Charakterisierung und Kristallisation des spleißosomalen DEAD-Box Proteins Prp28 Diplomarbeit vorgelegt von Andreas Schmitt aus Clausthal-Zellerfeld angefertigt im Institut für Mikrobiologie und Genetik, Abteilung Molekulare Strukturbiologie an der biologischen Fakultät der Georg-August-Universität Göttingen Göttingen, Februar 2009
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Andreas Schmitt - Georg-August-Universität Göttingen · Y = Pyrimidin; R = Purin. Das Adenin der Verzweigungsstelle ist rot markiert (nach Burge et al. 1998) Einleitung_____ 8 1.2
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Charakterisierung und Kristallisation des
spleißosomalen DEAD-Box Proteins Prp28
Diplomarbeit
vorgelegt von
Andreas Schmitt
aus
Clausthal-Zellerfeld
angefertigt
im Institut für Mikrobiologie und Genetik, Abteilung Molekulare Strukturbiologie
an der biologischen Fakultät der Georg-August-Universität Göttingen
Göttingen, Februar 2009
Referent: Prof. Dr. Ralf Ficner
Korreferent: Prof. Dr. Kai Tittmann
Tag der Abgabe der Diplomarbeit: 25.02.2009
Letzter Tag der mündlichen Prüfung: 09.05.2008
Inhaltsverzeichnis 3
1 EINLEITUNG 6
1.1 INTRONKLASSEN 6
1.2 DER MECHANISMUS DES SPLEIßENS 8
1.3 DAS SPLEIßOSOM 9
1.4 DER SPLEIßZYKLUS 9
1.5 DEXD/H-BOX HELIKASEN 10
1.5.1 FUNKTION DER DEXD/H-BOX HELIKASEN BEIM SPLEIßVORGANG 11
1.5.2 DREIDIMENSIONALE STRUKTUR VON DEXD/H-BOX RNA-HELIKASEN 13
1.5.3 FUNKTION VON DEXD/H-BOX HELIKASEN 14
1.5.4 DIE DEAD-BOX HELIKASE PRP28 15
1.6 AUFGABENSTELLUNG UND ZIELSETZUNG 17
2 MATERIAL UND METHODEN 18
2.1 MATERIAL 18
2.1.1 REAGENZIEN 18
2.1.2 GERÄTE 18
2.1.3 SONSTIGE MATERIALIEN 19
2.1.4 CHROMATOGRAPHIESÄULEN 19
2.1.5 VEKTOREN 20
2.1.6 ENZYME 20
2.1.7 RNA-OLIGONUKLEOTIDE 20
2.1.8 DNA-OLIGONUKLEOTIDE 20
2.1.9 KIT-SYSTEME 20
2.1.10 GRÖßENSTANDARDS 21
2.1.11 ORGANISMEN MIT RESISTENZEN 21
2.1.12 KRISTALLISATIONSSCREENS 21
2.1.13 ANTIBIOTIKA MIT ARBEITSKONZENTRATIONEN 21
2.1.14 COMPUTERPROGRAMME 21
2.2 METHODEN 22
2.2.1 MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN 22
2.2.1.1 Polymerase-Kettenreaktion 22
Inhaltsverzeichnis 4
2.2.1.2 DNA-Sequenzierung 23
2.2.2 MIKROBIOLOGISCHE METHODEN 24
2.2.2.1 Herstellung und Selektionsbedingungen von LB-Agarplatten und LB-
Der eigentliche Spleißvorgang besteht aus zwei aufeinander folgenden
Umesterungsschritten (Abb. 2). Im ersten Schritt erfolgt ein nukleophiler Angriff der 2´-
Hydroxylgruppe des branchpoint Adenins auf das Phosphat der 5´-Spleißstelle. Dadurch
entsteht an dieser ein freies 5´-Exon mit einer freien 3´-Hydroxylgruppe. Das Intron liegt
nach diesem ersten Schritt in einer lassoförmigen Struktur (engl. lariat) vor, die durch die
2´-5´-Phosphodiesterbindung zwischen dem branchpoint Adenin und dem Phosphat der 5´-
Spleißstelle gebildet wird. Im zweiten Reaktionsschritt kommt es nun zu einem
nukleophilen Angriff der freien 3´-Hydroxylgruppe des 5´-Exon auf das Phosphat der 3´-
Spleißstelle. Dabei werden die beiden Exons durch eine 3´-5´-Phosphodiesterbindung
miteinender verknüpft. Das Intron wird als Intron-Lariat freigesetzt (Grabowski et al.
1984; Ruskin et al. 1984).
In beiden Reaktionsschritten muss keine zusätzliche Energie aufgewandt werden, da es
sich lediglich um Umesterungsreaktionen handelt, und nicht um die Hydrolyse und
anschließende Neubildung von Phosphodiesterbindungen.
Abb. 2: Spleißreaktion. Die Spleißreaktion läuft in zwei Umesterungsschritten ab, durch welche die gespleißte mRNA und das Intron-Lariat entstehen (Newman 1998).
(Konarska et al. 1987; Cheng et al. 1987). Die dadurch erreichte aktive Konformation des
Spleißosoms wird C-Komplex genannt. Die U6 snRNA bildet nun Basenpaarungen sowohl
mit der 5´-Spleißstelle als auch mit der U2 snRNA aus. Infolgedessen werden die an der
ersten Umesterungsreaktion beteiligten Nukleotide der 5´-Spleißstelle sowie des
branchpoint in räumliche Nähe zueinender gebracht. Nach den beiden
Umesterungsschritten (1.2) zerfällt der Komplex aus snRNPs und mRNA, wobei das
Intron in Form des Lariat freigesetzt und später abgebaut wird (1.2). Die snRNPs werden
regeneriert und stehen dann für einen weiteren Spleißzyklus zur Verfügung.
