ANKARA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK …acikarsiv.ankara.edu.tr/browse/24254/Binder1.pdf · sahip ve 600,000 ölümle sonuçlanan sistemik bir hastalık olan

ANKARA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

YÜKSEK LİSANS TEZİ

Salmonella Typhimurium’ da stj FİMBRİYAL OPERONU AKTİVE EDİLMİŞ MUTANTLARIN GENETİK ANALİZİ

Deniz YÜKSEL

BİYOLOJİ ANABİLİM DALI

ANKARA

2010

Her hakkı saklıdır

i

ÖZET

Yüksek Lisans Tezi

Salmonella Typhimurium’ da stj FİMBRİYAL OPERONU AKTİVE EDİLMİŞ MUTANTLARIN GENETİK ANALİZİ

Deniz YÜKSEL

Ankara Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Biyoloji Anabilim Dalı

Danışman: Prof. Dr. Mustafa AKÇELİK

stj fimbriyal operonunun in vitro koşullarda ifadesinin tanımlanması amacı ile stjE::lacZYA füzyonu içeren Salmonella Typhimurium LT2 mutantı (MA2) kullanıldı. T-POP transpozonu ile gerçekleştirilen mutasyonel çalışmalar sonucu stj fimbriyal operonu ifade edilen mutantların seçiminde stj operonu içine füzyonu yapılan lacZYA genlerinin fenotipik özelliğinden yararlanıldı. Bu mutantlardan yüksek β-galaktozidaz aktivitesi belirlenenlerde T-POP giriş bölgesi ters yön PZR yöntemi kullanılarak çoğaltıldı ve PZR ürünleri, DNA dizi analizine tabi tutuldu. DNA dizi analizleri sonucu, T-POP olası giriş bölgeleri (olası stj regülatör genleri) çoklu ilaç dirençlilik gen bölgesi regülatörü (mdr), transkripsiyonel bir global regülatör olan cadC, bir diğer transkripsiyonel regülatör LysR ve H-NS genleri ile homoloji vermiştir. DNA dizi analizinden elde edilen bulgular, DNA veritabanları, proteomik çalışmalar ile birlikte yorumlandığında; stj fimbriyal operonunun H-NS ve LysR ailesi transkripsiyonel regülatörler tarafından koordineli bir şekilde negatif regülasyona tabi tutulduğu sonucuna varılmıştır.

Temmuz 2010, 85 sayfa

Anahtar Kelimeler : Salmonella Typhimurium, stj operonu, mutasyon, aktivasyon

ii

ABSTRACT

Master Thesis

GENETIC ANALYSIS OF stj FIMBRIAL OPERON ACTIVATED MUTANTS IN Salmonella Typhimurium

Deniz YÜKSEL

Ankara University Graduate School of Natural and Applied Sciences

Department of Biology

Supervisor: Prof. Dr. Mustafa AKÇELİK

Salmonella Typhimurium LT2 mutant (MA2), which contains stjE::lacZYA fusion, was used to identify in vitro expression conditions of stj fimbrial operon. Phenotypic characteristics of lacZYA genes that are fused in stj fimbrial operon were used for selection of mutants, whose stj fimbrial operon was expressed as a result of T-POP transposon mutation. Among these mutants, inverse PCR analyses and sequencing of PCR products were performed at which exhibit high β-galactosidase activity. As a result of DNA sequence analysis, T-POP entry sites (possible stj regulator genes) shown similarity with the regulator of multi-drug resistance gene (mdr), global transcriptional regulator cadC, another transcriptional regulator LysR and H-NS genes. These findings, obtained from DNA sequence analysis, were interpreted with DNA database and proteomic analyses and it was concluded that stj fimbrial operon is subjected to coordinated negative regulation of H-NS and LysR family transcriptional regulators.

July 2010, 85 pages

Key Words: Salmonella Typhimurium, stj operon, mutation, activation

iii

TEŞEKKÜR

Yüksek lisans eğitimim boyunca bana emek veren, çalışmalarımın her aşamasında her türlü desteği, anlayışı gösteren ve her zaman yanımda olan sevgili danışman hocam Prof. Dr. Mustafa AKÇELİK’e (Ankara Üniversitesi, Fen Fakültesi, Biyoloji Bölümü)

Yardıma her ihtiyaç duyduğumda yanımda olan ve bana destek veren biricik hocam, çalışma arkadaşım Arş. Gör. Nefise AKKOÇ’a, çalışmaya birlikte başladığım sevgili arkadaşım Uzman Biyolog Meral KAYA’ya, yanımda olarak bana destek veren A. Cüneyt ERTUĞAL’a, tüm çalışma arkadaşlarıma,

Bu günlere gelmemi sağlayan, beni her durumda destekleyen ve yanımda olan anneme ve babama,

Yüksek lisans öğrenimim süresince sağladığı yüksek lisans bursu ile destek olan TÜBİTAK-BİDEB’e,

Sonsuz teşekkürlerimi sunarım.

Deniz YÜKSEL

Ankara, Temmuz 2010

iv

İÇİNDEKİLER

ÖZET………………………………………………………………………..……. i

ABSTRACT……………………………………………………………………… ii

TEŞEKKÜR……………………………………………………………………… iii

SİMGELER DİZİNİ…………………………………………………….………. vi

ŞEKİLLER DİZİNİ……………………………………………………..……… viii

ÇİZELGELER DİZİNİ………………………………………………………… ix

1. GİRİŞ…………………………………………………………………..…,,,,,,. 1

2. KAYNAK ÖZETLERİ……………………………………………………..… 3

2.1 Salmonella Cinsinin Genel Özellikleri…………………………………….... 3

2.2 Salmonella Patojenitesinin Temel Mekanizmaları………………………… 4

2.3 Salmonella’ nın Sahip Olduğu Virülens Faktörler………………………… 8

2.3.1 Fimbriyalar………………………………………..………..……………… 8

2.3.2 stj fimbriyal operonu ve patojenitedeki rolü………………………..…… 12

2.4 Salmonella’ da Virülens Faktörlerin Regülasyonunda Rol Görev Alan

Global Regülatör Sistemleri……………………………………………...…

13

2.4.1 ppGpp sistemi……………………………………………………………… 14

2.4.2 Cad sistemi…………………………………………………………………. 14

2.4.3 Csr sistemi………………………………………………………………….. 16

2.4.4 SirA/BarA sistemi…………………………………………………………. 17

2.4.5 RpoS sistemi……………………………………………………………….. 18

2.4.6 PhoP/PhoQ sistemi………………………………………………………… 20

2.4.7 OmpD/EnvZ regülatör sistemi……………………………………………. 21

2.4.8 LysR-Tip transkripsiyonel regülatör sistemleri…………………………. 21

3. MATERYAL VE YÖNTEM…………………………………………….…. 23

3.1 Materyal……………………………………………………………………… 23

3.1.1 Mikroorganizmalar……………………………………………………….. 23

3.1.2 Mikroorganizmaların saklama koşulları ve besiyeri…………………… 23

3.1.3 Çözeltiler…………………………………………………………………… 24

3.1.4 Primerler…………………………………………………………………… 31

3.1.5 Antibiyotikler……………………………………………………………… 31

v

3.2 Yöntem……………………………………………………………………….. 32

3.2.1 S. Typhimurium’ da P22 faj lizatlarının hazırlanması ve faj titresinin

yükseltilmesi………………………………………………………………..

32

3.2.2 T-POP transpozonunu içeren P22 faj lizatlarının hazırlanması………... 32

3.2.3 T-POP transpozon mutasyonu……………………………………………. 33

3.2.4 β-galaktozidaz testi………………………………………………………… 33

3.2.5 Genomik DNA izolasyonu…………………………………………………. 34

3.2.6 Ters yön polimeraz zincir reaksiyonu (PZR)…………………………….. 35

3.2.7 cadC gen bölgesinin çoğaltılması………………………………………….. 37

3.2.8 Antimikrobiyel duyarlılığın belirlenmesi………………………………… 38

3.2.9 Bradford yöntemi ile protein miktar tayini……………………………… 38

3.2.10 Sodyum Dodezil Sülfat (SDS) iki yönlü jel elektroforezi………………. 39

3.2.11 MALDİ-Tof Analizi………………………………………………………. 39

4. ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA…………….……………… 41

4.1 Transpozon Mutasyonu Yöntemi ile stj Fimbriyal Operonunun

İfadesinin Sağlanması……………………………………………………….

41

4.2 Mutantlarda T-POP Transpozonunun Genoma Giriş Bölgesinin

Belirlenmesi………………………………………………………………….

44

4.3 Çoklu İlaç Dirençlilik Regülatörünün stj Fimbriyal Operonu Üzerine

Etkilerinin Araştırılması……………………………………..……………..

47

4.4 CadC Regülatörünün stj Fimbriyal Operonu Üzerine Etkisinin

Araştırılması…………………………………………………………………

48

4.5 stj Fimbriyal Operonunun İfadesi Üzerine LysR ve H-NS Regülatör

Proteinlerinin Etkisinin Belirlenmesi………………………………………

51

5. SONUÇ………………………………………………………………………… 67

KAYNAKLAR…………………………………………………………………… 68

EK (Ters Yön PZR Veri Analizi Sonuçları)..……..…………………………… 84

ÖZGEÇMİŞ……………………………………………………………………… 85

vi

KISALTMALAR DİZİNİ

ACN Asetonitril

AK Amikasin

APS Amonyumpersülfat

bç Baz çifti

BSA Sığır serum albumini

°C Santigrat

Da Dalton

DNA Deoksiribonükleik asit

dNTP Deoksinükleotidtrifosfat

EDTA Etilen Diamin Tetraasetik Asit

g Gram

GEN Gentamisin

HTH Heliks-dönüş-heliks

IS İnsersiyon sekansı

KAN Kanamisin

kDa Kilodalton

LB Luria Bertani

LDC Lisin dekarboksilaz

LPS Lipopolisakkarit

Lys Lisin

µg Mikrogram

µL Mikrolitre

µm Mikrometre

mg Miligram

mL Mililitre

mM Milimolar

mm Milimetre

NEO Neomisin

PZR Polimeraz zincir reaksiyonu

vii

S. Salmonella

SDS Sodyum dodesil sülfat

SPI Salmonella patojenite adası

STR Streptomisin

TAE Tris Asetat Etilen Diamin Tetraasetik Asit

TE Tris Etilen Diamin Tetraasetik Asit

Tet Tetrasiklin

TFA Trifloroasetik asit

TTSS Tip 3 Salgı sistemi

UV Ultraviole

WHO Dünya sağlık örgütü

viii

ŞEKİLLER DİZİNİ

Şekil 4.1 stj fimbriyal operonu aktive edilen mutantlarda ters yön PZR analizi........

45

Şekil 4.2 Doğal suş ve mutantlarda çogaltılan cadC gen bölgesi…………………...

49

Şekil 4.3 20 numaralı mutatın SDS-iki yönlü jel elektroforezi ile belirlenen toplam protein profilleri…………..……………………………………………..

52

Şekil 4.4 S. Typhimurium LT2 suşunun SDS-iki yönlü jel elektroforezi ile belirlenen toplam protein profilleri……………..………………………..

53

Şekil 4.5 20 numaralı mutanta ait tripsin enzim kesimi sonucu stjB ile ortak olan peptitler…………………………………………………………………

54

Şekil 4.6.a Kontrol olarak kullanılan S. Typhimurium LT2 suşu, b. 20 numaralı mutanta ait SDS-iki yönlü jel elektroforezi ile belirlenen stjB ve cadC protein spotları …….…………………………………………………….

56

Şekil 4.7.a Kontrol suş olarak kullanılan S. Typhimurium LT2 suşu, b. 20 numaralı mutanta ait SDS-iki yönlü jel elektroforezi ile belirlenen sirA protein spotlar………………………..…………………………………..

57

Şekil 4.8 S. Typhimurium LT2 suşuna ait tripsin enzim kesimi sonucu sirA proteini ile ortak olan peptitler……………….……..…………………..

58

Şekil 4.9 20 numaralı mutanta ait tripsin enzim kesimi sonucu sirA proteini ile ortak olan peptitler…………………..…………………………………..

60

Şekil 4.10 20 numaralı mutanta ait tripsin enzim kesimi sonucu cadC proteini ile ortak olan peptitler…………………..…………………………………..

62

Şekil 4.11.a Kontrol suş olarak kullanılan S. Typhimurium LT2, b. 20 numaralı mutanta ait SDS-iki yönlü jel elektroforezi ile belirlenen ybdH protein spotu ……………...……………………………………………………...

63

Şekil 4.12 S. Typhimurium suşuna ait tripsin enzim kesim sonucu ybdH proteini ile ortak olan peptitler………………………...……...…………………..

64

ix

ÇİZELGELER DİZİNİ

Çizelge 3.1 Çalışmada kullanılan primerler ve sekansları………………………...

31

Çizelge 3.2 Çalışmada kullanılan antibiyotik diskleri ve konsantrasyonları……...

31

Çizelge 4.1 Füzyon suş ve mutantların β-galaktozidaz aktiviteleri……………….

42

Çizelge 4.2 S. Typhimurium LT2 suşu ve 20 numaralı mutantın antibiyotik duyarlılıkları…………………………………………………………

48

Çizelge 4.3 Farklı pH değerlerinde füzyon suşun ve transpozon mutantlarının β-galaktozidaz aktiviteleri…………………………………………..

50

1

1.GİRİŞ

Salmonelloz tüm dünyada gıda kökenli hastalıkların en önemlilerinden biridir. Hastalık

etmeni olan Salmonella enterica türü gastroenteritin en önemli ajanlarından biri olan

Typhimurium ile birlikte 2500’ün üzerinde serovaryete içermektedir. Bakteriyel

enfeksiyonun başlamasında ilk aşama patojenin konakçı epitel hücrelere tutunmasıdır.

Özgül tutunma, bakteriyel yüzeyler ile konakçı dokular arasında meydana gelen

bağlanıcı-almaç bölgelerin tamamlayıcı ilişkisi ile gerçekleşmektedir. Bakterilerin

yüzeyinde bulunan protein yapıdaki tutunma organalleri (fimbriya) söz konusu

tutunmanın başlıca ajanıdır. Salmonella cinsinin de dahil olduğu Enterobacteriacea

ailesinin birçok üyesinde en yaygın bulunan tutunma organeli Tip I fimbriya olarak

adlandırılmaktadır. Tip I fimbriya; eritrositler, lökositler, ince bağırsak sistem hücreleri,

protozoonlar, mayalar, küf hifleri ve bitki kök saçaklarına tutunma yeteneği

içermektedir.

Genetik analizler sonucu, Salmonella serovaryetelerinde ayrıca 12 fimbriyal operonun

daha varlığı tespit edilmiştir. Bu fimbriyaların yalnız iki adetinin in vitro koşullarda

üretildiği belirlenmiştir. Bunlar Tip I fimbriya (fim) ve ince agregatif fimbriyadır (agf).

Diğer yaygın Salmonella fimbriyaları içerisinde yer alan plazmid kodlu fimbriyanın

(pef) ve uzun polar fimbriyanın (lpf) heterolog konakçılarda ifadesinin sağlanması

nedeni ile konakçı hedef hücrelere bağlanma karakteristikleri ve patojenitede

oynadıkları rol detaylı bir şekilde tanımlanmıştır. Diğer dokuz Salmonella fimbriyasının

in vitro koşullarda üretilememesi nedeni ile tutunma ve kalıcılıkta oynadıkları roller

üzerinde çok az bilgi bulunmaktadır.

Salmonella’da tespit edilen fimbriyal operonların evrimsel açıdan en ilginç olanı, 2500

serovaryete içerisinde yalnız S. Typhimurium’da bulunan stj fimbriyal operonudur.

Yalnız DNA dizi analizleri sonucu elde edilen verilerin veritabanında değerlendirilmesi

sonucu fimbriyal yapılar ile kısmi uyumu tanımlanan bu operonun ifadesi ve

regülasyonu üzerinde herhangi bir bilgi bulunmamaktadır. Sadece araştırma grubumuz

tarafından yapılan çalışmada stj fimbriyasının fare model sistemlerde S. Typhimurium’

2

un kalıcılığında rol oynadığı ve dolayısı ile bu serovaryete için konakçı hedef hücrelere

tutunmada etkin bir ajan olduğu tanımlanmıştır (Akkoç vd. 2009).

Bu araştırmada stj fimbriyal operonunun S. Typhimurium’un patojenitesinde oynadığı

rolün detaylandırılmasına olanak sağlayacak çalışmaların önünü açmak amacıyla, söz

konusu operonun regülasyon karakteristiklerinin belirlemesi amaçlanmıştır.

3

2. KAYNAK ÖZETLERİ

2.1 Salmonella Cinsinin Genel Özellikleri

Salmonella, adını bulucusu olan Dr. Daniel Salmon’dan alan Gram-negatif, çubuk

şeklinde, spor oluşturmayan, fakültatif anaerob, Enterobacteriaceae familyasına ait bir

cinstir (Brenner vd. 2000). Salmonella enterica serovar Pullorum ve Salmonella

enterica serovar Gallinarum hareketini, sahip olduğu flagella ile sağlar. Hareketsiz olan

suşlar etkin olmayan flagellaya sahiptir. Salmonella’nın üreme sıcaklığı 2-47 °C

arasındadır. Hızlı üreme 25 °C ile 43 °C arasında meydana gelmektedir. Üreme için

gerekli optimum pH 6.5 ile 7.5 arasındadır. % 3 ve üzerindeki NaCl konsantrasyonu

genellikle üremeyi inhibe etmektedir (D’Aoust vd. 2001).

Salmonella’nın sınıflandırması karmaşık ve tartışmalıdır. Salmonella cinsi; S. enterica,

S. bongori ve S. subterranea olmak üzere üç tür içermektedir. S. enterica türü ise;

S. enterica subsp. enterica, salamae, arizonaei, diarizonae, houtenae ve indica olarak

adlandırılan altı alt türe ayrılmıştır (Fluit 2005). Adlandırmada meydana gelen

karışıklıktan kaçınmak için serovaryete adlarının ilk harfi büyük yazılmakta ve italik

olmamaktadır (Örn; Salmonella enterica subspecies enterica serovar Enteritidis). Kısa

yazımda cins adını takiben doğrudan serovaryete adı yazılmaktadır (Salmonella

Enteritidis) (Brenner vd. 2000, Ohl ve Miller 2001).

Salmonella’nın serotiplendirmesi veya antijenik sınıflandırması; bakterinin yüzey

antijenleri ile antikor etkileşimi sonucu saptanan reaksiyon tipine göre yapılmaktadır.

Spesifik serovaryetelerde LPS O-, flagellar H-, ve polisakkarit Vi- antijenlerinin

immünolojik olarak farklı kombinasyonları tanımlanmıştır. Bunun sonucu olarak 2500’

ün üzerinde Salmonella serovaryetesi izole edildikleri konakçıların veya şehirlerin

isimleriyle adlandırılmıştır (Brenner vd. 2000, Santos vd. 2002).

Büyük bir çeşitlilik gösteren Salmonella serovaryeteleri tüm dünyada geniş bir dağılıma

sahiptir. Bazı Salmonella serovaryeteleri konakçı spesifiktir. Örneğin; S. Pullorum

4

kümes hayvanlarında, S. Cholerasuius domuzlarda, S. Dublin büyükbaş hayvanlarda

görülmektedir. Diğer yandan S. Typhimurium gibi bazı serotipler oldukça geniş konakçı

çeşitliliğine sahiptir. Salmonella neredeyse tüm hayvan sınıflarından izole

edilebilmektedir. Salmonella’nın bu geniş yayılımı bakterinin farklı çevrelere kolay

uyum sağladığına işaret etmektedir (Fredorka-Cray ve Wray 2000, Santos 2003).

Patojenik Salmonella türleri bulaşıcı hastalıklara sebep olmaları nedeniyle dünya

çapında önemli bir risk grubu olarak değerlendirilmektedir. Organizmaların taşınması

fekal-oral yolla olmakta ve tifo ateşinden gastroenterite kadar çeşitli enfeksiyonlara yol

açmaktadır. Zorunlu insan patojeni S. Typhi, dünya çapında her yıl 16 milyon sıklığa

sahip ve 600,000 ölümle sonuçlanan sistemik bir hastalık olan tifo ateşine neden

olmaktadır. İnsan populasyonunda Salmonella kaynaklı hastalıklar, genellikle

gelişmekte olan ülkelerde su ve besin kaynaklarının iyi arıtılmaması sonucunda ortaya

çıkmaktadır. Hastalığın yayılmasını önlemede temel yaklaşım; antibiyotik tedavisi

yanında temizlik koşullarının iyileştirilmesini içermektedir. Bununla birlikte, antibiyotik

dirençli Salmonella türlerinin enfeksiyonlarının ortaya çıkması, tedavide büyük sorunlar

yaratmaktadır (WHO 1997, Jones 2005).

Salmonella sadece dünya çapında halk sağlığını tehdit etmeye devam etmesi açısından

değil, bakteriyel patojenitenin temel mekanizmalarını çalışmak için verimli bir model

sistem olması bakımından da önem taşımaktadır. Moleküler genetik yöntemlere iyi

yanıt vermesi ve insanlarda görülen tifo ateşinin fare modellerindekine benzemesi

nedeniyle, neredeyse tüm Salmonella patojenitesi çalışmalarında S. Typhimurium

kullanılmaktadır (Ohl ve Miller 2001, Santos vd. 2001, Jones 2005).

2.2 Salmonella Patojenitesinin Temel Mekanizmaları

Salmonella enfeksiyonuyla ilgili başlıca klinik sendromlar tifo ateşi ve gastroenterittir.

Tifo ateşi, yalnız insan patojenleri olan S. Typhi ve S. Paratyphi ile bulaşı sonucu oluşan

sistemik hastalıktır. Tersi bir durum olarak S. Enteritidis ve S. Typhimurium gibi tifoid

5

olmayan Salmonella suşları geniş konakçı dizgesine sahiptirler (Miller ve Pegues 2000,

Ohl ve Miller 2001).

Hastalık sürecinde ilk basamak duyarlı konakçıya geçiştir. Salmonella için bu durum

genellikle kontamine gıdaların tüketimiyle olmaktadır. Yapılan çalışmalarla

enfeksiyonun başlaması için 105-1010 bakterinin gerekliliği hesaplanmıştır (McCulloug

ve Eisele 1951, Glaser ve Newman 1982, Ohl ve Miller 2001). Gıda ile alınan suşların

virülansı ve ayrıca konakçının fiziksel durumu da hastalık için önemlidir. Genellikle,

mide asiditesinin üstesinden gelmek ve bağırsak sistemindeki normal florayla

yarışabilmek için fazla miktarda bakterinin alınması gerektiğine inanılmaktadır. Bunu

destekleyen çok sayıda kanıt vardır. Yiyeceklerle tüketilen Salmonella’nın bulaşıcı dozu

arttıkça mideden geçişi hızlanmaktadır. Ayrıca yemekler bu durumda mide asiditesinin

etkisini düşürmektedir (örneğin; peynir, süt) (Tauxe ve Pavia 1998, Santos 2002).

