos
placas de vidrio. El gel separador se preparó con acrilamida-bisacrilamida 30% (p/v), a una
concentración final de 15%, tamponado con Tris-HCl 1,5 M, pH 8,8 y SDS 0,4%. El gel
espaciador se preparó con acrilamida-bisacrilamida 30% (p/v), a una concentración final de 4%,
tamponado con Tris-HCl 0,5M, pH 6,8 y SDS 0,4%. Ambos geles fueron polimerizados con
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46
persulfato de aminio 0,05% (p/v) y TEMED 0,15% (p/v) de concentración final. Las muestras
con tampón de muestra fueron denaturadas en termociclador por 3 minutos a 95°C, para
posteriormente ser cargadas en los pocillos del gel. Una vez que el sistema fue montado e
inmerso en tampón de corrida se le aplicó una corriente de 70 Volt por 20 minutos y luego 120
Volt por 2 horas. Terminada la corrida electroforética, la mitad del gel se tiñó durante toda la
noche, con el fin de visualizar las proteínas. Para eliminar el exceso de colorante se sumergió en
agua destilada y se calentó en el microondas durante aproximadamente 5 minutos a potencia
media.
3.2.11.2 Western blot confirmatorio de Prolactina
Luego de realizada la electroforesis, se procedió a realizar la electro-transferencia a una
membrana de nitrocelulosa en tampón de transferencia con 20% de metanol, aplicando una
corriente de 50mA por 10 horas. Posteriormente se tomó la membrana y se bloqueó los sitios
inespecíficos con solución de bloqueo para western blot, por una hora a temperatura ambiente.
Luego, se incubó durante una noche con el anticuerpo primario, anti prolactina de salmón hecho
en conejo (Tesis de María Soto, 2013), a una dilución de 1:4000 en solución de bloqueo. Luego
se realizaron 3 lavados con TNT cada uno de 5 minutos y agitación suave. Se incubó por 1 hora
con el segundo anticuerpo anti-IgG de conejo conjugado con peroxidasa, a una dilución de
1:2000. Se realizaron 3 lavados con TNT por 5 minutos con agitación suave. Para el revelado de
la membrana, se incubó con solución de revelado por 15 minutos, agregando a los 5 minutos de
reacción 15 µL más de perhidrol. La reacción se detuvo sumergiendo la membrana en agua
destilada.
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3.2.11.3 Ensayo de actividad de prolactina
Para probar si la prolactina en stock poseía actividad estimulando el sistema inmune, se
realizó una estimulación a células SHK-1. Se sembraron 250.000 células por pocillo en placas de
6, se dejaron durante 12 horas con medio L-15 sin suplementar a 20°C. Luego, se eliminó el
medio y se cambió por L-15 5% SBF y se estimuló con 3 dosis distintas de PRL: 250, 500 y
1.000 ng/mL, se prepararon diluciones a partir del stock de PRL de 1,2μg/μL, así todos los
pocillos fueron estimulados con igual volumen (50μL). A los pocillos control se le adicionó 50μL
del vehículo, PBS 1X. Pasadas 16 h de la estimulación, se recolectaron las células y se
centrifugación a 16.000 xg durante 10 minutos, se eliminó el sobrenadante y el sedimento de
células fue almacenado a -80°C hasta la extracción RNA y síntesis de cDNA, tal como se
describe en la sección 3.2.12.6.
Finalmente la actividad de prolactina se midió mediante RT-qPCR, analizando la
expresión de IL-1β y graficando como se describe en 3.2.12.7.
3.2.12 Ensayos de cinéticas de expresión de TLR1, TLR22 y TLR9 en cultivo
primario
Las cinéticas se realizaron en 4 tiempos: 3, 6, 12 y 24 horas. Los estímulos fueron:
infección con IBM-40 viva, LF-89 viva, IBM-40 inactivada por calor y proteínas totales de IBM-
40. Además, se realizó una cinética con prolactina y prolactina más IBM-40 viva.
3.2.12.1 Cultivo primario y purificación de leucocitos de riñón anterior de trucha
Se extrajo el riñón anterior por disección longitudinal del pez. El órgano se depositó en
placa Petri con medio L-15 suplementado con 2% suero bovino fetal. Trozos del órgano se
depositaron una malla de 70μm puesta en un tubo Falcon con 2 mL de L-15 suplementado, el
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48
órgano se disgregó con la ayuda de un vástago de jeringa previamente autoclavado, una vez
disgregado el tejido en su totalidad, el tubo con las células se centrifugó a 600 xg por 10 min a
4ºC, luego se eliminó el sobrenadante y se resuspendió suavemente las células en 15 mL medio
L-15 al 2% SBF.
Con el propósito de separar y recuperar leucocitos renales se preparó un gradiente
continuo de Percoll al 60 %, se depositó 3 mL de Percoll en el fondo de 8 tubos Falcon de 15 mL,
y se cargó en cada Percoll aproximadamente 1,8 mL de suspensión celular utilizando pipeta
Pasteur y cuidando de no dañar el gradiente. Los tubos se centrifugaron a 700xg por 60 min a
20ºC. Luego de la centrifugación, se procedió a la recuperación del anillo leucocitos, aspirando
con pipeta Pasteur un volumen aproximado de 1 mL correspondiente a la línea blanca,
depositando todos los anillos en un mismo tubo de 15 mL. Posteriormente se centrifugó a 400 xg
por 10 min a 4°C. Se desechó el sobrenadante y se repitió el lavado 2 veces más. Finalmente las
células fueron resupendidas en 3 mL L-15 2% SBF, se tomó una alícuota de 50 μL de la
suspensión celular y se depositó en un tubo Eppendorf para su conteo. Las células se mantuvieron
a 4°C por algunos minutos hasta su utilización.
3.2.12.2 Conteo y evaluación de células
Se contaron las células y se estimó el porcentaje de viabilidad utilizando en cámara de
Neubauer. Para ello, se prepararon diluciones (1:10 v/v) de la alícuota de suspensión celular, las
diluciones se mezclaron con azul de Tripan en PBS al 0,04% de concentración final. Se depositó
15μL de la mezcla sobre la cámara y se contabilizó células viables y no viables. Se utilizó un
criterio de 95% de viabilidad para la utilización de las células en las cinéticas de expresión. Las
suspensiones se ajustaron a 1x10⁶ cel/mL para su uso.
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3.2.12.3 Cinéticas de expresión .
Para los ensayos de cinética se sembraron 1x10⁶ células por pocillo, con un n=3 en placas
de 6 pocillos, cada placa tenía sus células estimuladas y respectivos controles para cada punto.
Las células de cabeza de riñón, previamente contadas y sembradas, se dejaron asentando por 2
horas en incubador a 18°C, para luego ser infectadas y/o estimuladas.
3.2.12.4 Infección con P. salmonis
La infección se realizó utilizando la proporción de 50 bacterias por célula para el caso de
la cepa tipo, LF-89, y con 25 bacterias por células para la cepa patógena IBM-40, tanto viva
como inactivada. Por lo tanto, la infección se realizó con 50x10⁶ y 25x10⁶ bacterias por pocillo,
las bacterias fueron resuspendidas en PBS 1X y se ajustó la dosis infectante a un volumen de
50μL, a los pocillos control se les adicionó únicamente 50 μL de PBS 1 X autoclavado.
En la cinética con proteínas totales de IBM-40, la infección se realizó con 10 µg de
proteínas por mL de medio de cultivo.
3.2.12.5 Estimulación con prolactina
Las células de cabeza de riñón ya sembradas se dejaron asentando por 2 horas en
incubador a 18°C conteniendo 500 ng/mL de PRL. Pasado este tiempo se estimuló con 25x10⁶
IBM-40 vivas en 50 μL de PBS 1 X, y los controles solo con el vehículo.
3.2.12.6 Recolección de los puntos de la cinética y extracción de RNA
Transcurrido los tiempos de las cinéticas, las células de cada punto fueron recolectadas en
un Eppendorf de 2 mL y centrifugadas a 16.600 xg durante 10 minutos a 4°C, lavadas con
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PBS1X autoclavado y centrifugadas nuevamente a 16.600xg por 10 min a 4°C, luego se eliminó
el sobrenadante y el sedimento de células fue almacenado a -80°C hasta la extracción de RNA.
El RNA fue extraído como se describe en la sección 3.2.2 con algunas modificaciones, los
volúmenes utilizados fueron disminuidos a un quinto, o sea, se utilizaron solo 200 μL de solución
de Chomczynski y 40 μL de cloroformo: alcohol isoamílico 24:1. La fase acuosa que contiene el
RNA fue precipitada adicionando 200 μL de una mezcla de glicógeno 50 μg/mL + acetato de
amonio 0,5 M en isopropanol frío y se dejó precipitando toda la noche a -20ºC.
Al día siguiente, se centrifugó y lavó el RNA, luego se dejó secar a aire. Finalmente, se
resuspendió el precipitado en 40 μL de agua ultra pura con pipeteo suave. Las muestras fueron
cuantificadas según la sección 3.2.2.1 para luego ser utilizadas de inmediato en la síntesis de
cDNA como se describe en 3.2.3.