Abb. 3: Der Spleißzyklus. Schematische Darstellung der Assemblierung des Spleißosoms an der prä-mRNA mit anschließender Freisetzung von mRNA und Intron-Lariat
Die prozessierte mRNA wird aus dem Zellkern ins Cytoplasma transportiert, wo sie durch
die Ribosomen in eine Aminosäuresequenz translatiert wird.
1.5 DExD/H-Box Helikasen
Wie bereits in 1.2 erwähnt, benötigt die eigentliche Spleißreaktion keine aus der Hydrolyse
von ATP gewonnene Energie. Es ist jedoch Energie in Form von ATP für die
Assemblierung, Umlagerung und den Zerfall des Spleißosoms nötig. DExD/H-Box RNA
Helikasen liefern die Energie für die notwendigen Umlagerungen durch die Hydrolyse von
Abb. 5: Modelle für die Funktion von Helikasen. Das active rolling Modell muss die Helikase als Dimer vorliegen, beim inchworm-Modell ist ein Monomer ausreichend (nach Tanner und Linder 2001)
Prozessive DExD/H-Box Helikasen wie z.B. das vom Hepatitis C Virus kodierte NS3
könnten nach diesem Modell funktionieren (Cheng et al. 2007; Dumont et al. 2006;
Büttner et al. 2007)
Bei Helikasen der DEAD-Box Familie wird davon ausgegangen, dass sie nach einem
anderen Prinzip funktionieren, da man bei ihnen eine RNA-Entwindung in beide
Richtungen festgestellt hat. Außerdem sind DEAD-Box-RNA Helikasen keine prozessiven
Helikasen, sondern sie entwinden nur kurze RNA-Duplexe (Cordin et al. 2006). Anhand
der dreidimensionalen Struktur der DEAD-Box Helikase Vasa wurde ein Modell für die
Funktion der DEAD-Box Helikasen erstellt. Dabei findet eine kooperative Bindung der
Helikasedomäne an ATP sowie den RNA-Strang statt. Die RNA wird dadurch derart
gebogen, dass die Interaktion mit einem anderen RNA-Strang destabilisiert wird. Durch
die anschließende Hydrolyse des gebundenen ATP verringert sich die Affinität zum
gebundenen RNA-Strang und die Helikase löst sich ab.
1.5.4 Die DEAD-Box Helikase Prp28
Prp28 ist ein essentielles DEAD-Box Protein aus der Hefe Saccharomyces cerevisiae,
welches an der Assemblierung des Spleißosoms beteiligt ist. Es besteht aus
588 Aminosäuren und hat ein Molekulargewicht von 66,6 kDa. Der isoelektrische Punkt pI
liegt bei 9,36. Die Analyse der Aminosäuresequenz von Prp28 ergab, dass sich die
Helikasedomäne am C-terminus befindet. Sie besteht aus zwei Subdomänen, der DEAD-
Box-Domäne sowie der HelicC-Domäne (helicase superfamily c-terminal domain) (Abb.
6). Im Unterschied zum humanen Prp28 Ortholog hPrp28 besitzt Prp28 aus S. cerevisiae
keine RS-Domäne am N-terminus. Diese Domäne verdankt ihren Namen dem hohen
Gehalt an Arginin (R) und Serin (S). In hPrp28 wird diese Domäne von der Protein-Kinase
SRPK2 phosphoryliert, wodurch es eine stabile Interaktion mit dem tri-snRNP eingeht. Da
Prp28 aus Hefe diese Domäne fehlt, wird es nicht phosphoryliert, was ein Grund dafür sein
könnte, dass es im Gegensatz zu seinem humanen Ortholog nicht mit dem tri-snRNP
assoziiert ist (Mathew et al. 2008).
Abb. 6: Domänenübersicht von Prp28. In Orange bzw. Rot: C- bzw. N-terminale Subdomäne der Helikasedomäne. Die Zahlen geben die Position in der Aminosäuresequenz an.
Identifiziert wurde Prp28 durch eine Mutation, bei der ein Glycin gegen Glutamat
ausgetauscht wurde, was zu einem kältesensitiven Phänotyp führte. Sequenzvergleiche mit
bekannten Proteinen zeigten eine große Sequenzübereinstimmung mit Proteinen aus der
Familie der ATP-abhängigen RNA-Helikasen (Strauss und Guthrie 1991). In Folge der
G297E Mutation kam es in vivo zu einer Agglomeration von spleißosomalen Komplexen,
bei denen die Entwindung der U4 und U6 snRNPs nicht stattgefunden hatte. Der
Spleißzyklus musste also durch den Ausfall von Prp28 in einem Schritt vor der U4/U6-
Entwindung unterbrochen worden sein. Eine Mutation der 5´-Spleißstelle, welche zu mehr
Basenpaarungen zwischen der U1 snRNA und der prä-mRNA führte, bewirkte ebenfalls
eine Anhäufung von spleißosomalen Komplexen, bei denen all fünf snRNPs enthalten
sind, und in denen U4 und U6 gepaart vorliegen. Durch Zugabe von Prp28 und ATP war
es in vitro möglich diese Komplexe wieder aufzulösen. Prp28 hat also die Funktion, die U1
snRNA von der 5´-Spleißstelle zu lösen und somit den Austausch gegen das U6 snRNP zu
ermöglichen (Staley und Guthrie 1999; de la Cruz et al. 1999). Bestätigt wird diese
Beobachtung durch die Tatsache, dass bei einer Schwächung der Interaktion zwischen 5´-
Spleißstelle und U1 snRNP durch Mutation der U1 snRNA Prp28 nicht mehr essentiell ist.
In vitro wir die Aktivität von Prp28 möglicherweise von Prp8 reguliert, wobei Prp8 die
Hat man verbesserte Bedingungen gefunden, werden die Kristalle im
Röntgenbeugungsexperiment getestet. Reichen die Verbesserungen nicht aus, um die
Kristallordnung zu erhöhen, wird auch auf diese neue Bedingung ein Fein-screening
durchgeführt.