Özellikle yaşlılardaki yüksek gastrik pH, enfeksiyon duyarlılığını arttırmaktadır. Diğer

yandan, farelere önceden streptomisin muamelesi yapılması normal flora miktarını

düşürmekte ve bu durum farelerin % 50’sinde enfeksiyon için gerekli Salmonella

dozunu azaltmaktadır (Bohnhoff vd. 1964, Voino-Yasenetsky 1977, Ryan 1987, Santos

2003). Antibiyotik muamelesinin benzer etkileri insanlarda da saptanmıştır. Gastrik pH’

yı arttıran koşullar Salmonella enfeksiyonunun dozunu düşürmektedir. Bu durum,

gastrik asiditenin enfeksiyon için önemli bir ön bariyer olduğunu göstermektedir. Diğer

yandan Salmonella’lar düşük pH’ya maruz kalma sonucunda mide gibi asidik

çevrelerde hayatta kalmayı yöneten adaptif asit tolerans cevabı da oluşturabilmektedir

(Gianella vd. 1972, Garcia-del Portillo vd. 1993, Darwin ve Miller 1999, Zhang 2003).

Patojen; ince bağırsağa girişinin ardından, bağırsak epitel hücrelerine ulaşmak için önce

bağırsak mukoza tabakasını geçmek zorundadır. Salmonella’lar epitel hücrelere tutunma

yeteneğine katkıda bulunan çeşitli fimbriyaları sentezlemektedir (Baumler vd. 1996,

Ohl and Miller 2001, Zhang 2003). İntestinal invazyon Salmonella patojenitesinin

karakteristik özelliğidir. Salmonella patojenitesinin en ilginç noktalarından biri, bu

bakterilerin fagositoz benzeri bir süreci yönlendirerek fagositik olmayan hücreleri istila

etme yeteneğidir. M hücreleri, Peyer plaklarında folikülle ilişkili epitel hücrelerinde yer

6

almaktadır. Peyer plakları, farelerde Salmonella’nın hedef olarak seçtiği birincil

bağırsak epitel hücreleridir. S. Typhimurium, sığırlarda M hücreleri ve enterositleri

istila etme yeteneğine sahiptir (Jones vd. 1994, Santos vd. 2002, Santos 2003).

Bağırsak epitel hücrelerine tutunmanın ardından, S. Typhimurium SPI-1 tarafından

kodlanan tip III salgı sistemleri (TTSS), konakçı hücre sitozolünde yer alan bakteriyel

efektör proteinlerle yer değiştirmektedir. Bu proteinlerden bazıları; kinaz, fosfataz veya

aktin bağlanma aktivitesine sahiptir ve öncelikle konakçı hücre iskeletindeki hareketi

yöneten yolakları değiştirmektedir. Dolayısı ile Tip III Salgı Sistemi, enfeksiyon

süresinde bakteriyel istilayı ve konakçı gen ifadesini yönlendiren ana sistemdir (Galan

ve Zhou 2000, Santos 2003). Salmonella’nın ökaryotik hücreleri istila etmesinin

moleküler esasları, hücre kültürleri kullanılarak in vitro koşullarda yoğun bir şekilde

çalışılmaktadır. Benzer genetik yaklaşımlar günümüzde in vivo intestinal invazyon

çalışmaları için de kullanılmaktadır. SPI-1, sistemik enfeksiyonun ilk basamağı için

zorunludur. TTSS’leri, bitki, hayvan ve insan patojeni olan Gram-negatif patojenlerde

bulunan karmaşık moleküler makinelerdir. TTSS’leri fonksiyonel ve yapısal olarak

flagellar sistemlerle ilişkilidir ve tipik olarak bakteriyel hücrenin sitoplazma ve

periplazmasındaki iç ve dış membranlarda yer alan yirmiden fazla protein alt ünitesi

içermektedir. Bununla birlikte TTSS’lerinin temel fonksiyonunun hedef ökaryot

hücrelerdeki substrat proteinlerinin temas-bağımlı translokasyon olduğu saptanmıştır

(Jones ve Falkow 1996, Hueck 1998, Hanser-Wester ve Hensel 2001, Zhang 2003).

Konakçı hücre içindeki translokasyon, SPI-1 kodlu TTSS tarafından salgılanan efektör

proteinlerle sağlanmaktadır. SipA, SipB, SipC, SptP ve AvrA, SPI-1 lokusundaki genler

tarafından kodlanmaktadır. SipA doğrudan konakçı hücredeki aktine bağlanmakta,

polimerizasyon için gerekli kritik konsantrasyonu düşürmekte ve polimerizasyonun

inhibisyonu yoluyla aktin flamentlerini stabilize etmektedir. SopA, SopB, SopD, SopE

ve SopE2, SPI-1’den bağımsız bir bölgede kodlanmaktadır. SptP, SopE ve SopE2’nin

yapı ve fonksiyonu detaylı olarak çalışılmıştır. Bu proteinler, küçük GTPaz ailesine

dahil olan konakçı hücre proteinlerinin fonksiyonlarına engel olmaktadır (örneğin;

Cdc42, Rac-1 ve Rho). Ayrıca, sitoiskeletin hareketliliğini ve F-aktin filamentlerinin

oluşumunu düzenlemektedir. SPI-1 tarafından kodlanan Tip III salgı sisteminin

içeriklerinden, efektör proteinlerden veya SPI-1 transkripsiyonel regülatörlerden yoksun

7

mutant S. Typhimurium suşları epitel hücrelerini istila etme yeteneğine sahip değildir.

Bu da söz konusu sistemlerin Salmonella enfeksiyonu için zorunlu olduğuna işaret

etmektedir (Penheiter vd. 1997, Zhou vd. 1999, Marcus vd. 2000, Mirold vd. 2001,

Gerstel vd. 2003).

1990’ların ilk yıllarında yürütülen çalışmalarda, S. Typhimurium ve tek katman

bağırsak epitel hücreleri arasındaki etkileşimin morfolojik özellikleri belirlenmiştir.

Daha sonra gerçekleştirilen araştırmalarla salınma karakteristikleri Salmonella’nın tek

katman epitel hücrelerinin apikal yüzeylerine tutunup hücre içine girmesinden kısa bir

süre sonra, epitel hücrelerinde var olan hücre iskeletinin bozulmasıyla sitoplazmik giriş

başlamakta olduğu ve enfeksiyondan 30 dk sonra hücre işgalinin meydana geldiği

saptanmıştır. Enfeksiyondan 2 saat sonra ise, serbest bakteriler tek katman yapının

bazolateral bölgesinden salınmaktadır (Finlay ve Falkow 1991, Santos 2003).

S. Typhimurium farelerde sirkülasyon yolu ile sistematik olarak yayılmaktadır ve

enfeksiyon Peyer plaklarında, mezenterik lenf nodüllerinde, karaciğerde ve dalakta

yüksek sayıda bakteri içeren dokuyla ve çeşitli patolojik değişimlerle karakterize

edilmektedir (Hensel vd. 1997, Raffatellu vd. 2005). Dokularda bakterinin neden

olduğu benzer sistemik hasarlar tifo ateşine sahip hastalarda da rapor edilmiştir (Coburn

vd. 2005, Berger vd. 2006). Bu sendromda tipik olarak düşük seviyede bakteremi ortaya

çıkmaktadır (Zhang vd. 2003, Tükel vd. 2005, Mastroeni ve Maskel 2006). Tersi bir

durum olarak, insanda S. Typhimurium enfeksiyonunda genellikle bakteriler bağırsak ve

mezenterik lenf nodüllerinde lokalize olur. Bakteremi, enterokolit süresince geçici bir

durum olup, enfeksiyonun spesifik bir sonucu değildir. Tifo ateşi ve enterokolit

süresince konakçı cevaptan kaynaklanan en dikkat çekici farklılıklar, bağırsakta

tanımlanan inflamasyon tipidir. Tifo, inflamasyon oluşturan mononükleer hücrelerin

yavaş bir şekilde gelişen sızıntısı ve az veya hiç olmayan doku hasarı ile karakterize

edilir. S. Typhimurium’la enfekte edilmiş farelerde mononükleer lökositlerin sızıntısıyla

karakterize edilen enfeksiyon sonrasında 3 ile 5 gün içinde ince bağırsakta yayılan

enterit gelişmektedir (Walsh vd. 2000, Hapfelmeier vd. 2005, Miao vd. 2006). Bununla

birlikte enterokolit, baskın hücre tipi olarak hızlı bir şekilde gelişen nötrofil sızıntısı

yanında ileum ve kolonun büyük bölgelerindeki üst mukozanın nekrozu ile karakterize

8

edilmektedir. S. Typhimurium’la enfekte olmuş hastalardan alınan rektal biyopsiler, ilk

olarak nötrofil sızıntısıyla oluşan inflamasyonla karakterize edilen akut enteridi açığa

çıkarmaktadır (Zhang vd. 2003, Lawley vd. 2008). Bu nötrofil pompalaması ileum ve

kolonun son bölgesindeki mukozanın üst yüzeyinde geniş bir bölgede oluşan nekroz ile

ilişkilidir (Fischbach vd. 2006, Crouch vd. 2008). S. Typhimurium’un fare ve insandaki

enfeksiyonu; konakçı yanıtı, sendromlar ve bağırsak patolojisi açısından önemli

farklılıklar içermektedir. Bu farklılıklar, insanda meydana gelen S. Typhimurium

enfeksiyonunun patojenitesinin fare modellerinden elde edilen verilerle açıklanmasını

zorlaştırmaktadır. İnsan ve fare bağırsaklarında gözlenen farklı inflamasyon yanıtlarına

rağmen, kemirgenle ilişkili ileal parçalar S. Typhimurium tarafından indüklenen

patojenez çevriminde muhtemel virülens faktörlerin katkısının değerlendirilmesinde

model olarak kullanılmaktadır (Miao vd. 2006, Santos 2009).

2.3 Salmonella’nın Sahip Olduğu Virülens Faktörler

2.3.1 Fimbriyalar

Salmonella’nın hastalığa neden olmasını sağlayan mekanizmaların anlaşılabilmesi için;

hücre ve doku kültür sistemleri yanında hayvan modelleri de geliştirilmiştir. Bu

biyolojik araçların kullanımı ile Salmonella patojenitesi için gerekli çeşitli virülens

faktörlerin karakterizasyonu gerçekleştirilmiştir. Örneğin; doku kültüründe oluşturulan

epitel ve makrofaj hücrelerinin enfeksiyonu, invazyon ve Salmonella’nın hücre içinde

hayatta kalması için gerekli genetik elementlerin tanımlanmasına ve karakterize

edilmesine yardım etmiştir. Ek olarak, fare ve sığır modelleri, gastroenterit için önemli

bilgiler elde edilmesini sağlarken, kemirgen modellerde ağız yoluyla enfeksiyon ve

bağırsak bağımlı çalışmalar tifo ateşinin sistemik patojenitesini yöneten virülens

faktörlerin keşfedilmesine olanak tanımıştır (Wallis ve Golyov 2000, Jones 2005).

Böylece in vivo ve in vitro çalışmalar, Salmonella’nın neden olduğu hastalık için

gerekli virülens faktörlere dair daha çok bilgi elde edilmesini sağlamıştır. Salmonella

için önemli olan virülens özelliklerden bir tanesi, farklı Salmonella serovaryetelerinin

sahip olduğu çeşitli fimbriya tipleri tarafından yönetilen konakçı intestinal dokulara

tutunma yeteneğidir. Fimbriyalar, bakterilerin yüzeyinde bulunan ve reseptöre

9

bağlanmayı yöneten katı, filamentli yapılardır. Çoğu fimbriya, şaperon-usher sistemi

kullanmaktadır ve filamentli yapı genellikle birkaç alt üniteden oluşmaktadır. Fimbriya

tipik olarak tekrarlı bir ana alt ünite ve bu ana alt ünitelere bağlanan ve fonksiyonu

bilinmeyen küçük alt ünitelerden oluşmaktadır. Bu tutunma yapılarının en bilinenleri;

Tip 1 fimbriya, uzun polar fimbriya, plazmid kodlu fimbriya ve ince agregatif

fimbriyadır (Hultgren vd. 1991, Darwin ve Miller 1999, Jones 2005).

Sıvı besiyerinde gelişen S. Typhimurium hücrelerinin yüzeyinde fimbriya olarak

adlandırılan filamentli uzantılar ilk olarak 1958 yılında tanımlanmıştır. Daha sonra

birçok S. Typhimurium suşunda fimbriyanın ifadesi ve sıvı besiyeri kültüründe maya ya

da kırmızı kan hücrelerini aglütinasyon etme yeteneği saptanmıştır. Ortaya çıkan bu

aglütinasyon, ortama mannozun ilavesi ile inhibe edilebilir. Bu mannoz duyarlı

aglütinasyon ile düzenlenen adhezin, Tip1 fimbriya olarak adlandırılmıştır. Tip1

fimbriya, S. Typhimurium kromozomundaki fim operonu tarafından kodlanmakta ve

şaperon-usher sistemi içermektedir. fimA geni; ana alt üniteyi, fimH geni ise; reseptöre

bağlanmayı yöneten ve fimbriyal yapının uç bölgesinde lokalize olmuş olan adhezin

proteinini kodlamaktadır. Bu fimbriya, 37 °C’de 48 saatlik statik gelişmenin ardından in

vitro olarak ifade edilmektedir. Yapılan çalışmalarda söz konusu fimbriyanın, tavuk

bağırsak sisteminde, kemirgen bağırsak epitelinde ve Hep-2 doku kültür hücrelerinde

biyofilm oluşumunda rol aldığı belirlenmiştir (Lockman ve Curtiss 1992, Boddicker vd.

2002, Ledeboer ve Jones 2005).

Elektron mikroskopi yöntemleri ve sıvı bakteri kültürlerinde yürütülen hemaglütinasyon

testleri, çoğu S. Typhimurium izolatında Tip1 fimbriyanın sadece sıvı besiyerinde

üremenin ardından ifade edilen bir fimbriyal adhezin olduğunu göstermiştir. Katı

ortamda üreyen hücrelerde, elektron mikroskopi yöntemiyle tanımlanan fimbriyal tipler

morfolojik olarak Tip1 fimbriyadan farklılıklar göstermektedir. Bu yüzey uzantıları

mannoz-dirençli hemaglütinasyon bağlantılı ince kıvrımlı fimbriya olarak

adlandırılmaktadır. S. Typhimurium’da ince kıvrımlı fimbriyanın agf (csg) operonu

tarafından kodlandığı, saflaştırılan fimbriya ana protein bandının N-terminal ucunun

dizi analiziyle belirlenmiştir (Stolpe vd. 1994, Romling vd. 1998, Raffatellu vd. 2005).

10

Genomik analiz verileri S. Typhimurium’un Tip I ve ince kıvrımlı fimbriya dışında

başka fimbriyal adhezinlere de sahip olduğunu göstermiştir. Genetik analizler

sonucunda; S. Typhimurium’da fim ve agf’ye ek olarak en az beş adet daha fimbriyal

operon bulunduğu saptanmıştır. Bunlar; lpf (uzun polar fimbriya), pef (plazmid kodlu

fimbriya), bcf (sığır kolonizasyon faktörü), stf (S.Typhimurium fimbriya) ve saf

(Salmonella atipik fimbriya)’yı içermektedir. Salmonella’nın sahip olduğu diğer

fimbriyalar da kısmen karakterize edilmiştir. Uzun polar fimbriya (Lpf) lpfABCDE

genleri tarafından kodlanmaktadır ve kemirgen bağırsak mukozasında kolonizasyona

yardımcı olmaktadır (Baumler ve Heffron 1995, Baumler vd. 1996, Tsolis vd. 1999,

Kingsley vd. 2002, White vd. 2006). Bilimsel veriler lpf genlerinin ifadesinin, konakçı

immün sisteminden kaçmaya yardım eden faz varyasyonu mekanizması tarafından

kontrol edildiğini göstermiştir. Escherichia coli ve Proteus mirabilis ile yürütülen faz

varyasyon çalışmaları, bakterilerde in vivo koşullarda fimbriyaya sahip olma veya

olamama seçiminin organda kolonizasyon ve fimbriya gerekliliğine bağlı olduğunu

göstermiştir. Plazmid kodlu fimbriya (pef) 90-kb büyüklüğündeki Salmonella virülens

plazmidinde yer alan ve bağımsız transkribe edilen iki operon tarafından

kodlanmaktadır (Friedrich vd. 1993, Norris vd. 1998, Fitzgerald vd. 2003, Suar vd.

2006). Pef fimbriya, Salmonella’nın kemirgen epitel hücrelerine tutunması sonucu

oluşan sıvı birikmesini yönetmektedir. Bu fimbriyanın regülasyonu E. coli Pap

sisteminin analoğu olan faz varyasyonu mekanizmasıyla sağlanmaktadır. İnce agregatif

fimbriya (Tafi), yüksek adhezif özelliğe sahip olan uzantılardır. Bu tutunma faktörünün

içerikleri, farklı olarak transkribe edilen csgBAC ve csgDEFG operonları tarafından

kodlanmaktadır. Tafi ekstraselüler matriks proteinlerine tutunmayı, faz proteinleriyle ve

ana doku uyuşum kompleksi sınıf I molekülleriyle iletişim kurmayı sağlamaktadır. Tafi,

ayrıca biyofilm oluşumunda ve fare virülensine katkı sağlamada rol almaktadır. Tafi’nin

in vitro ifadesi, düşük sıcaklıkta optimum olarak gerçekleşmektedir. Çevresel sinyallerle

düzenlenen Tafi biyosentezi, ana alt ünite olan CsgA’nın ifadesini doğrudan düzenleyen

csgD gen ürünüyle ilerlemektedir. Bunlara ek olarak, Tafi ifadesinin regülasyonunda rol

alan CsgD ayrıca selüloz biyosentezinin ve bazı yüzeylerde oluşan Salmonella

biyofilminde bulunan ekzopolisakkaritlerin bileşenlerinin regülasyonunda da görev

almaktadır (McClelland vd. 2001, Prouty vd. 2002, Solano vd. 2002, Prouty ve Gunn

2003, Garcia vd. 2004, Ledeboer ve Jones 2005, Tükel vd. 2005, Tükel vd. 2007).

11

Yukarıda tanımlananlara ek olarak Salmonella genom analizleri sonucu altı adet olası

fimbriyal operon daha belirlenmiştir. Bunlardan stj fimbriyal operonu sadece

S. Typhimurium’da bulanmaktadır (Chessa vd. 2008).

Fimbriyaların in vitro koşullarda doku kültür hücrelerine invazyon için de gerekli

olduğu belirlenmiştir. SPI1 tarafından kodlanan Tip III salgı sistemi, tüm hücre

tiplerinin istilası için gerekli iken, her bir fimbriyal operon sadece belirli hücrelere

tutunma ve bu hücreleri istila etmede rol oynamaktadır. Bu yüzden fimbriyalar,

serovaryete Typhimurium’a farklı epitel hücreleri ayırt etme yeteneği sağlıyor olabilir.

Yapılan çalışmalarda, Salmonella’nın epitel hücrelere ve fare bağırsak dokusuna

tutunmasını ve biyofilm oluşumunu yöneten adhezin molekülü olan Tip 1 fimbriyadaki

spesifik amino asitlerin önemini açığa çıkarmıştır. Uzun polar fimbriyanın, bağırsaktaki

lenf folikülleri boyunca yer alan peyer plaklarına bağlanmayı sağladığı kesin kanıtlarla

belirlenmiştir (Baumler vd. 1996, Darwin ve Miller, 1999, Humpries vd. 2001,

Boekema vd. 2004, Wilson vd. 2008).

Fimbriyalar tarafından sağlanan tutunma enfeksiyon için kritik önem taşımakta, ancak

bu yüzey yapılarının ifadesi aynı zamanda patojen için potansiyel bir dezavantaj da

teşkil etmektedir. Zira yaklaşık olarak 1000 ana alt ünite kopyasından oluşan fimbriyal

filamentler, konakçının immün cevabı oluşturması için iyi bir hedef teşkil etmektedir.

Bu görüşü destekler kanıtlar, yani fimbriyal adhezinlerin enfeksiyonda antijen gibi rol

alması; SefA, PefA ve FimA için S. Enteritidis ile yürütülen tavuk enfeksiyon ve LpfA

için S. Typhimurium ile yürütülen fare enfeksiyon modellerinden elde edilmiştir

(Nicholson ve Baumler 2001, Humpries vd. 2001, Helms vd. 2005, Wilson vd. 2008).

Farelerdeki Typhimurium enfeksiyonuna karşı oluşan adaptif immün cevap, B hücre-

bağımlı ve T-hücre bağımlı efektör mekanizmaların her ikisini de içermektedir. Bu

duruma örnek olarak; B hücrelerinden yoksun farelerde S. Typhimurium’a karşı oluşan

immün cevabın bozulmamış B hücrelerine sahip farelerde oluşan cevaba göre daha

duyarlı oluşu, gösterilebilir. Benzer şekilde, S. Typhimurim’la enfekte edilmiş T

hücrelerinden yoksun farelerin virülent S. Typhimurium’a karşı direnmede duyarlılığı

artmaktadır. Bu çalışmalar ışığında, Salmonella serovaryetelerinin oluşturduğu

enfeksiyon süresince fimbriyal proteinlere maruz kalma sonucu T hücre ve B hücre

12

bağımlı cevabın ortaya çıktığı düşünülmektedir (Mastroeni vd. 1992, Barbour vd. 2000,

Humpries vd. 2001, Chakravortty vd. 2002, Desvaux vd. 2004, Srivatsan ve Wong

2008).

2.3.2 stj fimbriyal operonu ve patojenitedeki rolü

S. Typhimurium genomu agf(csg), fim, lpf, pef, bcf, stb, ste, std, stf, sth, sti, saf ve stj’yi

içeren 13 fimbriyal operon içermektedir (Weening vd. 2005, Tükel vd. 2007, Chessa vd.