3.2.12.7 Cuantificación de la expresión génica de las cinéticas mediante RT-qPCR
Para analizar la expresión de los receptores: TLR1, TLR22, TLR9, también MyD88 e IL-1ß, se
utilizó el kit GoTaq® qPCR Master Mix, de acuerdo a las instrucciones del proveedor, en un
termociclador de tiempo real Mx3000 y Mx3005 (Stratagene). El equipo se programó con los
siguientes ciclos: denaturación inicial a 95ºC por 10 min, 45 ciclos de 94ºC por 20 s, 63ºC por 10
s y 72ºC por 20 s. Además se agregó en cada corrida un paso para elaborar la curva de
disociación, con 95ºC por 20s, 63ºC por 10s y 95ºC por 1s. La fluorescencia fue medida al final
de cada uno de los 45 ciclos y durante la última rampla de aumento de temperatura para la
elaboración de la curva de disociación. Se utilizó EF-1α como gen normalizador. Cada
cuantificación se realizó por triplicado. La línea base para el cálculo del ciclo umbral (ct) de cada
muestra fue calculada por el programa MxPRO (Stratagene) utilizando un algoritmo LMS (Least-
Mean-Square algorithm) y el mismo programa entregó los datos de ct. La cuantificación relativa
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se hizo según la fórmula del "ΔΔct" (Pfaffl, 2001) y se graficaron los datos y se les realizó la
prueba estadística T de Student, usando el programa Sigmaplot 10.0, seleccionando los p<0.01
como altamente significativo (**) y p<0.05 como significativo (*).
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4. RESULTADOS
4.1. Análisis semi-cuantificación de la expresión de TLR1, TLR22 y MyD88 en
distintos órganos de trucha arcoíris
Se diseñaron partidores homólogos a partir de las secuencias disponibles en la base de
datos para los mensajeros de TLR1, TLR22, MyD88y EF1-α. Se realizaron ensayos de RT-PCR
utilizando como templado cDNA de riñón anterior y bazo probando distintas temperaturas de
apareamiento para estandarizar los juegos de partidores, así, se optimizaron las condiciones
térmicas para la amplificación de los productos esperados de 122, 122, 123 y 110pb
respectivamente, a una temperatura de 61°C.
Posteriormente, se realizaron ensayos de RT-PCR para TLR1, TLR22, MyD88y EF1-α,
utilizando como templado cDNA de riñón anterior y bazo obtenidos de truchas sanas. Los
productos fueron fraccionados en un gel de agarosa (Figura 5: A, B, C y D) y luego evaluados de
acuerdo a la intensidad de los pixeles de las bandas; dichas intensidades permitieron obtener
valores de expresión relativa para cada órgano estudiado respecto a la intensidad de los pixeles de
las bandas del normalizar EF1-α. Con los valores de intensidad se logró elaborar una gráfica con
los niveles de expresión relativa de los receptores en cada órgano (Figura 5E). Se aprecia
expresión de TLR1 y TLR22 en todos los órganos analizados, preferentemente se detectó altos
niveles de mensajero en bazo y riñón anterior, mientras que, cerebro mostró la expresión más
baja de estos receptores. Sorprendentemente, en órganos incluidos como controles negativos,
como corazón, se observó una expresión comparable con branquias pero menor que en órganos
involucrados en la respuesta inmune. El mensajero de la proteína adaptadora MyD88 se expresa
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h
Figura 5: Análisis de expresión de TLR1, TLR22 y MyD88 en distintos órganos de O.
mykiss: A) Productos de PCR fraccionados en gel de agarosa al 1%, producto esperado para
TLR1 de 122pb, B) para TLR22 110pb, C) para MyD88123pb y D) para EF1-α 110pb. En todos
los geles de observa en 1: bazo, 2: músculo, 3: corazón, 4: branquias, 5: intestino, 6: riñón
anterior, 7: riñón medio, 8: riñón posterior, 9: cerebro, 10: hígado y 11 control de reacción sin
cDNA templado. E) Cuantificación relativa de TLR1, TLR22 y MyD88, se realizó una
cuantificación de las intensidades de las bandas en base a EF1-α. En negro se observa la
expresión relativa del gen TLR1, en gris TLR22 y en blanco MyD88. Como estándar se utilizó
DNA ladder de 100pb.
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en todos los órganos estudiados, prevaleciendo en riñón, siendo incluso mayor que la expresión
de los TLR en éste órgano. Además, se observa una alta expresión de MyD88en bazo,
comparable con TLR22 pero inferior a TLR1, la expresión más baja se observa en músculo.
4.2 Evaluación de Prolactina purificada de purificada de pituitaria de salmón
Se debió cuantificar proteínas en el producto final de una purificación de proteínas a partir
de pituitaria de salmón, confirmar la presencia y pureza de la hormona prolactina, además de
realizar un ensayo de actividad. La muestra fue cuantificada según método de Bradford y la
concentración obtenida fue 1,2 µg/mL de proteína contenida en la solución.
4.2.1 Electroforesis en gel de poliacrilamida y western blot confirmatorio
Para confirmar la presencia y la pureza de prolactina, se cargó en un gel de poliacrilamida
al 15% dos concentraciones distintas de la proteína purificada, 1 y 5 µg totales. La membrana de
nitrocelulosa, obtenida de la electrotransferencia, se incubó con el anticuerpo anti PRL de salmón
a una dilución de 1:4000, obteniéndose una única banda de masa de 23 kDa (Figura 6).
4.2.2 Ensayo de actividad de prolactina
Para comprobar la actividad biológica de prolactina en el sistema inmune, se realizó un
ensayo de estimulaciónde la expresión de IL-1β en células SHK-1. Para ello, se sembraron
250.000 células con medio L-15 sin suplementar y se dejaron durante 12 horas a 20°C. Luego, se
eliminó el medio y se cambió por L-15 al 5% SBF y se estimuló con 3 dosis distintas de PRL:
250, 500 y 1.000 ng/mL. Pasadas 16 h post estimulación, se recolectaron las células, se
centrifugaron y el pellet de células fue almacenado a -80°C hasta la extracción RNA y síntesis de
cDNA. Finalmente, la actividad de prolactina se obtuvo mediante RT-qPCR, midiendo la
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Figura 6: Western blot confirmatorio para prolactina. La electrotransferencia se efectuó a
partir de un gel SDS-PAGE al 15% y se detectó una banda de 23kDa a una dilución de 1:4000 del
anticuerpo anti-PRL de salmón. Carril 1: 5 µg de proteínas totales. Se incluye además un estándar
preteñido y sus correspondientes valores de a la izquierda.
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expresión del mensajero de IL-1β y graficando su expresión respecto al gen constitutivo EF1-α de
salmón (Figura 7 C).
Las T° de melting aproximadas que se obtuvieron para cada gen de Salmo salar en estudio
son: EF1-α 87,5°C e IL-1β 84°C (Figura 7, A y B).
En el gráfico de la figura 7C se observa que el nivel de expresión de IL-1β aumenta
significativamente únicamente con la dosis de 500ng/mL de prolactina.
4.3 Inactivación P. salmonis cepa IBM-40
Con el fin de alterar lo menos posible la estructura externa de la bacteria, se realizó una
gradiente de inactivación a distintas temperaturas: 30; 37,5; 45; 52,5; 60 y 67,5°C durante 10
minutos, luego se dejaron a 18°C durante 17 h. Pasado este tiempo se midió por turbidimetría si
había crecimiento bacteriano, para ello se restó el valor de OD a 600nm de las muestras justo
antes de la inactivación. Además, se realizó tinción de Gram a cada muestra para observar y
comparar la estructura respecto al control.
En la Figura 8 se observa que el crecimiento de la solución bacteriana disminuye con
todas las temperaturas, pero es 45°C la temperatura más baja a la cual se inhibe por completo el
crecimiento, además, las tinciones de Gram muestran integridad de la forma cocoide de la
bacteria en todas las temperaturas de inactivación (Datos no mostrados). Por lo tanto, la
temperatura utilizada para la cinética de estimulación con IBM-40 inactivada es de 45°C.
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Figura 7: Evaluación de actividad de prolactina. En A) y B) se muestra las curvas de
disociación de EF1-α e IL-1β respectivamente. En C) se muestra el gráfico de expresión de IL-1β
en células SHK-1 estimuladas con distintas dosis de prolactina respecto al control sin estimular,
utilizando como gen normalizador EF1-α.
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Figura 8: Curva de inactivación de IBM-40 a distintas temperaturas. En el eje X se muestran
las distintas temperaturas de inactivación, como control (en verde) se muestra el valor de OD a
600nm para una muestra sin inactivar, incubada a 18°C. En el eje Y, los valores de OD 600nm
pasadas 17 horas post inactivación por calor. Con rojo se destaca la menor temperatura a la cual
se logra una completa inactivación.
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4.4 Cinéticas de expresión
Para evaluar la expresión de los receptores TLR1, TLR22 y TLR9 frente a la infección
causada por Piscirickettsia salmonis se realizaron cinéticas a 4 tiempos: 3, 6, 12 y 24 horas. Los
estímulos fueron: infección con las cepas IBM-40 viva, LF-89 viva, IBM-40 inactivada por calor
y proteínas totales de IBM-40. Además, se realizó una cinética con prolactina y prolactina más
IBM-40 viva. De esta manera, se pudo evaluar la expresión de los distintos genes en estudio
frente a los mismos patrones moleculares expuestos de maneras distintas. Junto con analizar los
receptores en estudio, se evaluó la proteína MyD88 y la citoquina IL-1β, ambos involucrados en
la respuesta inmune del pez frente a una infección bacteriana.
Las distintas cinéticas se realizaron de la siguiente manera: Cada tiempo en estudio se
evaluó con n=3, una vez transcurrido el tiempo correspondiente se procedió a recolectar las
células en estudio, congelarlas y extraer el RNA de ellas, posteriormente se sintetizó a cDNA.
Este cDNA se cuantificó y comprobó su integridad por PCR convencional, amplificando β-actina
(ya que los partidores utilizados para β-actina posee un intrón entre los partidores), los productos
de PCR obtenidos algunas muestras de la cinética de expresión con LF-89 viva se muestran como
ejemplo en la Figura 9, en todas las cinéticas ocurre lo mismo, pudiendo observarse que las
muestras se están libres de contaminación con DNA genómico.
