Analizadores

PORTADA

RESUMEN

La utilizaci6n de sistemas analíticos de química en fase s6lida en los laboratorios c1inicos se remonta a los años 50. Las primeras técnicas desarrolladas permitieron la determinación de glucosa en orina, dada su significación c1inica en el diagnóstico y seguimiento de pacientes diabéticos (Clinistix®, Ames; S-Glukotest®, Boehringer Mannheim). Se trataba de tiras-reactivas que contenían los reactivos en estado desecado. Ofrecían resultados cualitativos, determinados visualmente por el propio operador, comparando el color desarrollado en la reacción con una tabla de colores de referencia. Actualmente se siguen utilizando y están basadas en los mismos principios que las aparecidas hace 40 años.

Posteriormente, la ampliación del número de constituyentes analizables en orina (leucocitos, hemoglobina, cuerpos cetónicos, albumina, etc.) condujo a la aparici6n de tiras reactivas multiparametricas (N-Multistix<l' SG, Ames; Combur-9-Test0 , Boehringer Mannheim; etc.), que ailll hoy dia se utilizan en muchos laboratorios c1inicos para e1 amilisis rutinario de las orinas.

INNDICE

OBJETIVO

MARCO TEORICO

ANALIZADORES PARA QUÍMICA CLINICA EN FASE SÓLIDA

Analizadores en pequeños laboratorios y consultas médicas:

Tiras reactivas (química en fase sólida)

Fotometría de reflectancia

Potenciometría

Analizadores de glucosa para control de insulinodependientes

Analizadores para análisis sistemáticos de orina.

BIBLIOGRAFIAANEXOS

QUÍMICA SECA

La tecnología de química seca tiene sus inicios en los años 70’s. En 1976 ya se tenían algunos avances

pero fue hasta 1978 cuando realmente se hizo la introducción de esta tecnología. 

Actualmente se cuenta con un analizador automatizado que utiliza la tecnología de química seca, el cual

emplea un sistema de multicapas en un soporte de plástico. Este contiene todos los reactivos necesarios

para analizar la muestra, utilizando 10µL de suero, plasma, líquido cefalorraquídeo u orina, la cual es

aplicada a una lámina o “slide” que contiene reactivos que permiten la detección y cuantificación del

analito en estudio.

Existen diferentes tipos de “slide”, dependiendo del tipo de análisis por realizar:

Colorimétricas la cual hace una determinación de punto final, ya que hace la medición una vez

terminada la reacción, ejemplo: glucosa, ácido úrico, colesterol.

Enzimáticas, se llevan a cabo varias lecturas durante el curso de la reacción, ejemplo: lactato

deshidrogenasa, amilasa, lipasa. En ambas la concentración del analito se cuantifica a través de una

medición espectrofotométrica.

Potenciométricas, mide el diferencial de potencial entre la muestra y el fluido de referencia, por medio de

un electrodo de ion selectivo. Permite medir la concentración de electrolitos.

Un “slide” típico consta de cuatro capas y se clasifican de acuerdo a la función que cumplan:

Capa difusora: es una capa porosa que permite distribuir uniformemente la muestra además de funcionar como filtro, ya que no deja pasar moléculas como proteínas, lípidos, hemoglobina, o bilirrubina. Sirve también como pantalla para al reflexión de la luz.

Capa de reacción: contiene sustancias que pueden ser enzimas o cualquier sustancia química, que se

encuentra en condiciones muy controladas que intervienen en la reacción.

Capa indicadora: contiene el colorante para formar un complejo colorido, que será proporcional a la concentración del analito, la cual se cuantifica por espectrofotometría de reflexión.

Capa de soporte: es la base de la laminilla donde están depositadas las demás capas. Está fabricada con un material de plástico transparente que permite que pase la luz para que la reacción pueda ser medida.