2008). Bu 13 fimbriyal operondan biri olan stj operonu sadece S. Typhimurium

genomunda bulunmaktadır. Bu durum Stj fimbriyasının serovaryete-spesifik virülens

karakteristik olarak etki gösterebileceğine işaret etmektedir. stj fimbriyal operonu

sadece S. Typhimurium LT2 genom dizi analiziyle tanımlanmıştır. Stj fimbriyasının

S. Typhimurium’ un konakçı sistemde virülensi ve hayatta kalması üzerine 2009 yılına

kadar herhangi bir çalışma bulunmamaktadır. Çalışma grubumuz tarafından yürütülen

araştırma, S. Typhimurium’da stj fimbriyal operonunun fare model sistemlerinde

kolonizasyon ve konakçı sistemde kalıcılık üzerinde etkili olduğunu gösteren ilk

çalışmadır (Akkoç vd. 2009). Bu çalışmada stj fimbriyal operonunun genetik olarak

dirençli farelerde (CBA) S. Typhimurium’un hayatta kalmasını arttırdığını belirlemek

için intihar plazmidi olan PGP704 plazmidinin kromozomal insersiyonuyla MA44

olarak adlandırılan stj mutant elde edilmiştir. Stj fimbriyal operonunun intestinal

sistemde hayatta kalmada oynadığı rolü araştırmak amacıyla dört CBA fare grubunda

yarışmalı inhibisyon denemeleri yapılmıştır. Eşit sayıda stj mutant (MA44) ve phoN’de

mutasyon taşıyan S. Typhimurium AJB715 suşu, CBA fare grubunda mide içine inoküle

edilmiştir. Fare fekal örnekleri enfeksiyonun 3, 7, 9, 14, 17, 21, 25, 28, 30 ve 34

günlerinde toplanmıştır. Yarışmacı suş AJB715’in (phoN, beyaz koloniler) ve stj

fimbriyal mutant MA44’ün (phoN+, mavi koloniler) sayıları LB agar ortamınına fekal

homojenatlardan yayma ekim yapılarak belirlenmiştir. Deneydeki 34 günlük zaman

periyodundan sonra stj mutant MA44’ün, yarışmacı suş olan AJB715’ten önemli ölçüde

daha az sayıda olduğu belirlenmiştir (p<0.005). Tüm periferal bölgedeki örneklerde

(dalak, bağırsak ve mezenterik lenf nodülleri) mutant, doğal suş olan AJB715’ten daha

az kolonize olmuştur (p<0.005). Bu sonuçlar stj fimbriyal operonunun, S.

13

Typhimurium’un farede kolonizasyonunda ve fare intestinal sistemde uzun süreli

kalıcılığında kritik bir oynadığını kanıtlamıştır (Akkoç vd. 2009).

stj fimbriyal operonunun S. Typhimurium’un patojenitesinde kritik bir role sahip

olduğunun belirlenmesi, bu operonun genetik regülasyonunun tanımlanmasının önemini

arttırmıştır.

2.4 Salmonella’da Virülens Faktörlerin Regülasyonunda Görev Alan Global

Regülatör Sistemleri

Salmonella patojenitesi, konakçı hayvanda farklı anatomik bölgeleri kullanan çeşitli

bakteriyel virülens faktörlerin koordineli regülasyonunu gerektiren oldukça karışık bir

süreçtir. Yapılan çalışmalar, konakçı hücreleri istila için gerekli olan genlerin

regülasyonu üzerine yoğunlaşmıştır. Araştırmalar sonucunda; bakteriyel gelişme,

ozmolarite, oksijen gerilimi gibi belli başlı çevresel koşulların, Salmonella’nın doku

kültür hücrelerini istila etme yeteneğini etkilediği belirlenmiştir. Bu koşullara in vitro ve

in vivo süreçlerde adaptasyon genellikle global regülatörler tarafından sağlanmaktadır

(Galan ve Curtiss III 1989, Ernst vd. 1990, Lee ve Falkow 1990, McBeth ve Lee 1993,

Jones 2005).

Fakültatif hücre içi patojenler, memeli konakçıları enfekte etme süresince;

gastrointestinal sistem ve onu takiben makrofajlar ve epitel hücreler içindeki çeşitli

çevresel koşullara hızlı şekilde uyum sağlamak zorundadırlar. Konakçıda başarılı bir

enfeksiyon için, enfeksiyonun hücre içi ve hücre dışı fazları arasındaki adaptasyonda

görev alan çok sayıda virülenslikle ilişkili genin ifadesi gerekmektedir. Bakteriyel

genetik döngüler hiyerarşik bir organizasyon sürecinde gerçekleşmektedir. Bu

hiyerarşik regülasyon basamakları gen, operon, modülen ve stimülen sistemlerden

oluşmaktadır (Gottesman 1984, Haralalka vd. 2003, Raffatellu vd. 2006, Tükel vd.

2007).

14

2.4.1 ppGpp sistemi

Son yıllarda yürütülen çalışmalarda; gelişme, stres, besinsel azlık ve konakçıda hayatta

kalmayla ilişkili süreçlerde (p)ppGpp’nin gerekliliği saptanmıştır. Bakteriyel sinyal

molekülü ppGpp, hücre içi ve hücre dışı koşullar doğrultusunda virülens gen

sistemlerinin regülasyonunu sağlayan önemli bir global regülatördür. ppGpp’nin

Mycobacterium tuberculossis, Leigonella pneumophila, Vibrio cholera ve Pseudomonas

aeruginosa’yı içeren patojenik bakterilerin virülensinde önemli bir rol oynadığını

gösteren kanıtlar artmaktadır (Primm vd. 2000, Taylor vd. 2002, Haralalka vd. 2003,

Erickson vd. 2004, Ngwei vd. 2006, Ezequiel vd. 2008, Potrykus ve Cashel 2008).

Yapılan çalışmalarda duyarlı BALB/c farelerde, ∆relA∆spoT S. Typhimurium

mutantların kalıcılığının düştüğü ve in vitro denemelerde epitel hücreleri istila

yeteneğini yitirdiği belirlenmiştir. Bu sonuçlar ppGpp’nin Salmonella’da virülens gen

ifadesinde kritik rol oynayabileceğini göstermektedir. ppGpp’nin, konakçı

enfeksiyonuyla ilgili gelişme koşullarına dair neredeyse bilinen tüm Salmonella virülens

genlerinin ifadesi için gerekli olduğu belirlenmiştir (Pizarro-Cerda ve Tedin 2004,

Thompson vd. 2006, Chessa vd. 2008).

2.4.2 Cad sistemi

Ağız yoluyla vücuda alınan enterik bakteriler, gastrik bariyeri aşmaya ve asidik koşullar

altında bağırsakta çoğalmaya çalışmaktadırlar. E. coli, Salmonella ve Shigella gibi

enterik bakteriler hayatta kalabilmek için karmaşık asit indükleyen stratejiler

geliştirmişlerdir. Düşük pH, hücresel yaşam için uygun pH seviyesini oluşturan çeşitli

amino asit dekarboksilazların transkripsiyonunu harekete geçiren moleküler cevapları

indüklemektedir (Bearson vd. 1997, Merrell ve Camilli 2002).

pH dengesini sağlayan üç büyük dekarboksilaz sisteminden bir tanesi lisin

dekarboksilaz aktivitesini esas alan sistemdir. E. coli’de bu aktivite, lisin dekarboksilaz

(cadA) ve lisin dekarboksilaz taşıyıcı protein (cadB) vasıtasıyla gerçekleşmektedir. Bu

sistem düşük pH ve lisin varlığında indüklenmektedir. cadBA operonunun ifadesi; bu

15

genlerin üst transkripsiyon bölgesinde yer alan, bu operondan bağımsız olarak

transkripsiyonu yapılabilen ve bu operonun pozitif aktivatörü olan CadC’ye bağlıdır

(Merrell ve Camilli 2002).

Lisin dekarboksilaz (CadA) biyolojik parçalanmayı sağlayan bir enzimdir ve hücre

dışından sağlanan lizini, alkali ürün olan kadaverine dönüştürerek asidik çevrenin pH

dengesinin ayarlanmasına katkıda bulunmaktadır. Bu aktivitesini, kadaverini hücre

dışına salgılayarak gerçekleştirmektedir. Ayrıca, dekarboksilasyon süresince CadA

tarafından üretilen CO2’in, nükleotit biyosentezini de içeren çeşitli metabolik yollara

katkıda bulunduğu düşünülmektedir (Takayama vd. 1994, Helms vd. 2005).

Patojenik E. coli suşları için bağırsak epitel hücrelerine tutunma, enfeksiyonun

gerçekleşmesi için gereklidir. Yapılan çalışmalarda, bu tutunmada birçok faktörün rol

aldığı bulunmuştur. Bu faktörlerden bir tanesi de CadA proteinidir. Bu proteinin çeşitli

enterik patojenlerde virülensi negatif olarak düzenlediği düşünülmektedir. Flagella ve

F9 fimbriyanın cadA mutantlarda daha fazla regüle edildiği saptanmıştır. Bu durum Cad

regülatör mekanizmasının tutunmadaki ilişkisini ortaya koymaktadır (Morita vd. 2006).

Japonya’da S. Enteritidis’in LDC-negatif izolatlarının sayısının beklenmedik derecede

yüksek olduğu ve tüm izolatların cadC geninde aynı pozisyonda tek baz delesyonu

içerdiği belirlenmiştir. LDC-pozitif fenotip Salmonella suşlarında ana karakteristik

özelliktir (Farmer 2003, Wilson 2004, Morita vd. 2006). Salmonella’daki CadC

yokluğu, konakçı dokularda hayatta kalmasını arttırmak için ortaya çıkan patoadaptif bir

mutasyon olarak değerlendirilebilir. Bununla birlikte, S. Typhimurium’da CadC’nin

enfeksiyon süresince indüklendiği tespit edilmiştir. Bu durum, CadC’nin konakçı

dokusunda hayatta kalmaya katkıda bulunarak patojeniteyi arttırdığını

düşündürmektedir (Heithoff vd. 1997, Eriksonn vd. 2003, Vazquez-Juarez vd. 2008).

16

2.4.3 Csr sistemi

Csr sistemi, çeşitli bakteri türlerinde bulunan post-transkripsiyonel bir regülatördür. Bu

sistem yaygın olarak E. coli’de çalışılmış ve karbon metabolizmasının ve hareketliliğin

düzenlenmesinden sorumlu olduğu belirlenmiştir. S. Typhimurium’da csrA ve csrB’nin

her ikisi de E. coli’deki eşdeğerleriyle güçlü bir sekans homolojisi göstermektedir

(Romeo vd. 1993, Altier vd. 2000b). CsrA, E. coli’de karbon metabolizması gibi temel

fonksiyonları düzenleyen global bir regülatör olmasına rağmen S. Typhimurium’da

E. coli’de bulunmayan özel virülens determinantları düzenlemektedir (Wei vd. 2001,

Baker vd. 2002). CsrA, S. Typhimurium’da invazyon genlerinin regülatörüdür. SPI-1

invazyon gelerinin ifadesi csrA mutantlarda büyük ölçüde indüklenmektedir.

Salmonella suşlarında doğal ya da yapay csrA mutantların flagellasız ve hareketsiz

olduğu saptanmıştır. Salmonella tarafından benzer şekilde kullanılan iki metabolik

yolun genlerinin; etanolamin katabolizması için zorunlu eut operonu ve 1,2-propanediol

katabolizması için zorunlu pdu operonunun ifadesinin Csr sistemi tarafından

indüklendiği tanımlanmıştır. Ayrıca CsrA’nın, etanolamin ve 1,2-propanediol’ün her

ikisinin de metabolizması için gerekli olan B12 vitamininin sentezini cob operonu ile

birlikte düzenlendiği belirlenmiştir. Diğer yandan csrA mutantlarda maltoz ve

maltodekstrinlerin kullanımı ve taşınması için gerekli olan mal operonunun genleri

zayıf olarak ifade edilmekte ve normalde dış membranın baskın proteini olan

maltoporinin miktarı indirgenmektedir. S. Typhimurium patojenitesinin ilk basamağı

olan epitel hücreleri istila etme yeteneği, SPI-1’de lokalize olmuş Tip III salgı sistemi

tarafından kodlanmaktadır. Oksijen azlığı, pH, ozmolarite ve gelişme fazının, invazyon

genlerinin ifadesinde değişime neden olduğu gösterilmiştir. Bu koşullara cevabın

birçoğu SPI-1’in OmpR/ToxR ailesi bir regülatör olan HilA tarafından

düzenlenmektedir (Bajaj vd. 1995, Bajaj vd. 1996, Altier vd. 2000a, Altier vd. 2000b,

Lawhon vd. 2003, Unsworth vd. 2004). SPI-1 invazyon genlerinin CsrAB tarafından

regülasyonu ise oldukça karmaşık bir süreçtir. CsrA’nın kaybı veya CsrB’nin fazla ifade

edilmesiyle serbest CsrA’nın indirgenmesi, SPI-1 genlerinin ifadesini ve epitel hücre

invazyonunu azaltmaktadır. Ancak CsrA’nın fazla ifadesi veya CsrB’nin kaybı da aynı

etkilere yol açmaktadır. Bu bulgular Csr sisteminin invazyonu hem pozitif hem de

negatif olarak regüle ettiğini göstermektedir. Optimum invazyon için aktif CsrA

17

seviyesinin sıkı kontrolü gerekmektedir. CsrA, SPI-1 genlerinin ifadesini pozitif olarak

düzenlemekte ayrıca diğer SPI-1 genlerinin regülatörü olan HilA’yı da kontrol

etmektedir. CsrA’ya, HilA’dan bağımsız olarak, invF ve sipC’nin ifadesi için de ihtiyaç

duyulmaktadır. InvF, sip operonunun transkripsiyonunu aktive ederek sipC’nin tam

olarak ifade edilmesi için gereklidir. csrA’nın yüksek seviyede ifade edilmesi, SPI-1

genlerine csrA mutantlardakiyle aynı etkiyi göstermektedir. CsrA, SPI-1 genlerini

aktive eden CsrB’nin repressörüdür (Altier vd. 2000a,b, Unsworth vd. 2004, Bourzac ve

Guillemin 2005, Galan 2008).

2.4.4 SirA/BarA Sistemi

Salmonella’da bir çok patojenite adası kendi transkripsiyonel regülatörlerini

kodlamaktadır. Bu durum transkripsiyonel regülatörlerin, organizmanın merkezi

metabolizma regülatörleri tarafından düzenlenen adaptör regülatörler olduğuna işaret

etmektedir. Bunun en iyi örneği SPI1’in regülasyon mekanizmasıdır. HilA, diğer SPI1

genlerinin ifadesinin kontrolünü sağlayan, SPI1 tarafından kodlanan ompR/toxR

ailesinin transkripsiyonel regülatörüdür. Bununla birlikte HilA, fosforil akseptör

bölgesinden yoksun bir temel aktivatördür. Çeşitli çevresel faktörlerin hilA

transkripsiyonunda etkili olduğu bilinmektedir. Bu koşullar; ozmolarite, pH, oksijen ve

divalent katyonları içermektedir (Guiney vd. 1995, Lee vd. 1992, Bajaj vd. 1995,

Ahmer vd. 1999). HilA’nın ifadesinin regülasyonundan sorumlu sensör proteinler tam

olarak belirlenmiştir. En iyi şekilde karakterize edileni iki-bileşenli PhoPQ regülatör

sistemidir. Bu sistem enfeksiyonun intestinal fazı tamamlandıktan sonra HilA’yı

baskılamaktadır. hilA ifadesinin ikinci bir regülatörü prgH’dir. Bu regülatör sirA

(Salmonella invasion regulator) olarak adlandırılmıştır ve uvrC genlerinin üst

transkripsiyon bölgesinde yer almaktadır. PhoQ’nun aksine SirA, hilA’nın

aktivatörüdür (Johnston vd. 1996, Soncini vd. 1996, Vescovi vd. 1997, Ahmer vd.

1999). sirA geni, S. Typhimurium, Erwinia carovata ve çeşitli Pseudomanas türlerinde

salgılanan virülens faktörlerin ifadesi için gereklidir (Rich ve Willis 1997, Eriksson vd.

1998, Ahmer vd. 1999). Virülens genlerin ifadesinde, fosforile edilmiş SirA, SPI1-

kodlu virülens regülatörler hilA ve hilC’nin promotoruyla doğrudan etkileşime

geçmektedir. Bununla birlikte SPI-4 ve SPI-5’te SirA tarafından düzenlenen genler de

18

hilA bağımlıdır. S. Typhimurium’da barA ve sirA genleri, iki bileşenli sensör kinazı ve

cevap regülatörü kodlamaktadır. Bu sistem virülens genlerinin ifadesini arttırmasının

yanında, hareket genlerinin ifadesini azaltmaktadır. Flagellar genlerin temel regülatörü

flhDC, intestinal virülens faktörlerin birincil regülatörü olan hilA üzerinde pozitif

regülatör etkisi göstermektedir; fakat hilA’nın flhDC üzerinde etkisi yoktur. SirA, hilA

mutantlarda flhDC’yi baskılamakta ve flhDC mutantlarda hilA’yı aktive etmektedir.

flhDC ve hilA regülatörleri birbirini etkilemesine rağmen, sirA bunların her birine

bağımsız olarak etki etmektedir (Teplitski vd. 2003, Gente vd. 2004).

CsrA/CsrB sistemin flagellar gen ifadesi üzerine doğrudan etkili olduğu bilinmektedir.

sirA geni ise csrA’yı düzenlememekte fakat csrB’nin ifadesini aktive etmektedir.

Fosforlanmış SirA’nın csrA promotoruna bağlanmadığı, fakat csrB promotoruna

doğrudan bağlandığı bulunmuştur. Bu modele göre, SirA; csrB aracılığıyla flagellar

regülonu dolaylı olarak baskılarken, HilA aracılığıyla virülens ifadesini doğrudan aktive

etmektedir (Teplitski vd. 2003, Teplitski vd. 2006).

SirA ve Csr sisteminin ayrıca Tip1 fimbriyayı kodlayan fim operonunu kontrol ettiği

belirlenmiştir. Diğer bakterilerdeki sirA ortologlarının ve S. Typhimurium’daki sirA

regülonunun biyofilm üretimi üzerindeki etkinliği in vitro koşullarda test edilmiştir.

sirA, csrB/csrC ve fiml mutantlarda biyofilm oluşumu engellenmiştir. Ayrıca flhDC’nin

inaktivasyonunun biyofilm oluşumunu arttırdığı belirlenmiştir. Diğer yandan SirA,

biyofilm oluşumunu arttıran fim operonu, csrB ve csrC’yi aktive etmektedir. csrB ve

csrC, fim operonunun translasyonunu arttırırken, aynı zamanda biyofilm oluşumunu

inhibe eden flagella translasyonunu da engellemektedir (Teplitski vd. 2006, Chessa vd.

2008).

2.4.5 RpoS sistemi

Bakteriler; toksik kimyasallar, asit koşullar, yüksek ozmolarite ve sıcaklık, sınırlı besin

kaynaklarını içeren çeşitli stres koşullarına karşı hızlı bir şekilde adaptasyon sağlama

yeteneğine sahiptir. Bu koşullar altında bakteriler genellikle spesifik gen setlerinin

aktivasyonu için sigma faktörlerini harekete geçirirler. E. coli ve çeşitli diğer bakteriler,

19

sigma-24, sigma-28, sigma-32, sigma-38 ve sigma-54 olarak tanımlanan alternatif

sigma faktörlerine sahiptir (Jishage vd. 1996). Bunlardan sigma-38 (ayrıca KatF, RpoS

ve sigma-S olarak da adlandırılır), asidik pH, sınırlı besin kaynaklarının bulunduğu

koşullarda veya üssel gelişme evresinde aktive edilen çeşitli genlerin ifadesinde rol

almaktadır (Hengge-Aronis 1996, Zambrano ve Kolter 1996). Ayrıca sigma-S, hidrojen

peroksitin toksit etkilerine karşı bakteriyel dirence, sekonder metabolitlerin üretimine ve

S. Typhimurium gibi hayvan patojenlerinin virülensine de katkıda bulunmaktadır

(Sarniguet vd. 1995, Fang vd. 1996).

Salmonella’nın oral enfeksiyonu sonrası organizmalar bağırsak epitel hücrelerine doğru

göç eder ve Peyer plaklarının parçası olan makrofajlarca fagosite edilir. Yaygın olarak

görülen enfeksiyonlarda Salmonella lenf dokuya ve kan damarlarına yayılır, ardından

başta karaciğer ve dalak olmak üzere iç organlarda çoğalır. Salmonella spp.’nin

makrofajları enfeksiyonu, patojenitesi için son derece önemli bir evredir ve

makrofajlarda hayatta kalma yeteneğinde olmayan mutantlar virülens özelliğe sahip

değildir. Virülens plazmid tarafından kodlanan spv genleri konakçı hücrenin hücre içi

koşulları tarafından indüklenmektedir (Rhen vd. 1993, Guiney vd. 1995, Santos vd.

2003). spv genleri, S. Typhimurium, S. Dublin, S. Enteritidis, S. Choleraesuis ve

S. Gallinarum-Pullorum’u içeren sistemik hastalıklarla ilişkili Salmonella

serovaryetelerinde bulunmaktadır. spvRABCD gen kümesi Salmonella’nın iç

organlarda gelişme düzeyini kontrol etmektedir. Ayrıca insanlarda ve hayvanlarda

sistemik enfeksiyon ve bakterimi için zorunludur. S. Typhimurium’da σs, Salmonella

virülens plazmidindeki spv genlerinin ifadesini sağlamaktadır. Salmonella RpoS

mutantlarla enfekte edilmiş farelerin dalağında kolonizasyonun ciddi miktarda azaldığı

belirlenmiştir. Buna ek olarak RpoS mutasyonlarının, enfekte farelerde

S. Typhimurium’un Peyer plaklarında kolonizasyonunu önemli ölçüde düşürdüğü ve

virülens plazmidi giderilmiş mutantların ise aynı serovaryetenin dalaktaki

kolonizasyonunu düşürdüğü saptanmıştır (Kowarz vd. 1994, Nickerson ve Curtiss 1997,

Marcus vd. 2000, Hensen-Wester ve Hensel 2001, Gentle vd. 2004, Morgan vd. 2007).

20

2.4.6 PhoP/PhoQ Regülatör Sistemi

İki elemanlı PhoP/PhoQ regülatör sistemi S. Typhimurium’un patojenitesinin ve kırktan

fazla genin transkripsiyonunun kontrolü için gereklidir. PhoP/PhoQ, farede virülenslik,

makrofajların içinde hayatta kalma, katyonik antimikrobiyel peptitler (CAMPs) için

direnç, tek karbon kaynağı süksinat olan ortamda gelişme ve sınırlı miktarda

magnezyum bulunan ortamda gelişme için gereklidir. PhoQ, PhoP’yi fosforile eden

sensör histidin kinazdır ve çevresel koşullara cevap oluşturan bir regülatördür.

