ANEXO I: PROTOCOLO EXTRACCIÓN ÁCIDOS NUCLEICOS · 2016. 1. 18. · ANEXO I: PROTOCOLO EXTRACCIÓN ÁCIDOS NUCLEICOS A cada muestra tras la homogenización se le añadieron 500µl

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ANEXO I: PROTOCOLO EXTRACCIÓN ÁCIDOS NUCLEICOS

A cada muestra tras la homogenización se le añadieron 500µl de Trizol en una

campana de extracción de gases. Para que las muestras se disolvieran bien nos

ayudamos de un vortex, finalmente se incubaron en un bloque seco a 60°C durante

15min para completar la disolución de los ácidos nucleicos.

-Separación de fases

A continuación, también en la campana de

extracción de gases, se añadieron a cada

muestra 100µl de cloroformo y se mezclaron

hasta conseguir una solución homogénea. Tras

incubar las muestras 3min a temperatura

ambiente se centrifugaron durante 15min a 4°C

y 12.000rpm para conseguir la separación de

fases. La fase acuosa superior que contiene los

ácidos nucleícos (Figura 7) se transfirió a

nuevos tubos Eppendorf.

-Precipitación de los ácidos nucleícos

A los muestras se les añadieron 250µl de propanol y se mezclaron por inversión, tras

lo cual se incubaron 8min en hielo antes de centrifugarlas durante 10min a 4°C y

12.000rpm para conseguir la precipitación de los ácidos nucleicos.

-Lavado

Se retiró el sobrenadante y se añadieron 500µl de etanol al 75% en agua DEPC. Se

lavó el precipitado mezclando con el vortex. A continuación se volvieron a centrifugar

durante 6min a 4°C y 7.500rpm. Se retiró el sobrena dante y se dejaron secar las

muestras a temperatura ambiente durante 5min para eliminar los restos de etanol.

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-Redisolución

Finalmente cada muestra se redisolvió en 100µl de agua DEPC, y se incubaron

durante 10min a 60°C en un bloque seco, para la com pleta disolución.

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ANEXO II: PROTOCOLO LIMPIEZA DEL RNA

-Unión del RNA a la membrana de sílice

A cada dilución de RNA se le añadieron 350µl de buffer

RLT y 250µl de etanol absoluto obteniendo un volumen final

de 700µl. A continuación se traspasó este volumen a las

columnas proporcionadas en el kit que contienen una

membrana de sílice que retiene el RNA. Las columnas se

introdujeron en un tubo colector de 2ml y se centrifugaron a

10.000rpm durante 15s.

-Limpieza

Cada columna se traspasó a un nuevo tubo colector, se le

añadieron 500µl de buffer RPE y se centrifugó a 10.000rpm

durante 15s. Tras esto se le añadieron a cada columna 500µl

de etanol al 80% en H2O DEPC y se centrifugó a 10.000rpm

durante 2min.

A continuación se transfirió de nuevo el tubo colector y se

centrifugaron a 13.000rpm durante 5min para eliminar el

etanol residual.

-Elución

Para la redisolución del RNA ya limpio, cada columna se

transfirió a un tubo Eppendorf de 1,5ml y se le añadieron 10µl

de agua libre de RNAsas. Las muestras se centrifugaron a

13.000rpm durante 1min de modo que los 10µl con el RNA

disuelto son recogidos en el tubo Eppendorf. Este paso se

repitió obteniendo de este modo 20µl de volumen final.�

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ANEXO III: PROTOCOLO SÍNTESIS DEL cDNA

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H2O DEPC 16,7µl x Nº de reacciones = µl H2O DEPC

Buffer RT 10µl x Nº de reacciones = µl buffer RT

dNTPs (20mM) 1,8µl x Nº de reacciones = µl dNTPs

Inhibidor de RNAsa 0,5µl x Nº de reacciones = µl inhibidor de

RNAsa

RT (transcriptasa reversa) (200u/µl) 1 µl x Nº de reacciones = µl RT

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ANEXO IV: PROTOCOLO DE PCR SEMICUANTITATIVA

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Las reacciones de amplificación se realizaron en una cabina de flujo vertical utilizando

material estéril para evitar contaminaciones.