La tecnología de química seca tiene varias ventajas: Excelente precisión y exactitud, el control de calidad, se corre una vez al día, la calibración es estable por seis meses o cada cambio de lote, utiliza 10µL de muestra por prueba y cada muestra usa una punta diferente disminuyendo el peligro de contaminación. El equipo es sencillo de utilizar, la manipulación de la muestra se reduce a colocar el líquido por analizar en el equipo, y programar los análisis deseados.

http://www.bioacademia.com.mx/miembros/tecnologia/0009.html

3.   REACTIVOS PARA QUÍMICA SECALos reactivos de química seca constituyen la manera de introducir la muestra en los fotómetros de reflexión. Son unidades de reacción con una sólida: poseen en forma deshidratada, todos los componentes que se necesitan para la identificación de un analito determinado.Modo de empleo: la muestra que contiene el analito a determinar (suero, plasma, sangre total, orina) se aplica sobre la superficie del reactivo en fase sólida, y a partir de esta difunde a la matriz, disolviendo los componentes de reacción que contiene; cuando los reactivos se disuelven se produce la reacción, que se cuantificara por fotometría de reflectancia.

Todos los sistemas constan de tres partes:Parte soporteEstá constituida por una lamina de plástico, sobre la cual se construye el reactivo de fase solida.Parte reflectanteSu función es reflejar la luz; está hecha de materiales reflectantes como metales, o materiales  fibrosos como el papel.Parte reactivaContiene, en forma deshidratada todos los reactivos y sustancias auxiliares necesarias para que se produzca una reacción. Los reactivos son reconstituidos mediante rehidratación por el agua de la muestra

A veces se añaden otras capas con funciones complementarias como una capa difusora (con lo cual la muestra difunde rápidamente hacia los laterales y se distribuye uniformemente) o una capa separadora de plasma (la utilizan los sistemas preparados para

trabajar con sangre total, su función es retener las células y permitir el paso del plasma hacia la matriz del reactivo).

La estructura de las capas depende del sistema reactivo de fase solida que se trate, variando de unos a Otros.

4.    SISTEMAS REACTIVOS

Los reactivos de fase sólida empleados en la química seca se engloban en dos tipos: las tiras reactivas  y las películas multicapa.

Tiras reactivas

Se utilizan para:-análisis de orina-autocontrol de la glucemia-en sistemas de diagnóstico rápido en la consulta médica y a la cabecera del enfermo.Consisten, básicamente en un soporte de plástico que sirve de soporte a una matriz de celulosa que contiene los reactivos secos  necesarios para que se produzca una reacción con el componente a  estudiar.

Tira reactiva del sistema Seralyzer (Ames): consiste en una matriz de celulosa impregnada de reactivos secos que se unen a una lamina soporte de plástico; sobre ella lleva una franja código, que tiene como finalidad ser leída cuando se la inserta en  el instrumento.

Tira reactiva del sistema Reflotron (Boheringer Mannheim): consta de una lámina soporte al cual se le adhiere el sistema reactivo separado en dos zonas:-una está unida a la lamina. Incluye una serie de capas destinadas a la preparación de la muestra.-la otra se encuentra inicialmente separada de la lámina soporte, y se pone en contacto con ella por simple presión cuando se desea  que el plasma entre en contacto con los reactivos para desencadenar la reacción; esta zona lleva en su superficie una laminilla transparente a través de la cual se realizara la lectura.La disposición en dos bloques hace posible que la parte destinada a la preparación de la muestra se puedan llevar a cabo etapas de preincubación o eliminación de interferentes.Esta tira incorpora también una capa separadora de fibra de vidrio para la obtención de plasma, con lo cual evitamos la centrifugación previa al análisis.

Ventajas de las tiras: al mantener los reactivos deshidratados aportan una prolongada estabilidad al sistema, que puede ser de meses e incluso de uno o dos años.

Películas multicapa o slides

Están constituidas por diferentes capas muy finas, a través de las cuales se van produciendo todas las etapas necesarias para la determinación cuantitativa del analito. Tiene la apariencia de una diapositiva y está constituido  por cuatro capas (que incluyen todos los componentes del sistema). El sistema de más amplia implantación es el Ektachem (Kodak).