Material und Methoden 43
2.2.4.3 Quervernetzung mit Glutaraldehyd Um während der Röntegbeugungsexperimente am Kristall auftretende Strahlenschäden
möglichts gering zu halten, wird der Kristall vor der Datensammlung in flüssigem
Stickstoff eingefroren, und während des gesamten Experimentes in einem Stickstoffstrom
mit einer Temperatur von ca. 100 K gehalten. Dabei treten am Kristall Belastungen auf,
welche die Kristallordnung zerstören und damit negativen Einfluss auf die
Beugungseigenschaften des Kristalls haben können. Um des Kristall zu stabilisieren, kann
die Methode der Quervernetzung angewandt werden.
Die Kristalle wurden dazu für zwei Stunden in einer 2 % (w/v) Glutaraldehyd-Lösung bei
4 °C inkubiert. Das Glutaraldehyd diffundiert dabei in den Kristall und bildet
Querverbindungen zwischen Lysinresten der Aminosäurekette aus, die Den Kristall
stabilisieren.
2.2.5 Röntgenbeugungsexperimente Mittels Röntgenkristallographie ist es möglich, die molekulare Struktur großer
Makromoleküle wie Proteine aufzuklären. Notwendig dafür sind geeignete Kristalle des
entsprechenden Proteins. Der Kristall wird dann mit einem Röntgenstrahl definierter
Wellenlänge bestrahlt. Trifft dieser auf den Proteinkristall, so wird er gestreut und das
Streuungsmuster wird detektiert. Da das Streuverhalten von der Orientierung des Kristalls
abhängt, wird er während der Messung gedreht, um möglichst alle Streu-Reflexe zu
erfassen.
Vor der Datensammlung wird der Kristall in flüssigem Stickstoff eingefroren und dann auf
einem Goniometerkopf im Schnittpunkt des Röntgenstrahls mit der Rotationsachse
montiert. In dieser Position wird der Kristall durch einen mit flüssigem Stickstoff
gekühlten Cryostrom auf einer Temperatur von 100 K gehalten. Die Datensammlung bei
tiefen Temperaturen verringert die Schädigung des Kristalls durch die Strahlung und
ermöglicht dadurch häufig die Aufnahme mehrerer Datensätze von einem einzigen
Kristall.
Röntenbeugungsexperimente von Prp28∆N-Kristallen wurden am ID 23-2 Strahl der
European Syncrotron Radiation Facility (ESRF, Grenoble) sowie durch Dr. Jana
Schmitzova an dem 14.1-Strahl des Berliner Elektronensynchrotrons (BESSY, Freie
Universität Berlin) durchgeführt.
Ergebnisse 44
3 Ergebnisse
3.1 Expression von Prp28∆N
Zu Beginn dieser Arbeit wurde von Dr. Jana Schmitzova (Universität Göttingen) das
Konstrukt pET-21a-Prp28∆N zur Verfügung gestellt. Dieses enthält den Vektor pET-21a
und die kodierende Sequenz für die Aminosäuren 131 - 588 von Prp28. Diese N-terminale
verkürzte Variante von Prp28 wird im weiteren Verlauf dieser Arbeit als Prp28∆N
bezeichnet. Die DNA von Prp28∆N wurde über die Restriktionsschnittstellen NdeI und
XhoI in den entsprechend geschnittenen Vektor inseriert. Dieser enthält zusätzlich eine
kodierende Sequenz, welche eine Hexa-Histidin-Affinitätssequenz C-terminal an das zu
exprimierende Protein anfügt.
Vor der Expression wurde das Plasmid mittels Sequenzanalyse (2.2.1.2) auf Fehlerfreiheit
überprüft.
Das Plasmid wurde in chemisch kompetenten Zellen des E. coli Stammes Rosetta 2 (DE3)
transformiert, die Expression erfolgte wie in (2.2.2.4) beschrieben.
Die Zellernte erfolgte bei 4 °C und 5750 x g, anschließend wurden die Zellen
aufgeschlossen (2.2.2.6)
Aufschluss, Überstand und Pellet wurden mittels SDS-PAGE analysiert. Die vor der
Induktion aus der Kultur genommene Probe ging vor dem Auftrag auf das Gel verloren.
Die SDS-PAGE (Abb. 8) zeigt im Aufschluss eine deutliche Überexpression von Prp28∆N
mit einem apparenten Molekulargewicht von etwa 51 kDa. Nach der Zentrifugation waren
sowohl im Überstand wie auch im Pellet größere Mengen von Prp28∆N vorhanden, wobei
das Verhältnis etwa 1:1 beträgt. Da die Menge im Überstand ausreichend groß für die
weiteren Experimente war, wurde darauf verzichtet, die Löslichkeit des Proteins weiter zu
verbessern.
Ergebnisse 45
3.2 Reinigung von Prp28∆N
3.2.1 Affinitätschromatographische Reinigung über His-Trap-Säulen
Der Überstand nach der Zentrifugation wurde über eine HiTrapChelating Ni-NTA-
Sepharose-Säule gereinigt (2.2.3.5.1.1).
Abb. X: Chromatogramm von Beladung und Elution der HiTrapChelating Ni-NTA-Sepharose-Säule. Die Schulter im vorderen Bereich des Maximums bei 150 ml deutet auf eine Verunreinigung des eluierten Proteins hin. (blau: UV-Absorption bei 280 nm; rot: Leitfähigkeit; grün: Anteil Elutionspuffer; rot gekennzeichnet: eluiertes Protein)
Die Elution mit einem Gradienten von 0 – 100 % Elutionspuffer führte zu einem
Elutionsmaximum von etwa 350 mAu bei 160 ml mit einer leichten Schulter im vorderen
Bereich. Danach flacht die Kurve wieder ab, und es zeigt sich kein weiteres Maximum
mehr. Das Maximum in der Kurve der Leitfähigkeit wurde durch das Waschen der Säule
mit 2 M LiCl hervorgerufen.
