ANÁLISIS DE FLUJOS METABÓLICOS EN LA PRODUCCIÓN DE ÁCIDO CLAVULÁNICO A PARTIR DE Streptomyces clavuligerus CLAUDIA PATRICIA SÁNCHEZ HENAO Ingeniera Química, M.Sc. UNIVERSIDAD DE ANTIOQUIA FACULTAD DE INGENIERÍA DOCTORADO EN INGENIERÍA MEDELLIN (ANT.) 2013
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ANÁLISIS DE FLUJOS METABÓLICOS EN LA
PRODUCCIÓN DE ÁCIDO CLAVULÁNICO A PARTIR DE
Streptomyces clavuligerus
CLAUDIA PATRICIA SÁNCHEZ HENAO
Ingeniera Química, M.Sc.
UNIVERSIDAD DE ANTIOQUIA
FACULTAD DE INGENIERÍA
DOCTORADO EN INGENIERÍA
MEDELLIN (ANT.)
2013
ANÁLISIS DE FLUJOS METABÓLICOS EN LA
PRODUCCIÓN DE ÁCIDO CLAVULÁNICO A PARTIR DE
Streptomyces clavuligerus
CLAUDIA PATRICIA SÁNCHEZ HENAO
Ingeniera Química, M.Sc.
Tesis para optar al título de Doctora en Ingeniería
Director
JUAN CARLOS QUINTERO DÍAZ
Ingeniero Químico, M.Sc., Ph.D.
UNIVERSIDAD DE ANTIOQUIA
FACULTAD DE INGENIERÍA
DOCTORADO EN INGENIERÍA
MEDELLIN (ANT.)
2013
iii
Gracias Dios:
Por los dones que me has dado y por iluminarme
para saber cuál es el mejor camino a seguir,
por enseñarme a aceptar y aprender de las dificultades
y darme ánimos para seguir en la lucha de mis metas propuestas.
Porque he aprendido no sólo de los buenos resultados,
y de las excelentes personas que has puesto en mí camino,
sino también de aquellos que en ciertos momentos desearon hacerme daño.
Por permitirme ser un ser integral.
Debo este logro a la memoria de mi padre, por siempre creer en mí y brindarme su apoyo.
Inyectó energía a mi vida, mi hija, quien me motivo a continuar con mi trabajo.
Otra razón de inspiración, mi amor, quien me enseñó aprender a desaprender,
Sin duda, gracias a mis amigos y a toda mi familia por confiar en mí .
iv
AGRADECIMIENTOS
La autora expresa sus agradecimientos a:
La Universidad de Antioquia por su apoyo para iniciar mis estudios a través de la beca de
Estudiante instructor y posteriormente facilitar la culminación a través de Comisión de Estudios. Al
Departamento Administrativo de Ciencia, Tecnología e Innovación - COLCIENCIAS, por financiar
mi estudios a través de la Convocatoria de Doctorados Nacionales – 2007.
La Universidad de Antioquia y a Colciencias, por el apoyo económico al proyecto ―Modelado
metabólico de la producción de ácido clavulanico‖ a través del contrato 227 de 2009 y por el apoyo
para dotación a través del proyecto de Sostenibilidad.
Los profesores evaluadores Claudio Avignone-Rosa, Pablo Iván Nikel y Rodrigo Torres por su
colaboración y disponer parte de su tiempo para la revisión, mejoramiento y sustentación de este
trabajo.
El Profesor Juan Carlos Quintero Díaz, Director de la Investigación, por sus enseñanzas, por su
compresión, por la confianza depositada en mí y la motivación durante el desarrollo del trabajo.
Los profesores Paloma Liras y Juan Francisco Martín por permitirme realizar la pasantía en
INBIOTEC y brindarme las orientaciones y acompañamiento para la realización de los cultivos de
producción de ácido clavulánico en este trabajo.
Los profesores Silvia Ochoa C. y Rigoberto Ríos E. por sus orientaciones para la realización del
proyecto modelado metabólico de la producción de AC y por su apoyo en este trabajo.
La estudiante de Maestría Nathalia Gómez Grimaldos por permitir profundizar más en los aspectos
de modelado cinético y por toda su colaboración en la realización de las pruebas experimentales y
en especial por su amistad.
Al profesor Rodrigo Torres Sáez y sus estudiantes Cesar Vargas García y Carlos García Sánchez
por su apoyo en el manejo del software CellNetAnalyzer y algunos tips para el trabajo en modelado
metabólico en sistemas subdeterminado (FBA).
La profesora María Esperanza López y el Ingeniero Cesar Augusto Botache por confiar en mí, y ser
mis codeudores ante el ICETEX en el crédito condonable concedido por COLCIENCIAS. Al
profesor Mauricio Sánchez por confiar en mí al servirme de codeudor ante la Universidad de
Antioquia para acceder a la comisión de Estudios.
Los integrantes del Grupo de Bioprocesos por su compañía, apoyo e interés en el buen desarrollo
de este trabajo.
A los profesores del Departamento de Alimentos de la Facultad de Química Farmacéutica, por
creer en mí y tener paciencia para la buena culminación de mis estudios doctorales.
Y a todos aquellos que se me escapan sus nombres de la mente, pero están en mi corazón y que de
alguna manera han estado colaborándome, como amigos o como personas silenciosas, pero
importantes también para el cumplimiento de esta meta.
Tabla 1. 1. Formulaciones comerciales, prescripciones médicas y microorganismos susceptibles de provocar enfermedades infecciosas ................................................... 32
CAPÍTULO 2.
Tabla 2. 1. Relación simplificada entre los aminoácidos y su producto de biosíntesis en la vía principal del carbono y los aminoácidos productos de síntesis .......................... 72
Tabla 2. 2. Importancia biológica de los elementos químicos en los microorganismos. 76
CAPÍTULO 3.
Tabla 3.1. Parámetros del modelo cinético estimados con un 95% de nivel de confianza, que fueron utilizados para la simulación de la fermentación de S. clavuligerus. ............................................................................................................... 127
CAPÍTULO 4.
Tabla 4.1. Parámetros del modelo cinético estimados con un 95% de nivel de
confianza, que fueron utilizados para la simulación de la fermentación de S.
clavuligerus 149
Tabla 4. 2. Valores de flujos medidos obtenidos a dos tasas de dilución. ............... 151
Tabla 4. 3. Análisis de sensibilidad para los flujos calculados con respecto a cambios en los flujos medidos ................................................................................................. 153
Tabla 4. 4. Reacciones que corresponden a los flujos medidos de mayor incidencia en el sistema, de acuerdo con el análisis de sensibilidad. .............................................. 160
CAPÍTULO 5.
Tabla 5. 1. Flujos medidos a una tasa de dilución de 0.03 h-1. 177
Tabla 5. 2. Condiciones de evaluación de los flujos de algunos sustratos a
condiciones de limitación de nutrientes. 179
Tabla 5. 3. Comparación entre flujos experimentales y simulados para diferentes
funciones objetivos (tasa de dilución 0.03 h-1). 180
xii
LISTA DE FIGURAS
CAPÍTULO 1.
Figura 1. 1. Estructura química de algunos antibióticos β-lactámicos 34
Figura 1. 2. Diagrama esquemático de una penicilina genérica, la hidrólisis catalizada por
β-lactamasa 38
CAPÍTULO 2.
Figura 2. 1. Ciclo de vida de Streptomyces sp. en medio sólido. 46
Figura 2. 2. Presentación jerarquica de la taxonomia de Streptomyces 48
Figura 2. 3. Morfología macroscópica de colonias de Streptomyces coelicolor. 50
Figura 2. 4. Esquema simplificado de requerimiento de precursores para la biosíntesis
de antibióticos 53
Figura 2. 5. Ruta de biosíntesis de ácido clavulánico y bifurcación hacia-ruta de las
clavamas. 66
Figura 2. 6. Esquema de un sistema de elementos que se tienen en cuenta para el
modelado en bioprocesos 82
Figura 2. 7. Diagrama de flujo de los pasos a seguir en la solución al modelado
metabólico. 88
Figura 2. 8. Presentación esquemática de la metodología empleada para realizar AFM.
90
Figura 2. 9 Modelo simplificado del metabolismo de S. clavuligerus 94
Figura 2. 10. Matriz estequiométrica correspondiente al ejemplo de estudio 94
Figura 2. 11. Desarrollo del AFM 95
Figura 2. 12. Representación esquemática de la metodología empleada para realizar
FBA 101
CAPÍTULO 3
Figura 3. 1. Efecto del uso de diferentes medios de cultivo sobre la producción de ácido
clavulánico (AC) 123
xiii
Figura 3. 2. Efecto de la concentración de glicerol (2, 5 y 10%), empleada como fuente
de carbono en cultivos de S. clavuligerus, sobre la producción de ácido clavulánico 125
Figura 3. 3. Cinética de fermentación de S. clavuligerus en un biorreactor de 5L,
empleando el medio 5 a una concentración de glicerol de 5%. 127
CAPÍTULO 4
Figura 4. 1. Representación esquemática del proceso de producción de AC en lote y en
continuo. 135
Figura 4. 2. Representación esquemática de la red bioquímica empleada para AFM en
Sc. 143
Figura 4. 3. Cinética de fermentación de S. clavuligerus en un biorreactor de 3L,
empleando el medio químicamente definido. 148
Figura 4. 4. Distribución de flujos metabólicos de la producción de AC a partir de
Streptomyces clavuligerus (Sc). 163
CAPÍTULO 5.
Figura 5.1. Representación sintética de la red bioquímica empleada para modelado
metabólico en Sc. 173
Figura 5.2. Representación simplificada de la red metabólica de Sc, incluyendo los flujos
intracelulares más representativos. 182
Figura 5.3. Efecto de la disminución del flujo de glicerol, sobre el flujo de AC y de
biomasa y sobre los flujos internos, "In Silico" para S. clavuligerus. 184
Figura 5.4. Efecto de la disminución del flujo de amonio, sobre el flujo de AC y de
biomasa y sobre los flujos internos, " In Silico" para S. clavuligerus. 185
Figura 5.5. Efecto de la disminución del flujo de oxígeno, sobre el flujo de AC y de
biomasa y sobre los flujos internos, " In Silico" para S. clavuligerus. 187
Figura 5.6. Efecto de la disminución del flujo de fosfato, sobre el flujo de AC y de
biomasa y sobre los flujos internos," In Silico" para S. clavuligerus. 189
xiv
LISTA DE APÉNDICES
CAPÍTULO 4
APÉNDICE A. Modelo de reacciones metabólicas para producir ácido clavulánico a
partir de Sc. 194
APÉNDICE B. Análisis de sensibilidad y de flujos metabólicos
Tabla B1. Análisis de sensibilidad de los flujos considerados como medidos. 196
Tabla B2. Análisis de flujos metabólicos, a dos tasas de dilución, en la producción de AC
a partir de S. clavuligerus. 197
CAPÍTULO 5
APÉNDICE A. Modelo de reacciones metabólicas para producir ácido clavulánico a partir
de Sc¡Error! Marcador no definido.
198
LISTA DE ANEXOS
ANEXO 1. IMPACTOS DEL TRABAJO DE INVESTIGACIÓN 201
ANEXO 2. PRODUCCIÓN CIENTÍFICA DERIVADA DE LA TESIS 205
Figura 1.1. Estructura química de algunos antibióticos β-lactámicos: La naturaleza de los sustituyentes R es responsable de cambios en las propiedades químicas y biológicas de las moléculas.