Capa difusora: sobre ella se deposita la muestra. Lleva sustancias capaces de reflejar la luz, es la superficie reflectante. Homogeneíza la muestra antes de que llegue a la capa reactiva, distribuyéndola por toda la superficie. Retiene células, cristales y pequeñas y grandes moléculas, así la muestra se convierte en un filtrado libre de proteínas, eliminándose las interferencias.

Capa reactiva: pueden ser una o varias, son las que  contienen los reactivos.

Capa soporte: está hecha de plástico transparente y sobre ella se depositan todas las demás capas una tras otra.  Tiene doble función: servir de soporte y  dejar pasar la luz, ya que la lectura se hace por la parte inferior (la opuesta a la de la aplicación de la muestra).

5.   INSTRUMENTOS DE MEDIDA PARA BIOQUIMICA SANGUÍNEASon tres los sistemas que se emplean actualmente. Dos de ellos trabajan con tiras reactivas: Seralyzer y Reflotron; el tercero trabaja con slides o reactivos multicapa.

Seralyzer (Ames)Emplea tiras reactivas. Tras aplicarle la muestra de suero se coloca la tira en una plataforma termostatizada a 37º que se introduce en el aparato. Allí es irradiado por un haz de luz que incide sobre la zona reactiva de la tira; allí se produce la reflexión. Los valores de reflectancia son convertidos en valores de concentración.

Reflotron-Emplea tiras reactivas. Se puede trabajar con sangre total, suero o plasma; ya que incorpora una capa separadora, que consigue la separación de los eritrocitos del plasma.-Después de aplicar la muestra, la tira reactiva se introduce en el aparato. El plasma pasa al reservorio situado en la parte inferior de la tira; la reacción comienza cuando (por acción del aparato) se presiona la capa reactiva sobre la capa reservorio del plasma.

-La luz reflejada por la zona de reacción se recoge en un detector de medida, que convierte los valores de reflectancia en valores de concentración.

EktachemEmplea los slides. Ofrecen medianos y grandes analizadores, cuya finalidad es ser utilizados en el laboratorio clínico.La muestra de suero se aplica en la superficie del slide por el autoanalizador, luego es transferida a una cámara de incubación. La muestra se difunde a través de las capas, produciéndose la reacción. La lectura se produce por irradiación que incide en la cara inferior del slide. La luz reflejada es recogida por un detector.

6.   SISTEMAS PARA ANÁLISIS DE ORINALos dos sistemas más difundidos para análisis de orina son: Sistema  Clinitek y Sistema Urotron. Ambos incluyen las tiras reactivas y los lectores de tira de orina.

Estructura de las tiras reactivas:-un soporte (lamina de plástico blanca).-zonas de papel impregnando con los reactivos, que van fijados al soporte.-cada zona reactiva tiene impregnados reactivos distintos, de manera que cada uno tomara una coloración diferente cuya intensidad dependerá de la concentración del componente en la orina.

Modo de empleo:1.     Sumergir la tira reactiva en la orina2.     Eliminar el exceso de orina3.     Leer el resultado. Se puede hacer visualmente sobre una carta de

colores o empleando un fotómetro de reflexión.

Sistema ClinitekSe emplea la tira reactiva Multistix-10-SG.Está preparada para la determinación de diez parámetros:

-        Glucosa-        Bilirrubina-        Cuerpos cetónicos-        densidad-        sangre-        pH-        proteínas-        urobilinógeno-        nitritos-        leucocitos.

Esta tira aporta la ventaja de poder hacer la determinación de densidad de la orina sobre una de las zonas reactivas.

Sistema UrotronSe emplea la tira reactiva COMBUR-9-TEST.Está preparada para la determinación de nueve parámetros:

-        glucosa-        bilirrubina-        cuerpos cetónicos-        angre

-        pH-        proteínas-        urobilinógeno-        nitritos-        leucocitos.