El análisis de la expresión de los distintos genes a estudiar se realizó mediante PCR
tiempo real. Para ello fue necesario diseñar partidores para cada uno de los genes de interés, los
que fueron verificados por RT-qPCR que sólo se obtuviera un producto y ausencia de
dimerización para cada juego de los partidores, en la Figuras 10 a la 15 se muestran los gráficos
de las curvas de disociación del producto de qPCR de cada juego de partidores, en donde la
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Figura 9: PCR convencional para β-actina de cDNA de riñón anterior infectado con LF-89
viva. Gel de agarosa al 1% teñido con Syber safe, producto esperado para cDNA es de 467 pb y
para DNA genómico es de aprox. 1300 pb. C+ es el control positivo con cDNA de riñón anterior
como templado, G: DNA genómico de trucha y C- el control de reacción sin templado. Los
triplicados de pocillo también se comprobaron de esta forma, obteniendo en todos los cDNA el
mismo resultado.
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Figura 10: Estandarización de partidores para la amplificación de TLR1. A) secuencia de
TLR1 de 122pb, amplificado por los partidores TLR1F y TLR1R. B) Curva de disociación de los
productos de RT-qPCR, realizada por el equipo Stratagene MxPro 3000p mediante el software
MxPro, luego de finalizada la amplificación.
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Figura 11: Estandarización de partidores para la amplificación de TLR9. A) secuencia de
TLR9 de 123pb, amplificado por los partidores t-TLR9-F y t-TLR9-R. B) Curva de disociación
de los productos de RT-qPCR, realizada por el equipo Stratagene MxPro 3000p mediante el
software MxPro, luego de finalizada la amplificación.
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Figura 12: Estandarización de partidores para la amplificación de TLR22. A) secuencia de
TLR22 de 110pb, amplificado por los partidores TLR22F y TLR22R. B) Curva de disociación de
los productos de RT-qPCR, realizada por el equipo Stratagene MxPro 3000p mediante el
software MxPro, luego de finalizada la amplificación.
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Figura 13: Estandarización de partidores para la amplificación de MyD88. A) secuencia de
MyD88de 123pb, amplificado por los partidores tMyD88-F y tMyD88-R. B) Curva de
disociación de los productos de RT-qPCR, realizada por el equipo Stratagene MxPro 3000p
mediante el software MxPro, luego de finalizada la amplificación.
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Figura 14: Estandarización de partidores para la amplificación de IL-1β. A) secuencia de
IL-1β de 112pb, amplificado por los partidores tIL1b-F y tIL1b-R. B) Curva de disociación de los
productos de RT-qPCR, realizada por el equipo Stratagene MxPro 3000p mediante el software
MxPro, luego de finalizada la amplificación.
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Figura 15: Estandarización de partidores para la amplificación de EF1-α. A) secuencia de
EF1-α de 110 pb, amplificado por los partidores tEF1aF y tEF1aR. B) Curva de disociación de
los productos de RT-qPCR, realizada por el equipo Stratagene MxPro 3000p mediante el
software MxPro, luego de finalizada la amplificación.
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ordenada corresponde a derivada de la fluorescencia emitida por el producto y la abscisa a la
Temperatura en °C, se puede observar sólo un pick de amplificación lo que corresponde a un solo
producto de PCR para cada par de partidores. Como normalizador para los ensayos de cinética se
analizó EF1-α.
Una vez realizados los ensayos de RT-qPCR en triplicado para todas las muestras de cada
cinética se revisó cada curva de disociación obtenida y se corroboró que la T° de melting
corresponda al producto esperado para cada juego de partidores.
Las T° de melting aproximadas que se obtuvieron para cada gen son: TLR1 83°C, TLR9
88°C, TLR22 81°C, MyD88 86°C, IL-1β 86°C, EF1-α 86°C.
4.4.1. Evaluación de la cinética de expresión de TLRs
La evaluación se realizó utilizando la formula descrita en material y métodos, de esta
manera se cuantificó la expresión relativa de cada gen estudiado. Una vez obtenido el resultado
de la fórmula, se calculó la media de la expresión relativa en los controles de cada cinética, esta
media se utilizó como expresión basal de cada gen estudiado y equivale en el gráfico a: 1 de
razón de expresión, en el eje de las ordenadas. De esta manera se puede calcular la relación entre
la media de la expresión relativa de cada tiempo con la media calculada para sus controles
correspondientes, y así, poder observar si aumenta o disminuye la expresión al compararla con el
control, esto se realizó para todas las muestras de las distintas cinéticas.
La evaluación realizada a los receptores tipo Toll en estudio, junto a MyD88 e IL-1β se
realizó analizando de forma independiente cada cinética, debido a que la presentación de los
patrones moleculares en cada una de ellas es de manera diferente.
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4.4.1.1 Evaluación de la cinética de expresión frente a infección con la cepa IBM-40 viva
(Gráficos se pueden observar en la Figura 16)
La cinética se realizó utilizando 25 bacterias por célula.
Evaluación de TLR1: Se observa un aumento en la expresión en todos los tiempo
estudiados, la expresión a las 3 h es de 5,5 veces, a las 6 h de 33,9 veces respecto al control,
teniendo un pico máximo de 47 veces a las 12 h para luego disminuir la expresión a 30 veces a
las 24 h.
Evaluación de TLR22: Se observa un perfil de expresión similar a TLR1, a las 3 y 6 horas
la expresión es prácticamente la misma que el receptor antes mencionado, siendo 7,8 y 39,4
respectivamente. Sin embargo, la expresión a las 12 h aumenta mucho más, llegando a 82 veces
para luego disminuir drásticamente a 15,8 a las 24 h.
Evaluación de TLR9: Se ve un aumento progresivo en la expresión, siendo 3,5; 49,8; 64,2
y 180,8 veces respecto al control a las 3, 6, 12 y 24 h respectivamente.
Evaluación de MyD88: Se observa aumento en la expresión solo en los 3 últimos tiempos,
una razón de expresión de 16,6 a las 6 h, un pick máximo de expresión de 36,8 y luego disminuye
a 14,8 veces respecto al control a las 24h.
Evaluación de IL-1β: Al igual que TLR9 se ve un aumento progresivo en todos los
tiempos estudiados, a las 3 h se observa un aumento no significativo de 3,2 veces. A las 6 y 12 h
se ve una razón de expresión de 70,5 y 219,4 respectivamente, con un máximo de expresión a las
24 h de 536,2 veces respecto al control.
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Figura 16: Gráficos de cinéticas de expresión frente a IBM-40 viva. Utilizando RNA total de
cultivo primario de riñón anterior de trucha arcoíris, se evaluó la expresión a nivel de transcrito
de los genes A) TLR1, B) TLR22, C) TLR9, D) MyD88y E) IL-1β frente a infección IBM-40,
utilizando 25 bacterias por célula. Todos los genes fueron analizados mediante RT-qPCR en
triplicado, usando como gen constitutivo EF1-α. Los gráficos representan la cuantificación
relativa al gen normalizador de tres pocillos tratados con IBM-40 (n=3) respecto a los pocillos
control (n=3), las barras indican el error estándar. Se considera p<0.01 como altamente
significativo (**) y p<0.05 como significativo (*) según la prueba estadística T de Student.
A B C
D E
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4.4.1.2 Evaluación de la cinética de expresión frente a infección con la cepa LF-89 viva
(Gráficos se pueden observar en la Figura 17)
La cinética se realizó utilizando 50 bacterias por célula.
En todos los TLR estudiados, así como, en MyD88no se observan cambios significativos
en la razón de expresión respecto a los controles. Sin embargo, se ve un aumento no significativo
en la expresión de TLR 9 de 2 veces a las 12 h y 5,5 veces a las 24 h.
Evaluación de IL-1β: Se ve un perfil de expresión particular, con un máximo de expresión
al primer tiempo estudiado de 48,4 veces, para luego disminuir a 18,9 a las 6 h y posteriormente
aumentar progresivamente a 20,7 y 27,2 veces a las 12 y 24 h respectivamente.
4.4.1.3 Evaluación de la cinética de expresión de TLR frente a infección con la cepa IBM-40
inactivada por calor (Gráficos se pueden observar en la Figura 18)
La cinética se realizó utilizando 25 bacterias inactivadas por célula, la inactivación fue a
45°C durante 10 minutos.
Al igual que en la cinética con la cepa no patógena, LF-89, aquí no se observan cambios
significativos en la expresión de todos los TLR estudiados ni de MyD88, a pesar de ello, si se
observa un claro perfil de expresión de MyD88con una disminución progresiva en el tiempo de 3;
2,6; 1,8 y 0,8 veces a las 3, 6, 12 y 24 h respectivamente.
Evaluación de IL-1β: Se ve un aumento progresivo en la expresión de 2; 2,6; 57,1 y 65,4 a
las 3, 6, 12 y 24 h respectivamente.
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71
Figura 17: Gráficos de cinéticas de expresión frente a LF-89 viva. Se evaluó la expresión a
nivel de transcrito de los genes A) TLR1, B) TLR22, C) TLR9, D) MyD88y E) IL-1β frente a
infección con 50 bacterias por célula, utilizando la cepa tipo, LF-89. Todos los genes fueron
analizados mediante RT-qPCR en triplicado, usando como gen constitutivo EF1-α. Los gráficos
representan la cuantificación relativa al gen normalizador de tres pocillos tratados con LF-89
(n=3) respecto a tres pocillos control (n=3), las barras indican el error estándar. Según la prueba
estadística T de Student, se considera p<0.01 como altamente significativo (**).
A B C
D E
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72
Figura 18: Gráficos de cinéticas de expresión frente a la cepa IBM-40 inactivada. Utilizando
RNA total de cultivo primario de riñón anterior de trucha arcoíris se evaluó la expresión a nivel
de transcrito de los genes A) TLR1, B) TLR22, C) TLR9, D) MyD88y E) IL-1β frente a
infección con IBM-40 (25 bacterias por célula) inactivada a 45°C durante 10 min. Todos los
genes fueron analizados mediante RT-qPCR en triplicado, usando como constitutivo EF1-α. Los
gráficos muestran la cuantificación relativa al gen normalizador de tres pocillos tratados con
IBM-40 inactivada por calor (n=3) respecto a tres pocillos control (n=3), las barras indican el
error estándar. Se indica p<0.01 como altamente significativo (**) y p<0.05 como significativo
(*) según la prueba estadística T de Student.
