ANEXO: PROYECTO: METABOLITOS DE INTERÉS BIOTECNOLÓGICO PRODUCIDOS POR LEVADURAS. 20060695 RESUMEN En este proyecto se abordaron aspectos referentes a la producción de amilasas, proteasas intracelulares y extracelulares y al citocromo P450 relacionado con la degradación de hidrocarburos en levaduras. En relación a las amilasas, se realizó una selección primaria para aislar y seleccionar levaduras, a partir de 292 aislados de diversas fuentes naturales, usando medios sólidos con almidón al 1%. De esta primera fase, sólo se aislaron 2, de las cuales una fue la que produjo los mayores niveles de amilasa extracelular en medio Castañeda- almidón. Con ésta se realizaron estudios cinéticos para ensayar diversos sustratos amiláceos, obteniéndose los mejores resultados con la harina de trigo. La caracterización realizada con el extracto crudo de la enzima, reveló que es una alfa amilasa, con un pH óptimo de actividad y estabilidad a 6.0, termoestable. Esta enzima está sujeta a represión por glucosa aún a concentraciones de 1%.. La identificación molecular de la levadura revela que pertenece al género Wickerhamia sp. Como parte de este trabajo, se trató de implementar un método de purificación más rápido y económico para la enzima, que pueda ser aplicable en el ámbito industrial, usando como principio la adsorción en almidón y posterior hidrólisis de éste por la enzima. Los resultados obtenidos muestran mayor eficiencia en la separación que el método convencional de purificación. Con respecto a las proteasas, se logró purificar la extracelular de Y. lipolytica, cuyas características bioquímicas la clasifican como una metalo-serín proteasa alcalina, termoestable, con una masa molecular de 36.500 Da. Por otra parte se realizó una búsqueda de secuencias de genes codificantes para DAPs, APEs y CPs intracelulares de hongos en la base de datos http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ . Las secuencias se sometieron a un análisis tipo BLAST contra el genoma completo de Y. lipolytica en la base de datos http://cbi.labri.fr/Genolevures/blast/index.php
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ANEXO:
PROYECTO: METABOLITOS DE INTERÉS BIOTECNOLÓGICO
PRODUCIDOS POR LEVADURAS. 20060695
RESUMEN
En este proyecto se abordaron aspectos referentes a la producción de amilasas,
proteasas intracelulares y extracelulares y al citocromo P450 relacionado con la
degradación de hidrocarburos en levaduras.
En relación a las amilasas, se realizó una selección primaria para aislar y
seleccionar levaduras, a partir de 292 aislados de diversas fuentes naturales, usando
medios sólidos con almidón al 1%. De esta primera fase, sólo se aislaron 2, de las cuales
una fue la que produjo los mayores niveles de amilasa extracelular en medio Castañeda-
almidón. Con ésta se realizaron estudios cinéticos para ensayar diversos sustratos
amiláceos, obteniéndose los mejores resultados con la harina de trigo. La
caracterización realizada con el extracto crudo de la enzima, reveló que es una alfa
amilasa, con un pH óptimo de actividad y estabilidad a 6.0, termoestable. Esta enzima
está sujeta a represión por glucosa aún a concentraciones de 1%.. La identificación
molecular de la levadura revela que pertenece al género Wickerhamia sp. Como parte
de este trabajo, se trató de implementar un método de purificación más rápido y
económico para la enzima, que pueda ser aplicable en el ámbito industrial, usando como
principio la adsorción en almidón y posterior hidrólisis de éste por la enzima. Los
resultados obtenidos muestran mayor eficiencia en la separación que el método
convencional de purificación.
Con respecto a las proteasas, se logró purificar la extracelular de Y. lipolytica,
cuyas características bioquímicas la clasifican como una metalo-serín proteasa alcalina,
termoestable, con una masa molecular de 36.500 Da.
Por otra parte se realizó una búsqueda de secuencias de genes codificantes para
DAPs, APEs y CPs intracelulares de hongos en la base de datos
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/. Las secuencias se sometieron a un análisis tipo BLAST
contra el genoma completo de Y. lipolytica en la base de datos
http://cbi.labri.fr/Genolevures/blast/index.php
A partir de la secuencia encontrada, se procedió a hacer el análisis de su región
promotora, con el fin de saber que sitios de unión a factores de transcripción pudieran
estar presentes afectando la expresión del gen de la yylDAP, se obtuvo la secuencia río
arriba del gen, correspondiente a la porción intergénica situada entre el final del gen
inmediato anterior al de nuestro interés y el inicio del gen a estudiar.