Einzelne Fraktionen des Säulenlaufs wurden auf einem SDS-Gel analysiert. Dabei zeigte
sich, dass neben dem Protein mit Histidin-Affinitätssequenz weitere Proteine an die Säule
gebunden haben, welche im Elutionsmaximum von der Säule eluieren. Eines mit etwa 80
kDa und eines mit etwa 28 kDa. Hauptsächlich jedoch Protein mit ca. 50 kDa, was relativ
Ergebnisse 46
genau dem überexprimierten Prp28∆N mit einem theoretischen Molekulargewicht von
51,1 kDa entspricht.
Prp28∆N
Abb. 8: SDS-PAGE des Prp28∆N-Aufschlusses und der Histidin-Affinitätschromatographie. M = Marker; A = Aufschluss; Ü = Überstand; P = Pellet; F8 – F47 = Fraktionen der Histidin-Affinitätschromatographie. Im Aufschluss ist die Überexpression eines ca. 51 kDa großen Proteins zu erkennen (roter Pfeil). Sowohl im Überstand als auch im Pellet befinden sich größere Mengen dieses Proteins. Das exprimierte Protein Prp28∆N ist in den Fraktionen 30 bis 47 deutlich zu sehen (schwarzer Pfeil). Ebenso ist ein verunreinigendes Protein mit einer Größe von etwa 28 kDa zu sehen, welches wahrscheinlich die Schulter im Elutionsmaximum in Abb. X verursacht.
3.2.2 Größenausschlußchromatographische Reinigung über Gelfiltrationssäulen
Als letzter Reinigungsschritt wurde eine Größenausschlusschromatographie mittels einer
Gelfiltrationssäule Superdex 75 26/60 (2.2.3.5.2) durchgeführt. Ziel war es, alle
Fremdproteine vom überexprimierten Fusionsprotein Prp28∆N zu trennen.
Dazu wurde die Probe auf die Säule appliziert und der Lauf mit einer Geschwindigkeit von
1 ml/min bei 4 °C durchgeführt.
Im Chromatogramm entspricht das erste Maximum bei etwa 100 ml dem
Ausschlussvolumen der Säule. Alle Proteine sowie Proteinkomplexe die größer als ca. 130
kDa sind, werden hier eluiert. Das zweite Maximum bei etwa 115 ml Elutionsvolumen
entspricht dem Fremdprotein, welches als deutliche Bande in Abb. 10 zu sehen ist. Das
dritte Maximum bei ca. 160 ml Elutionsvolumen stellt das überexprimierte Protein
Prp28∆N dar.
Ergebnisse 47
Abb. 9: Chromatogramm der Größenauschlusschromatographie über eine Superdex 75 26/60 Gelfiltrationssäule. Prp28∆N Maximum bei 170 ml. Die Asymmetrie des Maximums weist auf eine Verunreinigung des Proteins hin. (blau: UV-Absorption bei 280 nm)
Die einzelnen Fraktionen wurden per SDS-PAGE analysiert.
Abb. 10: SDS-PAGE der Größenausschlusschromatographie. M: Größenstandard; 13 -24: Fraktionen der Größenausschlusschromatographie aus Abb. 9
Ergebnisse 48
Auf dem SDS-Gel (Abb. 10) entspricht Spur 1 dem erstem Maximum, und somit dem
Ausschlussvolumen. Die hier laufenden Proteine sind meist mißgefaltet und lagern sich
über hydrophobe Bereiche zu Komplexen zusammen. Die Banden in Spur 1 sind nur sehr
schwach, was wahrscheinlich auf die geringe Proteinkonzentration zurückzuführen ist. Die
zweite Spur entspricht Fraktion 15 in Abb. 9. Hier ist eine deutliche Bande bei ca. 66 kDa
zu sehen, welche das zweite Maximum im Chromatogramm hervorruft. Die Spuren 3 – 6
repräsentieren die Fraktionen 20 – 21 und 23 – 24, welche dem dritten Maximum
entsprechen. Es sind sehr starke Banden bei etwa 50 kDa zu beobachten, welche dem
überexprimierten Protein Prp28∆N entsprechen. Die Proben wurden auf 5 mg/ml
konzentriert. Eine anschließende erneute Analyse mittels SDS-PAGE zeigte, dass die in
Abb. 10 in Spur 4 zu sehende Bande bei etwa 20 kDa durch den Prozess des
Ankonzentrierens (2.2.3.4) entfernt werden konnte. Die Probe besaß somit eine
ausreichende Reinheit um damit biochemische Charakterisierungen sowie
Kristallisationsversuche durchführen zu können.
Es ergab sich eine Ausbeute von ca. 8,5 mg reinem Protein pro Liter Expressionskultur.
3.3 Kristallisation von Prp28∆N
Ein zentraler Punkt dieser Diplomarbeit bestand in der Kristallisation von Prp28∆N. Für
die Kristallisationsversuche wurde das Protein in einer Konzentration von 4 mg/ml
eingesetzt. In das Reservoir wurden jeweils 500 µl der Bedingung vorgelegt, anschließend
1 µl der Bedingung in die zentral liegende Vertiefung (engl.: well) pipettiert und mit 1 µl
der Proteinlösung gemischt. Die Platten wurden unmittelbar danach verschlossen und bei 4
°C gelagert. Es wurden folgende Screens pipettiert:
Crystal Screen I
Crystal Screen II
Crystal Screen lite
Crystal Screen Cryo
JB 1 – 9
Magic Screen 1 – 3
Footprint Screen I
The Opti Salts
Ergebnisse 49
Crystal Screen PEG/Ion
Additive Screen 1 – 2
In etwa 50 % der Fälle präzipitierte das Protein nach einigen Tagen in der
Kristallisationsbedingung. Es konnten keine Anzeichen von Kristallisation oder
Kristallisationsvorstufen wie z.B. granulöse Strukturen oder Sphärolithe gefunden werden.