PhoQ’nun aktivitesi divalent katyonlar olan magnezyum ve kalsiyum tarafından

baskılanmaktadır. PhoP, pags (PhoP tarafından aktive edilen genler) olarak adlandırılan

bir grup genin ifadesini aktive etmektedir. Bu genler, tahminen katyonlar gibi spesifik

moleküllerin transportunu aktive ederek ve dış membranın CAMP’lara karşı bariyer

fonksiyonunu geliştirerek Salmonella’nın konakçı dokularda hayatta kalma olasılığını

yükseltmektedir (Groisman vd. 1992, Gunn vd. 1996, Helms vd. 2005). PhoP ile aktive

edilen genler tarafından kodlanan proteinler; spesifik olmayan asit fosfatazı, katyon

taşıyıcılarını, dış membran proteinlerini ve lipopolisakkarit modifikasyonu için önemli

olan enzimleri içermektedir. PhoP-PO4 ayrıca, pacB, pmrAB olarak da bilinen pmrCAB

operonunun (polimiksin direnç lokusu) ifadesini de aktive etmektedir. Bu lokus asidik

koşullara karşı cevap oluşturmada pozitif regülatör olarak görev alan iki elemanlı

regülatör sistemi kodlamaktadır. PmrB; Mg+2 duyarlı PhoPQ sistem ile dolaylı olarak

iletişime geçen ve Mg+2 duyarlılığı olan sensör kinazdır. Oysa PmrA, transkripsiyonel

bir cevap regülatörüdür. PhoPQ sistem, SPI-1’de bulunan prgs olarak tanımlanan başka

bir grup genin transkripsiyonunu baskılamaktadır. Bu genler; transkripsiyonel bir

regülatör kodlayan hilA ve TTSS içeriklerini kodlayan prgHIJKorgA operonunu

içermektedir. Çok sayıda genin regülasyonu için phoPQ operonu kendi kendini regüle

etmektedir. Bunun için, PhoP ve PhoQ’nun tamamen ifade edilmesi gerekmektedir.

(Soncini vd. 1995, Hueck vd. 1995, Pegues vd. 1995, Soncini ve Groisman 1996, Guo

vd. 1998, Ohl ve Miller. 2001, Gerlach ve Hensel 2007).

PhoQ’nun aktivasyonu için in vivo sinyaller tam olarak tanımlanmamıştır. Aktivasyon

in vitro koşullarda, divalent katyonlar olan Ca+2 ve Mg+2’un mikromolar

konsantrasyonlarını içeren ortamda gelişme sonucu veya düşük pH ile indükleniyor

21

olabilir. PhoQ, Mg+2 ve Ca+2 için ayrı bağlanma bölgelerine sahiptir ve bu iki katyonun

varlığında baskılanması en üst seviyede olmaktadır (Bearson 1998, Chessa vd. 2008).

2.4.7 OmpD/EnvZ regülatör sistemi

Hücre dışı ozmolariteye karşı oluşturulan cevap iki içerikli regülatör sistem

OmpD /EnvZ tarafından kontrol edimektedir. OmpD, dış membran porları olan; OmpC

ve OmpF’nin ifadesini düzenlemektedir. S. Typhimurium, yüksek ozmolarite

koşullarına maruz kalırsa OmpF’nin seviyesi düşerken, membrandaki OmpC’nin

seviyesi artmaktadır. OmpC, yapı olarak OmpF’den daha küçük çaptaki porlardır.

Bakteri yüksek ozmolariteye maruz kaldığında membrandaki OmpC’nin ifade

edilmesiyle membranın zararlı maddelere karşı geçirgenliğinin düştüğü

düşünülmektedir. ompC veya ompF’deki nokta mutasyonlar S. Typhimurium’da

virülensliği azaltmamaktadır. Örneğin, farelere ağız yoluyla verilen ompCompF

mutantlardaki virülensliğin büyük oranda düştüğü belirlenmiştir (Chaltfield vd. 1991).

OmpR/EnvZ, ayrıca makrofajlar içindeki S. Typhimurium tarafından indüklenen geç

hücre ölümünün başlaması için gereklidir. OmpR, ssrA promotoruna doğrudan

bağlanarak iki bileşenli SsrAB regülatör sisteminin aktivitesini kontrol etmektedir.

OmpR ve EnvZ ayrıca, iplik şeklinde tübüler lizozomların oluşumu için gereklidir.

OmpZ/EnvZ tarafından düzenlenen genlerin, Salmonella içeren fagozomların enfekte

ökaryot sistemlerdeki hareketide de etkili olduğu düşünülmektedir (Lindgren vd. 1996,

Lee vd. 2000, Hendrson vd. 2004, Gerlach vd. 2007).

2.4.8 LysR-Tip transkripsiyonel regülatör sistemleri

LysR-tip transkripsiyonel regülatör (LTTR) ailesi transkripsiyonel regülatörler

içerisinde iyi karakterize edilmiş olan gruptur. LTTR ailesi ilk olarak Henikoff vd.

(1988) tarafından tanımlanmıştır. DNA bağlanma bölgeleri (DBD) ve sekans

benzerlikleri olan transkripsiyonel regülatörlerden en az dokuz fonksiyonunun

farklılığıyla ayrılmaktadır. Farklı bakterilerin genomlarındaki LTTR’lerin korunmuş

bölgeleri bulunmaktadır. Bu proteinler; metabolizma, hücre bölünmesi, virülens,

22

hareketlilik, azot fiksasyonu ve oksidatif strese karşı oluşturulan cevap ve toksin

üretimini sağlayan genlerin regülasyonunda rol almaktadır (Kovacikova ve Skorupski

1999, Deghmane vd. 2000, Deghmane vd. 2002, Cao vd. 2001, Kim vd. 2004, Russell

vd. 2004, Bryne vd. 2007, Sperandio vd. 2007). Çoğu LTTR, hedef genlerin ifadesini

aktive ederken kendi ifadelerini baskılamaktadır. Bunu sıklıkla farklı promotorları

kullanarak yapmaktadırlar. Diğer bakteriyel transkripsiyon faktörleriyle ortak olarak

LTTR’ler homodimer veya heterodimer yapıda aktiftir. İkinci yapı tahmin metodlarına

göre LTTR’lerin DNA bağlanma bölgeleri ‘heliks-dönüş-heliks’ (HTH) motifine benzer

bir yapı göstermektedir. Çoğu HTH motifi içeren transkripsiyonel regülatörler,

transkripsiyonel aktivatörler ve baskılayıcılar olmak üzere iki farklı gruba ayrılırlar.

Tarnskripsiyonel aktivatörler karakteristik olarak HTH motifine C ucunda sahipken,

baskılayıcılar bu motifte N ucunda sahiptir. HTH motifi N terminal uçtan 20-90 amino

asit uzağa lokalize olmuştur ve bu durum LTTR’lere, kendilerini veya düzenledikleri

diğer genleri aktive etme veya baskılama yeteneği kazandırmaktadır (Grob ve Guiney

1996, Zaim ve Kierzek 2003, Maddocks ve Onston, 2008). Salmonella’daki virülens

plazmidinin esas rolü tartışmalıdır. Bununla birlikte, plazmidi giderilmiş suşların spv

lokusunun tamamlanması durumunda virülens fenotipi kazanmada etkili olduğu

görülmüştür. Salmonella plazmidindeki spv bölgesi, bir regülonda yer alan

spvRABCD’yi içeren beş genden meydana gelmektedir. Bu lokusun regülatörü, 33 kDa

büyüklükte LysR-tip protein olan SpvR’dir. SpvR, spvRABCD operonunun ifadesini,

ayrıca makrofaj içinde üreme ve bakteriyel üremenin durma fazında kendi ifadesini

baskılamaktadır. spvR’nin virülens gen ifadesinin regülasyonu üzerindeki önemli

fonksiyonu, hedef genlerin fonksiyonunun açıklamasıyla daha anlaşılır bir hale

gelmiştir. spvB, farklı hücrelerde ve fare modellerinde ifade edilen aktini substrat olarak

kullanarak aktin filamentlerini depolimerize eden, ADP-ribolizasyon enzimini

kodlamaktadır (Sperandino vd. 2007, Maddocks ve Onston 2008, Lahiri ve Chakrovorty

2009).

23

3. MATERYAL VE YÖNTEM

3.1 Materyal

3.1.1 Mikroorganizmalar

Bu çalışmada kullanılan S. Typhimurium MA2 suşu, S. Typhimurium TH3923 suşu,

kontrol olarak kullanılan S. Typhimurium LT2 suşu ve P22 fajı Ankara Üniversitesi Fen

Fakültesi Biyoloji Bölümü, Prokaryot Genetiği Laboratuarı kültür koleksiyonundan

sağlanmıştır.

3.1.2 Mikroorganizmaların saklama koşulları ve besiyerleri

Bakterilerin geliştirilmesinde; Salmonella suşları için LB broth ve agar besiyeri

kullanılmıştır. Bakteriler yukarıda belirtilen gelişme ortamlarına % 30 oranında steril

gliserol ilave edilerek -20°C’de saklanmıştır.

Luria Bertani (LB) Broth ve Agar (Merck, Germany)

Tripton 10 g

Maya ekstratı 5 g

NaCl 10 g

Agar 15 g

pH7.0±0.002 (sterilizasyondan önce)

Ortam içerikleri 1000mL distile su içerisinde çözülmüş ve sterilizasyon, 121°C’de 15

dakika süre ile yapılmıştır.

24

3.1.3 Çözeltiler

Minimal E Ortamı

MgSO4.7H2O 28,9 g

Sitrik Asit 300 g

K2HPO4.3H2O 1965 g

NaNH4PO4.4H2O 525 g

Distile Su 3000 mL

P22 Transdüksiyon Ortamı

LB Broth 97 mL

Minimal E Ortamı 2 mL

Glukoz (% 20) 1 mL

P22 Faj Lizatı 0,1 mL

PBS

NaCl 8 g

KCl 0,2 g

Na2HPO4 1,44 g

KH2PO4 0,24 g

25

Z Tampon Çözeltisi

Na2HPO4.7H2O 0,80 g

Na2HPO4.H2O 0,28 g

KCl (1M) 1 mL

MgSO4 (1M) 0,05 mL

β-merkaptoetanol (0,05M) 0,05 mL

Ortama, hacim 40 mL’ye ulaşıncaya kadar destile su ilave edilir. Tüm tuzlar çözülür.

Ortam pH’sı 2N HCl kullanılarak 7.0±0.002 olacak şekilde ayarlanır. Distile su ilavesi

ile toplam hacim 50 mL’ye tamamlanır. Sterilizasyon, 0,45µm por çaplı filtreden

geçirilerek yapılır. Hazırlanan çözelti +4 °C’de saklanır.

ONPG (o-nitrofenil-β-D-galaktozidaz) Çözeltisi

ONPG 0,004 g

Fosfat Tamponu 1 mL

Fosfat Tampon Çözeltisi

Na2HPO4.7H2O 1,61 g

Na2HPO4.H2O 0,55 g

Distile su 100 mL

pH 7.0±0.002

Sterilizasyon 0,45 µm por çaplı filtreden geçirilerek yapılır. Hazırlanan çözelti +4 °C’de

saklanır.

26

CTAB/NaCl Çözeltisi

NaCl 4,1 g

CTAB 10 g

NaCl 80 mL destile su içerisinde çözülür. 10 g CTAB yavaş yavaş eklenir. CTAB’ın

çözünmesi için çözelti aralıklarla 65 °C’ye kadar ısıtılır. Son aşamada toplam hacim

distile su ile 100 mL’ye tamamlanır.

Tris/HCl Çözeltisi

(0.5 M EDTA pH8)

Tris 1,21 g

EDTA 0,37 g

Distile su 1000 mL

pH 7.0±0.002 (Sterilizasyondan önce)

Sterilizasyon işlemi 121°C’de 15 dk süre ile yapılır.

%10 SDS Çözeltisi

SDS 5 g

Steril distile su 50 mL

DNA Jel Yükleme Tampon Çözetisi

Bromfenol mavisi 0.25 mL

Sakkaroz 40 g

Steril distile su 100 mL

27

% 20 Glukoz Çözeltisi

Glukoz 0.7 g

Distile su 20 mL

Sterilizasyon işlemi 0.45 µm por çaplı filtreden geçirilerek yapılır.

Fenol/Kloroform/İzoamil Alkol Çözeltisi

Fenol 25 mL

Kloroform 24 mL

İzoamil alkol 1 mL

Kloroform/ İzoamil Alkol Çözeltisi

Kloroform 24 mL

İzoamil Alkol 1 mL

Liziz Tamponu

(0.15M NaCl, 5mM EDTA, 50 mM Tris-HCl)

NaCl 0.43 g

EDTA 0.09 g

Tris-HCl 0.3 g

Proteaz inhibitör Karışımı (Roche) 1 tablet

Ultra saf su su 50 mL

pH 7.5±0.002

28

Hazırlanan çözeltiye % 1 oranında olacak şekilde Np40 (Applichem) eklenir.

Sterilizasyon işlemi 0.20µm por çaplı filtreden geçirilerek yapılır. Çözelti -20 °C’de

saklanır.

Dengeleme Tamponu I

(6M Üre, 1.5M Tris-HCl)

Üre 4.3 g

Tris-HCl 3 mL

% 10 SDS 2.4 mL

Gliserol 2.4 mL

Çözelti hazırlandıktan sonra son konsantrasyon % 2 olacak şekilde DDT eklenir.

Kullanımdan önce bromfenol mavisi eklenir.

Dengeleme Tamponu II

(6M Üre, 1.5M Tris-HCl)

Üre 4.3 g

Tris-HCl 3 mL

% 10 SDS 2.4 mL

Gliserol 2.4 mL

Çözelti hazırlandıktan sonra son konsantrasyon % 2.5 olacak şekilde iodoasetamid

eklenir. Kullanımdan önce bromfenol mavisi eklenir.

29

Ekstraksiyon Tamponu

% 1 Formik Asit 50 µL

% 2 Asetonitril (ACN) 100 µL

Ultra saf su 4.85 mL

Fiksasyon (Tespit) Çözeltisi

Metanol 100 mL

Asetik Asit 70 mL

Ultra saf su 830 mL

Çözelti hazırlanırken öncelikle su konulur. Ardından diğer bileşenler eklenir.

Yığma Jel

(1 adet jel için)

0.5 M Tris-HCl 5.5 mL

Akrilamid/Bisakrilamid 2.2 mL

% 10 SDS 220 µL

Ultra saf su 13.9 mL

% 10 APS 110 µL

TEMED 22 µL

30

Ayırıcı Jel

(1 adet jel için)

1.5 M Tris-HCl 19.81 mL

Akrilamid/Bisakrilamid 23.77 mL

% 10 SDS 792.5 µL

Ultra saf su 34.43 mL

% 10 APS 396.2 µL

TEMED 39.7 µL

Çözücü Solüsyon

ACN 225 µL

Ultra saf su 225 µL

% 1 Trifloroasetik asit (TFA) (Supelco) 50 µL

Matriks Çözeltisi

2 mg matriks 100 µL çözücü çözeltide ultra sonik su banyosunda çözülür. Daha sonra

kısa süreli santrifüj uygulanarak süpernatant yeni bir mkrosantrifüj tüpüne alınır.

Beş Peptit Karışımı

1mg/mL stok solüsyonu olan angiotensin, substans P, Glu Fib, Rennin-14pep ve

ACTH-18,39 (Proteomass Maldi MS Standart, Sigma Chem Co., USA) peptit

solüsyonlarından son konsantrasyonları 100 pmol olacak şekilde ultra saf su ile

seyreltilerek her birinden eşit hacimde mikrosantrifüj tüpüne alınır. Üzerine 1/1

hacimde matriks çözeltisi eklenir.

31

3.1.4 Primerler

Çalışmada kullanılan primerlerin dizilimleri ve PZR koşulları Çizelge 3.1’de verilmiştir.

Çizelge 3.1 Çalışmada kullanılan primer ve sekansları

Primer Primer sekansı(İleri/Geri) Ta/te PZR ürünü (bç)

T-POP CGCTTTTCCCGAGATCATATG/

GCACTTGTCTCCTGTTTACTCC 55°C/60 sn değişken

cadC TTCGGCCCGCATAAAGTG/

TGCAATCCCGCTCCCCATCA 60°C/60 sn 2100

Ta: Bağlanma sıcaklığı, te: Bağlanma süresi

3.1.5 Antibiyotikler

Çizelge 3.2 Çalışmada kullanılan antibiyotik diskleri ve konsantrasyonları

Antibiyotikler (Sembol) Antibiyotik Grubu Disk konsantrasyonu (µg)

Amikasin (AK) Aminoglikozid 30

Streptomisin (STR) Aminoglikozid 10

Neomisin (NEO) Aminoglikozid 5

Kanamisin (KAN) Aminoglikozid 30

Gentamisin (GEN) Aminoglikozid 10

32

3.2 Yöntem

3.2.1 S. Typhimurium’da P22 faj lizatlarının hazırlanması ve faj titresinin yükseltilmesi

%1 inokülasyon oranı ile LB broth ortamına aktarılan Salmonella suşları 37°C’de 200

rpm çalkalama hızında 12 saat inkübasyona bırakıldı. Bu süre sonunda sonunda gelişen

kültür ortamından alınan 1 mL’lik hacimler üzerine 4 mL P22 transdüksiyon broth

ortamı aktarıldı. Hazırlanan bu ortamlar 37°C’de 200 rpm çalkalama hızında 12 saat

inkübe edildikten sonra 8000 rpm’de +4°C’de 10 dakika santrifüj edilerek bakteriler ve

hücre kalıntıları çöktürüldü. Üst sıvı yeni steril tüplere aktarıldı ve üzerine 0.2 mL

kloroform ilave edilerek 30 saniye karıştırıldı. Bu işlem ayrıca üst sıvı 0.45 µm por

çaplı filtreden (Sartorius, Germany) geçirilerek de gerçekleştirildi. Hazırlanan faj

lizatları +4 °C’de saklandı.

Hazırlanan faj lizatlarının titresini belirlemek için transdüksiyon broth ortamında 10-7

seviyesine kadar faj dilüsyonları hazırlandı. Bu dilüsyonlar 900 µL PBS içeren steril

ortamlarda yapıldı. Aktif S. Typhimurium LT2 suş kültüründen LB agar ortamına

100 µL aktarılarak yayma ekim yapıldı. Agar yüzeyleri kuruduktan sonra her bir

dilüsyondan uygun yerlere 10 µL damlatma yapıldı. 37°C’de 18 saat inkübasyon

süresinin sonunda faj plakları incelendi. Faj titreleri aşağıdaki formül kullanılarak

hesaplandı (Sanderson ve Roth 1983, Margolin 1987, Casjens ve Hayden 1988).

Faj Titresi (pfu/mL) : Plakların sayısı × Dilüsyon Faktörü × 1000 (µL/ mL)

Damlatma miktarı (µL)

3.2.2 T-POP transpoznunu içeren P22 faj lizatlarının hazırlanması

T-POP transpozonunu içeren S. Typhimurium TH3923 (CarbR, TetR) suşu gerekli

antibiyotikler eklenmiş LB broth ortamında % 1 inokülasyon oranı ile aktarılıp 37 °C’de

200 rpm çalkalama hızında 12 saat inkübasyona bırakıldı. İnkübasyon sonunda TH3923

suşundan 1 mL, P22 fajı için hazırlanmış transdüksiyon broth ortamından 4 mL alınıp

steril tüpe aktarıldı ve 37 °C’de 200 rpm çalkalama hızında 12 saat inkübasyona tabi

33

tutuldu. İnkübasyon bitiminde 8000 rpm’de +4 °C’de 10 dakika santrifüj işlemine tabi

tutulan ortam 0.45 µm por çaplı membran filtrelerden (Sartorius, Germany) geçirilerek

steril tüpe aktarıldı. T-POP transpozonunu içeren bu faj süspansiyonları, söz konusu

transpozonun hedef suşlara aktarımında kullanıldı (Rappleye ve Roth 1997).

3.2.3 T-POP transpozon mutasyonu

Alıcı olarak kullanılan S. Typhimurium MA2 (StjE::LacZYA, CarbR, CmR) gerekli

antibiyotikler ilave edilen LB broth ortamına % 1 inokülasyon oranı ile aktarıldı ve

37 °C’de 200 rpm çalkalama hızında 12 saat inkübasyona bırakıldı. Bu süre sonunda

0.1 mL alıcı suş ile 0.1 mL T-POP transpozonunu içeren P22 transdüksiyon broth

karıştırıldı ve 37 °C’de 30 dk süre ile inkübasyona tabi tutuldu. Süre sonunda tetrasiklin

ve X-Gal içeren agar ortamlarına yayma ekim yapıldı. 37 °C’de 18 saat süre ile

inkübasyona bırakılan ortamlarda gelişen koyu mavi renkli koloniler öze ile alınarak

aynı koloni hem tetrasiklin ve X-Gal içeren ve hem de sadece X-Gal içeren LB agara

ekildi. Tekrar 37 °C’de 18 saat süre ile inkübasyona bırakılan ortamlarda aynı koloninin

tetrasiklin ve X-Gal içeren ve sadece X-Gal içeren besiyerinde verdiği renk

karşılaştırıldı. X-Gal içeren besiyerinde beyaz, tetrasiklin ve X-Gal içeren besiyerinde

koyu mavi renk veya her ikisinde de koyu mavi renk veren koloniler tetrasiklin içeren

LB broth ortamlarına alındı (Schmieger 1972, Rapplaye ve Roth 1997).

3.2.4 β-Galaktozidaz testi

Transdüktantlar; tetrasiklin içeren LB broth ortamına % 1 oranında inoküle edildi ve

37 °C’de 200 rpm çalkalama hızında 12 saat geliştirildi. Aktif transdüktantlar bu kez

tetrasiklin içeren ve içermeyen LB ortamlarına % 1 oranında inoküle edildi ve 3 saat

yukarıda belirtilen inkübasyon koşullarında geliştirildi. Negatif kontrol olarak

β-galaktozidaz aktivitesi içermeyen S. Typhimurium MA2 suşu kullanıldı. Optik

yoğunlukları (OD600) 0.4 - 0.6 arasına ulaşan (yaklaşık 3 saat) bakteri kültürleriden 1

mL hücre süspansiyonu, 1 mL Z tampon içerisinde çözüldü. Seyreltilen hücre

süspansiyonu üzerine 100 µL kloroform ve 50 µL % 0.1 SDS ilave edilerek karıştırılan

tüpler, 28 °C su banyosunda 5 dk inkübasyona tabi tutuldu. Reaksiyon, 0.2 mL ONPG

34

(o-nitrofenil-β-D-galaktozidaz, 4 mg/mL) (Fluka Biochemica, Switzerland) eklenerek

başlatıldı ve bu ortamlar 28 °C su banyosunda (GFL 1002, GFL GmbH., Germany)

inkübe edildi. Reaksiyon uygun sarı renk oluşuncaya kadar sürdürüldü. Uygun sarı renk

oluşumu saptandıktan ve bunun için geçen zaman kaydedildikten sonra reaksiyon 0.5

mL, 1M Na2CO3 ilave edilerek durduruldu. Bu ortamdan alınan 1mL’lik hacimler

mikrosantrifüj tüplerine aktarıldı ve 5 dk santrifüj edilerek kloroform ve hücre çökeltisi

uzaklaştırıldı. Her bir tüpteki üst sıvının optik yoğunluğu 420 nm ve 550 nm dalga

boylarında ölçüldü (Shimadzu spektrophotometer, Japan). β-galaktozidaz aktivitesi

aşağıdaki formül kullanılarak hesaplandı (Miller 1972):

Miller Ünitesi: 1000×(OD420-1.75×OD550) / (T×V×OD600)

T: Dakika olarak reaksiyon zamanları

V: Deneyde kullanılan kültürün mL olarak hacmi

3.2.5 Genomik DNA izolasyonu

Çalışılan bakteri 5 mL LB broth ortamına % 1 oranında inoküle edildi ve 37 °C’de 200

rpm çalkalama hızında 12 saat süre ile geliştirildi. Bu süre bitiminde 1.5 mL kültür

mikrosantrifüj tüplerine alındı ve 12000 rpm’de 2 dk santrifüj edilerek bakteri hücreleri

çöktürüldü. Üst svı ortamdan uzaklaştırıldıktan sonra, hücre çökeltisi 567 µL Tris-

EDTA tampon içerisinde çözüldü. Üzerine 30 µL % 10 SDS ve 3 µL proteinaz K (20

mg/ mL, Sigma Chem Co., USA) aktarılıp karıştırıldı ve 37 °C’de 1 saat tutuldu.