 7.   VENTAJAS Y DESVENTAJAS DE LA QUIMICA SECAVENTAJAS :

-        el usuario solo necesita aplicar la muestra al reactivo en fase sólida para iniciar el análisis, que tiene lugar en unos minutos

-        no se precisa preparación previa de los reactivos. Son únicos para cada parámetro y desechables.

-        Tienen larga estabilidad-        Son fáciles de almacenar.

DESVENTAJAS : -        Su costo es más elevado que el de la química convencional-        No es práctico para laboratorios con gran carga de trabajo, ya que por

cada tira solo se puede realizar la determinación de un analito.

UTILIDADES DE LA   QUÍMICA   SECA

Se pueden hacer todo tipo de determinaciones bioquímicas, electrolitos, enzimas, perfil lipídico y pruebas derivadas.En los laboratorios clínicos de hoy en día, se emplea esta técnica para el análisis de orina, mediante el uso de la tira reactiva.

CUADRO RESUMEN DE LOS TEMAS 1-6

Tema 7 - CENTRIFUGACIÓN

Fundamentos de las técnicas de centrifugación - es una técnica de separación de particulas que se basa en la distinta velocidad de desplazamiento de las partículas en un medio líquido al ser sometidas a un campo centrifugo; cuando se centrifuga una solución => se rompe la homogeneidad y se produce la separación de solvente y soluto y las 1ªs partículas en sedimentar son las de mayor masa.

Velocidad de sedimentación - es proporcional a la masa de la partícula y esta propiedad nos permite  separar partículas de diferente masa => a (+) masa => (+) velocidad de sedimentación.

ge (gravedad efectiva) - es el tiempo que provoca la sedimentación forzada cuando se acelera; para acelerar la sedimentación se puede aumentar la W (velocidad angular); a (+) W => (+) velocidad de sedimentación; la velocidad de sedimentación es util para caracterizar partículas y en concreto se usa un valor que llamamos coeficiente de sedimentación, que es una característica de todas las partículas que nos da información de dicha partícula; conocerlo, nos facilita conocer =>

tamaño, densidad y forma de las partículas y además nos permite diseñar métodos de aislamiento de partículas.

Tipos de centrifugas:1)- de sobre mesa o baja velocidad o "clínicas": son de pequeño tamaño, no necesitan refrigeración, max.velocidad hasta 10.000 rpm, útiles para partículas grandes (células, precipitados,...)2)- microfugas: son una variante de la anterior; tubos cortos para volúmenes muy pequeños, no necesitan refrigeración, velocidad mas de 10.000 rpm, para volúmenes pequeños, se usan en biologia molécular.3)- alta velocidad: velocidad entre 18.000 y 25.000 rpm, necesitan refrigeración, algunas tienen sistema de vacio, útiles para separar fracciones celulares (membranas, orgánulos) pero no sirven para virus ni ribosomas o macromoléculas.4)- ultra-centrifugas: velocidad a partir de 50.000 rpm, necesitan refrigeración, sistema de vacio; hay 2 tipos => 1.analíticas (analizan las propiedades de la sedimentación, tienen detectores, determinan la concentración de parametros  mediante la DO) 2.preparativas(preparar la muestra para luego analizar => aislar virus, macromoléculas)

Tipos de rotores:a)- flotantes o basculantes: posición de 90º con el eje, los tubos utilizados están unidos al brazo del rotor por su parte superior; se usan para volúmenes pequeños de muestra; se utiliza en biología molecular.b)- de ángulo fijo/angulares: en ángulo fijo (+ o - entre 20-30º con el eje); son paravolúmenes mas grandes y se usan en clínica habitualmente;c)- rotores verticales: se produce en vertical (ángulo 0º); para volúmenes muy grandes; se consigue un "pellet" (sedimento muy poco concentrado); gradiente de densidad isopícnica.