ON
S
COOH
NHCR
OCH3
CH3
12
34
56
7
R1
ON
SNHC
O
R2
OOH
7
8
1
3
4
2
5
6
SO3HON
NHCR
O
O
OH
ON
C
S-R
.R1
ON
O
CO2H
CH2
H
OH
S
N
COOH
O
OCH3
OCONH2
NH
O
NH2
COOH
35
embargo presentan más resistencia a las β-lactamasas y tienen un espectro de actividad
antibacterial más amplio que las penicilinas, gracias al desarrollo de modificaciones
semisintéticas de los radicales R1 y R2 [2, 13]. Entre los productos comerciales esta la
Cefalexina. Las cefamicinas son similares a las cefalosporinas, la única diferencia es
que tienen un grupo metoxi en el ácido 7-aminocefalosporánico. Son producidas por
hongos productores de β-lactamasa (Cephalosporium acremonium ), sin embargo se
han encontrado especies de Streptomyces (como clavuligerus) productoras tanto de
penicilinas como de cefalosporinas [2, 13]. Un producto comercial es la Cefamicina C,
con un anillo ß-lactámico, un anillo dihidrotiacínico, una cadena lateral de ácido α-
aminoadípico, un grupo metoxi en el carbono C-7, y un grupo carbamato en C-3.
c) Otros β-lactámicos no convencionales son las monobactamas, carbapenems,
clavamas y nocardicinas. El principal mecanismo de acción de estos compuestos es la
inhibición de la síntesis de la pared celular por lo que alteran la integridad de la
membrana citoplasmática impidiendo la síntesis de proteínas y la síntesis de los ácidos
nucleicos. Las monobactamas son antibióticos ß-lactámicos mono cíclicos que
interactúan con las PBP induciendo la formación de largas estructuras bacterianas
filamentosas. En caso de ser alérgico a la penicilina se usa una monobactama
[3,14].Clavamas es una familia de compuestos con una estructura básica de anillos
similar al del ácido clavulánico, pero son opuestos en su configuración estereoquímica.
La clavamas diferentes al AC poseen estructura 3S, 5S por lo que carecen de actividad
inhibidora de ß-lactamasas, pero algunos poseen actividad anti fúngica o antibacteriana.
Como modelo, la alanil-clavama posee actividad bacteriostática frente a bacterias Gram-
positivas y Gram-negativas y frente a hongos, mediante la inhibición de la enzima
homoserina transacetilasa, que participa en la biosíntesis de metionina [3, 14].
36
Entre las calvamas, está el ácido clavulánico, una molécula inhibidora de β-lactamasas.
Se han realizado diversos estudios para determinar la eficacia clínica de varios
inhibidores de β-lactamasas bacterianas (AC, sulbactam, tazobactam) donde se ha
demostrado que el AC tiene mayor efectividad sobre bacterias aerobias y anaerobias
[13-15].
1.2. RESISTENCIA MICROBIANA A LOS ANTIBIÓTICOS.
El problema de resistencia de microorganismos Gram negativos a los antimicrobianos β-
lactámicos se describe a partir de 1960, cuando aparecieron cepas de Escherichia coli
productoras de β-lactamasas. Posteriormente también se describieron Klebsiella
pneumoniae, Haemophilus influenzae, Neisseria gonorrhoeae, resistentes a β-lactámicos
por producción de β-lactamasas[11, 16]. La resistencia a los antibióticos es un ejemplo
de como las bacterias desarrollan de forma natural nuevos fenotipos a través de
combinaciones de mecanismos difíciles de predecir y los cuales pueden estar
influenciados por el ambiente, el cual juega un papel importante en la selección y
mantenimiento de tales fenotipos [10, 14].
Los antibióticos son empleados para eliminar la capacidad de reproducción
bacteriananas atacando partes específicas en su estructura. Sin embargo estas bacterias
pueden generar mecanismos que las protegen de la actividad de los antibióticos. Entre
los mecanismos de resistencia que han sido identificados se encuentran: i) La
producción de enzimas principalmente en bacterias Gram negativas que destruyen el
antibiótico, especialmente de la familia de β-lactámicos y aminoglucósidos, ii) Cambios
en los sitios activos de las PBP que disminuyen la afinidad por los antibióticos β-
lactámicos, esta información se pasa a través de transformación natural y recombinación
37
de DNA con otros organismos confiriéndoles a las células resistencia. iii) El desarrollo
de proteínas complejas capaces de bombear el antibiótico hacia fuera de la célula, iv)
Modificaciones en la molécula de la célula que es objetivo del antibiótico [10, 11].
Las de β-lactamasas se clasifican en cuatro clases: A, B, C y D. Las pertenecientes a las
clases A, C y D poseen serina (SER) como el nucleófilo en un sitio activo, mientras que
en la de clase B un ión metálico (Zn2+
) es responsable de la inactivación de las β-
lactamasas. En Enterobacteriaceae (por ejemplo, en Escherichia coli y Klebsiella
pneumoniae) las β-lactamasas más frecuentes pertenecen a la clase A [19]. En la
actualidad la mayor parte de estudios están orientados a entender el mecanismo de
acción de β-lactamasas tipo A, donde algunas de ellas son inhibidas irreversiblemente
por AC, Sulbatam y Tazobactam [8, 11].
Las β-lactamasas (E.C. 3.5.2.6) son enzimas bacterianas periplásmicas (hidrolasas) que
son producidas principalmente en bacterias del género Enterobacteriaceae y son
responsables de la resistencia que estas bacterias presentan frente a la penicilina,
cefalosporina y carbapenems. Las enzimas hidrolizan el anillo β—lactámico, el cual
inactiva las propiedades antibacteriales de la molécula. En la figura 1.2 se presenta de
forma esquemática el mecanismo de reacción de hidrólisis de un genérico de penicilina
denominado como antibiótico activo (AA) con la enzima β-lactamasa (E). Con la
reacción horizontal se representa como la enzima β-lactamasa reacciona con parte de la
estructura del antibiótico denominada ácido 6-aminopenicilánico, del cual se derivan las
penicilinas, desdoblando esta estructura (antibiótico inactivo) y regenerándose la
enzima, esto se da en varias etapas que son mostradas en detalle en las referencias [11,
17]. Para evitar la destrucción del antibiótico, este se aplica en combinación con algún
inhibidor de las β-lactamasas (I) (reacción vertical en la figura 1.2), las β-lactamasas
38
reaccionan con el anillo β-lactámico de estos inhibidores formando el complejo EI de
forma covalente e irreversible, quedando disponible la penicilina para ser enlazada a la
PBP y provocar la destrucción de la célula por lisis osmótica [11, 17].
Figura 1. 2. .Diagrama esquemático de una penicilina genérica, la hidrólisis catalizada por β-lactamasa (parte superior) e inhibidores de β-lactamasa en la parte inferior [17].
1.3. PRODUCCIÓN INDUSTRIAL DE β-LACTÁMICOS
El desarrollo de diversas formulaciones requiere de una alta producción industrial de AC
[15, 18, 19]. Los antibióticos generaron ventas por USD 42 mil millones en el mercado
global, en 2009. Aproximadamente el 50% de las ventas corresponden a productos β-
[17] P. Carey, Y. Chen, B. Gong and M. Kalp, ―Review. Kinetic crystallography by Raman
microscopy,‖ Biochimica et Biophysica Acta, vol. 1814, pp. 742–49, 2011.
[18] R. Li and C. Townsend, ―Rational strain improvement for enhanced clavulanic acid
production by genetic engineering of the glycolytic pathway in Streptomyces
clavuligerus,‖ Metabolic engineering, vol. 8, no. 3, pp. 240–52, 2006.
[19] K.- Chen, Y. Lin, J. Wu and S. Hwang, ―Enhancement of clavulanic acid production in
Streptomyces clavuligerus with ornithine feeding,‖ Enzyme and Microbial Technology,
vol. 32, pp. 152–156, 2003.
[20] A. So, N. Gupta, S. Brahmachari, I. Chopra, et al, ―Towards new business models for
R&D for novel antibiotics,‖ Drug resistance update, vol. 14, no. 2, pp. 88–94, 2011.
[21] M. Jurgens, G. Seidel, and K. Schugerl, ―Production of Cephalosporin C by Acremonium
chrysogenum in semisynthetic medium,‖ Process Biochemistry, vol. 38, no. 2, pp. 263–
72, 2002
[22] J. Teodoro, A. Batista-Neto, M. Araujo, C. Hokka and A. Badino, ―Influence of glycerol
and ornithine feeding on clavulanic acid production by Streptomyces clavuligerus,‖ vol.
27, no. 4, pp. 499 – 506, 2010.
[23] L. Gordon Cambell and L. Lilley, ―Clavulanic Acid Production,‖ U.S. Patent 1, 571,
888, 1980.
[24] T. Olleros Izard, J. L. Fernández Puentes and M. A. Moreno Valle, ―Procedimiento para
Mejorar la Extracción de ácido clavulánico,‖ U.S. Patent 537, 158, 1984.
43
CAPITULO 2
METABOLISMO DE S. Clavuligerus
En los últimos 20 años, se han desarrollado unas estrategias de modelado del
metabolismo celular, con el objetivo de identificar a partir de un análisis sistémico y
racional, los cuellos de botella en las rutas de biosíntesis de metabolitos de interés.
Eliminar estas limitaciones permitiría incrementar los rendimientos de productos así
como encontrar nuevos productos de interés. La aplicación de estas estrategias mediante
el uso de técnicas para el análisis racional del metabolismo celular que facilite y oriente
las posteriores estrategias de manipulación genética con el objetivo de mejorar los
bioprocesos, se conoce como Ingeniería Metabólica (IM). En la actualidad, la IM se
viene aplicando con acelerado crecimiento permitiendo entender mucho mejor los
procesos de biocatálisis orientados a maximizar el rendimiento y la productividad de
metabolitos de interés en campos, como Biotecnología de alimentos, Biotecnología
ambiental y, más recientemente, Biotecnología farmacéutica [1, 2, 3]. En este último
campo se han logrado obtener titulaciones más altas de algunos β-lactámicos y el
desarrollo de nuevos productos de interés farmacéutico [3]. La metodología incluye el
análisis de la capacidad celular, análisis de flujos metabólicos, análisis de control
metabólico (MCA) y síntesis de sistemas e integración de datos bioinformáticos. Dentro
de los trabajos para el mejoramiento de la producción de compuestos β-lactámicos se
han empleado como modelos diversas especies del género Streptomyces. Existen pocos
44
trabajos en los cuales se ha aplicado IM para incrementar la titulación de ácido
clavulánico (AC), inhibidor de β-lactamasas.
En este capítulo se presenta una discusión sobre el metabolismo de S. calvuligerus que
permitirá establecer el mapa o modelo metabólico que se empleará más adelante para
trabajos de análisis de flujos metabólicos (AFM) y análisis de balance de flujos
metabólicos (ABM).