Ortama 100 µL 5M NaCl ilave edilerek karıştırıldı. 80 µL CTAB/NaCl çözeltisinin

ilavesinin ardından kesik uçlu mikropipet uçları kullanılarak beyaz partikül yapısı

oluşuncaya kadar iyice karıştırılan tüpler, 65 °C’de 10 dk tutuldu. Bu ortam üzerine

0.75 µL kloroform/izoamil alkol (24/1 hacim/hacim) aktarılıp karıştırıldı. 12000 rpm’de

5 dk santrifüj edilen ortamın üst fazı yeni mikrosantrifüj tüplerine alındı. Alınan faz

üzerine 0.75 mL fenol/kloroform/izoamil alkol (25/24/1 hacim/hacim) ilave edildi ve

12000 rpm’de 5 dk santrifüj işlemine tabi tutuldu. Santrifüj işleminin sonunda

tüplerdeki üst sıvı yeni mikrosantrifüj tüplerine aktarıldı ve bu sıvının üzerine hacmin

0.6’sı (~350 µL) oranında izopropanol ilave edildi. Tüpler beyaz çökelti oluşuncaya

kadar öne arkaya hareket ettirilerek karıştırıldı. Daha sonra 12000 rpm’de 5 dk santrifüj

35

işlemi uygulandı. Üst sıvı döküldükten sonra çökelti üzerine 350 µL % 70 etanol

eklenerek tekrar 12000 rpm’de 5 dk santrifüj işlemine tabi tutuldu. Üst sıvı dikkatli bir

şekilde ortamdan uzaklaştırıldı ve kromozomal DNA örneği oda sıcaklığında kurutuldu.

Son aşamada DNA çözeltisi 100 µL TE tampon içerisinde yaklaşık 1 saat muamele

edilerek çözüldü (Wilson 2001).

3.2.6 Ters yön polimeraz zincir reaksiyonu (PZR)

S. Typhimurium’dan izole edilen kromozomal DNA AluI restriksiyon endonükleaz

enzimi (Fermentas, Finland) ile kesildi. Kesim reaksiyonu için 3 ayrı tüpte 85 µL

kromozomal DNA izolasyon örneği, 5 µL AluI ve 10 µL kesim reaksiyon tamponu ile

karıştırıldı ve 37 °C’de 2 saat tutuldu. Bu reaksiyonun gerçekleştirildiği üç tüp (toplam

300 µL) karıştırılıp üzerine 200 µL TE tampon ilave edildi. Ortam karıştırıldıktan sonra

500 µL fenol/kloroform/izoamil alkol (25/24/1 hacim/hacim) ilave edilerek 12000

rpm’de 7,5 dk oda sıcaklığında santrifüj işlemine tabi tutuldu. Üst faz yeni

mikrosantrifüj tüplerine aktarıldı ve 35 µL 3M sodyum asetat (pH 4.8) ve 700 µL saf

etanol eklenerek yavaş bir şekilde karıştırıldı. Ortam -20 °C’de 30 dk bekletilerek

DNA’nın yoğunlaşması sağlandı ve 12000 rpm’de 5 dk santrifüj edilerek çöktürüldü.

DNA çökeltisi % 75 etanol ile yıkanarak oda sıcaklığında kurutuldu. DNA çökeltisi 75

µL steril destile su içerisinde çözüldükten sonra üzerine 20 µL T4 DNA ligaz tamponu

(Fermentas, Finland) ve 5 µL T4 DNA ligaz enzimi ilave edildi. Ortam 15 °C’de 1 gece

bekletildi. İnkübasyon süresinin sonunda tekrar 35 µL 3M sodyum asetat ve 700 µL saf

etanol ilave edilerek karıştırıldı. -20 °C’de 30 dk tutulan ortam 12000 rpm’de 5 dk

santrifüj edilerek çöktürüldü. Kurutulan DNA çökeltisi % 75 etanol ile yıkanarak oda

sıcaklığında kurutuldu. Son aşamada DNA örneği 10 µL saf su içerisinde çözülerek ters

yön PZR işleminde şablon olarak kullanıldı.

T-POP uç bölgeleri primer dizaynı için kullanıldı. Bu primerler birbirine zıt iki yön esas

alınarak oluşturuldu. PZR için GeneAmp9700 Thermocycler (Applied Biosystems,

USA) kullanıldı. PZR için kullanılan karışım ve PZR koşulları aşağıda belirtildiği

şekilde hazırlandı ve uygulandı (Tükel vd. 2007).

36

PZR karışımı (tek reaksiyon için):

- Steril distile su……………………………......36 µL

- 10X PZR tampon –MgCl2 (Fermentas)………5 µL

- dNTP (2 mM Fermentas)…………………......1 µL

- İleri primer (Bioneer)…………………………1 µL

- Geri primer (Bioneer)…………………………1 µL

- MgCl2 (25 mM Fermentas)…………………...4 µL

- Taq DNA polimeraz (5u/mL Fermentas)……..1 µL

- DNA…………………………………………..2 µL

PZR koşulları:

- 94°C…………2 dakika

- 94°C…………30 saniye

- 55°C…………1 dakika 30 döngü

- 72°C…………5 dakika

- 72°C…………10 dakika

- +4°C…………∞

Ta (bağlanma sıcaklığı, °C) her bir primer için ayrı ayrı Ta = 2 × (A+T) + 4 × (G+C)

formülü kullanılarak hesaplandı.

PZR sonrasında, elde edilen ürünlerden 10 µL alınarak 2 µL 6x yükleme boyası ile

karıştırıldı ve % 1 oranında agaroz içeren jelde 100 volt elektrik akımı altında 1.5 saat

koşturuldu. Bant büyüklüklerinin belirlenmesi amacı ile 1kb DNA Marker’dan

(Fermentas, Finland) yararlanıldı. Elektroforez sonrasında jeller, 0.2 µg/mL etidyum

bromit (Sigma Chem. Co., USA) çözeltisinde 20 dakika süre ile boyama işlemine tabi

tutuldu ve 366 nm dalga boyunda UV ışık altında görüntülenerek fotoğrafları çekildi

(Kodak Gel Logic 200 Imaging System).Saflaştırılan DNA örneklerinin dizi analizi

REFGEN (ODTÜ Teknokent, Ankara) firması tarafından yapıldı ve sonuçlar PSI-

BLAST programı kullanılarak değerlendirildi.

37

3.2.7 cadC gen bölgesinin çoğaltılması

Bu işlem için cadC gen bölgesine spesifik primerlerle PZR gerçekleştirildi. Yöntem

Kim vd. (2001) önerilen şekilde optimize edilerek uygulandı. Bu amaçla GeneAmp9700

Thermocycler (Applied Biosystems, USA) kullanıldı.

PZR’u için kullanılan karışım ve PZR koşulları aşağıda belirtildiği şekilde hazırlanmış

ve uygulanmıştır.

PZR karışımı (tek reaksiyon için):

- Steril distile su……………………..…………30.75 µL

- 5X PZR tampon-MgCl2 (Promega)………….10 µL

- dNTP…………………………………..….....1 µL

- İleri primer (metabion)………..………..…….1 µL

- Geri primer (metabion)……..………………..1 µL

- MgCl2 (25mM Promega)……………………..4 µL

- Taq DNA Polimeraz (5u/mL Promega)…..….0.5 µL

-DNA……………………………………….….2 µL

PZR koşulları:

- 95°C…………….5 dakika

- 95°C…………….1 dakika

- 60°C…………….1 dakika 30 döngü

- 72°C…………….1 dakika

- 72°C…………….5 dakika

- 4°C…………….. ∞

38

3.2.8 Antimikrobiyel duyarlılığın belirlenmesi

Antibiyotik duyarlılık düzeylerinin belirlenmesinde Bauer ve arkadaşları (1966)

tarafından önerilen antibiyotik disk difüzyon yöntemi modifiye edilerek kullanıldı.

Kültürler steril öze aracılığı ile 4 mL LB broth ortamına inoküle edildi ve çalkalamalı

(200 rpm) inkübatörde 37 °C’de 18 saat inkübasyona bırakıldı. İnkübasyon sonrasında,

steril saf su ile 1:100 (hacim/hacim) oranında seyreltilen edilen örneklerden Müller

Hinton (Oxoid, UK) agar plakaları üzerine yayma ekim yapıldı (100 µL).

Antimikrobiyel ajanlar (Oxoid,UK) emdirilmiş 6 mm’lik steril kağıt diskler, agar

yüzeyine yerleştirildi ve 37 °C’de 18 saat inkübe edildi. Disk difüzyon yöntemi için 5

farklı antimikrobiyel madde kullanıldı. Kullanılan antimikrobiyel diskler ve içerikleri

Çizelge 3.2’de verildi. İnkübasyon süresinin sonunda antibiyotik disklerinin etrafında

oluşan zonların çapı ölçüldü ve iki paralelin ortalaması alınarak sonuçlar belirlendi.

3.2.9 Bradford yöntemi ile protein miktar tayini

S. Typhimurium suşları 20 mL LB broth ortamına % 1 oranı ile inoküle edildi ve

37 °C’de 200 rpm çalkalama hızında 12 saat süre ile geliştirildi. Bu süre sonunda

bakteri kültürü 12000 rpm’de 2 dakika santrifüj edilerek bakteri hücreleri çöktürüldü.

Üst sıvı ortamdan uzaklaştırıldıktan sonra hücre çökeltisi ağırlığının iki katı hacimde

liziz tamponunda çözüldü. Hücrelerin parçalanması için ultrasonik su banyosunda

(Transsonic 570/H, Elma, USA) 3 dakika bekletildi. Hücre parçalanmasının

tamamlanması için 40 Amp.’da sonikasyon (Ultrasonic processor, Sonics, Vibra cell,

Taiwan) işlemi uygulandı. Bu işlemin ardından örnek 14000 rpm’de 10 dakika santrifüj

edilerek hücre kalıntıları çöktürüldü. Üst sıvı yeni mikrosantrifüj tüpüne aktarıldı.

Protein miktarının belirlenebilmesi için protein ayıracı boya (Bio-Rad, USA) ile 1/40

oranında karıştırıldı. Spektrofotometrik ölçümde 250 µg/mL, 500 µg/mL, 750 µg/mL ve

1000 µg/mL konsantrasyonlarında BSA (sığır serum albumini) (ambresco,USA)

kullanıldı. Örnekler, spektrofotometrede (Spectra Max M2, USA) 595 nm dalga

boyunda ölçülerek protein miktarı belirlendi (Bradford 1976).

39

3.2.10 Sodyum Dodesil Sülfat (SDS) iki yönlü jel elektroforezi

SDS-iki yönlü jel elektroforezi için ilk aşamada izoelektrik fokuslama yapıldı. Bu işlem

için 17 cm’lik pH 5-8 strip (Ready-Strip, Ipg Strip, Bio-Rad, USA) kullanıldı. Protein

miktarı 175 µg/mL olacak şekilde alınarak son hacim rehidratasyon tamponuyla

300 µL’ye tamamlandı. Hazırlanan karışım tanka yüklendi strip jel kısmı tanka gelecek

şekilde yerleştirildi. Buharlaşmayı önlemek için stribin üzeri mineral yağ ile kaplandı.

Rehidratasyon işlemi için stripler 20 °C’de 50 V akımda 15 saat süre tutuldu (Protean

IEF Cell, Bio-Rad, USA) ve izoelektrik fokuslama gerçekleştirildi (Protean IEF Cell,

Bio-Rad, USA). Elde edilen strip dengeleme tamponu I ve II ile 15’er dakika

mumamele edilerek yığma jelde 70V, ayırıcı jelde 120V elektrik akımı altına 1 gece

boyunca koşturuldu. Bant büyüklüklerinin belirlenmesi amacı ile Protein Ladder

(BioRad, USA, 10-250 kDa)’dan yararlanıldı. Elektroforez sonrasında jeller 45 dakika

tespit (fiksasyon) çözeltisinde bekletildi. SYBRO Ruby Protein Jel Boyası (Bio-Rad,

USA) ile bir gece muamele edilen jeller tekrar 45 dakika süreyle tespit çözeltisine

alındı. Bu işlemin ardından jellerin fotoğrafları çekildi (Bio-Rad Versa Doc Model

1000) (Garrels 1979).

3.2.11 MALDİ-Tof analizi

Moleküler ağırlıkları ve izoelektrik noktalarına göre belirlenen protein spotları PD

Quest programı kullanılarak jelden kesildi (Proteome Works Spot Cutter, Bio-Rad).

Kesilen spotlar 200 µL ultra saf su eklenmiş 96 kuyucuklu mikroplakların içerisine

alındı. Tripsinizasyon işlemi için öncelikle kuyucuklardaki su çekildi. Başlangıç

yıkaması ve boya uzaklaştırması için; kuyucuklara 50 µL 100 mM NH4HCO3 ve 50 µL

asetonitril (ACN) ilave edildi ve 37 °C’de 10 dk inkübasyona tabi tutuldu. Pipetle

çözeltiler geri çekilerek işlem tekrarlandı. Redüksiyon ve alkilasyon için; kuyucuklara

50 µL ACN ilave edildi ve 37 °C’de 5 dakika inkübe edildi. Bu sürenin ardından ACN

geri çekilerek 37 °C’de 10 dakika daha inkübasyona tabi tutuldu. 50 µL 10 mM

diklorodifeniltrikloretan (DDT) (Molecula, USA) ve 50 mM NH4HCO3 ilave edilerek

37 °C’de 30 dakika inkübasyona bırakıldı. İnkübasyon süresi bitiminde 50 µL 55 mM

iyodoasetamid ve 50 mM NH4HCO3 çözeltisi ilave edilerek 37 °C’de 20 dakika

40

bekletildi. Bu süre sonunda kuyucuklara 100 µL ACN eklenerek 37 °C’de 5 dakika

bekletildi. Son aşamada kuyucuklardaki tüm çözeltiler geri çekildi. Yıkama ve

dehidratasyon işlemi için bu ortama 50 µL ACN ilave edilerek 37°C’de 5 dakika

bekletildi ve bu işlem üç kez tekrarlandı. Daha sonra konulan tüm çözeltiler geri

çekilerek oda sıcaklığında 15 dakika bekletildi. Tripsinle kesim işlemi için; 5 ng/µL

tripsin (Promega,) olacak şekilde 50 mM NH4HCO3 çözeltisinde hazırlanmış enzim

çözeltisinden 30 µL ilave edildi ve oda sıcaklığında 30 dakika bekletildi. Daha sonra

plakanın üzeri streç filmle kaplanarak 37 °C’de bir gece boyunca inkübasyona bırakıldı

ve ardından 15-30 dakika oda sıcaklığında bekletildi. Ekstraksiyon işlemi için 30 µL

ekstraksiyon tamponu ilave edildi ve oda sıcaklığında 30 dakika tutuldu. Kısa süreli bir

santrifüj işleminin ardından üst faz PZR plakalarına alındı. 12 µL ekstraksiyon tamponu

ve 12 µL ACN ilave edilerek ortam oda sıcaklığında 30 dakika bekletildi. Sıvı faz PZR

plakasına tekrar aktarıldı ve 2-3 saat oda sıcaklığında tutularak kurutuldu.

Tripsin’le kesim işleminden sonra kurutulan örneklerin üzerine 1/1 hacimde çözücü

solüsyonu ve matriks eklenerek maldi plakasına yüklenebilecek duruma geldi.

Hazırlanan örneklerden 1.5-2 µL hacimle maldi plakasına yükleme yapıldı ve örneklerin

kuruması için beklendi. Analizde standart olarak hazırlanan beş peptit karışımı

kullanıldı. Elde edilen sonuçlar MASCOT/Mass Finger Print programı kullanılarak

değerlendirildi (Shevchenko vd. 2007).

41

4. ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA

4.1 Transpozon Mutasyonu Yöntemi ile stj Fimbriyal Operonunun İfadesinin Sağlanması

Transpozon (T-POP) mutasyon yöntemi ile stj fimbriyal operonunun sağlanmasında

Akkoç vd. (2009) tarafından oluşturulan stjE::LacZYA füzyonuna sahip

S. Typhimurium MA2 mutantı kullanılmıştır. Transpozaz genini içeren bu mutanta

T-POP transpozonu transdüksiyon yöntemi ile aktarıldıktan sonra, stj fimbriyal

operonunun ifadesi ilk aşamada fenotipik testlerle tanımlanmıştır. T-POP

transpozonunu içeren P22 faj transdüksiyon broth ile S. Typhimurium MA2 mutantının

muamelesinden sonra bu ortamlardan tetrasiklin (100 µg/mL) ve X-Gal (30 µg/mL)

içeren agar ortamlarına yayma ekimler yapılarak 37 °C’de 1 gece tutulmuştur.

İnkübasyon süresi sonunda agar ortamlarında tanımlanan koyu mavi koloniler

tetrasiklin içeren ve tetrasiklin içermeyen LB broth ortamlarında geliştirilerek

β-galaktozidaz aktiviteleri tespit edilmiştir.

Salmonella’da fimbriyal operonların ve patojenite ile ilişkili diğer moleküler

elemanların ifadesi çoğu durumda bu organizmaların konakçı sisteme dahil olması ile

teşvik edilmektedir. İn-vitro koşullarda yürütülen çalışmalarda fenotipik ifade, bir

reporter gen ya da gen grubu ile gerçekleştirilen füzyon aracılığı ile tanımlanmaktadır

(Marcus vd. 2000, Hanser-Wester ve Hensel 2001, Nuccino vd. 2007). Bu çalışmada

reporter genler olarak laktoz operonu genleri kullanılmıştır (lacZ; β-galaktozidaz geni,

lacY; laktoz permeaz geni ve lacA; giogalaktozit transferaz geni). S. Typhimurium

MA2, stj operonu ile lacZYA genlerinin füzyonu gerçekleştirilmiş bir mutanttır. Bu

mutantta lacZYA genleri stj operonunun promotorunun önüne klonlanmıştır. Dolayısı ile

S. Typhimurium MA2 mutantında stj fimbriyal operonunun promotorunun aktif olduğu

koşullarda (bir başka deyişle stj fimbriyasının üretildiği durumlarda) yüksek düzeyde

β-galaktozidaz aktivitesi ortaya çıkacaktır (Rapplaye ve Roth 1997, Nuccio vd. 2007).

42

Tn10 türevi olan T-POP transpozonu, Salmonella genomu üzerinde yaklaşık 1000 farklı

bölgeye girme yeteneğinde bir transpozondur. S.Typhimurium MA2 mutantında in-vitro

koşullarda çok düşük β-galaktozidaz aktivitesi belirlenmesi, stj fimbriyal operonunun

bu koşullarda ifade edilmediğini kanıtlamaktadır. Transpozon mutasyonu

gerçekleştirilerek tetrasiklin ve X-Gal (yapay laktoz) içeren ortamlarda seçilen koyu

mavi koloniler yüksek β-galaktozidaz aktivitesine işaret etmiştir. Zira bu yüksek

β-galaktozidaz aktivitesi sayesinde yapay laktoz olan X-Gal parçalanmakta ve söz

konusu substrata bağlı olan mavi renk salınmaktadır. Ortamdaki bu koyu mavi koloniler

tetrasiklin içeren ve içermeyen LB broth ortamlarında geliştirildikten sonra

β-galaktozidaz aktiviteleri Miller ünitesi cinsinden belirlenmiştir (Çizelge 4.1).

Çizelge 4.1 Füzyon suş ve mutantların β-Galaktozidaz aktiviteleri

Füzyon Suş ve Mutantlar

OD600 (Z tampon ile)

OD550 OD420 T (dk) Miller Ünitesi

MA2 0,354 0,006 0,937 30,06 40

2 0,487 0,015 3,068 10,50 297

2 Tet 0,351 0,012 2,489 12,59 280

7 0,586 0,010 2,408 12,14 168

7 Tet 0,587 0,058 1,362 20,59 52

12 0,350 0,010 2,659 9,37 402

12 Tet 0,356 0,014 3,215 11,37 394

43

Çizelge 4.1 Füzyon suş ve mutantların β-Galaktozidaz aktiviteleri (devam)

Füzyon Suş ve Mutantlar

OD600 (Z tampon ile)

OD550 OD420 T (dk) Miller Ünitesi

MA 2 0,674 0,03 1,614 21,32 54

18 0,361 0,005 2,709 8,58 439

18 Tet 0,600 0,023 3,612 8,03 370

19 0,405 0,007 2,914 10,21 350

19 Tet 0,397 0,006 2,498 17,33 180

20 0,359 0,012 2,395 6,48 510

20 Tet 0,511 0,007 2,914 7,44 381

21 0,327 0,092 2,515 8,28 434

21 Tet 0,729 0,012 3,612 5,48 455

Tetrasiklinin gelişme ortamında kullanılmasının nedeni T-POP transpozonunun

tetrasiklin tarafından teşvik edilen bir promotor içermesidir. S. Typhimurium MA2 suşu

ile yürütülen transpozon mutasyonunun stj fimbriyal operonu açma koşulu; T-POP

transpozisyonu sonucunda bu hareketli elementin stj fimbriyal operonunu regüle eden

genin promotor bölgesine lokalize olarak, tetrasiklin promotorunun indüksiyonu

doğrultusunda regülatörü üretmesidir. Bu koşullardaki mutantlarda tetrasiklin ortamda

iken T-POP promotoru (ve dolayısı ile regülatör gen) teşvik edilecek ve regülatörün

üretimi sağlanacaktır. Eğer regülatör negatif bir regülatör ise tetrasiklin teşvikine bağlı

olarak stj operonunun baskılanması, aksi durumda da aktivasyonu gerçekleşecektir

44

(Tükel vd. 2007, Jakomin vd. 2008). Bu çalışmada fenotipik tanı ile seçilen mutantlarda

her iki durum da gözlenmiştir. 2, 18 ve 21 numaralı mutantlarda tetrasiklin içeren ve

içermeyen ortamlarda belirgin bir şekilde β-galaktozidaz aktiviteleri birbirine yakın

bulunurken; 7, 18 ve 20 numaralı mutantlarda tetrasiklin içeren ortamlarda belirgin bir

β-galaktozidaz aktivite düşmesi saptanmıştır (Çizelge 4.1). Bu durum stj fimbriyal

operonunun negatif bir regülatör tarafından regüle edildiğine işaret etmektedir. Zira

T-POP transpozonun regülatör genin promotor bölgesini vurması halinde ortama

tetrasiklin verildiğinde baskılama gerçekleşmektedir. Ancak bu durumda stj fimbriyal

operonunun halen nasıl oluyor da ifade ediliyor olduğu açıklanamaz. İkinci olasılık ise

T-POP transpozonunun regülatör genin promotorunun değil de doğrudan yapısal

geninin içerisine lokalize olmasıdır ki bu çalışmadaki sonuçlar daha yüksek oranda söz

konusu duruma işaret etmektedir. Böyle bir durumda negatif regülatörün üretimi

engelleneceğinden baskılanma kalkmaktadır. Tetrasiklin varlığında β-galaktozidaz

aktivitesindeki (dolayısı ile stj fimbriyal operonunun ifadesindeki) düşme böylesi bir

olasılıkta mutasyonun pleitropik etkilerinden kaynaklanabilir.