A partir del alineamiento de la secuencia codificante de la proteasa pumDAPi, se
diseñaron un par de oligonucleótidos para la amplificación de una región del gen para el
análisis RT-PCR.
El tamaño del amplificado esperado fue de aproximadamente 406 pb
Se tuvieron avances en el estudio del citocromo P450 en una levadura aislada
de un suelo contaminado con hidrocarburos. Su identificación molecular revela que es
Candida fermentati, la cual está muy relacionada con C. tropicales, que también
degrada hidrocarburos. Se realizaron cinéticas para medir la degradación de hexeno,
hexadecano y fenol con esta levadura. Se obtuvieron los RNAs totales con alta pureza,
para realizar la expresión del citocromo bajo estas condiciones.
También se obtuvieron las secuencias de los genes que codifican para la P450.
Todos estos resultados contribuyen al conocimiento básico y posible aplicación
de las levaduras para la producción de metabolitos que normalmente se obtienen de
bacterias.
INTRODUCCIÓN
Las levaduras tienen un papel fundamental en la biotecnología, ya que se utilizan en diferentes
áreas de la producción. A pesar de que los productos de mayor impacto económico han sido el
etanol (bebidas alcohólicas) y la levadura de panificación, hoy día se explora el potencial de
estos microorganismos para la obtención de otros metabolitos como pueden ser las vitamina,
carotenos, ácidos orgánicos, precursores de esteroides, biosurfactantes y diversas enzimas, así
como su inclusión en el área de la biorremadiación. Dentro del ámbito industrial, se debe tomar
en cuenta que el microorganismo no ofrezca riesgo alguno para su manejo, es decir, que sea
tipo "GRASS"; En las levaduras se conocen muchos géneros que cumplen con este requisito.
Las enzimas hidrolíticas son de los metabolitos con mayor demanda en el ámbito industrial,
dentro de este grupo las proteasas y amilasas representan el 60% y 20% en ventas a nivel
mundial. Nosotros hemos encontrado levaduras con buenos niveles de producción de amilasas
y proteasas intra y extracelulares. Las enzimas extracelulares son las más utilizadas en diversos
procesos debido a su fácil recuperación a partir de las células. Sin embargo, para las
intracelulares, en el caso de las proteasas, se sugieren usos importantes, ya que en este grupo se
encuentran la mayoría de las actividades específicas, que generan como productos de hidrólisis
péptidos con secuencias específicas de aminoácidos, que pueden tener apliaciones como
aditivos de alimentos, en la formulación de alimentos terapeúticos, y como iniciadores en el
desarrollo de algunos medicamentos. En 2 proyectos anteriores se ha estudiado el perfil
proteolítico de una levadura que produce buenos niveles de diferentes proteasas y que fue
identificada bioquimica y molecularmente como Yarrowia lipolytica. Se han purificado algunas
de sus proteasas intracelulares mayoritarias de tipo específico como la DAP (dipeptidil
aminopeptidasa) y la APE (aminopeptidasa; así mismo, se han caracterizado la CP
(carbixipeptidasa) y 2 actividades proteolíticas extracelulares inducibles por pH y sustrato. Con
respecto a esta levadura se puede mencionar que ha llamado mucho la atención en el ámbito
biotecnológico, ya que posee características fisiológicas inusuales, las cuales la hacen
considerablemente diferente de otras levaduras ascomicetales.
En el presente proyecto se planteó la búsqueda de las secuencias codificantes para las enzimas
intracelulares en el genoma de Y. lipolytica, así como el análisis "in silico" de las secuencias
obtenidas. También se realizó un análisis mediante RT-PCR de la expresión del gen DAP bajo
distintas condiciones de cultivo de la levadura. Dicho análisis fue propuesto con el fin de
conocer más acerca de los mecanismos proteolíticos en dicha levadura, el papel fisiológico de
estas enzimas, ya que muchas de ellas intervienen durante el proceso de expresión de proteínas
heterólogas; este punto es muy importante porque Y. lipolytica se está usando actualmente
como vehículo de expresión.