2.1. BIOLOGIA DE Streptomyces sp.
2.1.1. Ciclo de Vida:
Los Estreptomicetos presentan un ciclo de vida complejo que implica procesos de
diferenciación morfológica y fisiológica. Estas bacterias son capaces de colonizar
sustratos con restos de materia orgánica, formando una red de hifas ramificadas y
septadas que dan lugar al ―micelio sustrato‖. Estas hifas obtienen los nutrientes de la
degradación del material orgánico insoluble gracias a sus numerosas enzimas
hidrolíticas [4, 5, 6]. En una primera fase, las zonas más alejadas de la fuente de
nutrientes empiezan a acumular sustancias de reserva (lípidos, glucógeno, etc.) hasta que
en un determinado momento, debido a la carencia de nutrientes reciben una serie de
señales en esta zona, que disparan la expresión de genes implicados en la formación del
micelio aéreo. Se produce así, el desarrollo de hifas que emergen del ―micelio sustrato‖
para dar lugar al micelio aéreo. Estas hifas se nutren de los productos de degradación
del micelio sustrato ―viejo‖, y en una segunda etapa sufren un proceso de curvatura,
enrollamiento, formación de septos y engrosamiento de la pared celular para dar lugar a
una cadena de esporas uninucleares, que se liberan al medio y que con las condiciones
adecuadas, germinan y desarrollan un nuevo micelio sustrato [5, 6]
45
El interés científico en las bacterias del género Streptomyces radica fundamentalmente
en dos importantes características: i) Su rico metabolismo secundario y ii) La
diferenciación morfológica que acompaña al primero (i) y se basa en el desarrollo
secuencial de un micelio aéreo, hifas y finalmente esporas descritas más adelante (ver
figura 2.1). Cuando una espora de Streptomyces se libera al medio ambiente y encuentra
las condiciones necesarias para su germinación, se pone en marcha una compleja
maquinaria molecular capaz de llevar a cabo un control genético temporal y espacial que
culmina con la formación de varios tejidos: micelio substrato, micelio aéreo y más
esporas, características morfológicas y fisiológicas similares a la de los hongos. Si bien
todas estas características asociadas a la bacteria Streptomyces son muy similares a la de
los organismos eucariotas multicelulares, las características celulares (típica de
procariotas) y el mecanismo de reproducción son muy diferentes. En la figura 2.1 se
presenta en forma gráfica y sintética el ciclo de vida de Streptomyces sp, y a
continuación se presenta en mayor detalle la forma como se lleva a cabo la interacción
micelio-sustrato [6, 7]:
Desarrollo del micelio sustrato: Cuando germina una espora unigenómica se forma un
tubo de germinación mediante crecimiento apical de la pared celular. Posteriormente las
células empiezan a desarrollar ramificaciones laterales logrando estabilizar la tasa de
crecimiento comenzando la septación [6, 7]. Las partes de micelio más viejas
comienzan a septarse, formando zonas apicales y sub-apicales. En las sub-apicales a
pesar de que aún hay síntesis de ADN, y se detiene el crecimiento de la pared celular
(en ocasiones, nuevas ramificaciones pueden aparecer en los compartimentos sub-
apicales, lo que lleva consigo la recuperación de ciertas características de la región
apical) [6]. Poco a poco el micelio sustrato se va expandiendo, la región más vieja se va
46
aglomerando y empiezan a ocurrir cambios en la colonia que llevarán a la creación de
micelio aéreo.
Figura 2. 1. Ciclo de vida de Streptomyces sp. en medio sólido. (a) Inicialmente un micelio filamentoso coloniza su sustrato. (b) Tras un periodo de crecimiento asimilativo, las hifas aéreas crecen hacia la atmósfera. (c) Posteriormente se septan (tabicación). Para (d) formar cadenas de esporas pigmentadas [3].
Desarrollo del micelio aéreo: Una vez desarrollado el aglomerado de hifas sobre el
sustrato, este se torna muy compacto en la zona central (y ancestral) donde ocurre un
agotamiento de las reservas de nutrientes y varios tipos de estrés fisiológico comienzan a
ejercer presión selectiva sobre la expresión de determinados genes. El
acondicionamiento a estos fenómenos está probablemente mediado por el gen relA y
nucleótidos polifosforilados como ppGpp [6, 8, 9]. Este fenómeno es conocido como
respuesta estricta y se basa en los siguientes mecanismos: i) El metabolismo primario se
(a)
(b)
(c)
(d)
47
vuelve más lento; ii) comienza la inducción del metabolismo secundario (proteínas
extracelulares, antibióticos, etc.); iii) hay un metabolismo acumulativo en la superficie
de la colonia; iv) comienza la lisis de ciertas regiones del micelio sustrato y se inicia el
crecimiento aéreo [6, 10].
Existe una muerte celular programada en la interacción micelio sustrato por la cual la
síntesis de diversas enzimas extracelulares permite a la colonia degradar el micelio
sustrato muerto así como otra materia orgánica remanente en el medio. La acumulación
de los nutrientes en la superficie de la colonia, permite el crecimiento de las hifas
aéreas de una forma saprofita (se alimentan de los segmentos aún viables del micelio
sustrato) y posteriormente forman esporas para colonizar nuevas áreas y la síntesis de
los compuestos biocidas del metabolismo secundario. Estos dos mecanismos otorgan
una importante ventaja a la bacteria a la hora de dominar su nicho [10].
La morfología de Estreptomicetos en medio líquido no ha sido muy estudiada por
considerar que bajo estas condiciones no hay esporulación y por ende diferenciación
morfológica [10]. Al crecer el microorganismo en medio líquido, el ciclo de vida
descrito anteriormente no se observa normalmente. Dependiendo del tipo de agitación,
componentes del medio de cultivo pueden formar agregados miceliares sencillos o en
tipo de pelet, el tamaño y la forma de éstos son relativos a la especie. En medio de
cultivo químicamente definido se tiene un crecimiento más disperso que el presentado
en medio de cultivo complejo con hidrolizados de harina soja. En este tipo de cultivos,
algunos componentes del medio, como el anti-espumante, almidón o agar a bajas
concentraciones pueden favorecer la dispersión del microorganismo, lo cual es bueno
para minimizar algunos problemas de transferencia de O2 y de nutrientes que se pueden
presentar. Sin embargo, el crecimiento disperso es frecuentemente acompañado por una
48
inhibición de metabolismo secundario. Indicando esto una relación entre la morfología y
la diferenciación fisiológica y la existencia de alguna señal involucrada en ambos
procesos de diferenciación [10].
2.1.2. Clasificación del microrganismo en estudio:
Hay aproximadamente 1017 especies de Streptomyces, de las cuales unas 100 son de
interés para la industria farmacéutica. Una clasificación de esta especie se basa en sus
características morfológicas, nutricionales y fisiológicas (ver la figura 2.2). Los
estreptomicetos antifúngicos son el más grande género de producción de antibióticos, el
cual produce antibacteriales y anti fúngicos, y un amplio rango de compuestos
bioactivos tales como immunosupresantes [7, 11, 12].
Figura 2.2. Presentación jerárquica de la taxonomía de la bacteria Streptomyces [11].
Streptomyces clavuligerus fue originalmente aislada de una muestra de suelo de América
del Sur, y se empleó inicialmente como productora de cefalosporinas. El nombre
clavuligerus se debe a la forma de bastón de las ramificaciones cortas que dan lugar a las
cadenas de esporas (del Latín clavula, pequeños bastones, e -igerus, que lleva). S.
Dominio: Bacteria
Phylum: Actinobacteria
Clase I: Actinobacteria
Subclase V: Actinobacteridae
Orden I: Actinomycetales
Suborden XIV:Streptomycineae
Familia I: Streptomycetaceae
Genero I: Streptomyces
49
clavuligerus está clasificado dentro de la Serie Gris de la Categoría IV del género
Streptomyces, con base en el color verde-grisáceo oscuro de las esporas maduras [11].
2.1.3. Generalidades de algunos Estreptomicetos:
Los Actinomicetos del género Streptomyces son los principales productores de
compuestos bioactivos para la industria biotecnológica [4, 5]. Son fuente de antibióticos
y biocompuestos de aplicación contra diversas enfermedades incluyendo el cáncer, así
como una amplia variedad de sustancias químicas inhibidoras de diversos procesos
celulares, como fungicidas, citostáticos, moduladores de la respuesta inmune y efectores
para el crecimiento de plantas [5, 10].
Los Estreptomicetos están ampliamente distribuidos en la naturaleza, siendo el suelo su
hábitat más común, aunque también se han hallado en lechos marinos [4, 12]. Están
actualmente clasificados como bacterias debido a que poseen una pared celular con
características bioquímicas que se asemejan más a las de bacterias que a los de hongos.
Su similitud con estos reside en su morfología filamentosa (figura 2.3), pero se
diferencian notablemente por el reducido diámetro de su filamento vegetativo. Presentan
otras características típicas de procariotas tales como la carencia de núcleo definido,
mitocondrias y cloroplastos [4]. Los Estreptomicetos son bacterias aerobias, Gram
positivas y con un elevado contenido de guanidina y citosina (G + C) en el DNA de 69-
78 % mol.
Las bacterias del género Streptomyces son productoras de más de la mitad de los
antibióticos conocidos. También son productoras de gran cantidad de enzimas
extracelulares de interés en el sector industrial, entre las que destacan: proteasas,
celulasas, nucleasas, amilasas, lipasas, quitinasas y xilanasas [4].
50
Figura 2. 3. Morfología macroscópica de colonias de Streptomyces coelicolor (www.ecured.cu/index.php/Actinomiceto, junio 2013)
.
Los Estreptomicetos más ampliamente estudiados son: S. grieseus, la primera especie
utilizada para la producción comercial de antibióticos (estreptomicina) y S. coelicolor,
que es la cepa más ampliamente usada en los laboratorios de investigación. Los genomas
de estas dos especies han sido secuenciados, encontrando cromosomas lineales (8-10
Mb) que contienen más de 7000 genes, entre los cuales el 45% es común entre si [5].
Las redes metabólicas de estos microorganismos han servido de base para el
secuenciamiento de S. clavuligerus, del cual se cuenta ya con un 100% del genoma [13].
Streptomyces clavuligerus (Sc) produce un número de compuestos β-lactámicos,
incluyendo cefamicina C, ácido clavulánico (AC) y al menos otros cuatro metabolitos
de la familia de las clavamas cuyas rutas de biosíntesis son aún desconocidas [14]. El
AC y las clavamas difieren de la cefamicina C, por presentar un núcleo bicíclico que
contiene un átomo de oxígeno en lugar de un átomo de azufre, como ocurre en los
antibióticos más convencionales del tipo de la cefamicina [15]. De las clavamas,
solamente el ácido clavulánico (AC) posee actividad inhibitoria de β-lactamasa por su
NGC (ácido N-glicilclavamínico)NGC (ácido N-glicilclavamínico)ACM (ácido clavamínico) NGC (ácido N-glicilclavamínico)ACM (ácido clavamínico) NGC (ácido N-glicilclavamínico)
Tabla 2. 1. Relación simplificada entre los aminoácidos y su producto de biosíntesis en la vía principal del carbono y los aminoácidos productos de la síntesis.