A B C
D E
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73
4.4.1.4 Evaluación de la cinética de expresión frente a estimulación con proteínas totales de
la cepa IBM-40 (Gráficos se pueden observar en la Figura 19)
La cinética se realizó utilizando 10 µg/mL de proteínas totales de IBM-40. Se observa un
aumento significativo en la expresión de todos los genes en los tiempos estudiados.
Evaluación de TLR1: Se observa una disminución progresiva en la expresión, alcanzando
un valor máximo de 1.241,8 veces a las 3 h, seguida de 461,6 y 407,6 veces a las 6 y 12 h
respectivamente. La expresión mínima se observa a las 24 h y es de 116,7 veces.
Evaluación de TLR22: Aquí, al igual que el receptor TLR1, se ve una disminución
progresiva en la expresión. Se observa un aumento en la expresión de 3.453,9 veces a las 3 h,
para luego disminuir bruscamente a 804; 173,5 y 153,2 veces a las 6, 12 y 24 h respectivamente.
Evaluación de TLR9: Se ve un aumento progresivo en la expresión, con una leve
pendiente en los primeros tiempos evaluados, con razón de expresión de 520,5; 567,2 y 572,3 a
las 3, 6 y 12 h respectivamente. Luego, a las 24 h la expresión aumenta al doble, llegando a
1.151,4 veces respecto al control.
Evaluación de MyD88: Se observa aumento en la expresión en los primeros 2 tiempos
para luego disminuir en la segunda mitad de la cinética. La expresión a las 3 h fue de 105 veces
respecto al control, con un máximo de 140,6 a las 6 h, luego disminuye a 96,2 y 69,1 a las 12 y
24 h.
Evaluación de IL-1β: Al igual que MyD88, aquí se ve un aumento en la primera mitad de
la cinética, para luego disminuir notoriamente en la segunda mitad del experimento. A las 3 y 6 h
se ve una razón de expresión de 221,5 y 272 respectivamente, luego baja la expresión a 92,5 a las
12 h y 36,3 a las 24.
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74
Figura 19: Gráficos de cinéticas de expresión frente a proteínas totales de la cepa IBM-40.
Utilizando RNA total de cultivo primario de riñón anterior de trucha arcoíris se evaluó la
expresión a nivel de transcrito de los genes A) TLR1, B) TLR22, C) TLR9, D) MyD88y E) IL-1β
frente a infección con 10 µg/mL de proteínas totales de IBM-40. Todos los genes fueron
analizados mediante RT-qPCR en triplicado, usando como constitutivo EF1-α. Los gráficos
representan la cuantificación relativa al gen normalizador de tres pocillos tratados con proteínas
totales de IBM-40 (n=3) respecto a tres pocillos control (n=3), las barras indican el error estándar
p<0.01 como altamente significativo (**) según la prueba estadística T de Student.
A B C
D E
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75
4.4.1.5 Evaluación de expresión de TLR en la cinética con prolactina y prolactina más IBM-
40 viva (Gráficos se pueden observar en la Figura 20)
Se realizó un análisis comparativo de los gráficos de expresión de los distintos genes
estudiados, utilizando una variable extra, prolactina. Se observa la expresión frente a infección
con IBM-40 utilizando 25 bacterias por célula. Además, se estimuló con una dosis de 500ng/mL
de PRL para poder evaluar su rol inmuno-estimulador. Finalmente, se observa la expresión de los
genes de interés en infección con 25 bacterias IBM-40 por célula, en células que fueron
estimuladas dos horas antes con PRL. Como control para los 3 estímulos se utilizó la expresión
de los genes adicionando solamente el vehículo, PBS 1X.
Evaluación de TLR1: Se observa que la expresión de este receptor a las 3 h aumenta 6,1;
5,9; 2,1 veces según sea infectado con IBM-40, estimulado con prolactina y con PRL más IBM-
40 respectivamente. A las 6 h la expresión es 33,9 para infección con IBM-40, 4,2 para PRL, en
cambio para PRL+IBM-40 la expresión es igual al control (1,0), de la misma manera, a las 12 h
la expresión es de 30,6 y 2,2 veces para IBM-40 y PRL respectivamente y para PRL + IBM la
expresión no varió respecto al control. A las 24 h se ve un aumento únicamente en la infección
con IBM-40 de 32,2 veces, para la estimulación con PRL la expresión disminuye a la mitad
respecto al control y para PRL + IBM la expresión es prácticamente la misma del control (1,1).
Evaluación de TLR22: Se observa un aumento significativo en la expresión frente a infección con
IBM-40 en todos los tiempos analizados, siendo éstos de 8,7; 39,5; 85,6 y 8,0 para las 3, 6, 12 y
24 h respectivamente. Para PRL y PRL + IBM-40 la expresión es de 11,3 y 2,1 a las 3 h, 3 y 0,6 a
las 6 h, 2,3 y 1,5 a las 12 h y a las 24 h la expresión disminuye respecto al control alcanzando
valores de 0,1 y 0,8 respectivamente.
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Figura 20: Gráficos de cinéticas de expresión de células infectadas con IBM-40 viva e
inmuno-estimuladas previamente con PRL. Utilizando RNA total de cultivo primario de riñón
anterior de trucha arcoíris se evaluó la expresión a nivel de transcrito de los genes A) TLR1, B)
TLR22, C) TLR9, D) MyD88y E) IL-1β frente a infección con IBM-40, 500 ng/mL de PRL, y
500 ng/mL PRL 2 horas antes de infectar con IBM-40. Como control para los 3 estímulos se
utilizó la expresión de los genes adicionando solamente el vehículo, PBS 1X. Todos los genes
fueron analizados mediante RT-qPCR en triplicado, usando como constitutivo EF1-α. Los
gráficos representan la cuantificación relativa al gen normalizador de tres pocillos tratados (n=3)
respecto a tres pocillos control sin ninguno de los tratamientos (n=3), las barras indican el error
estándar. Se indica **p<0.01 y *p<0.05 según la prueba estadística T de Student.
A B C
D E
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77
Evaluación de TLR9: Para la infección con IBM-40 a las 3, 6, 12 y 24 h la expresión es
respectivamente de 2,8; 51,8; 64,1 y 178,6 veces. En la estimulación con prolactina se observan
mínimas variaciones en la expresión de TLR9, aumentando 3,5; 4,7; 3,5 y 1,3 veces para las 3, 6,
12 y 24 h. Del mismo modo, no se observan variaciones significativas en la expresión del
receptor frente a estimulación con IBM-40 + PRL, alcanzando valores de 1,8; 0,8; 1,3 y 3,6 en
orden cronológico para cada hora analizada.
Evaluación de MyD88: Se ve un aumento significativo en la expresión frente a IBM-40 de
1,3; 16,6; 41,1 y 16,4 para las 3, 6, 12 y 24 h. En el caso de estimulación con PRL y estimulación
con PRL más infección con IBM-40 no se ven grandes variaciones en la expresión, siendo 3 y 8,5
a las 3 h, 2,3 y 4,9 a las 6 h, 2,8 y 5,3 a las 12 h y 0,8 y 5,4 a las 24 h.
Evaluación de IL-1β: Se observa un aumento significativo prácticamente en todos los
tiempos estudiados y bajo los tres estímulos. Al primer tiempo, se ve expresión de 3,2; 8,7 y 95,2
veces frente a IBM-40, PRL y PRL + IBM-40 respectivamente. A las 6 h la expresión fue de 70,5
veces frente a IBM-40; 14,9 veces ante estimulación con PRL y 144 veces frente a ambos
estímulos. A las 12 h la expresión observada es 219,4; 16,7 y 3.270,7 para IBM-40, PRL y PRL +
IBM-40. A las 24 h se observan valores muy elevados de expresión para cada estímulo, siendo
536,2 veces para infección con IBM-40; 154 veces PRL y 27.290,8 veces frente a IBM-40+PRL.
Además, se midió la expresión de p47phox ya que se conoce que es la única subunidad de
NADPH oxidasa que varía su expresión ante el tratamiento con prolactina (Olavarría et al.,
2012). Se observa que a las 3 h la expresión de p47phox es igual en células tratadas con PRL
respecto a infección con IBM-40 en células previamente estimuladas con PRL. A las 6 h la
expresión frente a IBM-40 + PRL alcanza 0,76 veces respecto a las células estimuladas con PRL.
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78
Luego, la expresión de p47phox es mayor en las células tratadas con IBM-40 + PRL, alcanzando
3,5 y 5,6 veces a las 12 y 24 h respectivamente (datos no mostrados).
4.4.1.6 Evaluación de expresión en la cinética de infección con IBM-40 respecto a infección
con LF-89 (Gráficos se pueden observar en la Figura 21)
Aquí se realiza una comparación de la expresión de los distintos genes en estudio frente a
infección de una cepa patógena (IBM-40, 25 bacterias por célula) respecto a la expresión frente a
infección con la cepa tipo de P. salmonis (LF-89, 50 bacterias por células), para ellos se utilizan
los datos de las cinéticas antes evaluadas en esta tesis y los valores de expresión para la cepa LF-
89 son llevados a 1 y se usan como control, para así poder comparar la variación entre las
expresión frente a infección con dos cepas distintas de P. salmonis.
Para todos los TLR analizados la expresión frente a la cepa IBM-40 es superior, pero sólo
para 6, 12 y 24 h la diferencia es significativa.