Para realizar cada amplificación se utilizaron 2µl de muestra más 18µl de mix de

reacción para un volumen final de 20µl. Se utilizó el kit DNA polimerasa de Biotools

compuesto por:

• Buffer Taq (10x)

• MgCl2 50mM

• Taq polimerasa (5u/µl)

Las mezclas de reacción se realizaron siguiendo el siguiente esquema:

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H2O DEPC 13,66µl x Nº de reacciones = µl H2O DEPC

Buffer 2µl x Nº de reacciones = µl buffer

MgCl2 (50mM) 0,34µl x Nº de reacciones = µl MgCl2

dNTPs (20mM) 0,2µl x Nº de reacciones = µl dNTPs

De cada Cebador 0,8µl x Nº de reacciones = µl cada Cebador

TAQ (5u/µl) 0,2µl x Nº de reacciones = µl TAQ

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Para cada muestra, los 18µl de mix se mezclaron con 2µl de cDNA depositados

previamente en uno de los tubos de una tira de 8 tubos de 0,2ml. A continuación se

agregó una gota de aceite (Mineral Oil de Sigma).

Una vez preparadas las reacciones se realizó la amplificación en un termociclador

siguiendo el siguiente programa:

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Fase 1 1 ciclo 94ºC 2 min

94ºC 1 min

Fase 2 33 ciclos xºC 1 min

72ºC 1 min

Fase 3 1 ciclo 72ºC 10 min

Fase 4 1 ciclo 4ºC ------

- Fase 1: Desnaturalización del DNA a 94ºC durante 2 min para la separación de las

hebras de DNA.

- Fase 2: La reacción en cadena de la DNA-Polimerasa se realiza en tres etapas que

constituyen un ciclo de amplificación que se repite 33 veces consecutivas. El ciclo consta:

• Desnaturalización del DNA a 94ºC durante 1min.

• Hibridación de las hebras simples de DNA de interés, con los cebadores durante

1min, a una temperatura que va a depender de la composición de bases, tamaño

de los cebadores.

• Etapa de elongación a 72ºC durante 1min, donde la DNA polimerasa sintetiza las

nuevas cadenas empleando como sustrato los dNTPs.

- Fase 3: Elongación de las hebras sintetizadas a 72ºC durante 10min.

- Fase 4: Mantenimiento de las muestras a 4ºC.

La visualización de los resultados se realizó mediante electroforesis en gel de agarosa

al 1,5% en tampón TBE 0,5x. Para la tinción de DNA se añadió el producto SYBR® DNA

gel stain al 0,1% (Invitrogen). La mezcla de las muestras (17µl) y el tampón de muestra

(3µl SB, glycerol (50%), bromophenol blue (0,25%) y Xylene cyanol (0,25%)) se realizó en

un papel Parafilm. Como marcador de peso molecular se utilizó el “100pb DNA Ladder”

de Invitrogen. Las condiciones de la electroforesis fueron 80V durante 1h y 40min. Para la