Aminoácidos Producto
ALA(1), SER(1), CYS(3) Y GLY(2) PYR
THR(1), LYS(10), LEU(8), TYR(7), PHE(8) Y
TRP (12)
ACCOA
GLU(1), GLN(2), PRO(3), ARG(4), HIS (5) aKG
ME(9), ISOLEU(9) Y VA (8) SUCCOA
ASP(1) Y ASN (2) OAA Nota: El número entre paréntesis se refiere al número de reacciones necesarias para transformar el aminoácido en
producto.
Algunos medios de cultivo para Sc contienen una FN compleja tal como extracto de
levadura, licor de maíz, proteína vegetal, proteínas de semillas o hidrolizado de tales
72
proteínas. La proteína de harina de soja (o su hidrolizado) ha resultado ser el más
eficiente nutriente para la producción de AC [34, 62]. Al hidrolizar la proteína se obtiene
una mezcla de AAs, los cuales presentan un efecto cruzado entre ellos que favorece la
síntesis de AC y cuyo mecanismo no ha sido aún elucidado [47, 63].
2.3.2. Fuente de carbono:
La fuente de carbono (FC) por lo general es un monosacárido como glucosa o fructosa,
disacáridos como lactosa, polisacáridos como dextrinas, almidones y celulosa, polioles
como glicerol, aceites y alcoholes [61, 64]. La glucosa es atractiva como FC, sin
embargo, el catabolismo rápido de la glucosa y otros carbohidratos se ha visto que
disminuyen la velocidad de biosíntesis de antibióticos, por ejemplo se ha reportado que
inhibe síntesis de penicilina de P. chrysogenum y la síntesis de Cefalosporina y AC de
Sc [64]. Debido a la dificultad de Sc para utilizar glucosa, se han utilizado como FC
lípidos (aceites vegetales) [68-71] y glicerol [61, 72-74], los cuales favorecen tanto el
crecimiento como la producción de antibióticos.
Es importante tener en cuenta el reto que tienen los procesos biotecnológicos por ser
procesos económicos, sostenibles, que empleen fuentes renovables, que sean escalables,
entre los aspectos a tener en cuenta esta la selección de las fuentes de carbono y de
nitrógeno, entre otros. Evitar efectos adversos que dificulten las etapas de purificación y
concentración del producto [75]. Por ejemplo emplear como FC lípidos, los cuales
presentan baja solubilidad en el medio de cultivo, lo que sirve como medio para evitar
represión catabólica. Los microorganismos al consumir lípidos exigen un mayor
requerimiento de oxígeno para su metabolismo, comparado con los carbohidratos.
Además hay necesidad de hacer tratamientos de purificación para eliminar los aceites
73
residuales [61, 64]. El emplear GLC como sustrato es ventajoso por no presentar los
problemas antes descritos (sustrato empleado actualmente a nivel industrial) [76-77],
sino por ser una alternativa de aplicación de un subproducto de la industria del biodiésel
(10% de la producción total del biodiésel) [78]. Desde hace más de dos décadas se está
estudiando el papel que desempeña el glicerol como FC tanto para el crecimiento como
para la biosíntesis de AC a partir de S. clavuligerus. Existen reportes acerca de
represión catabólica por glicerol a concentraciones superiores de 2% (20g/L) [50] las
cuales se han mitigado por estrategias como variación de la concentración de GLC y de
la FN en el medio [79] así como estrategias de cultivo en lote alimentado con GLC [74],
estos cambios en el proceso lograron incrementar la titulación y la estabilidad del AC.
2.3.3. Estudios de efecto de fuente de fósforo.
Los microorganismos requieren para subsistir de algunos elementos nutricionales en
menor cantidad, adicionales a la fuente de carbono y nitrógeno como son fósforo,
azufre, potasio, magnesio, calcio y cloro, entre otros. Los fosfatos son la principal
fuente de fósforo (FP) para la nutrición microbiana, ya que en el crecimiento celular
muchas de las enzimas del metabolismo primario y la expresión de genes de síntesis de
macromoléculas se estimulan con fosfato (PO4) [80]. El fosfato, usado como agente
buffer en los medios de cultivo, es crítico para la biosíntesis de ácidos nucleicos y para
el metabolismo de energía [63]. Las concentraciones de fosfato óptimas para
crecimiento celular se encuentran en el intervalo de 0.3–300 mM [80], pero dependiendo
del tipo de producto que se quiera obtener, estos límites varían así, a concentraciones de
fosfato ≥100 mM en el medio de cultivo pueden reducir la producción de AC en un
80%. Concentraciones de fosfato ≥50 mM pueden reducir en un 50% la producción de
74
cefamicina [48]. Se encontró que en Sc, el fosfato reprime la biosíntesis de las
enzimas cefamicina sintetasa y AC sintetasa, involucradas en la síntesis de cefamicina y
de AC. En la presencia de 2mM de fosfato, las actividades de estas enzimas fueron más
altas que a una concentración de 75mM de fosfato [61, 81]. Bajo limitación de fosfato
se ha encontrado mayor producción de AC [50].
Se ha encontrado que el nivel de fosfato inorgánico en el medio de cultivo, tiene un
efecto regulatorio en la biosíntesis de muchos antibióticos, como actinorrodina e
undecilprodigiosin de para S. coelicolor. Bajo condiciones de limitación de fosfato, se
da la síntesis del nucleótido guanosina tetrafosfato ppGpp activa la transcripción para
cambios en la producción de genes de rápido crecimiento a producción de genes para
iniciar fase estacionaria de la célula que reducen el crecimiento por limitación del
nucleótido y se inicia el metabolismo secundario, y en caso de suficiencia de fosfato se
reprime la transcripción del grupo de genes en la biosíntesis de antibióticos [5, 80]. El
mecanismo de regulación del fosfato no ha sido aún esclarecido [8, 23]. Se ha sugerido
que la concentración de ATP es el mediador intracelular para la regulación del fosfato
[8, 64]. También se comprobó para varias especies de Streptomyces (lividans,
avermitilis, antibioticus y giseus) que el ATP trabaja como molécula reguladora,
cambios que se den en el ATP a nivel intracelular están relacionados con la producción
de antibióticos [82]
2.3.4. Efecto de elementos trazas.
Los elementos trazas, en los cuales se incluye el magnesio, cobre, hierro, cobalto,
molibdeno, manganeso, calcio, boro, zinc, sulfatos y cloruros, no sólo son muy
importantes para la nutrición microbiana, sino que algunos de estos pueden afectar la
75
producción de antibióticos. En la tabla 2.2 se presenta cada uno de los elementos
importantes dentro de la célula y su función [61]. Las sales de cobalto tienen un efecto
positivo en la producción de tienamicina a partir de S. cattleya [64]. Existen pocos
trabajos orientados a optimizar el efecto de los nutrientes en el medio de cultivo [25, 83].
Se ha encontrado que el incremento de la concentración de sulfato estimula la
producción de AC [84], mientras que se observa una mayor estabilidad de AC con el
aumento de la concentración de magnesio en el medio [85] y de acuerdo con el tipo de
sal (NaCl >, CaCl2, > MgSO4 > Na2SO4) que se mezcle [60].
2.3.5. Efecto del oxígeno
Los procesos aerobios requieren oxígeno para el crecimiento celular, por lo que es
necesario suministrarlo de forma adecuada [86], y se requiere también para reoxidar
NAD(P)H2 o FADH2 para generar ATP, necesario para el metabolismo [17]. Además,
el suministro de oxígeno tiene un efecto importante tanto en la biosíntesis de AAs [27,
87] como en la biosíntesis de antibióticos en microrganismos aerobios [17], como en el
caso de Sc, el oxígeno es requerido para biosíntesis de AC [27, 32].
En un cultivo sumergido, la velocidad de transferencia de oxígeno está dada por la
ecuación (3)
(3) ]2[
OUROTRdt
Od
76
Tabla 2. 2. Importancia biológica de los elementos químicos en los microorganismos [58].
Elemento Símbolo Número
atómico Función fisiológica
Hidrógeno H 1 Constituyente del agua celular y materiales celulares orgánicos
Carbono C 6 Constituyente de materiales celulares orgánicos
Nitrógeno N 7 Constituyente de proteínas, ácidos nucleicos y coenzimas
Oxigeno O 8 Constituyente del agua celular y materiales orgánicos tales como
aceptor de electrones en respiración de aerobios
Sodio Na 11 Principal catión extracelular
Magnesio Mg 12 Importante catión divalente celular, cofactor inorgánico para muchas
reacciones enzimáticas, incluidas las que involucran ATP.
Fosforo P 15 Constituyente de los fosfolípidos, coenzimas y ácidos nucleicos.
Azufre S 16 Constituyente de la cisteína, cistina, metionina y proteínas ((COA y
cocarboxilasa).
cloro Cl 17 Principal anión intracelular y extracelular
Potasio K 19 Principal catión intracelular, cofactor para algunas enzimas.
Calcio Ca 20 Importante catión celular, cofactor para enzimas como las proteinasas.
Manganeso Mn 25 Catión cofactor inorgánico, cofactor para enzimas como las
proteinasas.
Hierro Fe 26 Constituyente de citocromos y otros hemo y no hemo proteínas,
cofactor para muchas enzimas
Cobalto Co 27 Constituyente de la vitamina B, y sus coenzimas derivadas
Cobre Cu 29 Constituyente inorgánico de enzimas especiales
El cambio de la concentración de oxígeno con el tiempo está dado por la diferencia entre
velocidad de transferencia de oxígeno (OTR) y la velocidad de consumo de oxígeno por
la célula (OUR).
77
El OTR se relaciona con parámetros físicos de operación mediante la relación (4)
) C - * (C KL.a = OTR (4)
El OTR corresponde a la cantidad de oxígeno entregada al sistema, y está expresado en
unidades de mmol O2 L-1
h-1
. En la ecuación (4), KL es el coeficiente de transferencia de
masa interfacial, a es el área interfacial entre la fase gaseosa y liquida, C*, es la
concentración de saturación del oxígeno en el líquido, y C es la concentración de
oxígeno.
La OUR está dada por la ecuación (5).
(5) XQOOUR 2
El QO2X corresponde a la demanda de oxígeno por parte de las células, y se expresa en
unidades de mmol O2 L-1
h-1
donde QO2 es la demanda específica de oxígeno (mmol O2
gx-1
h-1
) y X es la concentración de biomasa (gx L-1
) [86].
Algunas investigaciones muestran que los niveles de oxígeno disuelto (OD) influyen en
la interacción entre las reacciones metabólicas y los mecanismos de regulación genética,
así como en la formación de productos y subproductos en los procesos de producción de
metabolitos secundarios a partir de Streptomyces [8-89]. Se encontró que a valores de
OD inferiores al 10% no hay producción penicilina a partir de P. chrysogenum [90].
En la producción de cefamicina C de Streptomyces clavuligerus se encontró que durante
la trofofase, el OD baja hasta 0% y para la idiofase este alcanza un valor de 50% y si se
mantiene el oxígeno en valores altos se logra altos rendimientos [88]. Valores de OD
superiores a 20% suplen las necesidad de oxígeno para la producción de AC de Sc.
Enriquecer el aire con oxígeno no representa mejoras en la producción, mientras que
variaciones en las condiciones de aireación y de agitación si mostraron cambios
78
favorables significativas en la titulación de AC, en la producción y en la OUR [89]. Una
estrategia de suministro de oxígeno moderada y por etapas representó un aumento en la
producción de ARG y la disminución de subproductos para Corinobacterium crenatum
[87].