Regülatör genin tanısı ve bu olasılıkların belirlenmesi için, β-galaktozidaz aktivitesi

esas alınarak seçilen mutantlarda T-POP transpozonunun bölge tayini çalışmalarına

geçilmiştir.

4.2 Mutantlarda T-POP Transpozonunun Genoma Giriş Bölgesinin Belirlenmesi

stj fimbriyal operonu aktive edilmiş mutantlarda ters yön (invörs) PZR yöntemi ile

çoğaltılan transpozon giriş bölgelerinin dizi analizleri yapılarak olası regülatörler ve

bunların mekanizmaları tespit edilmiştir.

Genomik DNA izolasyonu yapılan mutantların AluI enzim kesimleri ve ters yön

PZR’leri gerçekleştirilmiştir. Genomik DNA, AluI kesim ve ters yön PZR sonuçları

Şekil 4.1’de verilmiştir.

45

Şekil 4.1 stj fimbriyal operonu aktive edilen mutantlarda ters yön PZR analiz

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17

18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35

1000 bç

3000 bç

250 bç

6000 bç

1000 bç

3000 bç

46

Kuyu Sırası Örnek Ürün

1-18 Marker 250-10000bç

2-3-4-5-6-7-8-9 2-7-12-18-19-20-21 (Sırasıyla)

Genomik DNA

10-11-12-13-1-4-15-16-17 2-7-12-18-19-20-21 (Sırasıyla)

AluI Enzim Kesimi

19 2 (Ta:52°C) 383 bç

20 2 (Ta:55°C) 383 bç

21 7 (Ta:52°C) 383 bç, 950 bç

22 7 (Ta:55°C) 383 bç, 950 bç

23 12 (Ta:52°C) 383 bç

24 12 (Ta:55°C) 383 bç

25 18 (Ta:52°C) 383 bç, 950 bç

26 18 (Ta:55°C) 383 bç, 950 bç

27 19 (Ta:52°C) 383 bç

28 19 (Ta:55°C) 383 bç

29 20 (Ta:52°C) 383 bç

30 20 (Ta:55°C) 383 bç

31 21 (Ta:52°C) 383 bç

32 21 (Ta:55°C) 383 bç

33 22 (Ta:52°C) 383 bç

34 22 (Ta:55°C) 383 bç

35 Negatif

Ters yön PZR çalışmasında esas; mutant genomlarında bilinmeyen bölgede bulunan

T-POP transpozonunun giriş yerinin belirlenmesidir. Bu amaçla T-POP transpozonunun

uç bölgelerine özgü ve birbirine ters yönde düzenlenmiş primerler, bu mutantların AluI

enzimi ile kesilmiş DNA parçaları ile muamele edilmiş ve her bir parça ligasyon ile

çevrimsel hale getirildikten sonra PZR’nu gerçekleştirilmiştir. Bu sayede T-POP’un

entegre olduğu bölgeler çoğaltılmıştır. Tüm mutantlarda 383 baz çifti uzunluktaki bir

47

spesifik fragmentin çoğaltılması (Şekil 4.1), β-galaktozidaz aktivitesi artan (stj

fimbriyası ifade edilen) fenotiplerde T-POP transpozonunun aynı bölgeye girdiğine

işaret etmektedir. 7 ve 18 numaralı mutantlarda 383 bç dışında çoğaltılan ikinci bir bant

(950 bç) ise spesifik olmayan PZR ürünüdür.

PZR ürünlerinin tamamının PSI-BLAST programı kullanılarak değerlendirilmesi

sonucunda; T-POP transpozonunun S. Typhimurium genomunda en olası giriş bölgeleri

olarak çoklu ilaç dirençlilik gen bölgesi regülatörü (mdr), transkripsiyonel bir global

regülatör olan cadC gen bölgesi, transkripsiyonel bir diğer regülatör LysR geni ve

H-NS ailesi ile homoloji göstermiştir (Ek).

Tüm mutantlarda aynı PZR ürünlerinin alınması ve çok benzer DNA dizi analizlerine

sahip olmaları nedeniyle, çalışmalara yalnız 20 numaralı mutant ile devam edilmiştir.

Bu çalışmalarda her bir aday gen ve buradan üretilen regülatörün stj fimbriyasının

ifadesindeki etkinliği tek tek araştırılmıştır.

4.3 Çoklu İlaç Dirençlilik Regülatörünün stj Fimbriyal Operonu Üzerine Etkilerinin Araştırılması

Çoklu ilaç dirençlilik regülatörlerinin fimbriyal operonlar üzerinde etkili olması şimdiye

kadar bakterilerde tanımlanmış bir durum değildir. Bu nedenle çoğaltılan PZR ürününün

dizi analizleri mdr regülatör gen dizi analizleri ile karşılaştırılmış ve ortak bölgelerin

yalnız insert serilerde (IS-II) çakıştığı belirlenmiştir. Bu durum stj fimbriyal operonunun

bu regülatör ile ilişkili ifadesinin söz konusu olmadığına işaret etmiştir. Bu sonuca

ikinci bir kanıt, S. Typhimurium LT2 ve 20 numaralı mutantların antibiyotik duyarlılık

testlerinden sağlanmıştır. Her iki bakteride de dirençli oldukları beş antibiyotiğe karşı

dirençlilik düzeyleri birbirine çok yakın bulunmuştur (Çizelge 4.2).

48

Çizelge 4.2 S. Typhimurium LT2 suşu ve 20 numaralı mutantın antibiyotik duyarlılıkları

Antibiyotik

Duyarlılık

LT2 20

Amikasin (30µg/mL) 17mm 20mm

Streptomisin (10 µg/mL) 12mm 13mm

Neomisin (5 µg/mL) 14mm 18mm

Kanamisin (30 µg/mL) 19mm 21mm

Gentamisin (10 µg/mL) 19mm 22mm

Eğer T-POP transpozonu mdr genleri regülatörünün promotoruna lokalize olmuş olsa

idi, 20 numaralı mutantta antibiyotik dirençlilik teşviki sonucu dirençlilik düzeyinde

önemli bir artış olması doğal bir sonuçtur. İkinci olasılıkta, yani T-POP transpozonunun

söz konusu regülatör genin içerisine girmesi durumunda ise beklenen sonuç 20 numaralı

mutantta çoklu antibiyotik dirençlilik fenotipinin ortadan kalkmasıdır. Bu iki sonuçtan

hiçbirinin gerçekleşmemesi, DNA dizi analiz verilerinin karşılaştırılmasından elde

edilen sonucu kesinleştirmektedir.

4.4 CadC Regülatörünün stj Fimbriyal Operonu Üzerine Etkisinin Araştırılması

CadC regülatörünün stj fimbriyal operonu üzerinde bir etkisinin bulunup blunmadığının

belirlenmesi amacı ile ilk aşamada 7, 18 ve 20 numaralı mutantlarda cadC gen bölgesi

çoğaltılarak (Şekil 4.2) dizi analizi yapılmıştır. Bu dizi analizlerinin PSI-BLAST

programında incelenmesi sonucunda T-POP transpozonuna ait bir bölge ile eşleşmediği

ve tamamının cadC dizileri olduğu saptanmıştır. Bu durum ters yön PZR verilerinin

benzerliğinin sadece insert serilerden (IS-II) ileri geldiğine işaret etmiştir.

49

Şekil 4.2 Doğal suş ve mutantlarda çoğaltılan cadC gen bölgesi

Kuyu Sırası Örnek PZR Ürünü (bç)

1 7 2100

2 18 2100

3 20 2100

4 LT2 (Pozitif Kontrol) 2100

5 Negatif Kontrol -

6 Marker 250-10000

2100 bç

250 bç

1000 bç

3000 bç

6000 bç

1 2 3 4 5 6

50

Dizi analiz verilerinin fenotipik kanıtlarla desteklenmesi için seçilen üç mutantta pH 5.8

ve pH 7.8’de lisin içeren ve lisin içermeyen ortamlardaki β-galaktozidaz

aktivitelerindeki değişimler incelenmiştir. Yürütülen çalışmalar sonucunda pH 5.8 ve

pH 7.8’de mutantların β-galaktozidaz aktivitelerinde önemli bir değişimin meydana

gelmediği saptanmıştır (Çizelge 4.3).

Çizelge 4.3 Farklı pH değerlerinde füzyon suşun ve transpozon mutantlarının β-galaktozidaz aktiviteleri

Füzyon Suş ve

Mutantlar

β-galaktozidaz Aktivitesi (Miller Ünitesi)

pH 5.8 pH 7.8

MA 2 32 32

7 8 7

7-Lys 10 6

18 6 5

18-Lys 5 5

20 20 39

20-Lys 21 39

Bu bulgular cad lokusunun regülatörü olan cad geninin stj fimbriyal operonunun

regülasyonunda doğrudan ya da dolaylı bir rol almadığının bir diğer kanıtıdır. Zira ağız

yoluyla vücuda alınan enterik bakteriler, gastrik bariyeri aşma ve asidik koşullara

adaptasyonda lisin dekarboksilaz aktivitesinden yararlanmaktadır. E. coli’de bu aktivite,

lisin dekarboksilaz (cadA) ve lisin dekarboksilaz taşıyıcı protein (cadB) vasıtasıyla

gerçekleşmektedir (Eink vd. 2007, Chuang vd. 2009). Ortamda lisin amino asidi

varlığında aktive olan bu sistem lizini bazik kadaverine çevirerek pH dengesinin

ayarlanmasına yardımcı olmaktadır. cadA geninin bazı enterik bakterilerde epitel

yüzeylerde tutunmada, bu yolla etkin olduğu bilinmektedir (Merrel ve Camilli 2002,

Vazquez Jaurez vd. 2008, Yoon vd. 2009). Ancak lisin varlığı ve yokluğunda farklı pH

51

değerlerinde T-POP mutantlarında β-galaktozidaz aktivitesinde bir değişiklik meydana

gelmemesi söz konusu regülatörün mutant suşlarda stj fimbriyasının ifadesinde herhangi

bir rolü olmadığını kanıtlamaktadır.

4.5 stj Fimbriyal Operonunun İfadesi Üzerine LysR ve H-NS Regülatör Proteinlerinin Etkisinin Belirlenmesi

Mutantlarda çoğaltılan ters yön PZR ürünlerinin LysR (ybdO) ve H-NS regülatör

protein genleri ile IS-II serileri dışında da sekans benzerliği göstermesi, bu

regülatörlerin stj fimbriyal operonunun regülasyonunda rol aldığına işaret etmektedir

(Ek 1). DNA dizi analizlerinin kısmi benzerliği etkin bir kanıt niteliği taşımadığından,

söz konusu regülatör proteinlerin mutantlarda ifadesinin arttığına dair kanıtlar için

proteomik çalışmalar yapılmıştır. Bu çalışmalarda da, tüm mutantların aynı genotipik ve

fenotipik karakteristiklere sahip olması nedeniyle, 20 numaralı mutant kullanılmıştır.

S. Typhimurium LT2 suşunun ve 20 numaralı T-POP mutantının toplam protein

profilleri 17 cm’lik pH 5-8 strip kullanılarak SDS-iki yönlü jel sistemlerinde tanımlandı

(Şekil 4.3 ve 4.4).

52

Şekil 4.3 20 numaralı mutantın SDS-iki yönlü jel elektroforezi ile belirlenen toplam protein profilleri

Marker

pH:5 pH:8

25 kDa

80 kDa

53

Şekil 4.4 S. Typhimurium LT2 suşunun SDS-iki yönlü jel elektroforezi ile belirlenen toplam protein profilleri

İki yönlü jel elektroforezi yapılan örneklerde izoelektrik noktalarına ve moleküler

büyüklüğüne göre seçilen ve ana suş ile farklanma olan protein spotlarının MALDİ-

TOF analizleri yapıldı. Elde edilen sonuçlar Mascot-Peptit Mass Fingerprint

programında değerlendirildi.

Bu sonuçlara göre kontrol olarak kullanılan S. Typhimurium LT2 suşunda stjB proteini

tanımlanamazken 20 numaralı mutantta tripsin enzimi kesimi sonucu oluşan

peptitlerden 1337.8943, 1602.1145, 1382.8025, 1239.1532, 1193.7943, 1189.9496,

1199.3779, 1375.3203 Dalton olan sekiz ortak peptitle stjB proteininin ifade edildiği

saptanmıştır (Şekil 4.5).

Marker

pH:5 pH:8

25 kDa

80 kDa

54

Şekil 4.5 20 numaralı mutanta ait tripsin enzim kesimi sonucu stjB ile ortak olan peptitler

55

Şekil 4.5 20 numaralı mutanta ait tripsin enzim kesimi sonucu stjB ile ortak olan peptitler (Devam)

Bu bulgu β-galaktozidaz aktivitesiyle belirlenen, mutanttaki Stj fimbriyal protein üretim

düzeyindeki artışı gösteren sonuçları desteklemektedir. SDS-iki yönlü jel

elektroforezinde stjB olarak tanımlanan protein spotu Şekil 4.6’da verilmiştir.

56

Şekil 4.6.a Kontrol olarak kullanılan S. Typhimurium LT2 suşu, b. 20 numaralı

mutanta ait SDS-iki yönlü jel elektroforezi ile belirlenen stjB ve cadC

protein spotları

Bu sonuçlar 20 numaralı T-POP mutantında transpozonun girdiği bölgenin stj fimbriyal

operonunu aktive ettiğini kesinleştiren kanıtlardır. Beş farklı genden oluşan stj operonu

(stjA, stjB, stjC, stjD ve stjE) sadece S. Typhimurium genom dizi analizlerinden elde

edilen verilerin, E. coli genomu ile karşılaştırılması sonucu teorik olarak tanımlanmıştır

(McClelland vd. 2001). Bundan sonra 2009 yılına kadar stj operonu ile ilgili herhangi

bir yayın yapılmamıştır. Akkoç vd. (2009), S. Typhimurium LT2 ve onun stj operonu

bozulmuş mutantları ile yürüttükleri çalışmalarda, stj operonunun fare model

sistemlerde gastrointestinal sistemde kalıcılık üzerinde önemli bir etkinliğe sahip

olduğunu tanımlamıştır. Çalışmamızda elde edilen protein analiz verileri;

S. Typhimurium’da stj fimbriyasının, bu bakterinin konakçı sisteme dahil olması sonucu

(in vitro koşullarda) üretildiğini kesin bir şekilde kanıtlamıştır. Salmonella enterica’nın

yaklaşık 2500 serotipi çerisinde sadece serovaryete Typhimurium’da bulunan bu

fimbriyal operonun (McClelland vd. 2001, Akkoç vd. 2009) regülasyonunun

a b

stjB

cadC

57

belirlenmesi, serovaryete evrimi açısından da büyük önem taşımaktadır. Bu amaçla

doğal suş ve mutantta protein profillerindeki tüm farklılıklar dikkate alınarak analizlere

devam edilmiştir. Bu farklanmada belirginlik gösteren bir protein bandı sirA’dır. SirA

için tanımlanan olası bantlar Şekil 4.7’de verilmiştir.

Şekil 4.7.a Kontrol suş olarak kullanılan S. Typhimurium LT2 suşu, b. 20 numaralı

mutanta ait SDS-iki yönlü jel elektroforezi ile belirlenen sirA protein spotları

S. Typhimurium’da barA ve sirA genleri iki bileşenli sensör kinazı ve cevap regülatörü

kodlamaktadır. Bu sistem virülens genlerinin ifadesini arttırmasının yanında, hareket

genlerinin ifadesini azaltmaktadır. Flagellar genlerin temel regülatörü flhDC, intestinal

virülens etmenlerinin birincil regülatörü olan hilA üzerinde pozitif regülatör etkisi

sirA

ba

58

göstermektedir. SirA sisteminin ayrıca Tip1 fimbriyayı kodlayan fim operonunu kontrol

ettiği belirlenmiştir. Diğer bakterilerdeki sirA ortologlarının ve S. Typhimurium’daki

sirA regülonunun tüm üyelerinin biofilm üretimi in vitro koşullarda test edilmiş ve sirA

mutanlarda biofilm oluşumunun gerçekleşmediği saptanmıştır (Teplitski vd. 2003,

Teplitski vd. 2006, Bodero vd. 2006, Foley ve Lynne 2008, Dorman ve Corcoran 2009).

Söz konusu sirA protein bantları ile yürütülen enzim kesimi sonucunda kontrol suş

S. Typhimurium LT2’da; 1195.3335, 1218.8103, 1277.0010, 1236.2242 ve 2404.5813

Dalton olmak üzere beş ortak peptitle sirA proteini tanımlanmıştır (Şekil 4.8).

Şekil 4.8 S. Typhimurium LT2 suşuna ait tripsin enzim kesimi sonucu sirA proteini ile ortak olan peptitler

59

Şekil 4.8 S. Typhimurium LT2 suşuna ait tripsin enzim kesimi sonucu sirA proteini ile ortak olan peptitler (Devam)

60

Ancak 20 numaralı mutant suşta sadece 1278.1886, 1700.5889, 1663.1710 ve

1470.3130 Dalton büyüklükte olan dört ortak peptit bulunmuştur (Şekil 4.9).

Şekil 4.9 20 numaralı mutanta ait tripsin enzim kesimi sonucu sirA proteini ile ortak olan peptitler

61

Şekil 4.9 20 numaralı mutanta ait tripsin enzim kesimi sonucu sirA proteini ile ortak olan peptitler (Devam)

Aktivatör SirA proteinin doğal ve mutant suşta üretiliyor olması; özellikle stj

operonunun doğal suşta ifade edilmediği göz önünde bulundurulur ise, stj fimbriyal

operonunun regülasyonuna katılmadığına işaret etmektedir.

CadC regülatör proteinin genetik ve fenotipik verileri stj fimbriyal operonunun

regülasyonuna katılmadığını göstermiş olmasına rağmen, söz konusu proteinin olası

bölgesinde iki yönlü SDS-PAGE analizleri sonucu ifadesi artmış bir bandın görülmesi

(Şekil 4.6) nedeni ile tripsinizasyon bantları değerlendirilmiştir. Bu işlem sonrasında 20

numaralı mutant için sadece 1277.698, 1565.9673, 1030.4460 ve 1379.4177 Daltonluk

dört adet peptidin belirlenmesi (Şekil 4.10) ve söz konusu bandın S. Typhimurium LT2

için tanımlanamaması, bu regülatörün dolaylı bir şekilde stj operonunun regülasyonuna

katıldığı olasılığına işaret etmektedir. Ancak bu durum büyük olasılıkla T-POP

mutasyonunun pleitropik etkisinden kaynaklanmaktadır. Bu öngörünün kesinlik

kazanması için söz konusu doğal suş ve mutantın mikrodizin analizlerinin yapılması

zorunludur.

62

Şekil 4.10 20 numaralı mutanta ait tripsin enzim kesimi sonucu cadC proteini ile ortak

olan peptitler

63

Son olarak S. Typhimurium LT2 doğal suşunda iki yönlü SDS-PAGE sistemlerinde

tanımlanan, ancak 20 numaralı mutantta bulunmayan ybdH proteini (Şekil 4.11), LT2

protein jellerinden kesilerek tripsinizasyona tabi tutulmuş ve 2408.7295, 1287.7070,

1331.7371 ve 2409.6655 Dalton büyüklüğünde dört ortak peptit ile Mascot-Mass

Fingerprint programında tanımlanmıştır (Şekil 4.12).

Şekil 4.11.a Kontrol suş olarak kullanılan S. Typhimurium LT2, b. 20 numaralı

mutanta ait SDS-iki yönlü jel elektroforezi ile belirlenen ybdH protein

spotu

a b

ybdH

64

Şekil 4.12 S. Typhimurium LT2 suşuna ait tripsin enzim kesimi sonucu ybdH proteini ile ortak olan peptitler

65

ybdH geni LysR ailesine ait regülatör (LTTR) olan ybdO tarafından regüle

edilmektedir. Farklı LTTR’ler Salmonella’da bakteriyel virülens ve hayatta kalmayı

kontrol eden çoklu bölgelerini düzenlediği saptanmıştır (Lahiri vd. 2009).

Histon benzeri prokaryotik proteinler (H-NS), E. Coli ve S. Typhimurium’da birbiriyle

ilişkili olmayan genlerin ifadesini düzenlediği saptanmıştır. Bu global regülatör

sisteminin ayrıca S. Typhimurium ve Shigella ssp.’de bazı virülens genlerinin

ifadesinde de rol oynadığı bilinmektedir. H-NS, etki ettiği genlerin büyük bir

çoğunluğunu negatif regülatör olarak düzenlemektedir, fakat flagellar regülonları içeren

bazı genleri pozitif olarak düzenlemektedir. H-NS-eksik hücreler, flhDC’nin

transkripsiyonunun baskılanmasından dolayı flagellasızdır (Bertin vd. 1994, Fang ve

Rimsky 2008, Lahiri vd. 2009).

S. Typhimurium’da yürütülen çalışmalarda; LysR ailesine ait HdfR regülatörünün

flagellar peronun üst transkripsiyon yönündeki bölgesine bağlanarak flagellar ana

operonunun H-NS bağımlı regülasyonunu sağladığı belirlenmiştir. hdfR’nin ifadesi

negatif olarak H-NS tarafından kontrol edilmektedir. Bu durum H-NS mutantlarda

flagella oluşumunun negatif etkisini açıklamaktadır. H-NS inaktif olduğu zaman hdfR

geninin ifadesi artmakta ve hdfR geninin fazla üretimi flhDC transkripsiyonunu

baskılamaktadır. Daha sonra yapılan çalışmalar da H-NS regülasyonunun çoğu durumda

transkripsiyonel susturucu olarak rol aldığına işaret etmiştir (Soutourina vd. 1999, Ko

ve Park 2000, Beier ve Gross 2006, Jakomin vd. 2008, Foley ve Lynne 2008).