Evaluación de TLR1: Se observa que la expresión de este receptor es 3,1 veces mayor
frente a la cepa patógena respecto a la cepa tipo a las 3 h post infección. Dicha diferencia es
máxima a las 6 h, siendo 56,8 veces, luego la brecha se estrecha levemente a 40 y 45 veces de
diferencia a las 12 y 40 h.
Evaluación de TLR22: Se ve, al igual que en TLR1, que la diferencia mínima de
expresión se da a las 3 h y la máxima a las 6 h, siendo de 6,4 y 98,8 veces respectivamente.
Luego disminuye, alcanzando a las 12 h una diferencia de 48,8 y a las 24 h la diferencia es de
23,2 veces.
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79
Figura 21: Comparación de Cinéticas de expresión frente a infección con una cepa
patógena respecto a una no patógena de P. salmonis. Se evaluó la expresión a nivel de
transcrito de los genes A) TLR1, B) TLR22, C) TLR9, D) MyD88y E) IL-1β frente a infección
con la cepa patógena IBM-40 (25 bacterias por célula) respecto a la cepa no patógena LF-89 (50
bacterias por célula) de P. salmonis. Todos los genes fueron analizados mediante RT-qPCR en
triplicado, usando como constitutivo EF1-α. Los niveles de expresión de los transcritos frente a
infección con LF-89 son llevados a valor =1 y son representados en los gráficos como basales.
Las barras indican el error estándar. Se indica p<0.01 como altamente significativo (**) y p<0.05
como significativo (*) según la prueba estadística T de Student.
A B C
D E
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Evaluación de TLR9: Se observa, al igual que en los receptores antes evaluados, una
diferencia mínima de expresión a las 3 h y máxima a las 6 h, siendo éstas de 7,2 y 119,4 veces. A
las 12 h se ve una diferencia de 32,1 veces y de 29,8 veces a las 24 h.
Evaluación de MyD88: En este gen se observa que a expresión a las 3 h post infección es
mayor para LF-89, sin embargo, en los siguientes tiempos la expresión del receptor vuelve a ser
mayor frente a infección con la cepa IBM-40. A las 3 h la expresión de MyD88frente a infección
con la cepa patógena es de tan solo 0,64 veces respecto a Lf-89, luego a las 6, 12 y 24 h la
expresión es de 36; 40,9 y 59,6 veces mayor en favor a la infección con IBM-40.
Evaluación de IL-1β: Aquí se observa lo mismo que en la evaluación de MyD88, una
mayor expresión a las 3 h para la infección con la cepa tipo, y en los siguientes tiempos la
diferencia en la expresión favorece a la cepa patógena. Se ve que IL-1β tan sólo se expresa 0,067
veces frente a la cepa patógena comparada con la expresión al mismo tiempo (3 h) post infección
con LF-89. Luego la diferencia es 3,7, 10,7 y 19,7 veces a las 6, 12 y 24 h respectivamente en
favor a la infección con IBM-40.
4.5 Clonamiento de TLR2
Al inicio de esta tesis, se desconocía la secuencia nucleotídica de TLR2. Utilizando como
referencia las secuencias de mRNA descritas en NCBI para el receptor en otras especies de peces,
se realizó una búsqueda BLAST y en la base de datos de EST para O. mykiss, no encontrandose
secuencia EST para TLR2. Luego, se diseñaron varios juegos de partidores heterólogos,
utilizando como molde la secuencia de Danio rerio, Ictalurus punctatus y Paralichythys
olivaceus, con la idea de intentar obtener la secuencia del mensajero.
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81
A partir de muestras de RNA de riñón anterior de trucha, se sintetizó cDNA, el cual fue
utilizado como templado para las reacciones de PCR realizadas con los juegos de partidores,
obteniéndose así productos de los tamaños esperados. Los productos de PCR fueron clonados en
el vector p-GEM-T easy y enviados a secuenciar. Las secuencias nucleotídicas obtenidas, fueron
analizadas por BLAST sin encontrar similitud con el receptor esperado (Datos no mostrados).
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82
5. DISCUSIÓN
5.1. Evaluación semi-cuantitativa de la expresión de TLR1, TLR22 y MyD88 en distintos
órganos de trucha arcoíris
Los TLR son de gran importancia en el sistema inmune de vertebrados e invertebrados
(Imler et al., 2004). Cumplen funciones como: detectar la presencia de algún patógeno en el
organismo hospedero y desencadenar una respuesta inmune innata, además de activar y guiar la
respuesta inmune adaptativa contra ellos (Moreno et al., 2003). Los TLR forman parte de los
RRPs, receptores que reconocen PAMPs (Randon-Barragan, 2009). A cada TLR se le ha
atribuido uno o varios PAMPs como ligando de reconocimiento (Tabla I), estos PAMPs son
característicos de los microorganismos y así, mediante cascadas de señalización, se desencadena
una respuesta contra el patógeno en particular (Kumar et al., 2009). Por esta razón es de gran
interés el estudio de estos receptores en peces teleósteos, y así poder comprender de una mejor
manera como es el funcionamiento del sistema inmune en ellos.
Antecedentes previos muestran que la expresión entre TLR3, TLR7 y TLR8 en trucha
arcoíris, presentada patrones similares, detectándose una mayor expresión en bazo, seguido de
riñón anterior y posterior (Palti et al., 2010a). En esta tesis se evaluó la expresión de TLR1,
TLR22 y MyD88 en distintos órganos.
Se aprecia que la expresión de TLR1 está presente en todos los órganos analizados,
mostrando una mayor expresión del mensajero en bazo (7,6 veces) y riñón anterior (5,8 veces)
(Figura 5). Estos resultados mantienen el mismo perfil de los obtenidos por Palti en 2010, en que
realizó el mismo análisis. Sin embargo, los valores de expresión distan bastante entre ambos
estudios, ya que los autores muestran valores de expresión de TLR1 en bazo de 80 veces, es
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83
decir, 10 veces más de la expresión obtenida en esta tesis, lo que sugiere que las truchas
utilizadas en 2010 pueden haber estado expuestas a algún patógeno que estimule TLR1. Además,
hay que tener en cuenta no sólo diferencias en su estado inmunológico, sino también la etapa de
desarrollo y antecedentes genéticos de los peces.
En el caso de TLR22, se aprecia expresión en todos los órganos analizados, mostrando
una mayor expresión del mensajero en riñón anterior (5 veces) seguida de bazo (4,7 veces)
(Figura 5). Estos datos concuerdan con los mostrados en porcentaje por Rebl et al en 2007, donde
se asignó un valor de 100 de expresión relativa al mensajero de TLR22 de bazo y un valor de 60
al mensajero en riñón anterior, siendo ambos los valores más elevados entre los distintos órganos
analizados por los autores .
El mensajero de la proteína adaptadora MyD88 se expresa en todos los órganos
estudiados, prevaleciendo en riñón, siendo incluso mayor que la expresión de los TLR en éste
órgano. Además, se observa una alta expresión de MyD88 en bazo. Esto concuerda con el hecho
de que, en pez cebra se demostró experimentalmente que TLRs necesitan utilizar directamente
MyD88 para desencadenar la cascada de señales, lo que confirmó la ruta de transducción de
señales iniciada por la activación de la vía de MyD88 dependiente (Liu et al., 2010). Ya que,
tanto TLR1 como TLR22 fueron detectados en todos los órganos analizado,s es totalmente
factible la presencia de MyD88 en los mismos. Además, se demostró que embriones de pez cebra
knock-out para MyD88 albergaban entre 100 a 1000 veces más bacterias que embriones del tipo
silvestre cuando son inyectados con la bacteria patógena Salmonella enterica, revelando el papel
de MyD88 en respuesta inmunológico de los peces (Van der Sar et al., 2006).
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84
5.2. Inactivación de la cepa IBM-40 de P. salmonis
La inactivación se realizó por calor, intentando alterar lo menos posible la estructura
externa de la bacteria, ya que antecedentes previos de inactivación de P. salmonis LF-89 con
formaldehído no generaba respuesta vía TLR. Se creyó que las proteínas bacterianas quedaban
ocultas en la membrana y menos accesibles a unirse a los receptores (Salazar, 2010). Por el
contrario, hay antecedentes de respuesta de TLR frente a infección con P. salmonis inactivada a
100°C, donde la expresión de los receptores aumenta drásticamente, lo que puede deberse a que
la bacteria pierde completamente su estructura dejando las proteínas libres a unirse a los
receptores; algo similar a estimular con proteínas totales de P. salmonis.
Con los antecedentes previos, en esta tesis se realizó una gradiente de inactivación de la
cepa IBM-40 a distintas temperaturas: 30; 37,5; 45; 52,5; 60 y 67,5°C durante 10 minutos, luego
se incubaron a 18°C durante 17 h, pasado este tiempo se midió por turbidimetría la exisencia de
crecimiento bacteriano, evaluando la diferencia de OD a 600nm de las muestras justo antes y
después de la inactivación. Además, se realizó tinción de Gram a cada muestra para observar y
comparar la estructura respecto al control.
En la Figura 8 se observa que a partir de los 45°C el crecimiento bacteriano se inhibe por
completo. Además, la estructura de la bacteria se observa intacta según la tinción de Gram. Se
escogió 45°C por ser la temperatura más baja a la cual se inhibe por completo el crecimiento,
intentando de esta forma alterar lo menos posible la estructura de la bacteria, para así eliminar las
dudas respecto a los resultados obtenidos con otras inactivaciones. Sin embargo, hay que tener en
cuenta que la inactivación con formaldehido realizada por Salazar se realizó en la cepa LF-89, y
en el caso de la inactivación con calor a 100°C se desconoce la cepa, por lo que los resultados de
cinéticas no son comparables entre sí. Por lo tanto, la intención es solo buscar una mejor forma de
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85
inactivación de P. salmonis para obtener resultados más certeros respectos al rol de los TLR en el
reconocimiento de IBM-40.