Centrifugación analítica - con esta se pretende estimar propiedades físicas de alguna partícula en concreto, es decir, sus propiedades hidrodinámicas; para esto se tiene que cumplir:

- aplicación en sustancias, en mezclas lo + puras posibles y no a grandes mezclas- se pueden aplicar velocidades elevadas de giro sin que repercute en la muestra- rotor utilizado: deben permitir alinear el tubo con los sistemas ópticos que miden la sedimentación en cada momento.Características:- poco volumen de muestra- pureza elevada- velocidad de giro elevada- en BQ se utiliza para determinar el coeficiente de sedimentación y saber que particulas, que composición tiene la muestra- los sistemas ópticos miden la DO de la muestraAplicaciones:- averiguar la pureza de un compuesto- determinar la proporción relativa de sus componentes- en investigación => para conocer e interpretar las estructuras moleculares de diferentes compuestos.

Centrifugación preparativa - a diferencia de la anterior, es la técnica que nos permite preparar o adecuar la muestra para su posterior análisis; hay 2 métodos:

A)- Centrifugación preparativa diferencial; es el método mas común de separación que nos permite separar las partículas en función de su velocidad de sedimentación(e.j.sangre); el resultado es la obtención de un sobrenadante y un "pellet" (material sedimentado); es inespecífico, ya que a priori, no se conoce en que fracción va a quedar cada partícula; muy útil para separar células y orgánulos sub. celulares.

B)- Centrifugación preparativa en gradiente de densidad: es mas compleja que la anterior; presenta muchas ventajas ya que permite la separación de varios o todos los componentes de la muestra; en los tubos hay un fluido que de arriba abajo va de menos a mas denso; esto permite separar la muestra por gradiente; la muestra se va colando según su masa y densidad; esto implica la utilización de un soporte fluido cuya densidad aumenta de la parte superior hacia la parte inferior; las características de este gradientes del fluido son:- material inerte (no altera la muestra)- que no se vea alterado por cambios de temperatura (resistente)- que no absorba radiación UV (no interfiera en la medición)- ser isoosmotico (ni hipo ni hiper respecto a la muestra)- no ser corrosivo, inflamable- ser aséptico- el intervalo de densidad debe ser suficiente- re-utilizable

Ejemplos de fluidos gradientes   que pueden separar las   partículas   de   interés :- Sacarosa (alta viscosidad => para estudio de proteínas)- Ficoll (polisacárido de alto peso molécula; menos viscoso que la anterior; para separación de células y orgánulos subcelulares)- Percoll (menos viscoso que las anteriores; para estudios de fisiología vegetal (micro-algas) y en investigación.Hay 2 tipos de fluidos - zonal (masa) y isopícnica (densidad)Zonal - se lleva a cabo mediante un gradiente de densidad y las partículas se separan en función de su masa; a (+) masa (+) velocidad de sedimentación (+) abajo; para proteínas, macro-moléculas, y estructuras subcelulares; características => si parte de la muestra tiene poco peso no podrá con la centrifugación atravesar las zonas mas densas del fluido; cuanto (+) grande => se sedimentara (+) abajo (atravesará las zonas mas densas); la densidad máxima del soporte tiene que ser inferior o como mucho igual a la de densidad máxima de la muestra, porque si es muy denso no podrán atravesar, pero si es muy bajo quedarán apelotonados todas abajo.

Isopícnica - cada partícula se quedará (se coloca) donde encuentra su propia densidad; para lipoproteínas (LDL) según su densidades; características => la densidad máxima del soporte fluido tiene que ser mayor a la densidad máxima de la muestra (porque si la muestra tiene componentes de 15 de densidad y el liquido solo 10, cuando centrifugamos los de 15, 13, 11... quedarán abajo sin separarse).

Definición de gradiente de densidad - es la distribución no homogénea de un fluido en la que concentración del mismo va de menos a mas (columna) consiguiéndose así una distribución gradual de densidad.