Bizim çalışmamızda stj fimbriyal operonu in vitro koşullarda açılan mutantlarda T-POP

transpozonunun esas giriş bölgelerinin ybdO ve H-NS genleri içinde olduğu DNA dizi

analiz verileri ile kesinlik kazanmıştır (Ek-1). Bu durum söz konusu genlerin stj

fimbriyal operonunun regülasyonuna ortak bir şekilde katıldığına işaret etmektedir.

ybdO geni LysR ailesi üyesi transkripsiyonel bir regülatördür ve ybdH genlerini aktive

ederken bazı genleri baskılamaktadır. ybdH proteinin üretiminin 20 numaralı mutantta

artması bu durumu açıklamaktadır. Yukarıda özetlenen literatür verilerinde olduğu gibi,

muhtemelen YbdO regülatörü stj operonunun düzenleyici bölgesine bağlanmakta ve

H-NS proteinleri ile ilişkilenerek stj operonunun negatif regülasyonu gerçekleşmektedir.

66

T-POP transpozonunun bu genlerin herhangi birini vurması durumunda ise negatif

regülasyon ortadan kalkarak Stj fimbriyası üretilmektedir.

67

5. SONUÇ

stj fimbriyal operonunun regülasyon karakteristiği; stj fimbriyal operonu ifade edilen

mutantlarda ters yön PZR analizi sonuçlarının DNA veritabanlarında değerlendirilmesi

ve tamamlayıcı olarak yapılan proteomik çalışmalar ile belirlenmiştir. Elde edilen

veriler dikkate alındığında, stj fimbriyal operonunun, H-NS ve LysR ailesi

transkripsiyonel regülatörler tarafından bağlantılı ve negatif olarak regüle edildiği

sonucuna varılmıştır. Bu bulgular, Salmonella patojenitesinin ve evriminin

anlaşılmasına evrensel düzeyde katkı niteliği taşımaktadır.

Tanımlanan regülatörlerin stj operonuna bağlanma etkinliğinin ve stj operonunun

bulunduğu kromozomal bölgenin, regülasyonun farklı süreçlerindeki konformasyonel

değişimlerinin belirlenmesi çalışmaları projenin bir sonraki aşamaları olarak

planlanmıştır.

68

KAYNAKLAR Ahmer, B.M., van Reeuwijk, J., Watson, P.R., Wallis, T.S. and Heffron, F. 1999.

Salmonella SirA is a global regulator of genes mediating enteropathogenesis. Molecular Microbiology, 31;971–982.

Akkoç, N., Özden, B., Begüm, G.T. and Akçelik, M. 2009. The role of stj fimbriyal

operone in the intestinal persistence of SalmonellaTyphimurium in mice. Biologia. 5;859-863.

Altier, C., Suyemoto, M., and Lawhon, S. 2000b. Regulation of Salmonella enterica serovar Typhimurium invasion genes by csrA. Infection and Immunity, 68;6790-6797.

Altier, C., Suyemoto, M., Ruiz, A. I., Burnham, K.D. and Maurer, R. 2000a. Characterization of two novel regulatory genes affecting Salmonella invasion gene expression. Molecular Microbiology., 35;635–646.

Bajaj, V., Hwang, C. and Lee, C.A. 1995. hilA is a novel ompR/toxR family member

that activates the expression of Salmonella Typhimurium invasion genes. Molecular Microbiology, 18;715–727.

Bajaj, V., Lucas, R.L., Hwang, C. and Lee, C.A. 1996. Co-ordinate regulation of

Salmonella typhimurium invasion genes by environmental and regulatory factors is mediated by control of hilA expression. Molecular Microbiology., 22;703-714.

Baker, C.S., Morozov, I., Suzuki, K., Romeo, T. and Babitzke, P. 2002. CsrA regulates

glycogen biosynthesis by preventing translation of glgC. Escherichia coli. Molecular Microbiology, 44;1599–1610.

Barbour, E.K., ElJurdi, L.H., Faroo, O.M., Daghir, N.J. and Bouljihad, M. 2000.

Chronological recognition by chicken of antigenic polypeptides in Salmonella enteritidis with di¡erent plasmid pro¢les: relationship to infection rate. American Journal of Veterinary Medicine. 62;565-570.

Bauer, A.W., Kirby, W.M.M., Sherris, J.C. and Turk, M. 1966. Antibiotic susceptibility

testing by a standardized single disk method. American Journal of Clinical Pathology, 45; 493-496.

Baumler, A.J. and Heffron, F. 1995. Identification and sequence analysis of lpfABCDE, a putative fimbrial operonof Salmonella typhimurium. Journal of Bacteriology. 177;2087–2097.

Baumler, A.J., Tsolis, R.M. and Heffron, F. 1996. The lpf fimbrial operon mediates

adhesion of Salmonella typhimurium to murine Peyer’s patches. The Proceeding of National Academy Science USA, 93;279–283.

69

Bearson, B.L., Wilson, L. and Foster, J.W. 1998. A low pH-inducible, PhoPQ-dependent acid tolerance response protects Salmonella Typhimurium against inorganic acid stress. Journal of Bacteriology, 180;2409–2417.

Bearson, S., Bearson, B., Foster, J.W. 1997. Acid stress responses in enterobacteria.

FEMS Microbiology Letters, 147;173-180. Beier, D. and Gross, R. 2006. Regulation of bacterial virulence by two component

systems. Current Oppinion in Microbiology. 9;143-152.

Berger, T., Duncan, G.S., Elia, A.J., You-Ten, A., Wakeham, A., Fong, E.H., Cheung, C.C. and Mak T.W. 2006. Lipocalin 2-deficient mice exhibit increased sensitivity to Escherichia coli infection but not to ischemia-reperfusion injury. The Proceeding of National Academy Science USA, 103;1834–1839.

Bertin, P., Terao, E., Lee, E.H., Lejeune, P., Colson, C., Danchin, A. and Collatz, E..

1994. The H-NS protein is involved in the biogenesis of flagella in Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 176;5537–5540.

Boddicker, J.D., Ledeboer, N.A., Jagnow, J., Jones, B.D. and Clegg, S. 2002.

Differential binding to and biofilm formation on, HEp-2 cells by Salmonella enterica serovar Typhimurium is dependent upon allelic variation in the fimH gene of the fim gene cluster. Molecular Microbiology., 45;1255–1265.

Bodero, M.D., Harden, E.A. and Musson, G.P. 2008. Transcriptional regulation of

subclass 5b fimbriae. BMC Microbiology. 8;1-10. Boekema, B.K.H.L., Van Putten, J.P.M., Stockhofe-Zurwieden, N. and Smith, H.E.

2004. Host cell contact-induced transcription of the Type IV fimbria gene cluster of Actinobacillus pleuropneumoniae. Infections and Immunity, 72 (2); 691-700.

Bohnhoff, M., Miller, C.P. and Martin, W. R. 1964. Resistance of the mouse’s intestinal tract to experimental Salmonella infection. II. Factors responsible for its loss following streptomycin treatment. Journal of Experimental Medicine, 120;817–828.

Bourzac, K.M. and Guillemin, K. 2005. Helicobacter pylori–host cell interactions

mediated by type IV secretion. Cellular Microbiology, 7 (7); 911-919.

Bradford, M.M. 1976. A rapid and sensitive method for quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye-binding. Analalytical Biochemistry, 72;248-254.

Brenner, F.W., Villar, R.G., Angulo, F.J., Tauxe, R. and Swaminathan, B. 2000. Salmonella nomenclature. Journal of Clinical Microbiology, 38;2465-2467.

Byrne, G.A., Russell, D.A., Chen, X. and Meijer, W.G. 2007. Transcriptional regulation

of the virR operon of the intracellular pathogen Rhodococcus equi. Journal of Bacteriology. 189;5082–5089.

70

Cao, H., Krishnan, G., Goumnerov, B., Tsongalis, J., Tompkins, R. and Rahme, L.G. 2001. A quorum sensing-associated virulence gene of Pseudomonas aeruginosa encodes a LysR-like transcription regulator with a unique self-regulatory mechanism. The Proceeding of National Academy Sciences USA. 98;14613–14618.

Casjens, S. and Hayden, M. 1988. Analysis in vivo of thhe bacteriophage P22 headful

nuclease. Molecular Biology. 199;467-474.

Chakravortty, D. , Hansen-Wester, I. and Hensel, M. 2002. Salmonella pathogenicity İsland 2 mediates protection of intracellular Salmonella from reactive nitrogen intermediates. Journal of Experimental Medicine, 195; 1155-1166.

Chaltfield S.N, Dorman C.J., Hayward C. and Dougan C. 1991. Role of ompR-dependent genes in Salmonella Typhimurium virulence:mutant deficient in both ompC and ompF are attenuated in vivo. Infections and Immunity, 59;449-452.

Chessa, D., Winter, M.G., Nuccio, S.P., Tükel Ç. and Baumler, A.J. 2008. RossE repress std fimbrial expression in Salmonella enterica serotype Typhimurium. Molecular Microbiology. 68;573–587.

Chuang, C.H., Su, L.H., Perera, J., Carlos, C., Tan, B.H., Kumarasınghe, G., So, T., Van, P.H., Chongthaleong, A., Hsueh, P.R., Lıu, J.W., Song, J.H. and Chıu, C.H. 2009. Surveillance of antimicrobial resistance of Salmonella enterica serotype Typhi in seven Asian countries. Epidemiology and Infection. 137;266-269.

Coburn, B., Li Y., Owen D., Vallance B.A. and Finlay B.B. 2005. Salmonella enterica serovar Typhimurium pathogenicity island 2 is necessary for complete virulence in a mouse model of infectious enterocolitis. Infections and Immunity. 73;3219– 3227.

Crouch, M.L. Castor M., Karlinsey J.E., Kalhon T. and Fang F.C. 2008. Biosynthesis

and IroC-dependent export of the siderophore salmochelin are essential for virulence of Salmonella enterica serovar Typhimurium. Molecular Microbiology. 67;971–983.

D’Aoust, J.Y., Maurer, J. and Bailey, J.S. 2001. Salmonella species. Food

Microbiology: Fundamentals and Frontiers. 141–178. Washington, DC. Darwin, K.H. and Miller, V.L. 1999. InvF is required for expression of genes encoding

proteins secreted by the SPI1 type III secretion apparatus in Salmonella Typhimurium. Journal of Bacteriology, 181;4949–4954.

Deghmane, A.E., Giorgini, D., Larribe, M., Alonso, J.M. and Taha, M.K. 2002. Down-

regulation of pili and capsule of Neisseria meningitidis upon contact with epithelial cells is mediated by CrgA regulatory protein. Moleculer of Microbiology. 43;1555–1564.

71

Deghmane, A.E., Petit, S., Topilko, A., Pereira, Y., Giorgini, D., Larribe, M. and Taha, M.K. 2000. Intimate adhesion of Neisseria meningitidis to human epithelial cells is under the control of the crgA gene, a novel LysR-type transcriptional regulator. EMBO Journal, 19;1068–1078.

Desvaux, M., Parham, N.J. and Henderson, I.R. 2004. The autotransporter secretion

system. Research in Microbiology, 155; 53–60.

Dorman, C.J. and Corcoran, C.P. 2009. Bacterial DNA topology and infectious disease.Nucleics acids research. 37;672-678.

Erickson, David L., Lines, J.L., Pesci, Everett C., Venturi, V., Storey, Douglas G. 2004. Pseudomonas aeruginosa relA contributes to virulence inDrosophila melanogaster. Infections and Immunity, 72;5638–5645.

Erickson, S., Lucchini, S., Thompson, A., Rhen, M. and Hinton, J.C. 2003. Unravelling

the biology of macrophage infection by gene expression profiling of intracellular Salmonella enterica. Molecular Microbiology, 47;103–118.

Eriksson, A.R., Andersson, R.A., Pirhonen, M. and Palva, E.T. 1998. Two-component

regulators involved in the global control of virulence in Erwinia carotovora subsp. carotovora. Molecular Plant–Microbe Interact 11;743–752.

Ernst, R.K., Dombroski,D.M. and Merrick, J.M. 1990. Infections andImmunity,

58;2014-2016.

Ezequiel, W., Jehoshua, K., Gad, G., Roee, V. 2008. ppGpp analogues as antibacterial compounds. Nucleic Asids Symposium Series, 52;633-634.

Fang, F.C. and Rimsky, S. 2008. New insights into transcriptional regulation by H-NS. Current Opinion in Microbiology. 11;113-120.

Fang, F.C., Chen, C.Y., Guiney, D.G. and Xu, Y. 1996. Identification of sS-regulated genes in Salmonella Typhimurium: complementary regulatory interactions between sS and cyclic AMP receptor protein. Journal of Bacteriology, 178;5112–5120.

Farmer, J.J., III. 2003. Enterobacteriaceae: introduction and identification. 636–651.

Washington, DC. Finlay, B.B. and Falkow, S. 1991. Salmonella interactions with polarized human

intestinal Caco-2 epithelial cells. Journal of Infectious Diseases. 162;1096-1106. Fischbach, M.A., Lin H., Zhou L., Yu Y., Abergel R.J., Liu D.R., Raymond K.N.,

Wanner B.L., Strong R.K., Walsh C.T., Aderem A. and Smith K.D. 2006. The pathogen-associated iroA gene cluster mediates bacterial evasion of lipocalin 2. The Proceeding of National Academy Science USA 103;16502–16507.

72

Fitzgerald, C., Sherwood, R., Gheesling, L.L., Brenner, F.W. and Patricia, I. 2003. Fields molecular analysis of the rfb O antigen gene cluster of Salmonella enterica serogroup O:6,14 and development of a serogroup-specific PCR assay. Applied Environental Microbiology, 69 (10); 6099–6105.

Fluit, A.C. 2005. Towards more virulent and antibiotic-resistant Salmonella? FEMS Foley, S.L. and Lynne, A.M. 2008. Food animal associated Salmonella challenges:

Pathogenicity and antimicrobial resistance. Jounal of Animal Science. 86;E173-E187.

Fredorka-Cray, P.J. and Wray, C. 2000. Salmonella infections in pigs. 191-207. Newyork NY.

Friedrich, M.J., Kinsey, N.E., Vila, J. and Kadner, R.J. 1993. Nucleotide sequence of a

13.9 kb segment of the 90 kb virulence plasmid of Salmonella typhimurium: the presence of fimbrial biosynthetic genes. Molecular of Microbiology. 8;543–558.

Galan, J.E. and Zhou, D. 2000. Striking a balance: modulation of the actin cytoskeleton

by Salmonella. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 97: 8754-8761.

Galan, J.E. 2008. Energizing Type III secretion machines: what is fuel? Nature

Structural and Molecular Biology, 15; 127-128.

Galan, J.E. and Curtiss III, R. 1989.Virulence and vaccine potential of phoP mutants of Salmonella Typhimurium. Microbial Pathogenessis, 6 (6); 433-43.

Garcia, B., Latasa, C., Solano, C., Garcia-del Portillo, F., Gamazo, C. and Lasa, I. 2004. Role of the GGDEF protein family in Salmonella cellulose biosynthesis and biofilm formation. Molecular Microbiology. 54;264–277.

Garcia-del Portillo, F., Foster J.W. and Finlay B.B. 1993. Role of acid tolerance

responce genes in Salmonella Typhimurium virulence. Infections and Immunity, 61 (10); 4489-4492.

Garrels. 1979. Two-dimensional gel electrophoresis and computer analysis of proteins synthesized by clonal cell lines. The Journal of Biologycal Chemistry, 254: 7961-7977.

Gentle, I., Gabriel, K., Beech, P., Waller, R. and Lithgow, T. 2004. The Omp85 family of proteins is essential for outer membrane biogenesis in mitochondria and bacteria. Journal of Cell Biology, 164; 19–24.

Gerlach, R.G. and Hensel, M. 2007. Protein secretion systems and adhesins: The molecular armory of Gram-negative pathogens. International Journal of MedicialMicrobiology, 297; 401–415.

Gerstel, U., Park, C. and Romling, U. 2003. Complex regulation of csgD promoter activity by global regulatory proteins. Molecular Microbiology. 49;639–654.

73

Giannella, R.A., Broitman, S.A., Zamcheck, N. 1972. Gastric acid barrier to ingested microorganisms in man: studies in vivo and in vitro. Gut. 13;251–56.

Glaser, M.J. and Newman, L.S. 1982. A review of human salmonellosis. I. Infective

dose. Review of Infectious Disease, 34;1096–1106. Gottesman, S., 1984. Bacterial regulation: global regulatory Networks. Annual Review

of Genetics, 18;415-441.

Grob, P., Guiney, D.G. 1996. In vitro binding of the Salmonella dublin virulence plasmid regulatory protein SpvR to the promoter regions of spvA and spvR. Journal of Bacteriology. 178;1813–20.

Groisman, E.A., Parra-Lopez, C., Salcedo, M., Lipps, C.J. and Heffron, F. 1992.

Resistence to host antimicrobial peptides is necessary for Salmonella virulence. The Proceedings of National Academy Sciences USA, 89;11939-11943.

Guiney, D.G., Fang, F.C., Krause, M., Libby, S.J., Buchmeier, N. and Fierer, J. 1995. Biology and clinical significance of virulence plasmids in Salmonella. Clinical Infections Diseases, 21;146–151.

Gunn, J.S., Hohmann, E.L. and Miller, S.I. 1996. Transcriptional regulation of

Salmonella virulence: a PhoQ periplasic domain mutaion results in increased net phosphotransfer to PhoP. Journal of Bacteriology, 178;6369-6373.

Guo, L. Kim, K.B., Poduje, C.M. 1998. Lipid A acylation and bacterial resistance againts vertebrate antinicrobial peptides. Cell, 95;189-198.

Hanser-Wester, I. and Hensel, M. 2001. Genome-based identification of chromosomal regions specific for Salmonella ssp. Infections and Immunity, 70;2351-2360.

Hapfelmeier, S., Stecher B., Barthel M., Kremmer M., Müller A.J., Heinkenwabler M., Stallmach T., Akira S. and Hardt M. 2005. The Salmonella pathogenicity island (SPI)-2 and SPI-1 type III secretion systems allow Salmonella serovar Typhimurium to trigger colitis via MyD88-dependent and MyD88-independent mechanisms. Journal of Immunology, 174;1675–1685.

Haralalka, S., Nandi, S., Bhadra, R.K. 2003. Mutation in the relA gene of Vibrio

cholerae affects in vitro and in vivo expression of virulence factors. Journal of Bacteriology, 185;4672–4682.

Heithoff, D.M., Conner, C.P., Hanna, P.C., Julio, S.M., Hentschel, U. and Mahan, M.J.

1997. Bacterial infection as assessed by in vivo gene expression. The Proceedings of National Academy Sciences USA, 94;934–939.

Helms, M. Etherlberg, S. and Molbak, K. 2005. International Salmonella Typhimurium

DT104 infections, 1992-2001. Em. Infection Disease, 11; 859-867.

74

Henderson, I.R., Navarro-Garcia, F., Desvaux, M., Fernandez, R.C. and Ala’Aldeen, D. 2004. Type V protein secretion pathway: the autotransporter story. Microbiology and Molecular Biology Rev., 68; 692–744.

Hengge-Aronis R. 1996. Regulation of gene expression during entry into stationary phase, 1497–1512 Washington, D.C.

Henikoff, S., Haughn, G.W., Calvo, J.M. and Wallace, J.C. 1988. A large family of

bacterial activator proteins. The Proceeding of National Academy Sciences USA, 85; 6602–6606.

Hensel, M., Shea J.E., Baumler A.J., Gleeson C., Blather F. and Holden D.W. 1997.

Analysis of the boundaries of Salmonella pathogenicity island 2 and the corresponding chromosomal region of Escherichia coli K-12. Journal of Bacteriology. 179;1105–1111.

Hueck, C.J. 1998. Type III protein secretion systems in bavterial pathogens of animals

and plants. Microbiology and Molecular Biology Reviews, 62;379-433.

Hueck, C.J., Hantman, M.J., Bajaj, V. 1995. Salmonella Typhimurium secreted invasion determinantsa re homologous to Shigella Ipa proteins. Molecular Biology, 18;47490.

Hultgren, S.J., Normark, S. and Abraham, S.N. 1991. Chaperone-assisted assembly and molecular architecture of adhesive pili. Annual Review of Microbiology, 45;383–415.

Humpries, A.D., Towsend, S.M., Kingsley, R.A., Nicholson, T.L., Tsolis, R.M.,

Baumler, A.J. 2001. Role of fimbriae as antigens and intestinal colonization factors of Salmonella serovars. Fems Microbiology Letters. 201;121-125. Immunology and Medical Microbiology, 43, 1-11.

Jakomin, M., Chessa, D., Baumler, A.J. and Casadesus, J. 2008. Regulation of the Salmonella enterica std fimbrial operon by DNA Adenine Methylation, SeqA, and HdfR. Journal of Bacteriology. 190;7406-7413.

Jishage, M., Iwata, A., Ueda, S. and Ishihama, A. 1996. Regulation of RNA sigma subunit synthesis in Escherichia coli: intracellular levels of four species of sigma subunit under various growth conditions. Journal of Bacteriology, 178;5447–5451.

Johnston, C., Pegues, D.A., Hueck, C.J., Lee, A. and Miller, S.I. 1996. Transcriptional

activation of Salmonella typhimurium invasion genes by a member of the phosphorylated response-regulator superfamily. Molecular Microbiology, 22;715–727.

Jones, B.D. and Falkow, S. 1996. Salmonellosıs: Host Immune Responses and Bacterial

Virulence Determinants. Annual Review of Immunolog,. 14;533-561.

75

Jones, B.D. 2005. Salmonella invasion gene regulation: a story of environmental awareness. The Journal of Microbiology, 43;110-117.

Jones, B.D., Ghori, N. and Falkow, S. 1994. Salmonella typhimurium initiates murine infection by penetrating and destroying the special-ized epithelial M cells of the Peyer’s patches. Journal of Experimental Medicine, 180;15-23.

Kim, B.H., Jeong, L., Lee, S.I., Bang, H.S., Kim, J. and Park, K.Y. 2001. Cloning and

Sequencing Analysis of cadC Encoding Transcriptional Activator CadC from Salmonella typhimurium. Journal of Microbiology. 39;109-115.

Kim, J., Kim, J.G., Kang, Y., Jang, J.Y., Jog, G.J., Lim, J.Y., Ki, S., Suga, H.,

Nagamatsu, T. and Hwang, I. 2004. Quorum sensing and the LysR-type transcriptional activator ToxR regulate toxoflavin biosynthesis and transport in Burkholderia glumae. Molecular Microbiology. 54;921–934.

Kingsley, R.A., Weening, E.H., Keestra, A.M. and Baumler, A.J. 2002. Population

heterogeneity of Salmonella enterica serotype Typhimurium resulting from phase variation of the lpf operon in vitro and in vivo. Journal of Bacteriology. 184;2352–2359.