Por otra parte resultó interesante conocer como están regulados los genes que codifican para
estas proteasas y con ello poder producirlas de una manera más eficiente.
Con respecto a las amilasas se caracterizó una levadura que fue aislada a partir de una fuente
natural, que tiene buenos niveles de producción. Se relizarron estudios cinéticos para evaluar su
eficiencia, se identificó el tipo de amilasas que produce y se ensayó un método de purificación
para las mismas.
Otro aspecto considerado en este proyecto, fue hacer estudios en relación al citocromo P450
bajo condiciones de crecimiento con diferentes hidrocarburos en cepas que ya se han
identificado bioquímica y molecularmente y que crecen en ellos. La actividad de este citocromo
aparentemente tiene que ver con la eficiencia en la mineralización de dichos compuestos y esto
puede tener una aplicación en el terreno de la biorremediación. Se realizará para tal propósito el
análisis de los RNAs correspondientes bajo dichas condiciones, usando sondas específicas.
MATERIALES Y MÉTODOS
MICROORGANISMOS Para estudiar la producción de amilasas extracelulares se utilizaron 292 aislados de fuentes naturales.
Además se utilizó una cepa de Bacillus subtilis como referencia en algunos experimentos.
Para el análisis y expresión de los genes DAP, CP y APE se utilizó una cepa de Yarrowia lipolytica
aislada de ambientes naturales, previamente identificada tanto bioquímica como molecularmente.
Para el estudio del citocromo P450 se utilizó una levadura que utiliza varios hidrocarburos que fue
identificada como Candida fermentati.
MEDIOS DE CULTIVO Medios de cultivo para la conservación de los microorganismos y selección primaria. . Compuesto Concentración (g/L) (NH4)2C6H6O7 NaCl KH2PO4 MgSO4.7H2O Na2CO3 Extracto de levadura Almidón
0.625 0.250 0.375 0.125 0.375 1 20
En algunos experimentos el almidón fue sustituido por otros sustratos amiláceos. Cuando se prepararon medios sólidos se adicionó agar 23 g/L. MÉTODOS ANALÍTICOS Determinación de azúcares reductores por el método del 3,5-DNS. En un tubo se adicionó una mezcla de 0.5 mL del sobrenadante diluido 1:10 con 0.5 mL de sustrato
(almidón al 1% en regulador de fosfatos 0.2 M a pH 6) y se incubó a 37º C durante 30 min; la
reacción se detuvo con 1.5 mL de ácido 3,5-dinitrosalicílico (DNS) y posteriormente las muestras
fueron ebullidas en un baño de agua durante 10 min. Pasado este tiempo las muestras se dejaron
enfriar y se llevaron a un volumen de 4 mL con agua destilada. Con el problema se preparó un testigo,
al cual se le adicionaron las sustancias en el siguiente orden: 0.5 mL del sobrenadante previamente
inactivado por calor, 0.5 mL de sustrato (almidón al 1% en regulador de fosfatos 0.2 M a pH 6) que se
incubaron a 37° C durante 30 min., luego se añadió 1.5 mL de DNS, se ebulló durante 10 min., luego
de dejar enfriar se llevo a 4 mL con agua destilada. Las muestras fueron leídas a 535 nm en un
espectrofotómetro. La lectura obtenida se interpoló en una curva tipo de maltosa de 0 – 1000 μg. La
actividad se expresó en unidades de amilasa (UA/mL).