Entender las características fisiológicas de los microorganismos en la producción de
metabolitos secundarios bajo diferentes condiciones metabólicas de asimilación de
oxígeno, empleando un método sistémico como el AFM, puede proporcionar
información interesante que permita entender y conocer los mecanismos metabólicos del
proceso. Basados en la información y el conocimiento obtenido por AFM se pueden
establecer estrategias de suministro óptimo de oxígeno que favorezcan el producto. Los
trabajos en los cuales se muestran interrelación entre perfiles de velocidad de consumo
de oxígeno con los flujos de metabolitos y producto es muy limitada [47, 87].
2.4. TIPO DE OPERACIÓN: LOTE, LOTE ALIMENTADO y
CONTINUO.
Las fermentaciones pueden ser operadas en reactores en lote, lote alimentado (LA) y
continuo. En reactor en lote todos los componentes, excepto los sustratos gaseosos tales
como oxígeno, agentes de regulación de pH y de espuma son adicionados al reactor al
inicio de la fermentación. En el proceso en lote alimentado, no se remueve nada del
reactor durante el proceso, pero el medio de cultivo o alguno de sus componentes, es
adicionado continuamente a modo de controlar la velocidad de reacción para evitar
efectos de represión catabólica sea por FC o FN. En un proceso continuo hay suministro
constante de nutrientes y salida constante de productos, regulando los caudales de
modo que el volumen de cultivo se mantiene constante y el sistema se mantiene en un
79
estado estacionario. La operación en continuo es más eficiente que en lote o LA en
términos de tiempo de proceso, debido a que hay menos tiempo muerto debido a la carga
y descarga de productos [61].
Para la producción de antibióticos han sido muchas las estrategias de modificación del
proceso empleadas hasta el momento. En el caso de AC se han realizado estudios
comparando estos tres tipos de procesos (lote, LA y continuo) para determinar el efecto
de la variación operacional sobre el producto, obteniendo titulaciones de AC de 194, 404
y 293 mg L-1
en lote, LA y continuo respectivamente. La productividad fue mayor en el
continuo obteniendo 10.6 mg L-1
h-1
, casi tres veces a la obtenida en lote, encontrando en
el proceso continuo una estrategia prominente para producir AC [91].
Cultivos en lote se han empleado para estudiar el efecto de algunos nutrientes, tratando
de optimizar un medio para la producción de AC. Variando la FN, se obtuvieron
titulaciones de AC de 380 mg L-1
para una concentración de aislado de proteína de soja
de 20 g L-1
(3 g de N total L-1
) [70].
Cultivos en lote alimentado se han empleado para controlar la velocidad de
crecimiento, prolongar la fase estacionaria y contrarrestar algún efecto de inhibición o
represión de algún metabolito. En la producción de AC, el sustrato más utilizado en este
tipo de procesos es el glicerol (GLC) [34, 70, 92], también se han empleado como
sustrato mezclas de GLC con un aminoácido sea ORN o ARG [34, 73], observando la
duplicación de la producción con respecto al lote, con títulos de 250 mg L-1
y mayor
estabilidad del producto en todos los casos [34, 73].
Cultivos en continuo se han empleado para recopilar información que permita hacer
análisis de flujos metabólicos, en el cual a través de ciertas herramientas matemáticas se
80
pueden establecer los flujos al interior de la célula [24, 93]. La discusión sobre esta
metodología se presenta en la sección 2.5.3.2.
2.5. MODELADO Y SIMULACIÓN EN BIOPROCESOS.
El modelado y la simulación juegan un papel muy importante en la optimización de
bioprocesos. Clásicamente, los modelados cinéticos de los procesos tienen como
objetivo, obtener algún parámetro que pueda predecir su comportamiento y obtener
criterios para escalar o hacer alguna variación en el proceso. Esto ha ido cambiando en
los últimos 20 años, en donde paulatinamente ha venido incursionando el concepto de
modelado metabólico, con el cual se permite un mayor acercamiento al comportamiento
celular como tal y se puede conocer más en detalle cómo se distribuyen los flujos
metabólicos para establecer posibles cuellos de botella y limitaciones estequiométricas
o energéticas. Esta información puede relacionarse con alguna estrategia de tipo
molecular para entender y optimizar los procesos. Puede decirse que la mayoría de los
trabajos orientados a mejorar y optimizar los procesos biológicos para la síntesis de
metabolitos de interés, están enfocados desde la observación macroscópica de los
fenómenos, y que con el modelado metabólico se logra un enfoque molecular de los
bioprocesos analizando las rutas bioquímicas que incluyen las reacciones de ensamble,
polimerización, biosíntesis y combustión.
En la figura 2.6 se presenta de manera esquemática un sistema de bioprocesos y alguno
de sus componentes. Se observa en dicha figura un sistema multi-jerarquico de
interacción entre variables intra y extra-celulares donde el propósito general es
maximizar productividad y rendimiento. A nivel extracelular (macroscópico) el
concepto de velocidad específica de crecimiento se usa no sólo como un importante
81
parámetro que indica la actividad microbiana, sino también como un parámetro cinético
en el campo de ingeniería de las reacciones para diseño de bioreactores y plantear
estrategias de operación. Así, las velocidades específicas de reacción se definen como
flujos de reacción de metabolitos extracelulares tales como sustratos y productos, los
cuales son parámetros útiles para el modelado metabólico. Al considerar el proceso
como un sistema en estado estacionario, se pueden plantear reacciones estequiométricas
que corresponden a balances de sustratos, productos, energía, incluye reacciones de
transporte, polimerización. Estas reacciones estequiométricas se pueden resolver por
análisis de flujos metabólicos y síntesis de los resultados. Si en el sistema se consideran
las reacciones cinéticas y un estado dinámico, se habla de control metabólico y el
sistema se resuelve por análisis de control metabólicos. En la parte inferior de la figura
2.6 se observa como a medida que se profundiza en el conocimiento del funcionamiento
celular, la descripción de los sistemas se hace más compleja y por ende se requiere de
mayor número de variables y del uso de herramientas computacionales que permitan
ayudar a organizar, manejar y obtener información de una manera sistémica. Para el
modelado metabólico se requiere de información de la ruta metabólica, la cual se puede
obtener de reportes bibliográficos o bases de datos científicas (como se explica en la
sección 2.2), el modelado metabólico se va haciendo tan complejo como se requiera, a
medida que se van adicionando reacciones de diferente tipo, hasta llegar a incluir
reacciones de tipo genético. El análisis y solución de los modelos metabólicos generados
requieren del uso de programas matemáticos de alta especialización [94, 95].
82
Figura 2. 6. Esquema de un sistema de elementos que se tienen en cuenta para el modelado en bioprocesos. El recuadro subrayado simboliza la célula y cada cuadro interno se refiere al nivel de complejidad para las variables del modelo. La metodología de solución al problema corresponde a modelado macroscópico y modelado metabólico [94].
A continuación se describirán algunos aspectos relevantes en el modelado cinético y
metabólico a tener en cuenta, orientados en su mayoría a casos de estudio con
Streptomyces sp.
2.5.1 Modelado cinético de Streptomyces sp.
Todo el esfuerzo realizado para poder construir un modelo matemático que describa un
sistema en estudio, se ve recompensado al obtener una herramienta para analizar en
forma cualitativa y cuantitativa, permitiendo su utilización para realizar predicciones,
optimización, control y diseño de equipos o para la determinación de nuevas condiciones
operacionales que mejoren el comportamiento del sistema [79].
En los modelos dinámicos propuestos para las fermentaciones, la concentración de
biomasa, sustrato y producto son variables temporales, que permiten evaluar la
evolución de la fermentación. Para describir la relación entre la velocidad de
crecimiento y la concentración de sustrato, se han propuesto diferentes modelos de
Propósito en el proceso:
Aumentar la
productividad y el
rendimiento
Velocidades específicas de: crecimiento
consumo de sustrato
formación de producto
formación de CO2
consumo de O2
formación de subproductos.
•Flujos metabólicos:
estequimetría
polimerización
transporte
termodinámica
•Control metabólico
reacciones
•Bioinformática:
Genoma
Transcriptoma
Proteoma
Metaboloma
Variables extracelular
Variables intracelulares
< 10 10-103 103-105
Metodología
Y
herramientas
Modelado
macroscópico
Modelado metabólico:
Análisis de flujos metabólicos
Análisis de control metabólico
Síntesis
Número de
variables
Microarreglos
Electroforesis
LC-masas
83
crecimiento microbiano, dentro de los cuales el más famoso de ellos es la expresión
propuesta por Jaques Monod en 1943, sin embargo la falta de consistencia en muchas
ocasiones con los datos experimentales, ha conducido a desarrollar modelos alternativos
como los propuestos por Contois, Teissier, Moser, entre otros [96].
Mientras las simulaciones constituyen una herramienta esencial para el desarrollo de
nuevos productos en diversas áreas industriales, este no es el caso en el desarrollo de
bioprocesos en la industria farmacéutica. Una de las razones es la complejidad de los
sistemas biológicos y el poco entendimiento que hay aún de los mismos. Este sector se
vería beneficiado si se emprenden esfuerzos para desarrollar modelos matemáticos y
programas de simulación que permitan incrementar la productividad y reducir costos
del proceso [95].
A pesar de que los modelos cinéticos son una importante herramienta para la
optimización y control de procesos, existen pocos modelos planteados para describir las
dinámicas de los procesos de fermentación de Estreptomicetos [64, 97]. Algunos
modelos cinéticos generados son el de tipo logístico para predecir el comportamiento de
crecimiento de S. coelicolor y el modelo tipo Luedeking-Piret para modelar la
producción de actinorrodina, los cuales se ajustan bien a los datos experimentales [98].
Es de resaltar que una característica de la producción de metabolitos secundarios es que
la cinética del producto no está asociada al crecimiento [97- 98], sin embargo, en este
microorganismo, donde la producción de actinorrodina resulta estar asociada al
crecimiento [98], puede atribuirse a diferencias en la naturaleza de los medios
empleados (definido vs complejo); se tomó información de velocidad de crecimiento de
un sólo grupo de datos empleando medio definido, pero se trabajó en medio complejo.
A pesar de esta diferencia en la cinética del producto, los parámetros encontrados
84
estuvieron dentro del rango de valores esperados comparado con los obtenidos para
otros cultivos microbianos.
El complejo comportamiento dinámico de S. tendae se ha descrito usando un modelo
estructurado y compartimentalizado y extrapolándolo luego a otras especies. En este
caso se presenta la velocidad de crecimiento como una función del contenido de
algunos compartimentos intracelulares [99-100]. También se han empleado modelos
cinéticos de crecimiento celular como los de Contois, Monod, Tessier y Logístico en
cultivo en lote para S. peucetius productora de rodomicina, encontrando en el Logístico
un mayor ajuste al comportamiento de crecimiento y consumo de sustrato [101]. Para Sc
existen pocos reportes de modelado cinético, entre los que están el modelo tipo Monod
que se ajusta bien al crecimiento. El modelo considera represión catabólica sobre
producción de AC durante la fase de crecimiento, y se asume formación de producto no
asociada al crecimiento, presentando un efecto mixto. La formación de AC comienza
cuando la concentración de glicerol (Cs) alcanza un valor crítico, Cs2, mayor que Cs1.