Um die DEAD-Box Domäne in der Lösung zu stabilisieren, wurde in den
Dieses Molekül ist ein Analog von ATP, welches aufgrund der Imidogruppe jedoch nicht
von Prp28∆N hydrolysiert werden kann. Ziel war es das Protein durch die Interaktion mit
AMP-PNP zu stabilisieren. Es konnte jedoch kein positiver Einfluss von AMP-PNP auf die
Kristallisation von Prp28∆N festgestellt werden.
3.3.1 Entfernung der C-terminalen Hexa-Histidin-Sequenz
Da sämtliche Kristallisationsversuche nicht erfolgreich waren, wurde versucht, die für die
Reinigung des Proteins benötigte Hexa-Histidin-Sequenz am C-terminus des Proteins zu
entfernen, da diese sich evtl. störend auf die Kristallisation auswirken könnte. Da das
rekombinante Protein über keine Proteaseschnittstelle zwischen der Sequenz von Prp28∆N
und der Hexa-Histidin-Sequenz verfügte, konnte diese nicht durch Verdau mit einer
Ergebnisse 50
spezifisch schneidenden Protease entfernt werden. Stattdessen wurde ein Verdau mit
Carboxypeptidase B durchgeführt. Carboxypeptidasen sind Metalloproteine, die Proteine
vom Carboxyterminus aus angreifen (sog. Exopeptidasen). Carboxypeptidase B spaltet
dabei nach basischen Aminosäuren.
Zum Verdau wurde Carboxypeptidase B in einem molaren Verhältnis von 1:1000 mit
Prp28∆N für 20 Minuten auf Eis inkubiert und anschließend in die vorgelegte
Kristallisationsbedingung pipettiert.
Das so verdaute Protein bildete in einer Bedingung des JB 5 Screen sehr viele jedoch sehr
kleine plattenförmige Kristalle.
Abb. 12: Prp28∆N-Kristalle in Bedingung 13 von JB 5 Zusammensetzung: 0,2 M NH4SO4; 22 % (w/v)
PEG 8000; 0,1 M MES pH 6,5
3.3.2 Fein-screening
Da die beobachteten Kristalle mit ca. 30 µm x 20 µm x 5 µm zu klein für
Röntgenbeugungsexperimente am zur Verfügung stehenden Röntgendiffraktometer waren,
wurde ein Fein-screening (2.2.4.2) durchgeführt, um die Größe und Qualität der Kristalle
zu verbessern.
Dabei wurde die NH4SO4-Konzentration in den Bedingungen in 0,02 M Schritten, der pH-
Wert in 0,1 Schritten und die PEG 8000 Konzentration in 0,5 % Schritten geändert.
Außerdem wurde je eines der folgenden Salze in Konzentrationen von 0,05 – 0,3 M in die
einzelnen Bedingungen gegeben:
Ergebnisse 51
NaCl
HCOO- / Na+
CH3COO- / Na+
NaSCN
Durch dieses Fein-screening konnte die Größe der Kristalle deutlich auf etwa
150 µm x 90 µm x 20 µm gesteigert werden (Abb. 13). Die Kristalle wiesen fast alle eine
dreieckige Form auf, wenige waren quaderförmig. Allen Kristallen gemein war das starke
Wachstum in zwei Dimensionen, während das Wachstum in die dritte Dimension deutlich
geringer war.
A B C
Abb. 13: Prp28∆N-Kristall in optimierten Bedingungen. Durch das Fein-screening konnte die Größe der Kristalle deutlich gesteigert werden. (A) Bedingung im Tropfen: 0,06 M NaSCN, 0,22 M NH4SO4, 20% (w/v) PEG8000, 0,1 M MES pH 6,8; (B) 0,12 M CH3COO- / Na+, 0,24 M NH4SO4, 20,5 % (w/v) PEG8000, 0,1 M MES pH 6,6; (C) In einer Bedingung mit 0,24 M NaSCN, 0,28 M NH4SO4, 21,5 % (w/v) PEG8000, 0,1 M MES pH 6,7 bildeten sich lange, stäbchenförmige Kristalle.
3.4 Röntgenbeugungsexperimente
Mit den Kristallen aus Abb. 13 (A) und (B) wurden sowohl am Röntgendiffraktometer der
Molekularen Strukturbiologie, Göttingen als auch durch Dr. Jana Schmitzova mit
Synchrotronstrahlung am BESSY, Berlin Röntgenbeugungsexperimente durchgeführt. In
beiden Fällen ergab sich eine Auflösung von lediglich 8 Å. Daraufhin wurde versucht,
durch Behandlung der Kristalle mit Glutaraldehyd (2.2.4.3) die Stabilität des Kristalls zu
erhöhen um höher auflösende Beugungsdaten zu erhalten. Diese Versuche erwiesen sich
jedoch als nicht erfolgreich, da sich die Auflösung nicht verbessern ließ.
Ergebnisse 52
Mit den langen, stäbchenförmigen Kristallen aus Abb. 13 wurden
Röntgenbeugungsexperimente mit Synchrotronstrahlung an der Microfocus Beamline
ID23-2 des ESRF Grenoble, Frankreich durchgeführt, da es hier möglich war, den
Röntgenstrahl auf einen geringeren Durchmesser als den Kristalldurchmesser zu
fokussieren. Dies ermöglicht eine hohe Strahlintensität im Kristall bei gleichzeitig
geringerem Hintergrund, als dies bei einem schwächer fokussierten Strahl der Fall ist,
dessen Durchmesser größer als der Durchmesser des zu messenden Kristalls ist.
Abb. 14: Beugungsbild eines Prp28∆N Kristalls aus Abb. 13 (C) Aufgenommen an der Beamline ID23-2 ESRF, Grenoble. Wellenlänge: 0,873 Å, Detektorentfernung 372.31 mm, Belichtungszeit: 1 sek., Auflösungsgrenze: ca. 7 Å
Die maximal erreichte Auflösung betrug auch in diesem Fall nur etwa 7 Å, was zur
Bestimmung der dreidimensionalen Kristallstruktur von Prp28∆N nicht ausreichend ist.