Una unidad de actividad de amilasa (UA) se define como la cantidad de enzima necesaria para liberar
1 micromol de grupos reductores
DETERMINACIÓN DEL CRECIMIENTO Se realizó por peso seco, lectura de densidad óptica a 600 nm y cuenta viable
DETERMINACIÓN DE SUSTRATO RESIDUAL (ALMIDÓN). Se diluyó el sobrenadante en un volumen de 10mL y se añadió 200 microlitros de la solución de yodo diluida 1:4 se agitó en le vortex hasta distinguir una coloración que fue del azul al amarillo. CARACTERIZACIÓN PARCIAL DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA A NIVEL DE EXTRACTO CRUDO Obtención de un extracto crudo de las enzimas La producción de enzima se realizó en medio de Castañeda-almidón 2%. Se preparó un matraz de 1L conteniendo 200mL de medio, este se inoculó con 3% de cultivo obtenido en las mismas condiciones y se incubó a 28°C durante 32h, tiempo de máxima producción de amilasas. Posteriormente se procedió a separar el caldo enzimático del paquete celular y sustrato remanente, centrifugando a 3,840 xg durante 10 min. El sobrenadante se conservó en congelación hasta su uso. Para la caracterización se tomaron en cuenta los siguientes aspectos: a) Vida de anaquel del extracto enzimático. b) Determinación del pH óptimo y estabilidad a diferentes pH’s. c) Determinación de la temperatura óptima y estabilidad de la enzima a diferentes temperaturas. d) efecto de diferentes iones sobre el actividad de la amilasa. e) efecto de un agente reductor sobre la actividad amilolitica. PURIFICACIÓN DE LAS AMILASAS
OBTENCIÓN DE LOS SOBRENADANTES
Se realizó la cinética de producción de las amilasas de ambas cepas hasta su tiempo de máxima
producción (32 horas en el caso de Wickerhamia sp y 36 horas para el B. amyloliquefaciens). Los
extractos crudos recuperados fueron centrifugados a 10000 rpm a 4º C, obteniendo el sobrenadante
(enzima) el cual fue conservado en congelación hasta su uso.
MÉTODO DE ADSORCIÓN CON ALMIDÓN
Se probaron concentraciones de almidón de 14, 28, 42, 56 %. Se colocaron 50 mL del extracto crudo
de la enzima con cada una de las concentraciones antes mencionadas durante 24 h en agitación a 4º C
para su adsorción. Pasado este tiempo, las muestras se centrifugaron a 13000 rpm a 4º C, recuperando
la enzima adsorbida al soporte (almidón) y la enzima que no fue adsorbida (sobrenadante) a los cuales
se les determinó la actividad enzimática por el método de Miller.
Se realizó colocando 200 mL de extracto crudo enzimático con la concentración óptima de almidón
(28%), durante 24 horas para su adsorción en agitación a una temperatura de 4º C. Posteriormente se
hizo una centrifugación a 13000 rpm a 4º C recuperando la enzima que no fue adsorbida al almidón
(sobrenadante) así como la enzima adsorbida al soporte y se midió la actividad amilolítica del
sobrenadante por el método de Miller. El almidón con la enzima adsorbida se puso a digerir con
regulador Tris-HCl 0.1 M a un pH de 7.5 en un baño de agua a 37º C durante 1 h, y se determinó la
actividad amilolítica del sobrenadante así como la cantidad de proteína por el método de Bradford. El
sobrenadante se recuperó por centrifugación y fue concentrado con sulfato de amonio al 80% durante
2 h a 4º C, cuidando que la adición del sulfato fuera lenta y en agitación constante. Luego la muestra se
centrifugó a 13000 rpm durante 1 h a 4º C. Con la enzima recuperada se procedió a dializarla en
membranas de diálisis primero con agua destilada y después con regulador de Tris –HCl 0.1 M pH
7.5 durante 24 h en agitación. Al final del proceso, se midió la actividad enzimática y la cantidad de
proteína recuperada después de la purificación.
MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS
Los principios de separación empleados fueron el de intercambio iónico y el de tamiz molecular.
CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO
La matriz empleada fue DAEA Sephadex A-25-120 en una columna de vidrio de 80 cm de longitud
por 2.5 cm de diámetro. Previamente, el gel se hidrató con regulador de Tris –HCl 0.01 M pH 7, y se
desgasificó. La columna se empacó con la matriz y se equilibró con 100 mL de regulador Tris-HCl
0.01M pH 7. Se colocaron 6 mL de la muestra (extracto crudo enzimático) que se mantenía en
congelación e inmediatamente se adicionaron 100 mL de regulador Tris- HCl 0.01M pH 7.
Para la elución de las proteínas retenidas en la columna se aplicó un gradiente de cloruro de sodio 0.1-
0.5 M empleando 100 mL de cada una de las concentraciones. Se recuperaron 200 fracciones, cada
una de aproximadamente 3 mL que posteriormente fueron leídas a 280 nm y se les determinó la
actividad amilolítica. Con los resultados se construyó un perfil de elusión.