La muerte celular y la degradación del producto son consideradas como reacciones de
primer orden en relación a la concentración celular (Cx) y concentración de producto
(Cp) respectivamente. El efecto de la concentración de oxígeno disuelto (OD) no se
consideró en el modelo por mantenerse por encima del valor crítico para evitar
limitación por este sustrato. El modelo propuesto, el cual se ajustó bien a la cinética de
Sc para producir AC, se presentan en las ecuaciones (6), (7) y (8). Los parámetros
cinéticos son entonces encontrados al resolver este sistema de ecuaciones [102].
85
(6)
(7)
(8) Cp.k)Cs(f.Cx.
dt
dCp
pr
Cx.CsKs
Cs..
Y
1
dt
dCs
sr
)Cs(f.Cx.kCx.CsKs
Cs.
dt
dCx
xr
p2
max
s/x
1dmax
Donde: rx, rs, rp son las velocidades de crecimiento microbiano, consumo de sustrato y
generación de producto, respectivamente. f (Cs1) es una función de etapa, inicialmente
igual a cero y que asume valores iguales a 1 para concentraciones menores al valor
crítico, Cs1, cuando comienza la muerte celular; f(Cs2), es también una función de
etapa, inicialmente igual a cero, durante la represión catabólica. Esta asume un valor
igual a 1 cuando la concentración de glicerol cae por debajo del valor crítico, Cs2.
También se ha empleado una cinética de Contois para modelar múltiples sustratos
aditivos, en un proceso continuo para la producción de AC por Sc. El modelo describe
el comportamiento de crecimiento celular, de consumo de sustrato y de formación de
producto aplicado a diferentes bioreactores. En este caso el producto se consideró con
una cinética de producción no asociada al crecimiento [103].
2.5.2 Modelado metabólico
El modelado metabólico es el resultado de plantear las reacciones bioquímicas que
mejor representen la reacciones catabólicas y anabólicas relacionadas con la biosíntesis
de un producto y a través de herramientas matemáticas poder resolver el sistema
matricial obtenido, de tal manera que se puedan conocer todos los flujos hacia y desde
sistema. Esto se conoce como análisis de flujos metabólicos, el cual, entre otras
aplicaciones, es una herramienta de la ingeniería metabólica.
86
2.5.2.1. Fundamentos de modelado metabólico.
La mutagénesis al azar fue la primera estrategia tecnológica empleada para modificar
genéticamente organismos. Sin embargo sus resultados son tan aleatorios que se puede
considerar más un arte que una ciencia. La selección de cepas a través de mutaciones
naturales y la tecnología del ADN recombinante dieron paso a la manipulación genética
o de vías metabólicas generando resultados específicos a modificaciones deseadas. En
los años 80 aparecieron los primeros conceptos acerca de la manipulación dirigida de
vías metabólicas y algunas formas de llamar a esta nueva estrategia fueron ―producción
molecular‖, ―evolución in vitro‖, ―ingeniería de vías metabólicas‖ e ―ingeniería
metabólica‖ [104]. A comienzos de los 90´s un artículo en honor a James E. Bailey,
considerado uno de los primeros investigadores en IM, donde se definió la disciplina
como ― el mejoramiento dirigido de la actividad celular a través de modificaciones de
reacciones bioquímicas específicas por manipulación de la actividad de sus enzimas, del
transporte y de las funciones regulatorias de la célula mediante el uso de la tecnología
del ADN recombinante‖ [105], definición que aun hoy está en uso, con algunas
actualizaciones debidas al desarrollo y aplicación de poderosas técnicas ―-omicas‖ y
bioinformáticas para el estudio de sistemas biológicos.
Entre las diversas metodologías que se pueden aplicar en IM están: Análisis de la
capacidad celular, análisis de flujo metabólico (AFM), análisis de control metabólico
(ACM) y síntesis de sistemas e integración de datos bioinformáticos [104].
El AFM es de gran utilidad para: Calcular flujos extracelulares no medidos, calcular
rendimientos teóricos máximos, identificar vías alternas en el metabolismo e identificar
puntos de ramificación de control metabólico (rigidez de nodos) [95]. En la figura 2.7 se
87
presentan de forma esquemática las posibilidades que brinda el uso de modelado
metabólico. Una vez establecidas las reacciones bioquímicas más representativas, se
realiza un balance de materia o balance molar para cada uno de los metabolitos
intermediarios, generando una matriz estequiométrica, denominada como E, un vector
de flujos y se asume que el sistema está en estado estacionario. De acuerdo con la
posibilidad de solución a este sistema, sea considerado determinado, subdeterminado o
sobre especificado, se presentan alternativas para solucionarlo: Análisis de flujos
metabólicos (AFM), para sistemas determinados, el cual provee, una única respuesta y
balances de flujos metabólicos (FBA), análisis de modo de flujos elementales (EFM) y
análisis de vías extremas (EPA), para sistemas subdeterminados, donde se debe recurrir
a programas de optimización que proveen una familia de soluciones que satisfacen el
sistema. Los programas de optimización se basan en método Simplex para FBA y
método de análisis convexo para EPA y EFM. El método de análisis de consistencia de
datos se aplica para sistemas sobre especificados, el método se describe en la sección
2.5.2 [95,106].
88
Plantear la Ruta bioquímica Ruta clavamas, ruta PP, TCA, X, PO4, ácidos orgánicos, Rxnes de varios AA. Consideraciones: cofactores son energéticamente covalentes, composición celular constante, balance en es
Balance de materia de cada metabolito
Grados de libertad, F Clasificación de flujos a medir y a calcular F= flujos- metabolitos Determinar NC
Sobredeterminado Datos redundantes
Subdeterminado: FBA Establecer función objetivo (Z) Solución por programación lineal
Propuesta de flujos medidos (teóricos)
+Balances elementales Y de óxido reducción +Determinar matriz de redundancia +Obtener vector de residuos, matriz de varianza-covarianza y el índice de consistencia
AFM Análisis de resultados a cambops
Única respuesta
Plantear la reacciones estequiométricas del metabolismo Gluconeogénesis, ruta de PP, ciclo de Krebs, ciclo de la urea, síntesis de X, ruta clavamas, ruta, síntesis de aminoácidos.
Consideraciones: Cofactores son energéticamente covalentes, composición celular constante, balance en estado estacionario. Metabolitos extracelulares con poco aporte se
El sistema puede ser:
Análisis de sensibilidad
Análisis de consistencia de datos experimentales
1 0 00 1 00 − 2 1
= 𝐸
𝑑𝐶𝐴 𝑑𝑡
𝑑𝐶𝐵 𝑑𝑡
𝑑𝐶𝑖 𝑑𝑡 =
1 0 00 1 00 0 1
.
𝜈1𝜈2𝜈𝑗
𝑬𝑻𝝂 = 0
Matriz estequiométrica (Ecuaciones estequiométricas derivadas del modelo metabólico)
Fuentes bibliográficas Para conocer y seleccionar las rutas metabólicas. Se consultan de: Bases de datos, artículos de revista y libros.
Un óptimo (Z) Varios ( Z)
Flujos medidos: datos experimentales
Determinado: AFM
Figura 2. 7. Diagrama de flujo de los pasos a seguir en la solución al modelado metabólico
89
2.5.2.2. Análisis de flujos metabólicos (AFM).
El análisis de flujo metabólico (AFM) es una herramienta de IM que permite mediante
el uso de programas matemáticos calcular los flujos metabólicos intracelulares, y
determinar así como estos flujos se distribuyen a través de las distintas rutas metabólicas
cuando el sistema se encuentra estado estacionario. A través de la aplicación de
diferentes cambios en la red metabólica, se puede conocer o prever los efectos de esas
modificaciones sobre alguna ruta o metabolito de interés. En la figura 2.8 se presenta la
metodología empleada para llevar a cabo un análisis de flujos metabólicos (AFM); el
proceso va desde la recopilación de información para el modelado metabólico hasta el
desarrollo matemático necesario para hacer las respectivas simulaciones y analizar la
variación de los flujos en el interior de la célula como resultado de modificaciones o
manipulaciones en el sistema.
La fisiología celular puede ser interpretada o entendida por observación de la
distribución de flujos bajo las condiciones ambientales investigadas. El impacto de una
estrategia de mejoramiento genético de un microrganismo, puede ser evaluada por
comparación de su distribución de flujos con respecto a la especie silvestre del
microrganismo [107].
Un método sistémico que detalla el procedimiento matemático a seguir para determinar
la distribución de flujos metabólicos ha sido presentado por varios autores [20, 106,
107]. El proporcionar la mayor información posible sobre reacciones y genes, etc.
permite el poder construir una red metabólica para trabajar y facilitar el obtener
información muy importante sobre el sistema. Sin embargo, ya que el análisis
cuantitativo del metabolismo, requiere de datos experimentales, es importante que la
90
consistencia de datos sea confirmada, antes de utilizarlos en la determinación de los
flujos metabólicos.
Fuentes bibliográficas
Balance de materia de cada metabolito
Figura 2. 8. Representación esquemática de la metodología empleada para realizar AFM. Donde E es matriz estequiométrica, Ci: concentración de metabolitos en estado estacionario. V: vector de fluxes metabólicos, subíndice c y m se refiere a calculados y medidos respectivamente, F: grados de libertad.
2.5.2.2.1 Modelización matemática de sistemas determinados
El análisis de flujo metabólico es realizado empleando un modelo estequiométrico en el
que se incluyen las reacciones bioquímicas más representativas para la biosíntesis de un
Plantear el Modelo estequiométrico ( E)
(ecuaciones estequiométricas derivadas del modelo
metabólico), determinar NC
Rutas metabólicas obtenidas
de bases de datos, artículos
de revistas y libros
Matriz estequiométrica
ETν= 0, estado estacionario
Clasificación de flujos a medir y a calcular
Análisis de grados de libertad
F = número de flujos - número de componentes
νC = - EC-1.
Em.νm, para realizar AFM
Análisis de resultados
Datos de flujos medidos para
sistema determinado
Simulaciones para AFM
Análisis de sensibilidad (AS)
Simulaciones para
AFM
E
120
010
001
jdtdCi
dtdCB
dtdCA
2
1
.
100
210
001
/
/
/
91
producto de interés. En caso de no tener suficiente información acerca del
microorganismo de estudio, se pueden agregar datos de otros microorganismos que
presenten rutas bioquímicas similares. El AFM se realiza mediante un balance de
materia alrededor de los metabolitos presentes en el modelo estequiométrico propuesto y
se asume estado estacionario, lo cual permite obtener un sistema de ecuaciones
algebraicas lineales, como se presenta en (21).
0
t
CEν
d
d (21)
Siendo E la matriz estequiométrica de dimensiones (e x n), donde las e filas representan
cada uno de los metabolitos y las n columnas representan las reacciones en las que
estos participan. El vector ν de dimensión (nx1), es el vector de flujos de todas las
reacciones. Los valores en cada columna corresponden a los coeficientes
estequiométricos de los metabolitos que participan en la reacción. Hay un coeficiente
negativo para cada metabolito consumido y positivo para cada metabolito producido. Un
coeficiente estequiométrico de cero se usa para metabolitos que no participan en la
reacción considerada. Se asume estado estacionario para las concentraciones todos los
metabolitos intracelulares (Ci) [66], con lo cual la velocidad de acumulación de todos
ellos es cero (lado derecho de (21)).