3.5 Biochemische Charakterisierung 3.5.1 ATPase Aktivität Die RNA-Helikase-Aktivität von DEAD-Box Proteinen setzt die Hydrolyse von ATP
voraus. Dementsprechend weisen viele dieser Proteine eine in vitro ATPase Aktivität auf.
In dieser Arbeit sollte ein Test zur quantitativen Bestimmung der ATPase-Aktivität von
Proteinen etabliert werden. Hierbei kam der kommerziell erhältliche EnzCheck Phosphate
Ergebnisse 53
Assay der Firma Invitrogen zum Einsatz, bei welchem in einer Phosphatabhängigen
Reaktion das Substrat MESG enzymatisch umgesetzt wird (2.2.3.7). Zur Kontrolle des
Assays wurde eine vom N-terminus um 464 Aminosäuren verkürzte Variante des
spleißosomalen DEAH-Box Proteins Prp22 aus Saccharomyces cerevisiae eingesetzt, deren
KM-Wert für die ATPase Aktivität aus der Literatur bekannt ist (Tanaka und Schwer 2005).
Vor Beginn der Messungen wurde der molare Extinktionskoeffizient ε von 2-amino-6-
mercapto-7-Methylpurin bei 360 nm bestimmt. Dazu wurden in einer Messreihe
Reaktionsansätze bestehend aus MESG, Purin Nukleosid Phosphorylase und Puffer mit
Phosphat in Konzentrationen von 0 – 100 µM inkubiert und die Absorption bei 360 nm
gemessen.
y = 0,01x
00,20,40,60,8
11,21,41,6
0 20 40 60 80 100 120 140 160
Phosphat [µM]
Extin
ktio
n 36
0nm
Abb. 15 Phosphatstandard zur Bestimmung des molaren Extinktionskoeffizienten. Die gemessenen Punkte liegen auf einer Geraden mit der Steigung 0,01
Die gemessene Extinktion wurde gegen die Phosphatkonzentration aufgetragen. Aus der
Steigung der Geraden ergab sich ein molarer Extinktionskoeffizient ε von 0,01/µM*cm.
Zur Bestimmung der maximalen Reaktionsgeschwindigkeit Vmax und der
Substratkonzentration, bei der Vmax/2 erreicht ist (KM-Wert) wurden Proben mit je 1µM
Prp22∆N angesetzt und 10 min in der Küvette im Photometer bei 25 °C inkubiert. Danach
wurde ATP in Konzentrationen von 0 – 500 µM zum Reaktionsansatz hinzugegeben und
die Absorption bei 360 nm über eine Zeitspanne von 5 min gemessen. Jede Probe wurde
dreimal unabhängig voneinander angesetzt und gemessen. Die Datenauswertung erfolgte
gemäß Lineweaver-Burk.
Ergebnisse 54
y = 0,389x + 0,011
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
0,4
0,45
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2
1/ATP [µM]
1/v
[µm
ol/(l
*min
)]
Abb. 16: Lineweaver-Burk Diagramm der gemittelten ATPase Aktivität von Prp22∆N. Es ist 1/Anfangsgeschwindigkeit v auf der Y-Achse gegen 1/ATP Konzentration in µM auf der X-Achse aufgetragen. Es ergibt sich folgende Gleichung für die Gerade: y = 0,389 + 0,011 , was einem KM-Wert von 35,22 µM und einem Wert von 90,53 µmol/(l*min) für Vmax entspricht Wie erwartet liegen die einzelnen Messwerte mit nur geringer Abweichung auf einer
Geraden. Aus der Steigung dieser Geraden ergab sich für Prp22∆N ein KM-Wert von 35,22
± 7,36 µM µM sowie ein Wert von 90,53 ± 8,23 µmol/(l*min) für Vmax.
Weiterhin wurde der KM-Wert sowie Vmax durch Kurvenanpassung an die Michaelis-
Menten-Gleichung mit dem Programm SigmaPlot bestimmt.
ATP [µM]
0 100 200 300 400 500
v [µ
mol
/(l*m
in)]
0
20
40
60
80
100
120
Abb. 17: Kurvenanpassung mit SigmaPlot. Dabei ergibt sich ein KM-Wert von 30,51 ± 9,78 µM sowie ein Wert von 101,93 ± 16,27 µmol/(l*min) für Vmax
Ergebnisse 55
Hierbei ergab sich für den KM-Wert 30,51 ± 9,78 µM und für Vmax 101,93 ± 16,27
µmol/(l*min).
Die Messungen zur Bestimmung der ATPase Aktivität von Prp28∆N wurden auf die
gleiche Weise durchgeführt. Es konnte dabei nach Abzug der Referenzmessungen ohne
Prp28∆N jedoch keine signifikante Absorptionsänderung beobachtet werden. Der durch
Kurvenanpassung ermittelte KM-Wert liegt bei 1,24 ± 3,41 µM, Vmax hat einen Wert von
0,057 ± 0,012 µmol/(l*min). Daraus ergibt sich zusammen mit der Proteinkonzentration
von 1µM eine Wechselzahl von 0,00095 s-1, was einem Umsatz von 1 Molekül ATP pro
1000 Sekunden entspricht.
ATP [µM]
0 200 400 600 800 1000 1200
v [µ
mol
/(l*m
in)]
-0,02
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
0,12
0,14
0,16
Abb. 18: ATPase-Aktivität von Prp28∆N. Es ist die Reaktionsgeschwindigkeit v bei verschiedenen ATP Konzentrationen aufgetragen. Eine Signifikante ATPase-Aktivität kann nicht beobachtet werden.