visualización del producto de amplificación se utilizó el GELDOC de BioRad y el

programa Quantity One 4.6.7.�

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ANEXO V: CEBADORES

-Colección Ax-Alb

Primers Código Secuencias Temperatura

AX-1-2 HV_CEb0002J23r2_s_at AACCCTTAAACTCCGGCAACGA

ACGAGGCCAAATCCTGCTGTT 58,7-59,2

AX-3-4 Contig2742_at ACCCTCGTCCTCAAATGCAA

ACCGCAACATGGAAACACCA 56,5-57,5

AX-5-6 Contig7944_at AAGGACATCTTCACGGCGAT

AAGAAGAAGGTGAGCGCGTA 56,2-56

AX-7-8 Contig12692_s_at ACATGGTGATGGACTACTGCGA

TACTACCATTGCTACGCCTACACG 57,8-58

AX-9-10 Contig10615_at CGCCATCCTCTTCGAGCACATA

TTCATCTCACTGTCGTGGCTTGT 58,8-58,3

AX-11-12 Contig9813_at TTCGGCAACGGCTTCTTCCA

AGTAACAACGCCACCGCAACTA 59,5-58,8

AX-13-14 Contig1800_at ACTTGACCCACAAGCTGAAGCA

TTGCCACGAGAAACGTCGATGA 59,0-58,7

AX-15-16 Contig4811_s_at TCAAGGAGGTTGGCGACATT

GTTGAACATTTCGGCGGTGA 55,9-56,5

AX-17-18 Contig2721_at ACAAGCTGAGCAAGCTGGAAGA

ACGACATGACACGGAAGCAGAA 58,8-58,6

AX-19-20 Contig418_at AAGACTGCGGCAAAGGCAAA

CCTCACCAAACTTGACGCCATT 57,8-58,0

AX-21-22 Contig5059_s_at ACAAGCTGGAGCCAATCGAGAA

TGGTTCACCGCCCATTTGATGT 58,6-59,4

AX-23-24 Contig14378_at TGTGGGAAAGGATGGACGAGTT

ACGTTGCTGTGCCTGTTGTT 57,8-58,1

AX-25-26 HV09F14u_at CCTGTGATACTTTCATGCCATCCG

CAACAAATCGGCTCAGTTGGGT 57,6-57,8

AX-27-28 Contig3221_at ACCTCGCCAAGCAGAAGAAA

TGTTTGCGTGCTGGATGTGA 57,4-56,7

AX-29-30 Contig828_s_at TCAAAGCATCCTCGCCATCT

TTGTTGACAGGGTCGGCAAT 57,0-56,3

AX-31-32 Contig19438_at AGCTCATCCGTCTGTGACAAGT

ACCAGGCGTACACGTTGAAG 58,0-57,3

AX-33-34 Contig13481_at CATTGCCACGCTGATGATGTTC

TCAATGGTGTAATGCCCTCTGC 56,7-57,3

AX-35-36 Contig2992_s_at ACGGCCATTTGGTTCTGGAT

AAGTTTCGCTGGGTGTAGCA 56,9-56,6

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AX-37-38 Contig9152_at GTCCAGGATGCCACGGACAA