Para resolver este sistema de ecuaciones lineales (e x n), se deben establecer los grados
de libertad (F) que indican si el sistema es determinado, indeterminado o sobre
especificado; estos corresponden a la diferencia entre el número de reacciones presentes
(n) y el total de compuestos (e) empleados para los balances de materia. En caso de
poder medir el número de flujos dado por F, el sistema se considera determinado. Otra
92
situación que puede presentarse es que el número de flujos medidos sea inferior a F, lo
que implica que el sistema es insuficiente para obtener una única solución, en tal caso se
obtiene un sistema subdeterminado. En este caso el sistema debe resolverse utilizando el
análisis de balance de flujos (FBA, flux balance analysis). Para la solución de un
sistema subdeterminado se requiere definir una función objetivo a optimizar y unas
restricciones al sistema de acuerdo con el conocimiento que se tenga de la ruta
metabólica. El FBA se ha empleado para redes bioquímicas muy grandes en donde es
difícil o imposible agotar todos los grados de libertad [56, 107]. Más detalles se
presentan en la sección 2.5.2.3.
El término E.ν, presente en la ecuación (21), se puede reorganizar en dos matrices
considerando los flujos medidos (νm) y calculados (νc), como se presenta en la ecuación
(22). Al reorganizar la matriz E separando los flujos a calcular, se puede solucionar el
sistema matricial como se muestra en ecuación (23), que es la base para realizar los
cálculos de análisis de flujo metabólico (AFM) [56, 108].
0 = CCmm νE + νE (22)
De donde
mmCC νEEν1
- =
(23)
2.5.2.2.2 Metodología para realizar AFM
La construcción de un modelo metabólico, en principio parece depender sólo del
conocimiento de las reacciones estequiométricas. Sin embargo, asegurar la consistencia
dentro del grupo de reacciones escogidas para el balance de metabolitos y la
calculabilidad de las velocidades escogidas, no siempre es sencilla y sobre todo en
93
presencia de redes muy grandes. Por ejemplo, puede ocurrir que existan reacciones
dependientes, lo cual puede hacer que el problema sea no solucionable. Si la matriz
estequiométrica es de rango completo y no tiene reacciones dependientes, se puede
solucionar. Por el contrario si la matriz no es de rango completo y tiene una o más
reacciones dependientes, se puede obtener una solución. Por el contrario si la matriz no
es de rango completo y tiene una o más reacciones dependientes, no será posible obtener
una solución. . Se plantea a manera de ejemplo sencillo como es la estrategia de AFM
con una red simplificada para Sc.
Después de plantear la matriz estequiométrica derivada de las reacciones
estequiométricas definidas como el modelo metabólico, (figura 2.9), el siguiente paso es
encontrar qué reacciones o columnas de la matriz tienen dependencia lineal con otras.
Para esto se hace uso del algebra lineal y de programas computacionales, tales como
Matlab.
Cuando la matriz estequiométrica es pequeña, el análisis puede realizarse mediante una
simple inspección visual. Para el ejemplo citado en esta sección, puede verse que hay
linealidad entre los flujos de los metabolitos ORN y ACE (ver figura 2.10), por lo que
se elimina uno de ellos (en este caso se eliminó acetato, ya que se mide ORN). Una vez
se haya obtenido la matriz estequiométrica y verificado que no posee reacciones con
dependencia lineal entre sí, el siguiente paso consiste en determinar el número mínimo
de flujos a ser medidos, calculados a partir de los grados de libertad (F). En este caso,
los grados de libertad son 12-9 =3. Los flujos seleccionados medidos son las
velocidades netas de consumo de GLC, NH4 y velocidad de producción de ORN, que
corresponden a los flujos ν1, ν6 y ν8.
94
PEP
ACCOA
TCA
aKG
OAAAsp
GLU
NH4GLUEXT
GLC
ORN
Figura 2.9. Modelo simplificado del metabolismo de S. clavuligerus. Siglas usadas: GLC, glicerol; PEP, fosfoenolpiruvato; OAA, oxaloacetato; GLU, glutamato; ASP, aspartato; ACE, acetato; ORN, ornitina; EXT. Externo.
Figura 2. 10. Matriz estequiométrica correspondiente al ejemplo de estudio. Las celdas punteadas corresponden a los flujos medidos. Las celdas sombreadas corresponden a metabolitos intermediarios.
flujos
metabolitos GLC -1 0 0 0 0 0 0 0 0
NH4 0 0 0 0 0 -1 0 0 0
ASP 0 0 0 0 0 0 1 0 0
ORN 0 0 0 0 0 0 0 1 0
ACE 0 0 0 0 0 0 0 1 0
GLUext 0 0 0 0 0 0 0 0 1
C02 0 -1 1 1 1 0 0 0 0
PEP 1 -1 -1 0 0 0 0 0 0
aKG 0 0 0 1 -1 -1 1 1 0
OAA 0 1 0 -1 1 0 -1 0 0
ACCOA 0 0 1 -1 0 0 0 -1 0
GLU 0 0 0 0 0 1 -1 -2 -1
NADH(NADPH) 2 0 1 1 1 -1 0 -1 0
6 7 8 91 2 3 4 5
1 GLC + 2NAD → PEP + 2NADH
2 PEP + CO2 + ATP → OAA + ADP
3 PEP + NAD →ACCOA + CO2 + NADH
4 ACCOA + OAA + NADP → aKG + NADPH + CO2
5 aKG + NAD → OAA + NADH + ATP + CO2
6 aKG + NH4 +NADPH → GLU + NADP
7 OAA + GLU → ASP + aKG
8 2GLU + ACCOA + ATP + NADPH → ORN + aKG +ACE
9 GLU → GLUEXT
95
197
287
157
90
140
40
ν
ν
ν
ν
ν
ν
: tienese
50
10
100
ν
ν
ν
: con
9
7
5
4
3
2
c
8
6
1
m
-
-
-
νν
Reorganizando la matriz de la figura 2.10 de acuerdo con los flujos medidos y los que se
van a calcular y aplicando la ecuación (23) se tiene la relación presente en la figura
2.11.
8
6
1
9
7
5
4
3
2
ν
ν
ν
ν
ν
ν
ν
ν
ν
112
210
100
110
001
100
100
010
001
001110
110000
000110
011101
011100
000011
001111
100000
0100001
Figura 2. 11. Desarrollo del AFM, La solución de la ecuación permite obtener la distribución de los flujos intracelulares indicados en el modelo de la figura 2.9.
Con los resultados se puede analizar el comportamiento de la red, identificar los flujos
que aumentan o disminuyen y la magnitud de esos cambios frente a un cambio en uno de
esos flujos, ocasionado por una perturbación en el sistema, ya sea de tipo experimental o
por simulación, por citar algunas preguntas que se resuelven con AFM.
2.5.2.2.2.1 Análisis de sensibilidad
Es importante señalar que cualquier modelo estequiométrico está sujeto a un análisis
matemático para determinar si el problema está bien condicionado, de manera que, al
resolver la ecuación (23), la matriz de los flujos a calcular representan la menor
96
#
CC EE NC
propagación del error de los flujos medidos. En caso de estar mal condicionado se debe
replantear la red metabólica, cambiando alguno de los flujos a medir. El número de
condición (NC) refleja la ―sensibilidad‖ de una solución de las ecuaciones lineales al
error en los datos para la estequiometria asumida, y se calcula por medio de la ecuación
(24). El NC no solo es proporcional al error actual propagado sino también al tamaño
de la matriz. Un NC por debajo de 1000 puede reflejar que está bien condicionado [31].
(24)
Las barras () describen una norma matricial. La matriz pseudo-inversa es
T
C
1
C
T
C
#
C E*)E*(EE , el superíndice T indica que es matriz transpuesta.
El análisis de sensibilidad se realiza una vez que la matriz está bien condicionada. Este
análisis puede proporcionar información considerable no sólo de la precisión de los
cálculos, sino también de las propiedades dinámicas de la red metabólica propuesta. Al
variar el vector de los flujos medidos puede ayudar a mejorar el diseño experimental al
permitir la escogencia de un buen grupo de flujos medidos tal que proporcione un valor
de NC bajo [31].
Partiendo de un sistema determinado, y siguiendo la metodología propuesta por Daae
and Ison (1999) para realizar el análisis de sensibilidad de la ruta metabólica propuesta,
a partir de la ecuación (22), se puede proponer que un cambio en el flujo medido
ocasiona un cambio en el flujo calculado, como se muestra en la ecuación (25) [31].
(25) )( m1m2m
-1
CC1C2 ν - ν EE - = ν - ν
97
La ecuación (25) se puede presentar en forma diferencial mediante la ecuación (26), la
cual es la base para el análisis de sensibilidad y depende de la estequiometria
únicamente.
(26) 1-
- = mEC
E
m
C
ν
ν
d
d
El impacto acumulado sobre el sistema de cada uno de los flujos medidos (νm) se
encuentra al extraer la raíz cuadrada de la sumatoria de los valores individuales de los
coeficientes de sensibilidad asociados a cada flujo elevado al cuadrado. Una vez que se
ha determinado cuales son los flujos a medir que generan un bajo número de condición,
e identificado el impacto acumulado por cada flujo medido, se procede luego a realizar
el análisis de flujo metabólico (AFM) empleando la ecuación (23).
2.5.2.2.3 Trabajos reportados sobre AFM para Streptomyces.
El análisis de flujo metabólico (AFM) ha sido aplicado exitosamente en el diseño de
procesos, usando pequeñas redes metabólicas y buscando optimizar el rendimiento del
producto (ej. antibióticos). Entre los estudios realizados, es posible citar trabajos con S.
tenebrarius [19], S. lividans [20, 26], S. coelicolor [25, 29, 41, 83, 98, 109] y los
trabajos realizados con Sc [13, 24, 27, 47, 93].
Para la producción de un antibiótico a partir de S. tenebrarius, se estudió la interacción
entre el metabolismo primario y secundario al trabajar con dos medios, uno con glucosa
como única FC y el otro con una combinación de glicerol y glucosa. Con este último
medio se obtuvo que en la idiofase los flujos en la vía Entner- Deudoroff (ED)
disminuyeron e incrementaron los flujos en las vías PP y EMP, relacionado esto con
altos flujos de NADH y NADPH y este hecho fue asociada con mayor producción del
98
antibiótico tobramicina y disminución en el porcentaje del subproducto indeseado,
kanamicina B [19].
Para S. lividans productor de los antibióticos actinorrodina y undecilprodigiosin se ha
encontrado que un incrementó en la producción de biomasa promueve un aumento en la
vía PP y en la glicolisis. En un medio limitado en fosfato, las distribuciones de los
flujos de carbono a través de las rutas catabólicas mostraron la dependencia de las vías
EMP y PP con respecto a la velocidad de crecimiento y la fuente de carbono y energía
empleada (glucosa o gluconato). Las síntesis de ambos antibióticos fueron
desfavorecidas con aumento en los flujos en vía PP [26].