CROMATOGRAFÍA DE TAMIZ MOLECULAR
Se utilizaron las fracciones eluídas con mayor actividad amilolítica provenientes de la columna de
intercambio iónico.
Éstas se pasaron a través de una columna de 80 cm de longitud por 2.5 cm de diámetro empacada con
Sephadex G75-120 y equilibrada con 100 ml de Tris-HCl 0.01M pH 7. Se recolectaron 40 fracciones
de 3 mL cada una, con un flujo constante de 1 mL por minuto, las fracciones fueron leídas a 280 nm y
se les determinó la actividad amilolítica.
COMPROBACIÓN DE LA PUREZA
Después de obtener los perfiles de elución que resultaron de las diferentes separaciones
cromatográficas, se tomaron las fracciones correspondientes a los picos de proteína con actividad de
amilasa y se concentraron en centricones con un límite de exclusión de 10000 Daltones.
A partir de las muestras concentradas se tomaron aproximadamente 40 μL de proteína para hacer
electroforesis en gel de poliacrilamida en condiciones despolimerizantes.
Para la purificación de la proteasa extracelular se utilizaron columnas de intercambio iónico y tamiz
molecular
ELECTROFORESIS EN GELES DE POLIACRILAMIDA SDS-PAGE
Se realizó empleando el método descrito por Laemmli (1973) con las muestras concentradas y
preparadas con solución 2X para la muestra (Tris-HCl 0.5M pH 6.8, SDS 2%, 2-mercaptoetanol 5%,
glicerol 10% y azul de bromofenol 0.002%) y sometidas a ebullición 2 min.
Para el corrimiento se prepararon geles de poliacrilamida, cuya concentración de arcrilamida en el gel
concentrador y separador fueron del 4 y 10% respectivamente a partir de una solución de monómeros
al 30.8%, TEMED 0.5 M pH 6.8, SDS al 10%, persulfato de amonio 10%. En el caso del gel
empacador se utilizó Tris-HCl 0.5 M a un pH de 6.8 y en el gel espaciador se utilizó Tris-HCl 1.5 M a
un pH de 8.8. El regulador de corrimiento fue Tris (1.5%), glicina (7.2%) y SDS (0.5%) a un pH final
de 8.3.
El corrimiento se realizó en una cámara de electroforesis Mini-PROTEIN II de Bio.Rad. Se aplicó una
corriente de 90 V, 12 mA durante 1.5 horas. Posteriormente la visualización de las bandas de proteínas
se realizó por la tinción con nitrato de plata.
ELECTROFORESIS EN GEL DE POLIACRILAMIDA EN CONDICIONES NATIVAS
A partir de la muestra concentrada, se tomaron 40 μL para hacer la electroforesis. Se utilizaron geles
de poliacrilamida al 10 % en condiciones no desnaturalizantes, (sin SDS) usando como regulador de
corrimiento Tris-glicina (3.0 g de Trizma-base, 14.4 g de glicina por litro de agua). El corrimiento se
realizó a 90 V, 12 mA durante 1.5 h., y una vez terminada la separación los geles se introdujeron en
una solución de almidón al 2% durante 1 hora a 4º C, con el objeto de que el gel se impregnara con el
almidón (sustrato); el exceso de almidón se eliminó con agua desionizada. Posteriormente el gel fue
sumergido en regulador de fosfatos 0.2 M a pH de 6 y se incubó a 37º C durante 30 minutos, para
que la amilasa hidrolizara al almidón. La visualización de la enzima se realizó revelando el gel con
una solución de lugol diluido 1:10. Se realizó un testigo en el cual se colocó una parte del gel en
regulador de fosfatos 0.2M pH 6 durante 30 minutos a temperatura ambiente que posteriormente fue
revelado con solución de lugol diluido 1:10.
TÉCNICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR 1. Análisis BLAST del genoma de Yarrowia lipolytica, empleando las secuencias reportadas de
otras proteasas en levaduras.