Ko, M. and Park, C. 2000. H-NS-Dependent Regulation of Flagellar Synthesis Is

Mediated by a LysR Family Protein. Journal of Bacteriology. 182;4670-4672. Kovacikova, G. and Skorupski, K. 1999. A Vibrio cholerae LysR homolog, AphB,

cooperates with AphA at the tcpPH promoter to activate expression of the ToxR virulence cascade. Journal of Bacteriology. 181;4250–4256.

Kowarz, L., Coynault C., Robbe-Saule, V. and Norel, F. 1994. The Salmonella

Typhimurium katF (rpoS) gene: cloning, nucleotide sequence, and regulation of spvR and spvABCD virulence plasmid genes. Journal of Bacteriology, 176;6852–6860.

Lahiri, A., Das, P., Chakravortty, D. 2009. Salmonella Typhimurium: Insight into the

multi-faceted role of the LysR-type transcriptional regulators in Salmonella. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 41;2129-2133.

Lawhon, S. D., Frye, J. G., Suyemoto, M., Porwollik, S., McClelland, M. and Altier, C. 2003. Global regulation by CsrA in Salmonella Typhimurium. Molecular Microbiology, 48;1633–1645.

Lawley, T.D., Bouley D.M., Hoy V.E., Gerke C., Relman D.A. and Monack D.M. 2008. Host transmission of Salmonella enterica serovar Typhimurium is controlled by virulence factors and indigenous intestinal microbiota. Infectious and Immunity, 76;403–416.

Ledeboer, N.A. and Jones, B.D. 2005. Exopolysaccharide sugars contribute to biofilm

formation by Salmonella enterica serovar Typhimurium on HEp-2 cells and chicken intestinal epithelium. Journal of Bacteriology. 187;3214–3226.

76

Lee, A.K., Detweiler, C.S. and Falkow, S. 2000. OmpR regulates the two component

system SsrA-ssrB in Salmonella pathogenicity island 2. Journal of Bacteriology, 182;771-781.

Lee, C.A. and Falkow, S. 1990. The ability of Salmonella to enter mammalian cells is affected by bacterial growth state. The Proceeding of National Academy Sciences USA, 87;4304–4308.

Lee, C.A., Jones, B.D. and Falkow, S. 1992. Identification of a Salmonella typhimurium

invasion locus by selection for hyperinvasive mutants. The Proceeding of National Academy Sciences USA, 89;1847–1851.

Lindgren, S.W., Stojiljkovic, I., Heffron, F. 1996. Macrophage killing is an essential

virulence mechanism of Salmonella Typhimurium. The Proceeding of National Academy Sciences USA, 93;4197–4201.

Lockman, H.A. and Curtiss, R. III 1992. Isolation and characterization of conditional

adherent and non-type 1 fimbriated Salmonella typhimurium mutants. Molecular Microbiology. 6;933–945.

Maddocks, S.E., Oyston, P.C. 2008. Structure and function of the LysR-type

transcriptional regulator (LTTR) family proteins. Microbiology. 154;3609–23. Marcus, S.L., Brumell, J.H., Pfeifer, C.G., Finlay, B. 2000. Salmonella pathogenicity

islands: big virulence in small packages. Microbes and Infections, 2;145-156. Margolin, P. 1987. Generalized transduction. In Escherichia coli and Salmonella

Typhimurium: Cellular and Molecular Biology. American Society of Microbiology. pp. 2898. Washingtano D.C.

Mastroeni, P. and Maskell, D. 2006. Salmonella infections. Clinical Immunological and Molecular Aspects. 146-167. New York.

Mastroeni, P., Villarreal-Ramos, B. and Hormaeche, C.E. 1992. Role of T cells, TNF

alpha and IFN gamma in recall of immunity to oral challenge with virulent salmonellae in mice vaccinated with live attenuated aro- Salmonella vaccines. Microbial Pathogenty, 13;477-491.

McBeth, K.J. and Lee, C.A. 1993. Prolonged Inhibition of Bacterial Protein Synthesis

Abolishes Salmonella Invasion. Infection and Immunity. p. 1544-1546.

McClelland, M., Sanderson, K.E., Spieth, J., Clifton, S.W., Latreille, P., Courtney, L., Porwollik, S., Ali, J., Dante, M., Du, F., Hou, S., Layman, D., Leonard, S., Nguyen, C., Scott, K., Holmes, A., Grewal, N., Mulvaney, E., Ryan, E., Sun, H., Florea, L., Miller, W., Stoneking, T., Nhan, M., Waterston, R. and Wilson, R. K. 2001. Complete genome sequence of Salmonella enterica serovar Typhimurium LT2. Nature 413;852–856.

77

McCullough, N.B. and Eisele, C.W. 1951. Experimental human salmonellosis. 4. Pathogenicity of strains of Salmonella pullorum obtained from spray-dried whole egg. Journal of Infectious Disease, 89;259–265.

Merrell, D.S. and Camilli, A. 2002. Regulation of Vibrio cholerae genes required for

acid tolerance by a member of the ‘‘ToxR-like’’ family of transcriptional regulators. Journal of Bacteriology, 182;5342-5350.

Miao, E.A., Alpuche-Aranda C.M., Dors M., Clark A.E., Bader M.W., Miller S.I. and

Aderem A. 2006. Cytoplasmic flagellin activates caspase-1 and secretion of interleukin 1beta via Ipaf. Nature Immunology, 7;569–575.

Miller, J.H. 1972. Expriments in Molecular Genetics. Cold Laboratory Press, Cold

Spring Harbor, New York, USA. 352-355. Miller, S.I., Pegues, D.A. 2000. Salmonella species, including Salmonella typhi.

InPrinciples and Practice of Infectious Diseases, ed. GL Mandell, JE Bennett, R Dolin, 2;2344–63. Philadelphia: Churchill Livingstone. 2 vols. 5th ed.

Mirold, S., Ehrbar, K., Weissmüller, A. 2001. Salmonella host cell invasion emerged by

acquising of a mosaic of seperate genetic elements, including Salmonella pathogenity island 1 (SPI-1), SPI-5, and spoE2. Journal of Bacteriology, 183;2348-2358.

Morgan, E., Bowen, A.J., Carnell, S.C., Wallis, T.S. and Stevens, M.P. 2007. SiiE is

secreted by the Salmonella enterica Serovar Typhimurium pathogenicity island 4-encoded secretion system and contributes to intestinal colonization in cattle. Infection and Immunity 75 (3); 1524-1533.

Morita, M., Mori, K., Tominaga, K., Terajima, J., Hirose, K., Watanabe, H. and Izumiya, H., 2006. Characterization of lysine decarboxylase-negative strains of Salmonella enterica serovar Enteritidis disseminated in Japan. FEMS Immunology and Medicinal Microbiology, 46;381–385.

Ngwai, Y.B., Adachi, Y., Ogawa, Y. and Hara, H. 2006. Characterization of biofilm-

forming abilities of antibiotic-resistant Salmonella Typhimurium DT104 on hydrophobic abiotic surfaces. The Journal of Microbiology, Immunology and Infection, 39(4); 278-91.

Nicholson, T.L. and Baumler, A.J. 2001. Salmonella enterica serotype Typhimurium

elicits cross-immunity against a Salmonella enterica serotype enteritidis strain expressing LP fimbriae from the lac promoter [in process citation]. Infection and Immunity, 69;204-212.

Nickerson, C.A. and Curtiss, R. 1997. Role of factor RpoS in initial stage of Salmonella

Typhimurium infection. Infection and Immunity, 65;1814–1823.

78

Norris, T.L., Kingsley, R.A. and Bumler, A.J. 1998. Expression and transcriptional control of the Salmonella typhimurium Ipf fimbrial operon by phase variation. Molecular Microbiology. 29;311–320.

Nuccino, S.P., Chessa, D., Weening, E.H., Raffatellu, M., Clegg, S. and Baumler, A.

2007. SIMPLE Approach for Isolating Mutants Expressing Fimbriae. Applied and Environmental Microbiology. 73;4455-4462.

Ohl, M.E. and Miller, S.I. 2001 SALMONELLA: AModel for Bacterial Pathogenesis Annual Review Medicine 52;259–74.

Pegues, D.A., Hantman, M.J., Behlau, I. and Miller, S.I. 1995. PhoP/PhoQ

transcriptional repressionof Salmonella Typhimurium invasion genes: evidence for a role in protein secretion. Molecular Biology, 17;169-181.

Penheiter, K.L., Mathur, N., Giles, D., Fahlen, T. and Jones, B.D. 1997. Noninvasive

Salmonella typhimurium mutants are avirulent because of an inability to enter and destroy M cells of ileal Peyer’s patches. Molecular Microbiology. 24;697-709.

Pizarro-Cerda, J. and Tedin, K. 2004. The bacterial signal molecule, ppGpp, regulates

Salmonella virulence gene expression. Molecular Microbiology, 52;1827–1844.

Potrykus, K. and Cashel, M. 2008. (p)ppGpp: Still Magical? Annual Reviews of Microbiology, 62;35-51.

Primm, T.P., Andersen, S.J., MizrahiI, V., Avarbock, D., Rubin, H., Barry, C.E. III.

2000. The stringent response of Mycobacterium tuberculosis is required for long-term survival. Journal of Bacteriology, 182;4889–4898.

Prouty, A.M. and Gunn, J.S. 2003. Comparative analysis of Salmonella enterica serovar

Typhimurium biofilm formation on gallstones and on glass. Infection and Immunity, 71;7154–7158.

Prouty, A.M., Schwesinger, W.H. and Gunn, J.S. 2002. Biofilm formation and

interaction with the surfaces of gallstones by Salmonella spp. Infection and Immunity, 70;2640–2649.

Raffatellu, M., Wilson R.P., Chessa D., Andrews-Polymenis H., Tran Q.T., Lawhon S.,

Khare S., Adams L.G., Baumler A.J. 2005. SipA, SopA, SopB, SopD and SopE2 contribute to Salmonella enterica serotype Typhimurium invasion of epithelial cells. Infection and Immunity, 73; 146–154.

Raffatellu, M., Chessa, D., Wilson, R.P., Tükel, Ç., Akçelik, M. and Baumler, A.J.

2006. Capsule-mediated immune evasion: a new hypothesis explaining aspects of typhoid fever pathogenesis. Infection and Immunity, 74; 19-27.

79

Rappleye, C.A. and Roth, J.R. 1997. A Tn10 derivate (T-POP) for isolation of insertions with conditional (tetracycline-dependent) phenotypes. Journal of Bacteriology. 179;5827-5834.

Rhen, M., Rjikonen, P. and Taira, S. 1993. Transcriptional regulation of Salmonella enterica virulence plasmid genes in cultured macrophages. Molecular Microbiology, 10;45–56.

Rich, J.J. and Willis, D.K. 1997. Multiple loci of Pseudomonas syringae pv. syringae

are involved in pathogenicity on bean: restoration of one lesion-deficient mutant requires two tRNA genes. Jornal of Bacteriology, 179; 2247–2258.

Romeo, T., Gong, M., Liu, M.Y. and Brun-Zinkernagel, A.M. 1993. Identification and

molecular characterization of csrA, a pleiotropic gene from Escherichia coli that affects glycogen biosynthesis, gluconeogenesis, cell size, and surface properties. Journal of Bacteriology, 175;4744–4755.

Romling, U., Sierralta, W.D., Eriksson, K. and Normark, S. 1998b. Multicellular and

aggregative behaviour of Salmonella typhimurium strains is controlled by mutations in the agfD promoter. Molecular Microbiology. 28;249–264.

Russell, D.A., Byrne, G.A., O’Connell, E.P., Boland, C.A. and Meijer, W.G. 2004. The

LysR-type transcriptional regulator VirR is required for expression of the virulence gene vapA of Rhodococcus equi ATCC 33701. Journal of Bacteriology. 186;5576–5584.

Ryan, C.A., Nickels, M.K., Hargrett-Bean, N.T., Potter, M.E., Endo, T., Mayer, L.,

Langkop, C.W., Gibson, C., McDonald, R.C., Kenney, R.T., Puhr, N.D., McDonnell, P.J., Martin, R.J., Cohen, M.L. and Blake, P.A. 1987. Massive outbreak of antimicrobial-resistant salmonellosis traced to pasteurized milk. JAMA 258;3269–3274.

Sanderson, K.E. and Roth, J. 1983. Linkage map of of Salmonella Typhimurium.

Microbiological Reviews, 47;410-453.

Santos, R.L., Raffatellu, M., Bevins, C.L., Adams, L.G., Tükel, Ç, Tsolis, R.M. and Baumler, A.J. 2009. Life in the inflamed intestine, Salmonella style. Trends in Microbiology.17;498-506.

Santos, R.L., Tsolis, R.M., Bäumler, A.J. and Adams, L.G. 2003. Pathogenesis of

Salmonella-induced enteritis. Brazilian Journal of Medical and Biological Research. 36;3-12.

Santos, R.L., Zhang, S., Tsolis, R.M., Bäumler, A.J. and Adams, L.G. 2002.

Morphologic and molecular characterization of Salmonella typhimurium infection in neonatal calves. Veterinary Pathology, 39;200-215.

80

Santos, R.L., Zhang, S., Tsolis, R.M., Kingsley, R.A., Adams, L.G. and Baumler, A.J. 2001. Animal models of Salmonella infections: enteritis versus typhoid fever. Microbes and Infections, 3;1335-1344.

Sarniguet, A., Kraus, J., Henkels, M.D., Muehlchen, A.M. and Loper, J.E. 1995. The

sigma factor ss affects antibiotic production and biological control activity of Pseudomonas fluorescens Pf-5. The Proceeding of National Academy Sciences USA, 92;12255–12259.

Schmieger, H. 1972. Phage P22 mutants with increased or decreased transduction

activities. Molecular Genetics and Genomics, 119:75-88. Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J.V. and Mann, M. 2007. In-gel digestion

for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. 1;2856-2860.

Solano, C., Garcia, B., Valle, J., Berasain, C., Ghigo, J.M., Gamazo, C. and Lasa, I. 2002. Genetic analysis of Salmonella enteritidis biofilm formation: critical role of cellulose. Molecular Microbiology, 43;793–808.

Soncini, F.C. and Groisman, E.A. 1996. Two-component regulatory systems can

interact to process multiple enviromental signals. Journal of Bacteriology, 178;6769-6801.

Soncini, F.C., Garcia Vescovi, E. and Groisman, E.A. 1995. Transcriptional autoregulation of Salmonella Typhimurium phoPQ operon. Journal of Bacteriology, 177;4364-4371.

Soutourina, B., Kolb, A., Krin, E., Laurent-Winter, C., Rimsky, S., Danchin, A. and

Bertin, P. 1999. Multiple control of flagellum biosynthesis in Escherichia coli: role of H-NS protein and the cyclic AMP-catabolite activator protein complex in transcription of the flhDC master operon. Journal of Bacteriology, 181;7500–7508.

Sperandio, B., Gautier, C., McGovern, S., Ehrlich, D.S., Renault, P., Martin-Verstraete,

I. and Gue´don, E. 2007. Control of methionine synthesis and uptake by MetR and homocysteine in Streptococcus mutans. Journal of Bacteriology. 189;7032–7044.

Srivatsan, A. and Wang, J.D. 2008. Control of bacterial transcription, translation and

replication by (p)ppGpp. Current Opinion Microbiology, 11; 100–105.

Stolpe, H., Grund, S. and Schroder, W. 1994. Purification and partial characterization of type 3 fimbriae from Salmonella typhimurium var. copenhagen. Zentralbl Bakteriol 281;8–15.

81

Suar, M., Jantsch, J., Hapfelmeier, S., Kremer, M., Stallmach, T., Barrow, P.A. and Hardt, W.D. 2006. Virulence of broad- and narrow-host-range Salmonella enterica serovars in the streptomycin-pretreated mouse model. Infection and Immunity, 74 (1); 632–644.

Takayama, M., Ohyama, T., Igarashi, K., Kobayashi, H. 1994. Escherichia coli cad functions as a supplier of carbon dioxide. Molecular Microbiology, 11;913-918.

Tauxe, R.V. and Pavia, A.T. 1998. Salmonellosis: nontyphoidal, p. 613– 630. In A. S.

Evans and P. S. Brachman (ed.), Bacterial infections of humans: epidemiology and control, 3rd ed. Plenum Medical Book Co., New York, N.Y.

Taylor, C.M., Beresford, M., Epton, H.A., Sigee, D.C., Shama, G., Andrew, P.W. and

Roberts, I.S., 2002. Listeria monocytogenes relA and hpt mutants are impaired in surface-attached growth and virulence. Journal of Bacteriology, 184;621-628.

Teplitski, M., Goodier, R.I. and Ahmer, B.M. 2003. Pathways leading from BarA/SirA

to motility and virulence gene expression in Salmonella. Journal of Bacteriology, 185;7257–7265.

Teplitski, M., Goodier, R.I. and Ahmer, B.M. 2006. Catabolite repression of the SirA

regulatory cascade in Salmonella enterica. Journal of Medicinal Microbiology, 296;446-466.

Thompson, A., Rolfe, M.D., Lucchini, S., Schwerk, P., Hinton, J.C.D. and Tedin, K.

2006. The bacterial signal molecule, ppGpp, mediates the enviromental regulation of both the invasion and intracellular virulence gene programs of Salmonella. The Journal of Biological Chemistry, 281;30112-30121.

Tsolis, R.M., Kingsley, R.A., Townsend, S.M., Ficht, T.A., Adams, L.G. and Bäumler, A.J. 1999. Of mice, calves, and men. Comparison of the mouse typhoid model with other Salmonella infections. Advances in Experimental Medicine and Biology, 473; 261-274.

Tükel, C., Raffatellu M., Humpries A.D., Wilson R.P., Andrews-Polymenis H.L., Gull

T., Figuerredo J.F., Wong M.H., Michelsen K.S., Akçelik M., Adams L.G. and Baumler A.J. 2005. CsgA is a pathogen-associated molecular pattern of Salmonella enterica serotype Typhimurium that is recognized by Toll-like receptor 2. Molecular Microbiology. 58;289–304.

Tükel, Ç., Akçelik, M., de Jong, M.F., Şimşek, Ö., Tsolis, R.M. and Baumler, A.J.

2007. MarT activates expression of the MisL autotransporter protein of Salmonella enterica Serotype Typhimurium. Journal of Bacteriology. 189;3922–3926.

Unsworth, K.E., Way, M., McNiven, M., Machesky, L. and Holden, D.W. 2004.

Analysis of the mechanisms of Salmonella-induced actin assembly during invasion of host cells and intracellular replication. Cellular Microbiology, 6; 1041–1055.

82

Vazquez-Juarez, R.C., Kuriakose, J.A., Rasko, D.A., Ritchie, J.M., Kendall, M.M., Slater, T.M., Sinha, M., Luxon, B.A., Popov, V.L., Waldor, M.K., Sperandio, V. and Torres, A.G. 2008. CadA negatively egulates Escherichia coli O157:H7 adherence and intestinal colonization. Infection and Immunity, 76;5072-5081.

Vescovi, E.G., Ayala, Y.M., Di, C.E. and Groisman, E.A. 1997. Characterization of the

bacterial sensor protein PhoQ. Evidence for distinct binding sites for Mg+2 and Ca+2. Journal of Biological Chemistry, 272;1440–1443.

Voino-Yasenetsky, M.V. 1977. Problems of the pathogenesis of salmonella infection.

Akade´miai Kiado´, Budapest, Hungary. Wallis, T.S. and Galyov, E.E. 2000. Molecular basis of Salmonellainduced enteritis.

Molecular Microbiology. 36;997-1005. Walsh, A.L., Phiri A.J., Amos J.D., Graham S.M., Molyneux E.M. and Molyneux M.E.

2000. Bacteremia in febrile Malawian children: clinical and microbiologic features. The Pediatric Infectious Disease Journal, 19;312–318.

Weening, E.H., Barker, J.D., Laarakker, M.C., Humphries, A.D., Tsolis, R.M. and

Baumler, A.J. 2005. The Salmonella enterica serotype Typhimurium lpf, bcf, stb, stc, std, and sth fimbrial operons are required for intestinal persistence in mice. Infection and Immunity, 73;3358–3366.

Wei, B.L., Brun-Zinkernagel, A.M., Simecka, J.W., Prüß, B.M., Babitzke, P. and

Romeo T. 2001. Positive regulation of motility and flhDC expression by the RNA-binding protein CsrA of Escherichia coli. Molecular Microbiology, 40;245–256.

White, A.P., Gibson, D.L., Kim, W., Kay, W.W. and Surette, M.G. 2006. Thin

aggregative fimbriae and cellulose enhance long-term survival and persistence of Salmonella. Journal of Bacteriology, 188; 3219–3227.

WHO Fact Sheet. 1997. World Healt Organization.

Wilson, G. 2004. Rapid and economical method for biochemical screening of stool isolates for Salmonella and Shigella species. Journal of Clinical Microbiology, 42;4821–4823.

Wilson, K. 2001. Preparation of genomic DNA from bacteria.Current Protocol of Molecular Biology, 2;2

Wilson, R.P., Raffatellu, M., Chessa, D., Winter, S.E., Tükel, Ç. and Baumler, A.J. 2008. The Vi capsule prevents toll-like receptor4 recognition of Salmonella. Cell. Microbiol., 10; 876-890.

Yoon, H., McDermott, J.E., Porwollik, S., McClelland, M., Heffron, F. 2009. Coordinated Regulation of Virulence during Sistemic Infection of Salmonella enterica serovar Typhimurium. Plos Pathogens. 5;1-15.

83

Zaim, J. and Kierzek, A.M. 2003. The structure of full-length LysR-type transcriptional regulators. Modeling of the full-length OxyR transcription factor dimer. Nucleic Acids Research, 31;1444–54.

Zambrano, M.M. and Kolter, R. 1996. Gasping for life in stationary phase. Cell,

86;181–184. Zhang, S. 2003. Molecular pathogenesis of Salmonella enterica serotype Typhimurium-

induced diarrhea. Infection and Immunity, 71;1–12. Zhou, D., Hardy, W.D. and Galan, J.E. 1999. Salmonella Typhimurium encodes a

putative iron transport system within the centisome 63 pathogenity island. Infections and Microbiology, 67;1974-1981.

84

EK Ters Yön PZR Veri Analizi Sonuçları

85

ÖZGEÇMİŞ

Adı Soyadı : Deniz YÜKSEL

Doğum Yeri : ANKARA

Doğum Tarihi : 26.11.1986

Medeni Hali : Bekar

Yabancı Dili : İngilizce

Eğitim Durumu

Lise : Dr. Rıdvan Ege-Dr. Binnaz Ege Anadolu Lisesi (2004)

Lisans : Ankara Üniversitesi Fen Fakültesi Biyoloji Bölümü (2008)

Yüksek Lisans : Ankara Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü, Biyoloji Anabilim

Dalı (Eylül 2008-Temmuz 2010)