GCAGGTTCAATGTTCAGACGGCAA 59,6-59,9

AX-39-40 Contig12724_at ATGTCCATTGCCTCGTTCCT

TGAACCTGACGAGTGGCTTA 55,5-56,3

-Colección QTL-Alb

Primers Código Secuencias Temperatura

QTL-1-2 Contig4499_s_at TCCAACCTCGGCAATCATGT

TGTGCATTAGGCTCCACCTT 56,6-56,3

QTL-3-4 Contig2515_at ACATTGCATCTGCGTCCAAGTG

ATTCATCCCTTCATCTCCGCCT 58-57,9

QTL-5-6 Contig7192_at TTGCACTCTGTAGCGGCAGTTT

ACTTTGGCGGCAGAATCCAGAA 59,1-59,1

QTL-7-8 Contig7090_s_at TTGGAAATGCCGCCAAGGTTGT

TGTTGCATTCAGCGCGTCTTCA 60,1-59,7

QTL-9-10 Contig2278_at TTAAGGGCATGGAGAAGGGCAT

TTGATGATCGCGGTGCTACACA 58,4-58,6

QTL-11-12 Contig6276_s_at AAAGCGACTGCCTCGTGAAA

AACTCCAGGGCTTGTTGCAT 57,0-51,1

QTL-13-14 Contig12110_s_at TGGGCATGTCTATGCGTGTT

ACCCGAAGCAGCAATTCACT 56,8-57,0

QTL-15-16 Contig4021_at TGTCTGCGACCAATGCTATCCA

TTCCTTTCGGTTACTGGGCCTT 58,3-58,4

QTL-17-18 Contig9559_at ATTAGCTGAGCGGTTGGGTT

AGCAGTTGCCTTGCTGAAGA 56,6-57,0

QTL-19-20 Contig4586_at ATGCTGGGCACTACATTCCT

AGGCAGCAAGGCAAGATACA 56,2-56,6

QTL-21-22 Contig4470_s_at TTAGGATTCGGGAGCTGGGTTT

AAACTGATGCCAACGCCCAT 58 -57,7

QTL-23-24 Contig6695_at TTCTCCAGGTGCCAACAACA

TCCTTCCATGCGTTCCTTCT 56,0-56,7

QTL-25-26 Contig11071_at ACGATGTCCAAGTCGTGCAA

GTGACAATTCGGCTGCAAGT 56,8-55,9

QTL-27-28 Contig8361_at TGGCAAAGGCAGTTGGCTACA

AGGCTGGCAGTTGCTTCACTT 59,5-59,5

QTL-29-30 SNP 6170-304 TTTGTTTGAGCGGGAGGCAT

ACGCCGTTGAACTTGACCTT 57,1-57,3

QTL-31-32 Contig6598_at TGATCTCACGGGCTTCATCA

TGTCGTAGTTGCCAAACCCA 56,6-55,7

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QTL-33-34 Contig9219_at ACGGCAGGCTTTGATTTGACGA

TCGTCTGTTTCCGCTAACTGGACT 59.4-59,6

-Colección Cl:

Primers Código Secuencias Temperatura

CL-1-2 Contig11738_at GATCACGGCGAGACAGATAGAA

TTTACTGGCCGCTATGGAGA 55,9-55,5

CL-3-4 Contig1314_s_at AAGTCCGACATCGTCATCGAG

ACACCTCAGCCATCAGGATT 56,3-55,9

CL-5-6 Contig13277_at ACGGTTGAAGCATCTGCGTGAT

AGTGGTGGCATCGTCTCTTTGA 59,2-58,2

CL-7-8 Contig14691_at TTGACACGGAGACGAGCAAT

ATCATCTTCGGCATCGTCCT 56,3-55,8

CL9-10 Contig14780_at TCGTGCAGACCAATCACCAA

TTAGGGTCGAACAGCGACTT 56,6-55,8

CL-11-12 Contig16148_at ACACACATACTGCCCACTCA

TTGGCATCAGGAGGAAGCAA 55,9-56,6

CL-13-14 Contig16389_at ACAGAAGAGCTGATGGCTGT

TTCATTGAGCTTGTCGCCCT 56,0-56,7

CL-15-16 Contig16595_at AGCTCGATGAAACCACGCTAGT

TCGGAGTTCAGGTTCTCTTGGA 58,2-57,3

CL-17-18 Contig17155_at TCACCGGCAACACAGTTGAGAA

TTGCCCAGGATCAGTTTCGGTT 58,8-58,9

Cl-19-20 Contig17319_at AAACATGATGCGGGCAGACGAT

AACGCAACCCAAGGCTGCTAAT 59,3-59,6

CL-21-22 Contig19088_at ATCCGCAAGACCAGCTACAAGA

AGCCGCTACTCAACAATCTCCA 58,1-58,1

CL-23-24 Contig2243_s_at ATCGGCAGCCATGAAGAGCA

TGAAGCCCTGAAGCGATCAGT 59,2-58,4

CL-25-26 Contig23344_at TGCAGCCAAACAAATCGGGAAC

AGCACACGGTGACTAGACTGAA 58,5-57,6

CL-27-28 Contig23926_at TTCTGAGGACGAGGGATGCAAT

TCTGTGTCAAATCCTCCGGCAA 57,9-58,5

CL-29-30 Contig24791_at AACGGAGAAATCGTCCAGCGATCA

TACAATGCAGCAAAGACGCCGA 60,1-59,3

CL-31-32 Contig24914_at CCCACCACAGAAGCAGATGAAT

AAGACCTCGACTGGTTTGGGTA 57,1-57,6

CL-33-34 Contig25153_at AGATCAAGCAGATCCGTGGTGA

AACGATGACGAACAGCGCAT 57,9-57,3

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CL-35-36 Contig26034_at GCAGTCGAACCTGAGACCATAA