5.3. Clonamiento de TLR2
El receptor TLR2 forma un heterodímero con TLR1 en mamíferos, en conjunto reconocen
distintos PAMPs de bacterias Gram negativas y Gram positivas (Kumar et al., 2009). Recientemente,
varios estudios han informado de las posibles funciones de TLR1 y TLR2 en peces. Hasta el
momento, TLR1 y TLR2 se han reportado en pez globo (Oshiumi et al., 2003), pez cebra (Jault et al.,
2004; Meijer et al., 2004 ), lenguado japonés (Hirono et al., 2004 ) y bagre de canal (Baoprasertkul et
al., 2007).Además, TLR1 se ha informado en Tetraodon nigroviridis (Wu et al., 2008) y trucha arco
iris (Palti et al., 2010b). Es de gran interés el estudio de estos receptores en peces teleósteos y así
poder comprender de una mejor manera como es el funcionamiento del sistema inmune en ellos.
En O. mykiss, hasta el momento del inicio de la tesis, no se encontraba secuenciado el mRNA
de TLR2, por lo que fue seleccionado para ser clonado y secuenciados. Todas las secuencias
aminoacídicas obtenidas, las que fueron deducidas de la secuencia nucleotídica del clonamiento de
cada receptor, no presentan las regiones y dominios característicos de los TLR.: LRRs, LRRCT y TIR
(Akira et al., 2006), importante en desencadenar la cascada de señalización en respuesta a algún
patógeno. En conjunto todas estas características encontradas, en las secuencias aminoacídicas
deducidas, nos dice que no corresponderían a TLR2. Esto se podría deber a la poca cercanía
filogenética de la trucha arcoíris con las especies de peces usadas como molde para generar
partidores. Además, en la actualidad se dispone de la secuencia de este receptor pudiendo
comprobarse la baja homología de secuencia entre las especies, razón por la cual no fue posible
obtener la secuencia del receptor en el transcurso de esta tesis.
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86
5.4. Cinéticas de expresión
La investigación de la interacción de diversas formas de exposición de P. salmonis con
los TLR en peces puede abrir puertas y estrategias terapéuticas para la profilaxis humana y
animal. Los TLR se han descrito como receptores de adyuvantes (Seya et al., 2006), por lo que
incorporar ligandos a TLR de manera preferente en una solución farmacológica, permitiría una
mejora en vacunas en desarrollo contra P. salmonis.
Adicionalmente, el entendimiento de la función de los TLR en peces y sus especificidades
de patógenos puede guiar al desarrollo de mejores inmunoestimulantes para el uso en acuicultura
comercial, así como agonistas para el control y prevención de enfermedades (Randon-Barragan,
2009).
5.4.1. Evaluación de Cinéticas por receptor
La expresión de los TLR no es estática, sino más bien modulada en respuesta a patógenos,
a una variedad de citoquinas o estrés ambiental (Akira et al., 2006). El estudio de las cinéticas de
expresión se basó principalmente en la infección causada por Piscirickettsia salmonis en cultivo
primario de riñón anterior de O. mykiss.
P. salmonis al ser una bacteria gram negativa acuática posee LPS, fosfolípidos, proteínas,
lipoproteínas, peptidoglicano (Boltaña et al., 2011), CpG-DNA bacteriano y también se ha
descrito que posee la proteína flagelina (Wilhelm et al., 2006), entre otros. Estos diversos PAMPs
pueden ser reconocidos por distintos TLR. Además, hay que tener en cuenta que los TLR trabajan
en conjunto en el reconocimiento de un patógeno, debido a que un patógeno puede presentar más
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de un PAMPs que permita su reconocimiento, por lo tanto las células pueden reconocer el
patógeno por varios TLR simultáneamente (Underhill et al., 2002).
Además de estudiar la infección con P. salmonis, se analizó el efecto inmuno-modulador
descrito para PRL (Balm 1997; Harris et al., 2000) sobre los TLR, y poder evaluar el
comportamiento de los distintos marcadores en estudio y aportar de esta manera al conocimiento
de los ligandos reconocidos por los TLRs de trucha.
En el desarrollo de la tesis se realizaron 5 cinéticas de expresión. Las cinéticas realizadas
utilizaron como elemento de infección a: IBM-40 viva, LF-89 viva, IBM-40 inactivada por calor,
proteínas totales de IBM-40 e infección con IBM-40 previa inmunoestimulación de 2 horas con
PRL. En todas las cinéticas se evaluó: la expresión de TLR1, TLR22, TLR9, MyD88 y IL-1β por
RT-qPCR. La idea de estudiar IL-1β y MyD88 es para poder visualizar como es el
comportamiento de la cascada de señalización en respuesta al reconocimiento de los distintos
PAMPs por sus correspondientes TLR. MyD88 es una de las cinco proteínas adaptadoras al
dominio TIR, y es utilizada por todos los TLR menos TLR3. Al activarse desencadena una
cascada de señalización que finaliza con la activación del factor de transcripción NF-ƙB (Kumar
et al., 2009), el cual dentro de los genes que activa se encuentra IL-1β. Esta interleuquina es el
mediador central de la respuesta inmune y respuesta inflamatoria, e inicia una variedad de
funciones, como activación de macrófagos y expresión de otras citoquinas (Bjornsdottir et al.,
2009). Además se agregó la evaluación de TLR9, receptor de endosoma que reconoce CpG DNA
no metilado, característico en el genoma de las bacterias (Akira et al., 2006).
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88
5.4.1.1. Cinéticas de expresión de TLR1
TLR1 en peces, se ha descrito como su ligando Triacil-lipopéptidos, por lo que es de
esperar que TLR1 logre reconocer ambas cepas de P. salmonis en estudio. En la cinética de
expresión con IBM-40 viva, se observó un aumento en la expresión en todos los tiempos
estudiados, teniendo un pico máximo de 47 veces a las 12 h para luego disminuir la expresión a
30 veces a las 24 h. Lo que indicaría que, efectivamente la cepa IBM-40 de P. salmonis posee
ligando para este receptor.
En la cinética de expresión con LF-89 no se observan cambios significativos en la razón
de expresión respecto a los controles. Lo que podría indicar que la cepa tipo de P. salmonis,
aislada originalmente en 1989, no posee ligando para el receptor TLR1 indicando una diferencia
fundamental con la cepa patógena IBM-40.
En la cinética con IBM-40 inactivada por calor, al igual que en la cinética con la cepa no
patógena, LF-89, se observan pequeños cambios no significativos en la expresión de TLR1 en
todos los tiempos en estudio. Resultados que concuerdan con los obtenidos en la tesis de Carolina
Salazar en 2011, donde se midió la expresión de estos TLR en la línea celular SHK-1 de S. salar
frente a P. salmonis LF-89 inactivada con formaldehido, en ese momento se pensó que la bacteria
inactivada era incapaz de estimular la expresión de TLR debido a que la metodología de la
inactivación ocultó el ligando y éste ya no era accesible al receptor. Sin embargo, en esta tesis la
inactivación fue por calor y procurando mantener la estructura de la bacteria, lo cual fue
observado por tinción de Gram.
En la cinética de expresión con Proteínas totales de IBM-40. Se observa una disminución
progresiva en la expresión, desde un valor máximo a muy corto tiempo, 1.242 veces de aumento
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89
a las 3 h, alcanzando una mínima de 117 a las 24 h. Lo cual sugiere el uso de proteínas totales de
IBM-40 para estimular en forma rápida y muy efectivo el sistema inmune de peces, vía TLRs.
La expresión del receptor TLR1 a las 3 horas fue prácticamente la misma frente a IBM-40
que frente a PRL (6,1 y 5,9 veces de aumento de expresión respecto al control). Sin embargo, la
expresión frente a IBM-40 se mantuvo en ascenso en los 3 siguientes tiempos en estudio;
mientras que, la expresión de TLR1 frente a PRL fue disminuyendo hasta alcanzar niveles
basales a las 24 h. La expresión frente a IBM-40, previa inmunoestimulación con PRL no sufrió
cambios respecto al control (Figura 20 A).
5.4.1.2. Cinéticas de expresión de TLR22
TLR22 es un receptor específico de peces, en humanos se encuentra como pseudogen
(Rebl et al., 2010). Se ha reportado, en pez cebra, que existe una modulación positiva de la
expresión de TLR22 frente a patógenos acuáticos como Aeromona salmonicida y Mycobaterium
marinum (Rebl et al., 2010). Además en lenguado japonés, peptidoglicano y dsRNA inducen un
aumento de la expresión de TLR22 (Rebl et al., 2007; Matsuo et al., 2008). Por estas razones se
piensa que TLR22 reconoce diversos ligandos de patógenos acuáticos, ya sean virus o bacteria.
En la cinética con IBM-40 viva, TLR22 presenta un aumento en todos los tiempos
estudiados, llegando a 82 veces a las 12 horas para luego disminuir a
15,8 a las 24 h. Se puede concluir que, al igual que TLR1, TLR22 reconoce algún ligando
presente en la cepa IBM-40 que aún no ha sido identificado.
Las cinéticas con Proteínas totales de IBM-40, se ve un máximo de 3.453,9 a las 3 h, para
luego disminuir bruscamente a 804 a las 6 h. Este resultado concuerda con el obtenido para
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90
TLR1, lo que sugiere que proteínas totales de IBM-40 son un rápido y efectivo método para
estimular los TLRs.
Las cinéticas expresión frente a infección con IBM-40 y estimulación con prolactina,
muestran que la expresión del receptor a las 3 horas fue levemente superior frente a únicamente a
PRL que a IBM-40. En las horas siguientes, la expresión frente a IBM-40 se mantuvo en ascenso;
en cambio, frente a PRL fue disminuyendo hasta alcanzar niveles basales. La expresión de
TLR22 frente a P. salmonis cepa IBM-40, previa inmunoestimulación con PRL no sufrió
cambios respecto al control a nivel de transcrito.