Con el fin de amplificar un fragmento del gen que codifica para la dipeptidil aminopeptidasa
yylDAP se realizó una búsqueda de secuencias de genes que codifiquen para DAPs intracelulares de
hongos en la base de datos http://www.ncbi.nlm.nih.gov/. Las secuencias se sometieron a un análisis
tipo BLAST con el genoma completo de Y. lipolytica en la base de datos
http://cbi.labri.fr/Genolevures/blast/index.php .
Para los genes codificantes de las yylAPE y yylCP también se realizó la búsqueda de los ORF’s
codificantes en la misma dirección electrónica.
Posteriormente, se sometieron a otro análisis tipo BLAST tanto para secuencias nucleotídicas como
aminoacídicas en la base de datos del GenBank http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ para confirmar
la función atribuida a dichos genes.
2. Análisis bioinformático de la secuencia promotora.
a) Análisis de la secuencia promotoras de los genes que codifican para una dipeptidil aminopeptidasa
(paquete bioinformático MatInspector)
3. Diseño de iniciadores para la amplificación del (los) gen(es) que codifica(n) para la proteasa
yylDAP
A partir del alineamiento de la secuencia codificante de la proteasa yylDAP, se diseñaron un par de
oligonucleótidos para la amplificación de una región del gen para el análisis RT-PCR.
4. Amplificación de una región del gen que codifica para la dipeptidil aminopeptidasa yylDAP.
Extracción de DNA genómico de Y. lipolytica.
La extracción del DNA genómico de Y. lipolytica se realizó por el método descrito por Hoffman y
Winston en 1987. La concentración del DNA se determinó espectrofotométricamente.
* Amplificación
Se realizóla amplificación de un fragmento del o los genes para yylDAP mediante la técnica de PCR
utilizando los iniciadores diseñados.
A continuación se muestran las condiciones que se utilizarán para la amplificación de los genes que
codifican para una aminopeptidasa yylDAP de Y. lipolytica .
Mezcla de reacción MgCl2 50 mM 1.0 µl Regulador de PCR 10X 2.5 µl Mezcla de dNTP´s 10 mM 0.5 µl Iniciador-D 10 mM 1.0 µl Iniciador-R 10 mM 1.0 µl DNA 10 ng/µl 1.0 µl Agua 18.0 µl El volumen final de la reacción será de 25 µl. Amplificación de genes CYP52
A partir de DNA genómico de las diferentes levaduras se procedió a realizar una PCR para la
amplificación de un fragmento de una 1 Kb de los genes CYP52 con las siguientes condiciones:
Iniciador derecho CYP52s: CYA TGT TGA GAC CAC ART TTG C
YALI0A18810g Saccharomyces cerevisiae YMR297w PRC1 carboxi peptidasa Y, serín-proteasa
55.2 4.6 493 1479 +
YALI0B20812g Saccharomyces cerevisiae YMR297w PRC1 carboxi peptidasa Y, serín-proteasa P3.65.f3.1
54.8 6.2 488 1464 -
YALI0C21604g Saccharomyces cerevisiae YMR297w PRC1 carboxi peptidasa Y, serín-proteasa P3.65.f3.1
65.6 4.9 589 1767 -
YALI0C23661g Saccharomyces cerevisiae YMR297w PRC1 carboxi peptidasa Y, serín-proteasa
50.2 4.8 458 1347 +
YALI0D08052g Saccharomyces cerevisiae YMR297w PRC1 carboxi peptidasa Y, serín.proteasa
52.8 4.6 468 1404 -
YALI0D09042g Saccharomyces cerevisiae YMR297w PRC1 carboxi peptidasa Y
52 5.0 461 1383 -
YALI0F11803g Saccharomyces cerevisiae YMR297w PRC1 carboxi peptidasa Y, serín-prpteasa
50.6 5.6 457 1371 +
Tabla 3. Proteínas de unión a probables sitios de transcripción en la región promotora del gen putativo de la dipeptidil aminopeptidasa de Yarrowia lipolytica
PROTEÍNA DE UNIÓN SECUENCIA QUE RECONOCE CARACTERISTICAS
MATA1 tGATGtact Mating factor 1
GCN4 cagTGACtgtttt Respuesta a inanición de aa
CUSE actattgtGCTGacc Respuesta a señales de cobre
HSF nTTCCaggann Respuesta a condiciones de estrés térmico