3.5.1.1 Stimulation der ATPase Aktivität durch RNA
Da Helikasen wie Prp28 und Prp22 in vivo während des Spleißvorgangs an RNA binden
und diese entwinden, sollte die Auswirkung von an das Protein gebundener RNA auf die
ATPase-Aktivität untersucht werden. Für die Messungen wurde Poly-Adenin RNA mit
einer Kettenlänge von 20 Nukleotiden verwendet, da für diesen RNA-Typ bereits
Messwerte bezüglich der ATPase-Aktivität von Prp22 in der Literatur vorliegen, die zum
Ergebnisse 56
Vergleich herangezogen werden können. Die Messungen erfolgten wie in (2.2.3.7)
beschrieben. Zusätzlich wurde RNA in Konzentrationen von 0 – 10 µM zu den einzelnen
Messansätzen hinzugefügt.
ATP [µM]
0 100 200 300 400 500
v [µ
mol
/(l*m
in)]
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
0 100 200 300 400 500
Abb. 19: ATPase-Aktivität von Prp22∆N in Anwesenheit von Poly-Adenin RNA. Aufgetragen ist die Reaktionsgeschwindigkeit v auf der Y-Achse gegen die ATP Konzentration auf der X-Achse. Für 0 und 10 µM RNA sind außerdem die Graphen aus der Kurvenanpassung aufgetragen (●: ohne RNA; ○: 1 µM RNA; ▼: 2 µM RNA; ∆: 4 µM RNA; ■: 10 µM RNA
Wie man in Abb. X sieht, ergibt sich bei steigender RNA-Konzentration ein deutlicher
Anstieg von Vmax. Die durch Kurvenanpassung mit SigmaPlot erhaltenen Werte lauten wie
folgt:
RNA-Konzentration KM [µM] Vmax [µmol/(l*min)]
0 µM (zum Vergleich) 30,51 ± 9,78 101,93 ± 7,85 1 µM 45,19 ± 4,55 114,82 ± 6,59 2 µM 58,72 ± 7,72 128,16 ± 9,97 4 µM 72,32 ± 7,12 153,73 ± 9,34 10 µM 81,28 ± 5,93 185,80 ± 8,48 Zusätzlich erfolgte die Auftragung der Messwerte nach Lineweaver-Burk. Durch die Art
der Auftragung werden hierbei die Messwerte bei niedrigen ATP-Konzentrationen stärker
gewichtet.
Ergebnisse 57
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
0,4
0,45
0,5
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2
1/ATP [µM]
1/v
[µm
ol/(l
*min
)]
1 µM RNA 2 µM RNA 4 µM RNA 10 µM RNA ohne RNA
Abb. 20: Lineweaver-Burk-Diagramm der ATPase-Aktivität von Prp22∆N bei unterschiedlichen PolyA-RNA Konzentrationen. Es ist 1/Anfangsgeschwindigkeit v auf der Y-Achse gegen 1/ATP Konzentration in µM auf der X-Achse für RNA-Konzentrationen von 0µM (schwarz), 1 µM (rot), 2 µM (gelb), 4 µM (blau) und 10 µM (grün) aufgetragen. Aus den Steigungen der Geraden ergeben sich folgende KM-Werte: 0 µM RNA: 35,22 µM; 1 µM RNA: 34,89 µM; 2 µM RNA: 28,28 µM; 4 µM RNA: 52,18 µM; 10 µM RNA: 54,29 µM Die aus der Steigung der Geraden durch die Messpunkte erhaltenen Werte lauten wie folgt:
4 µM 52,18 ± 5,24 117,25 ± 6,97 10 µM 54,29 ± 8,66 137,12 ± 9,74 Bei Prp28∆N zeigte sich in Anwesenheit von RNA auch bei Zugabe von hohen
Konzentrationen ATP (bis 5 mM) keine messbare ATPase-Aktivität.
Ergebnisse 58
3.5.2 Bindungsstudien mit ADP und ATP Eine Ursache für die fehlende in vitro ATPase Aktivität von Prp28∆N könnte sein, dass die
Konformation von isoliertem Prp28∆N derart verändert ist, dass keine ATP Bindung mehr
möglich ist. Um dies zu überprüfen, wurden Bindungsstudien durchgeführt, in deren
Verlauf die Dissoziationskonstante KD für die Interaktion von Prp28∆N mit ATP und ADP
bestimmt wurde.
Es kam hierbei ein fluorimetrisches Verfahren zum Einsatz, bei dem die durch Bindung
eines Liganden hervorgerufene Abnahme der Tryptophan-Fluoreszenz gemessen wurde
(2.2.3.6.1). Bei diesen Liganden handelte es sich um mant-modifizierte Nukleotide. Die
mant-Gruppe ist ein Fluorophor, dessen Anregungswellenlänge sich mit der
Emissionswellenlänge von Tryptophan überschneidet. Bei Bindung eines mant-
modifizierten Nukleotid kommt es zu einem Resonanzenergietransfer (FRET) zwischen
Tryptophan und der mant-Gruppe, was in der Abnahme der Tryptophan-Fluoreszenz
resultiert.
3.5.2.1 Bestimmung der Anregungs- und Emissionswellenlänge
Zur Ermittlung geeigneter Wellenlängen für Anregung sowie die Emissionsmessungen
wurden zunächst ein UV-Absorptionsspektrum von mant-ADP und ein
Fluoreszenzspektrum von Prp28∆N aufgenommen.
A B
Wellenlänge [nm]
250 300 350 400 450
Abs
orpt
ion
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
Wellenlänge [nm]
300 320 340 360 380 400 420 440 460
Fluo
resz
enz
[cps
]
0
1e+6
2e+6
3e+6
4e+6
5e+6
6e+6
Abb. 21: (A) UV-Absorptionsspektrum von mant-ADP. Die Kurve zeigt zwei Maxima bei 260 nm sowie bei 350 nm. (B) Fluoreszenzspektrum von Prp28∆N bei einer Anregungswellenlänge von 295 nm. Das Fluoreszenzmaximum befindet sich bei 350 nm.