ACAAGGGCATGTCGCAAAGA 56,4-57,2

CL-37-38 Contig4380_s_at TCCATGATGTGCTCCTACTCCT

GCTGCTTCTTGGTCTTGTGGTT 57,0-57,8

CL-39-40 Contig5004_at ATACGAGTCACTGTCCCACCAT

AACCTTGCTCAGCTCCTGTT 57,4-56,5

CL-41-42 Contig5708_at GCCTCCAAGGAAGGATCAGTTT

AGCCAACATAGGTGCCAGTT 56,8-56,6

CL-43-44 Contig6640_at AAACCGCCATTGAGGACAGTGA

TCTTCTAGCCGGTCCCTTTATGGT 58,8-59,1

CL-45-46 Contig6817_at TCAGCCATGTTTCTCGTGCCAA

TCATGTGCCGGTCAGACGTT 59,2-58,9

CL-47-48 Contig7509_at TGCCTTCAGCACAACCACTT

TGTTGTTTCGGTCTCCTGCT 57,2-56,3

CL-49-50 Contig8790_at AGATGGCTGACCCAATGCTT

AATGATGGTTTGGCGAGCGT 56,7-57,5

CL-51-52 Contig9121_at TATGCGTGAAAGCGGCCATT

TGCAGCCTTTGCCTTTGGTT 57,6-58,1

CL-53-54 Contig938_s_at TGGATCATCTCCGGCTTCTGCTAT

TTCGAGGCAGATTGGGCAAACA 59,4-59,3

CL-55-56 Contig9412_s_at ACCTGGGAATTGGGAAGATGGT

ACTGCCGTGTTCTTCAGCGA 58,2-59,1

CL-57-58 HVSMEb0007O01f_at TAAATTCCGTGGGTGGCGTA

AGGAATGAATGGCTCGGCTA 56,2-55,9

CL-59-60 HVSMEm0013I03r2_at TCCTCGTTCCTGAGCTTCGACAT

AACGCCAAGTTTGTGGACGTGA 59,7-59,4

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ANEXO VI: HOMOLOGÍAS Y ACRÓNIMOS

-Colección Ax-Alb

Acrónimo Primer Código Gen

PCL AX-1-2 HV_CEb0002J23r2_s_at Blue copper binding protein

TOM20 AX-3-4 Contig2742_at

Mitochondrial import receptor subunit

TOM20

PHT6 AX-5-6 Contig7944_at Phosphate transporter 6

GH16 AX-7-8 Contig12692_s_at

Xyloglucan

endotransglucosylase/hydrolase

Hv-ALB6 AX-9-10 Contig10615_at Predicted protein

EXO AX-11-12 Contig9813_at Phosphate-induced protein 1

PAL AX-13-14 Contig1800_at Phenylalanine ammonia-lyase

DYR AX-15-16 Contig4811_s_at Dehydration response related protein

PPIA AX-17-18 Contig2721_at Peptidyl-prolyl isomerase

WCAB-1 AX-19-20 Contig418_at Chlorophyll A-B binding protein

RNS AX-21-22 Contig5059_s_at Ribonuclease T2

RCC AX-23-24 Contig14378_at

Regulator of chromosome

condensation

JRL AX-25-26 HV09F14u_at

Jacalin-like lectin domain containing

protein

PSAN AX-27-28 Contig3221_at

Photosystem I reaction center subunit

N

WCAB-2 AX-29-30 Contig828_s_at Clorophyll A-B binding protein

FRO AX-31-32 Contig19438_at Ferric-Chelate reductase

Hv-ALB7 AX-33-34 Contig13481_at Phosphatidic acid phosphatase-related

CHIT AX-35-36 Contig2992_s_at Chitinase II

COR14b AX-37-38 Contig9152_at Cor14b protein

FLS AX-39-40 Contig12724_at

Flavonol synthase/flavanone 3-

hydroxylase

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-Colección QTL-Alb:

Acrónimo Primer Código Gen

TPR QTL-1-2 Contig4499_s_at Ubiquitin- ubiquitin ligase activity

HPR QTL-3-4 Contig2515_at

Erythronate-4-phosphate

dehydrogenase domain containing

protein, expressed

UPL QTL-5-6 Contig7192_at

Subfamily HECT-domain domain

containing protein

CPN60 QTL-7-8 Contig7090_s_at

RuBisCO large subunit-binding protein

subunit beta

FNR QTL-9-10 Contig2278_at Ferredoxin-NADP+ reductase

ABA7 QTL-11-12 Contig6276_s_at ABA-induced protein

ZOS3-23 QTL-13-14 Contig12110_s_at Zinc ion binding

ZIM QTL-15-16 Contig4021_at Zinc-finger protein

CAX QTL-17-18 Contig9559_at Sodium/calcium exchanger protein

SCP39 QTL-19-20 Contig4586_at Carboxypeptidase

INV QTL-21-22 Contig4470_s_at Beta-fructofuranosidase invertasa

MBL QTL-23-24 Contig6695_at Metallo-beta- lactamase

Hv-ALB5 QTL-25-26 Contig11071_at Expressed Protein

DDX QTL-27-28 Contig8361_at ATP-dependent RNA helicase activity

BAG QTL-29-30 SNP 6170-304 BAG domain-containing protein

NC QTL-31-32 Contig6598_at NC domain-containing protein

SCP46 QTL-33-34 Contig9219_at Serine carboxypeptidase 1 precursor

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-Colección Cl:

Acrónimo Primer Código Gen

RPS8 CL-1-2 Contig11738_at 50S ribosomal protein L16

Fd CL-3-4 Contig1314_s_at Ferrous iron binding (ferredoxina)

PTAC6 CL-5-6 Contig13277_at Plastid transcriptionally active 6

CRS1 CL-7-8 Contig14691_at

Chloroplastic group IIA intron splicing

facilitator CRS1

Hv-ALB2 CL9-10 Contig14780_at Photosystem II 11 kDa protein-related

ARC5 CL-11-12 Contig16148_at Dynamin family protein ARC5

SBE CL-13-14 Contig16389_at Starch Branching Enzyme

TAB CL-15-16 Contig16595_at psaB translation factor

EF-P CL-17-18 Contig17155_at Elongation factor P

CAF2 Cl-19-20 Contig17319_at

CRS2-associated factor 1, chloroplast

precursor

Hv-ALB3 CL-21-22 Contig19088_at

UDP-N- acetylglucosamine

diphosphorylase activity

BBI CL-23-24 Contig2243_s_at

BBTI11 - Bowman-Birk type bran

trypsin inhibitor precursor

PDE324 CL-25-26 Contig23344_at Plastid transcriptionally active 3

CHUP CL-27-28 Contig23926_at Motor activity, ATPase activity

DAL CL-29-30 Contig24791_at Differentiation and greening-like 1

NOS1 CL-31-32 Contig24914_at Nitric oxide synthase 1

RF CL-33-34 Contig25153_at Translation release factor

SRS CL-35-36

Contig26034_at Serine-tRNA ligase activity, ATP

binding

RPL28 CL-37-38 Contig4380_s_at Ribosomal protein L28 protein

RRF CL-39-40 Contig5004_at Ribosome recycling factor

PSRP4 CL-41-42 Contig5708_at 30S ribosomal protein S31

CRM CL-43-44 Contig6640_at

Chloroplastic group IIA intron splicing

facilitator CRS1

PSRP5 CL-45-46 Contig6817_at Plastid-specific 50S ribosomal protein 5

DAG CL-47-48 Contig7509_at DAG protein, chloroplast precursor

PK1B CL-49-50 Contig8790_at Protein kinase APK1B

PPT CL-51-52

Contig9121_at Pyrimidine nucleotide sugar

transmembrane transporter activity

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RHB1A CL-53-54 Contig938_s_at

RING, subfamily zinc finger (C3HC4-

type RING finger) family protein

RLUB CL-55-56 Contig9412_s_at Pseudouridine synthase family protein

PSBC CL-57-58 HVSMEb0007O01f_at

Photosystem II reaction center protein

C

SIG CL-59-60 HVSMEm0013I03r2_at RNA polymerase sigma factor

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ANEXO VII: RESULTADOS PCR SEMICUANTITATIVA

-Colección Ax-Alb

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-Colección QTL-Alb

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-Colección Cl:

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