Tanto para LF-89 como para IBM-40 inactivada no se encontró variaciones significativas
en la expresión del receptor.
5.4.1.3. Cinéticas de expresión de TLR9
TLR9 se encuentra en endosomas dentro de la célula y reconoce como ligando CpG-DNA
no metilado, los motivos CpG no metilados son abundantes en el genoma bacteriano (Akira et al.,
2006). En la cinética con IBM-40 viva, existe un aumento en las últimas 3 horas post-infección,
con respecto al control. Este comportamiento puede deberse a que la bacteria en las primeras
horas es fagocitada, donde las condiciones ácidas y reductoras degradan la doble hebra de DNA
en múltiples motivos de CpG que subsecuentemente interactúa con TLR9 (Akira et al., 2006).
También se ha reportado en lenguado japonés que TLR9 aumenta su expresión después de una
infección con Edwardsiella tarda, bacteria Gram negativa y en pez cebra también aumenta su
expresión frente a una infección con Mycobacterium marinum (Rebl et al., 2010).
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En la cinética con IBM-40 viva se ve un aumento progresivo en la expresión alcanzando
un máximo de 180,8 veces de expresión respecto al control a las 24 horas post infección. Esto se
debe a que CpG no metilados de P. salmonis cepa IBM-40 son reconocido por TLR9.
En la cinética con proteínas totales de IBM-40, se ve un aumento progresivo en la
expresión, con una leve pendiente en los primeros tiempos evaluados, hasta lograr 1.151 veces de
aumento a las 24 h, el doble que a las 12 h. Esto se explica porque la metodología utilizada para
la extracción de proteínas totales, en ningún momento se trató con DNAsa por lo que el genoma
parcialmente degradado de la bacteria quedó en la solución, por lo tanto secuencias CpG no
metiladas quedaron accesibles; ya que, se ha reportado que existe una inducción de la expresión
de TLR9 en leucocitos de salmón del Atlántico después del desafío con CpG (Skajaeveland et al.,
2008).
Tanto para LF-89, IBM-40 inactivada como para PRL y PRL + IBM-40, no se encontró
variaciones significativas en la expresión de TLR9.
5.4.1.4. Cinéticas de expresión de MyD88
MyD88 es una de las cinco proteínas adaptadoras que se encuentran a cargo de
desencadenar la respuesta inmune una vez que TLR ha reconocido su ligando (O´neill et al.,
2007).
En la cinética de expresión frente a infección con IBM-40 viva, se observa aumento en la
expresión solo en los 3 últimos tiempos analizados, con máximo a las 12 h de 36,8. El hecho de
que no se observe un aumento a las 3 h, se puede deber al hecho que primero se debe generar una
respuesta en la expresión de los TLR para que posteriormente se active la expresión de la
proteína adaptadora MyD88 y se desencadene una cascada de señales.
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En la cinética de proteínas totales de IBM-40 se observa aumento en la expresión en los
primeros 2 tiempos para luego disminuir en la segunda mitad de la cinética. En este caso, a
diferencia de la cinética con IBM-40 viva, el aumento en la expresión de MyD88 se da desde el
primer tiempo en estudio, alcanzando 105 ya a las 3 horas post infección valor que triplica al
máximo alcanzado en la infección con IBM-40 y en un tiempo mucho más corto (36,8 a las 12 h,
máxima para IBM-40 viva). Los cambios más rápidos y más elevados en a expresión de
MyD88se pueden explicar con los aumentos en la expresión de los TLR frente al mismo
estímulo, en los cuales los TLR1 y TLR22 alcanzaron sus máximos niveles de expresión ya a las
3 h. Estos datos confirman que lo que se sugiere previamente, que proteínas totales de IBM-40
son un rápido y efectivo método para estimular los TLRs.
En el caso de la infección con IBM-40 previa inmunoestimulación con PRL no se ven
grandes variaciones en la expresión alcanzando un valor máximo de 8,5 a las 3 h y mínimo de 4,9
a las 6 h.
Tanto para P. salmonis LF-89 viva, PRL e IBM-40 inactivada no se encontró variaciones
significativas en la expresión de MyD88.
5.4.1.5. Cinéticas de expresión de IL-1β
IL-1β es una citoquina de respuesta inflamatoria, la que se encuentra descrita en especies
salmonídeas (Ingerslev et al., 2010). IL-1β, además de ser modulada por PRL, es el mediador
central de la respuesta inmune e inflamatoria, iniciando la activación de macrófagos y expresión
de otras citoquinas (Bjornsdottir et al., 2009).
En la cinética de infección con la cepa IBM-40 viva, se ve un aumento de expresión en
todos los tiempos en estudio, con un máximo a las 24 h de 536,2 veces por sobre el control.
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93
Como se observó en la cinética, existe la activación de los tres TLR analizados y de MyD88,
estos receptores desencadenan una cascada de señalización que finaliza con la activación de
distintas citoquinas, entre ellas IL-1β, lo cual explica el aumento en la expresión de esta
citoquina.
En la cinética con LF-89 no se observó variaciones significativas en la expresión de
ninguno de los TLR estudiados, lo mismo ocurrió para MyD88, sin embargo, si se observó un
aumento en la expresión de IL-1β en los 4 tiempos en estudio. Se ve un perfil de expresión
particular, con un máximo de expresión a las 3 h de 48,4, para luego disminuir a 18,9 y luego
aumentar progresivamente a 20,7 y 27. Debido a que LF-89 no es capaz de estimular la expresión
de TLR ni de MyD88, se sospecha que LF-89 logra un rápido aumento en la expresión de IL-1β a
través de los TLR ya expresados en la célula, sin mediar la transcripción de nuevos receptores.
En la cinética de expresión con IBM-40 inactivada, se observa un aumento significativo
en la expresión solo a los dos últimos tiempos, alcanzando un máximo de 65,4 veces por sobre el
control a las 24 h. Es decir, se observa una estimulación tardía de la expresión, lo mismo que
observó Salazar en su tesis en 2011, donde la inactivación de la bacteria fue con formaldehido
que probablemente generó un ocultamiento o alteró el patrón de los ligandos a los TLR,
generando un aumento en la expresión de IL-1β a las 24h de 1,8 veces respecto al control a
tiempo cero. Por otro lado, la cepa empleada por Salazar, fue la cepa de referencia LF-89, que
tiene una probada menor patogenicidad y virulencia respecto a cepas de campo y especialmente
respecto a la cepa IBM-40. Adicionalmente, en este caso la inactivación fue por calor a 45°C, lo
que sumado a las diferencias intrínsecas entre las cepas, puede explicar la diferencia de resultado.
Es también posible especular que, la inactivación por calor de la cepa IBM-40 no genera
ocultamiento de los ligandos, o dado que esta cepa es mucho más patógena que la LF-89, el
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94
número de PAMPs que posee esta cepa es mayor, hace que la inactivación por calor no altere el
que puedan ser reconocidos por los TLR correspondientes, explicando de esta forma que la
expresión de IL-1β frente a IBM-40 inactivada sea mayor a LF-89 incluso viva, con valores de
65,4 versus 48,4 respectivamente.
En la cinética con proteínas totales de P. salmonis, se ve un aumento de expresión por
sobre 200 en los primeros dos tiempos, luego baja la expresión hasta 36,3 a las 24 h. Esto debido
a que los ligandos se encuentran más “libres” y expuestos para poder interactuar con sus
respectivos TLR y se ejerce una respuesta inmune mayor y mucho más rápida, alcanzando un
máximo de expresión de 272 veces por sobre el control. Este dato es importante para una posible
creación de vacunas contra P. salmonis.
Por último el dato más significativo, en la cinética con PRL se observa un aumento
significativo prácticamente en todos los tiempos estudiados y bajo los tres estímulos: IBM-40,
PRL y PRL + IBM-40. En los primeros dos tiempos en estudio, la expresión frente a IBM-40
previa estimulación de 2 horas con PRL fue 10 veces superior respecto a la expresión frente a
únicamente PRL, luego a las 12 horas la diferencia se hace mayor llegando a 200 veces,
alcanzando un valor de 3.270 para PRL + IBM-40. A las 24 h en estudio la diferencia se estrecha
a 177, eso sí alcanzando valores muy elevados de 154 ante estimulación con PRL y 27.290 frente
a PRL + IBM-40. Con estos datos se puede concluir que, el rol inmunoestimulador de prolactina
potencia el aumento en la expresión de IL-1β frente a IBM-40, obteniéndose un efecto sinérgico.
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95
5.4.2. Evaluación de Cinéticas por desafíos de infección
5.4.2.1. Evaluación de la cinética de expresión frente a infección con IBM-40 viva
En general se observa una estimulación de la expresión de todos los transcritos
estudiados. Lo que podría concluir que los TLR poseen la capacidad de reconocer y responder
frente a IBM-40, contradiciendo con el hecho de que P. salmonis puede vivir y replicarse dentro
de la célula del hospedero, por lo tanto podría evadir la respuesta inmune contra ella (McCarthy
et al., 2008).