Ergebnisse 59
Da Prp28∆N neben 5 Tryptophanen auch 14 Tyrosine enthält, in diesem Experiment aber
selektiv nur die Fluoreszenz der Tryptophane gemessen werden sollte, sollte eine
Anregungswellenlänge ≥ 295 nm gewählt werden, da unterhalb dieser Wellenlänge auch
die Tyrosine angeregt werden. Gleichzeitig sollte die Anregungswellenlänge aber auch so
gewählt werden, dass möglichst wenig Strahlung von mant-ADP bzw. mant-ATP
absorbiert wird, um den inner filter effect (2.2.3.6.1.2) möglichst gering zu halten.
Im UV-Absorbtionsspektrum zeigte sich für mant-ADP ein Minimum bei 292 nm. Für
mant-ATP trifft das gleiche zu. Zur Anregung der Tryptophane wurde daher eine
Wellenlänge von 295 nm gewählt.
Zur Messung der Tryptophan-Fluoreszenz sollte eine Wellenlänge gewählt werden, bei der
die Fluoreszenz der Tryptophane stark ist, die Absorption durch den Liganden mant-ADP
bzw. mant-ATP aber wiederum gering. Das Fluoreszenzspektrum von Prp28∆N zeigt ein
Maximum bei einer Wellenlänge von 345 nm. Allerdings tritt bei dieser Wellenlänge auch
eine starke Absorption durch die mant-Gruppe auf, die im UV-Absorptionsspektrum ein
Maximum bei 350 nm zeigt. Zur Messung der Fluoreszenz wurde daher eine Wellenlänge
von 330 nm verwendet. Bei dieser Wellenlänge absorbiert die mant-Gruppe deutlich
weniger stark, während die Fluoreszenz der Tryptophane nur geringfügig schwächer ist.
3.5.2.2 Dissoziationskonstante von Prp28∆N mit mant-ADP und mant-ATP
Zur Bestimmung des KD-Wertes wurden Proben mit 1 µM Prp28∆N und variierenden
Konzentrationen von mant-ADP (0 – 100 µM) bzw. mant-ATP (0 – 200 µM) angesetzt.
Die Proben wurden für 45 min bei 25 °C im Fluorimeter inkubiert, damit sich ein
Bindungsgleichgewicht einstellen konnte. Danach wurde jede Probe bei 295 nm angeregt
und das Fluoreszenzsignal bei 330 nm gemessen. Aufgrund der teilweise hohen
Ligandenkonzentrationen in den einzelnen Proben konnte ein inner filter effect trotz
Optimierung der Wellenlängen (2.2.3.6.1.1) nicht immer vermieden werden. Aus diesem
Grund wurden die gemessenen Fluoreszenzsignale entsprechend korrigiert (2.2.3.6.1.2).
Die dazu nötigen molaren Extinktionskoeffizienten für mant-ADP und mant-ATP wurden
aus dem UV-Absorptionsspektrum abgelesen. Es ergaben sich folgende Werte:
ε295nm = 463 M-1 cm -1 und ε330nm = 3550 M-1 cm-1.
Die Auswertung erfolgte gemäß dem Eadie-Hofstee Plot nach folgender Formel:
Ergebnisse 60
][max LFKFF D
Δ−Δ=Δ
Fmax = maximales korrigiertes Fluoreszenzsignal (S / R)korr ∆Fmax = maximaler Betrag der Steigung von (S / R)korr
[L] = Konzentration von mant-ADP bzw. –ATP [KD] = Dissoziationskonstante
Wie zu erwarten war, liegen die Werte für mant-ADP relativ gut auf einer Geraden mit
einer Steigung von -14,56 cps/(cps/µM). Daraus ergibt sich für mant-ADP ein KD-Wert
von 14,6 µM. Die Werte für mant-ATP liegen hingegen weit gestreut vor, was ein Hinweis
Abb. 22: Eadie-Hofstee Plot. Aufgetragen ist die Änderung des Fluoreszenzsignals ∆F auf der Y-Achse gegen die Änderung des Fluoreszenzsignals geteilt durch die Konzentration des Liganden mant-ADP bzw. mant-ATP auf der X-Achse. Für mant-ADP beträgt die Steigung der Geraden durch die Messwerte -14,56, was einem KD-Wert von 14,56 µM entspricht. In die Auftragung der Messwerte von mant-ATP konnte keine Gerade eingepasst werden.
Zusätzlich zur Auftragung gemäß Eadie-Hofstee wurden die KD-Werte durch
Kurvenanpassung bestimmt. Dabei wurden die Messwerte mit dem Programm SigmaPlot
an folgende Formel angepasst:
Dkorr KL
LFFRS
+Δ
−=][
][)/( max
max
Fmax = maximales korrigiertes Fluoreszenzsignal (S / R)korr ∆Fmax = maximaler Betrag der Steigung von (S / R)korr
Ergebnisse 61
mant-ADP [µM]
0 20 40 60 80 100 120
Fluo
resz
enz
(S /
R)k
orr [
cps]
1,2e+6
1,4e+6
1,6e+6
1,8e+6
2,0e+6
2,2e+6
2,4e+6
2,6e+6
Abb. 23: Kurvenanpassung mit SigmaPlot. Es ist sind die korrigierten Fluoreszenzwerte auf der X-Achse gegen die mant-ADP Konzentration in µM auf der auf der Y-Achse aufgetragen. Für mant-ADP ergibt sich ein KD-Wert von 14,2 ± 1,7 µM
Für mant-ADP ergibt sich ein KD-Wert von 14,2 ± 1,7 µM, was relativ gut mit dem Wert
aus dem Eadie-Hofstee-Plot übereinstimmt. In die Auftragung der Messwerte für mant-
ATP konnte keine Kurve eingepasst werden.
Diskussion 62
4 Diskussion Ziel dieser Diplomarbeit war die Etablierung eines nicht-radioaktiven ATPase-Assays zur
Charakterisierung von ATP-hydrolysierenden Proteinen wie z.B. Helikasen. Des Weiteren
sollte die spleißosomale DEAD-Box Helikase Prp28 aus Saccharomyces cerevisiae
gereinigt und anschließend kristallisiert werden, was die Grundlage für eine spätere