En particular existe aumento en la expresión de TLR1 y TLR22 ya a las 3 h post
infección, alcanzando un máximo a las 12 h y en particular un gran aumento en la expresión del
TLR de endosoma (TLR9) a partir de las 6 h post infección con un máximo a las 24 h de más de
180 veces respecto al control. La modulación de la expresión diferencial de los TLR estudiados
se apoya con el hecho de que las células del sistema inmune usan múltiples TLR para detectar
varias características de un patógeno simultáneamente (Underhill et al., 2002), productos
microbiales pueden también inducir otros TLR más de los específicos para su propio
reconocimiento (Randon-Barragan, 2009). Además, IBM-40 viva logra estimular la expresión de
MyD88 e IL-1β, con valores muy elevados para todos los genes en estudio. Por lo tanto, se puede
concluir que IBM-40 posee ligandos que son reconocidos por los 3 TLR en estudio y que logra
desencadenar una respuesta inmune que finaliza con el aumento de la IL en estudio 6 h después
de infectar con la cepa patógena de P. salmonis. Sin embargo, esta respuesta no es suficiente para
frenar la replicación de la bacteria dentro de las células, ya que se sabe que a los 3 días post
infección se puede observar claramente al microscopio el efecto citopático. Es decir, si bien los
TLR están involucrados en la respuesta frente a IBM-40 viva, se necesita lograr una forma
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96
efectiva de frenar la replicación de P. salmonis, para lograr evitar la sintomatología clínica del
SRS y las consecuentes pérdidas económicas, para ello se evaluaron otras formas de exposición
de P. salmonis.
5.4.2.2. Evaluación de la cinética de expresión frente a infección con la cepa LF-89 viva
En general no se observa una modulación de la expresión de los distintos TLR estudiados,
lo mismo ocurre con MyD88. Con estos datos, se puede concluir que LF-89 no posee ligandos
reconocidos por los TLR en estudio, sin embargo, LF-89 si es capaz de estimular la expresión de
IL-1β. El hecho que LF-89 si module positivamente la expresión de la IL en estudio, sugiere dos
posibles explicaciones, la primera es que no posee ligandos para los TLR en estudio, pero si para
otros TLR existentes en trucha. La segunda, y más factible explicación, es que el aumento en la
expresión de IL-1β sea desencadena por los TLR estudiados ya presentes en la célula sin mediar
transcripción de nuevos TLR y MyD88. Sugiriendo que LF-89 posee un menor número de
PAMPs comparada con IBM-40, lo que confirma los resultados bioinformáticos del número de
islas de patogenicidad obtenidos en la tesis en curso de Lagos, F.A.
5.4.2.3. Evaluación de la cinética de expresión de TLR frente a infección con la cepa IBM-
40 inactivada por calor
En general no se observa una modulación en la expresión de los receptores en estudio, con
lo cual se podría pensar que esta forma de inactivación no es buena para generar una respuesta
inmune, al menos vía TLR. Sin embargo, se observa una leve modulación positiva de la
expresión de MyD88, con un máximo de expresión de a las 3 horas cercano a 3 veces de aumento
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97
respecto al control. En el caso de IL-1β, se observa un aumento significativo en la expresión solo
a los dos últimos tiempos. Es decir, se observa una estimulación tardía de la expresión, cercana a
las 60 veces de expresión. En este caso, la inactivación fue por calor a 45°C, lo que sumado a las
diferencias intrínsecas entre las cepas LF-89 e IBM-40, puede explicar la diferencia de resultado
respecto a la tesis de Salazar en 2011. Es también posible especular que, la inactivación por calor
de la cepa IBM-40 no altere el que puedan ser reconocidos por los TLR correspondientes,
explicando de esta forma que la expresión de IL-1β frente a IBM-40 inactivada sea mayor a LF-
89 viva, esto dado a que la cepa IBM-40 es mucho más patógena que LF-89, y el número de
PAMPs que posee la cepa patógena es mayor incluso inactivada.
El hecho que IBM-40 inactivada module positivamente la expresión de la IL-1β, sin
mediar modulación de los TLR estudiados, sugiere que el aumento en la expresión de la citoquina
es desencadenada por los TLR ya presentes en la célula sin mediar transcripción de nuevos
receptores.
5.4.2.4. Evaluación de la cinética de expresión frente a estimulación con proteínas totales de
IBM-40
En general, se ve un aumento de la expresión de todos los marcadores evaluados y a muy
corto tiempo y con valores muy elevados. Al observar este resultado se podría concluir que esta
forma de exposición de IBM-40 podría ayudar en la creación de un adyuvante efectivo contra P.
salmonis, ya que se ven activados al menos tres TLR, lo que sería importante en activar y
modular una respuesta adaptativa en el hospedero (Seya et al., 2006). Esta forma de exposición
de la bacteria lograría que los ligandos estén más libres de puedan interactuar con sus
Page 111
98
correspondientes TLR y desencadenar una respuesta inmune adecuada, ya que proteínas totales
de la cepa IBM-40 son un rápido y muy efectivo método para estimular la expresión TLRs.
5.4.2.5. Evaluación de expresión de TLR en la cinética con prolactina e infección con IBM-
40 viva previa estimulación con PRL
En general, no se observa aumento en la expresión de los receptores en estudio para el
caso de infección con IBM-40 viva en cultivo primario previamente estimulado con PRL. Frente
a estimulación con PRL, sin posterior infección con P. salmonis, se observa un leve aumento en
la expresión solo en las primeras horas post estimulación para los receptores de membrana, TLR1
y TLR22. En el caso del receptor de endosoma, TLR9, solo se ve aumentada su expresión frente
a estimulación con IBM-40, sin responder a PRL. Con estos datos se podría pensar que prolactina
inhibe la respuesta inmune, al menos vía TLR.
Sin embargo, se observa una leve modulación positiva de la expresión de MyD88, tanto
para PRL como para infección con IBM-40 en cultivo primario estimulado con PRL. Además, se
observa una muy marcada estimulación en la expresión de IL-1β, especialmente a los dos últimos
tiempos de la cinética, donde la expresión frente a infección con IBM-40 sumada a la expresión
frente a estimulación con PRL es mucho menor a la obtenida al combinar ambos estímulos. Es
decir, se observa una estimulación sinérgica que alcanza valores de más de 27 mil veces respecto
al control sin infectar ni estimular a las 24 horas.
Olavarría y colaboradores en 2010, mostró las primeras evidencias que conectan PRL con
un proceso inmunológico: el estallido respiratorio y la expresión de citoquinas proinflamatorias
mediadas por la vías de señalización Jak/Stat y NF-kB. Los autores encontraron que PRL, en
peces teleósteos, regula la respuesta inmune por un entrecruzamiento en las vías de señalización
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99
Jak/Stat y NF-kB. Además, se confirma la diafonía entre las vías de señalización de los TLR y el
receptor de PRL, sugiriendo como ésta puede conducir a la activación sinérgica de las actividades
pro-inflamatorias de macrófagos o, en su defecto, a la inhibición de estas actividades. Con estos
antecedentes, se puede explicar el hecho que la estimulación previa con prolactina y posterior
infección con IBM-40 viva aumente la expresión de IL-1β sin mediar estimulación de la
expresión de TLR, dado que la estimulación con PRL provoca un aumento de la expresión de la
citoquina en estudio vía receptor de prolactina para así generar una activación de respuesta
inmune adquirida. Una vez que se produce la infección, dos horas después de la estimulación con
PRL, la célula ya se encuentra expresando IL-1β vía receptor de PRL, entonces se produce el
efecto sinérgico de ambos estímulos amentando la expresión de IL, además, mediante los
receptores TLR ya presentes en la membrana, como se esquematiza en la figura 22. Estos
resultados abren el camino para futuros experimentos destinados a lograr entender de mejor
manera el papel exacto desempeñado por PRL en la resolución de las enfermedades infecciosas
en los peces.
5.4.2.6 Evaluación de expresión en la cinética infectada con IBM-40 respecto a infectada
con LF-89
En general, se observa una mayor expresión de los marcadores evaluados en los últimos 3
tiempos frente a la cepa patógena IBM-40 respecto a la cepa LF-89. Lo cual sugiere que la cepa
de campo, IBM-40, posee un mayor número de PAMPs reconocidos por TLR que logran activar
la respuesta inmune de una forma mucha más potente. Por lo tanto, la cepa IBM-40 podría ser
mucho más efectiva en la creación de una vacuna contra P. salmonis, ya que se ven activados en
gran medida al menos tres TLR.
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100
Figura 22: Esquema representativo del entrecruzamiento en las vías de señalización de
TLR y receptor de Prolactina. Activación de TLR en respuesta a P. salmonis y receptor de
prolactina en respuesta a PRL. Se muestra las moléculas importantes en la cascada de señales de
cada vía, manteniendo una vía común a partir de la activación de NF-ƙB. Además, se representa
la prevalencia de la estimulación de la expresión de IL-1β vía receptor de PRL, obteniendo un
efecto sinérgico cuando se unen ambos estímulos, estimulación con PRL y posterior infección
con P. salmonis.
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101
Es importante recordar que este estudio se realizó en cultivo primario, por lo tanto las
interacciones entre distintos tipos celulares y compuestos humorales son posibles. Sin embargo,
es necesario el estudio en el organismo (in vivo) para comprobar que el comportamiento de los
TLR concuerda con el estudio realizado in vitro. Además, es necesario un análisis a nivel
proteico y se podrían agregar más factores para poder comprender el comportamiento del sistema
inmune más global frente a la infección con P. salmonis.
Basándose en los resultados obtenidos, podemos concluir que:
Se expresa RNA mensajero de TLR1, TLR22 y MyD88 en bazo, músculo, corazón,
branquias, intestino, riñón, cerebro e hígado de trucha.
P. salmonis cepa IBM-40, induce la expresión de mRNA de los receptores TLR1, TLR22,
TLR9, además de MyD88 e IL-1β, en cultivo primario de riñón anterior de trucha arcoris.
P. salmonis cepa LF-89, induce la expresión de mRNA de IL-1β sin mediar un aumento
en la expresión de mensajeros de TLR1, TLR22, TLR9 y MyD88 en cultivo primario de
riñón anterior de trucha arcoris.
Proteínas totales de la cepa IBM-40, podría ser una certera forma de exposición de P.
salmonis para una posible vacuna contra ella.
La estimulación previa con prolactina y posterior infección con IBM-40 viva, aumenta la
expresión de IL-1β en forma sinérgica, sin mediar estimulación de la expresión de TLR
en cultivo primario.
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102
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