Son diversas las estrategias que han sido implementadas para mejorar la producción de
AC haciendo uso del AFM. Mediante el conocimiento de la distribución de flujos en el
metabolismo central del carbono (MCC) de Sc, generados al limitar el medio de cultivo
en las fuentes de carbono, nitrógeno y fósforo se pudo proponer una estrategia racional
de mejoramiento del medio a través de alimentación de aminoácidos que favorecieran la
disponibilidad del precursor C5 (ARG). Se estableció que bajo limitación de nutrientes
en el medio, el flujo a través de la vía anaplerótica (carboxilación de PEP para producir
oxaloacetato) era bajo, consistente con la carencia del precursor ARG, limitando así los
flujos hacia la síntesis de AC. Con base en los resultados obtenidos se propuso que la
limitación de carbono restringe el flujo de carbono por la vía anaplerótica, reduciendo el
potencial requerido para el ciclo de Krebs. En este ciclo están involucrados los
metabolitos OAA y aKG que son precursores necesarios para síntesis de aminoácidos
como ASP y GLU necesarios en la biosíntesis de ARG, uno de los precursores directos
de AC. Bajo limitación de nitrógeno se encuentra una disminución en los flujos de
aminoácidos precursores de la biosíntesis de AC. Bajo limitación de fósforo, los
99
resultados mostraron altos valores de flujos en los precursores C3 y C5 que resultan en
un aumento de la producción de AC [93].
El AFM sirve para establecer estrategias de alimentación al cultivo de acuerdo con el
conocimiento previo de la distribución de flujos del MCC para Sc. Al comparar cultivos
en continuo con medio basal y con medio enriquecido por la adición de aminoácidos
individuales y combinados, se encontró que la adición de ASP, ASN y THR se
incrementan los flujos de la vía de síntesis de ARG con el consecuente aumento de 18
veces el rendimiento de AC, con respecto al medio sin adición de estos AAs [47]. Estos
resultados provenientes de resultados de modelado metabólico fueron confirmados
independientemente en experimentos donde al comparar una cepa silvestre con
mutantes, se identificaron los cuellos de botella de la biosíntesis de AC, y se propone
como estrategia alimentar ARG al cultivo, logrando incrementar la producción de AC
[24].
2.5.2.3 Análisis de balances de flujos (FBA).
Cuando se plantea un modelo metabólico como el representado en ecuación (21), se
pueden presentar tres situaciones dependiendo del número de flujos que se puedan
determinar experimentalmente para agotar los grados F del sistema. Para el caso donde
el número de flujos medidos es menor que los F, hay un número infinito de soluciones
que satisfacen el sistema, y los flujos pueden ser calculados mediante el uso de
algoritmos de programación lineal. Con esta técnica es posible obtener una solución
para los flujos intracelulares a partir de la optimización de una función objetivo
apropiada [104, 111].
100
La construcción de un modelo metabólico para aplicar análisis de balances de flujos
requiere establecer restricciones de diferente tipo, fisicoquímicas, espaciales,
topológicas, dependientes de las condiciones ambientales, de tipo regulatorio o genético.
El análisis asume que bajo algunas condiciones ambientales dadas, el organismo
alcanzará el estado estacionario que satisface esas restricciones fisicoquímicas. Ya que
las restricciones del sistema celular no se conocen en su totalidad, se pueden obtener
múltiples soluciones del estado estacionario. Para identificar un estado fisiológico
significativo en estado estacionario, se requiere de una optimización para encontrar los
valores óptimos de una función objetivo específica con respecto a las restricciones
dadas. El balance de masa es definido en términos de flujo a través de cada reacción y
se tiene en cuenta la estequiometria de la reacción. Esto da un conjunto acoplado de
reacciones diferenciales [111].
En la figura 2.12 se presenta la metodología empleada para llevar a cabo un análisis de
distribución de flujos metabólicos; el proceso va desde la recopilación de información
para la construcción del modelo metabólico hasta la solución matemática del modelo.
Posteriormente viene un análisis de los resultados de la distribución de los flujos al
interior de la célula en función de la implementación de algún cambio en el sistema.
El objetivo de FBA es identificar los flujos metabólicos desconocidos que proporcionan
una solución en estado estacionario bajo restricciones de tipo estequiométrico y de uno
o varios flujos medidos que permitan una única distribución de flujos. Un organismo
puede tener dos o más rutas redundantes y bajo diferente conjunto de datos se pueden
obtener los mismos óptimos. Para abordar esta problemática, recientemente se ha hecho
uso de análisis de variabilidad de flujos (FVA). Este tipo de análisis proporciona un
101
Balance de materia para cada metabolito
[dCi/dt] = E
Definición de número de observaciones
experimentales menores que los grados de
libertad del sistema
Análisis de resultados
Modelo subdeterminado (FBA)
, siendo C : ATP, µ o AC
Sujeto a :
Suposición estado estacionario
Análisis de grados de libertad
Grados de libertad (F)
F = número de flujos - número de componentes
Figura 2.12 Representación esquemática de la metodología empleada para realizar FBA. Donde E es matriz estequiométrica, Ci: concentración de metabolitos en estado estacionario.
: vector de flujos metabólicos, subíndice c y m se refiere a calculados y medidos respectivamente, F: grados de libertad.
Modelo metabólico propuesto
102
exp
supinf
0
ννννν
Eν
j
intervalo de valores para cada reacción en el sistema. Como el intervalo de solución es
único, los flujos considerados como verdaderos son los que estén incluidos en el
intervalo [111, 112].
2.5.3.3.1 Sistema subdeterminado, modelización matemática
Para encontrar la solución al sistema subdeterminado es necesario aplicar métodos de
programación lineal. En donde se plantea una función objetivo Z como hipótesis de que
el metabolismo celular es regulado de modo tal que se optimizan ciertas funciones de la
célula. La descripción del problema matemático a resolver se puede describir como se
presenta en la ecuación (27).
Maximizar/minimizar (27) )( CνZ f
La combinación lineal de flujos νC minimiza o maximiza bajo las siguientes
restricciones:
Siendo los subíndices inf, sup, exp: inferior, superior y experimental respectivamente.
Los valores inferior y superior corresponden a valores límites inferiores o superiores
que son establecidos por las diversas restricciones metabólicas, fisiológicas,
fisicoquímicas o ambientales. Las reacciones irreversibles se representan fijando el
límite inferior del valor del flujo en cero. Para reacciones reversibles sobre las que no se
tiene información acerca de los límites de su velocidad, se asignan a los límites inferior
y superior valores de gran magnitud (hasta del orden de 105). Un valor alto da libertad
para que todas las reacciones transcurran, negativo el primero y positivo el segundo
[113]. Si se quiere reducir más el espacio de solución, estas restricciones pueden
103
reducirse mediante la inclusión en el modelo de valores de flujos medidos a las
condiciones ambientales y/o genéticas en que se desea simular el comportamiento
celular. Estos valores se incluyen como restricciones de igualdad, y son los que permiten
ajustar el comportamiento celular a la situación particular que se desea analizar [111,
113].
Las suposiciones dadas para lograr obtener el óptimo son : Que la célula ha encaminado
su metabolismo a obtener el comportamiento óptimo respecto al objetivo propuesto, y
que dicho objetivo puede ser establecido matemáticamente en una forma apropiada
como se muestra en la ecuación (27), dando un peso relativo de 1 a la variable a
optimizar.
(27) )( Maximizar νωZ
Donde el vector ω representa el peso relativo que se asigna a cada flujo en la función
objetivo.
2.5.2.3.2. Funciones objetivo
En la mayoría de los trabajos con FBA se emplea como función objetivo la
maximización del crecimiento celular o velocidad de biosíntesis de biomasa [110, 111,
114], ya que se ha encontrado mucha consistencia entre los resultados del modelo y
datos experimentales. Sin embargo numerosas funciones objetivos adicionales pueden
ser empleadas y es posible compararlas de forma sistémica para seleccionar la más
apropiada [111, 115]. La simulación de producción de antibióticos presenta nuevos
cambios en la definición de la función objetivo, ya que estos como metabolitos
secundarios no se requieren para el crecimiento celular, y adicionalmente, bajo muchas
circunstancias puede decirse que el crecimiento celular óptimo y el metabolismo
104
secundario óptimo son mutuamente excluyentes, ya que la reducción de la velocidad de
crecimiento comúnmente induce el metabolismo secundario [115]. Otras funciones
objetivo que se pueden emplear son minimización de producción de ATP, minimización
de producción de poder reductor (NADH/NADPH), esto representa el concepto que el
metabolismo de la célula se esfuerza en operar en términos de eficiencia de energía [25,
110, 116]. También se ha empleado como función objetivo minimizar consumo de un
sustrato o maximizar algún producto de interés [115, 116]. También se puede emplear
una función objetivo múltiple, relacionando varios compuestos a maximizar o
minimizar [117].
La optimización puede ser realizada usando cualquier método de minimización
multivariable como por ejemplo la variación del algoritmo Simplex [118]. Existen
diversos programas especializados como CNA [119], COBRA [120], etc. que son
paquetes de programas que corren en el ambiente de Matlab, y que proporcionan una
interfase adecuada para la solución de problemas de FBA, FVA y para la simulación del
comportamiento de mutantes por eliminación de genes o la modificación de variables
ambientales (composición de medios de cultivo, etc.) [121].
2.5.2.3.3. Trabajos reportados sobre FBA para Streptomyces.
Se han realizado estudios de análisis de distribución de flujos metabólicos para algunas
Streptomyces entre los que se encuentra: El estudio del efecto de la limitación de
nutrientes (N, P, S, y K) sobre el metabolismo primario y secundario para S. coelicolor,
considerando como funciones objetivo maximizar la velocidad específica de
crecimiento y minimizar el requerimiento de energía. Al considerar el objetivo de
105
maximizar la velocidad de crecimiento, bajo limitación de P, los flujos calculados
coincidieron con los datos experimentales. Por el contrario, bajo limitación de N, el
objetivo celular que mejor se ajustó a los datos experimentales fue la minimización de
requerimiento de energía, se obtuvo por simulación mayor producción de actinorrodina
pero también hubo presencia de subproductos indeseables [25]. Esta bacteria también es
productora de un antibiótico dependiente de calcio (CDA), para el cual se ha estudiado
la distribución de los flujos, considerando como objetivo celular la maximización de
velocidad específica de crecimiento y la formación de producto, cada una de forma
independiente. Se encontró la producción de CDA está relacionada con la velocidad
específica de crecimiento. Con los resultados in silico con FBA se proponen estrategias
de manipulación genética para estudiar los efectos metabólicos deseados, logrando
buenas predicciones [29].
Se han logrado avances a nivel de la optimización, para redes a escala genómica. En el
caso de un mutante de S. coelicolor, se hizo uso de FVA y FBA para lograr seleccionar
una adecuada función objetivo. Para este caso se encontró que es necesaria una
aproximación indirecta, tal como examinar el efecto del proceso de alimentación sobre
la asimilación de nutrientes. Se encontró entonces que la mayor influencia del mutante
sobre la producción de antibiótico fue el resultado indirecto de la mutación sobre la
velocidad de asimilación de fosfato, cuando se consideró como función objetivo
maximizar la velocidad de consumo de glucosa [115]. Para S. clavuligerus se encontró
una muy buena correlación entre los resultados experimentales y los resultados
simulados empleando balance de flujo dinámico (FBAd).Este modelado sirvió para ver
que la mayoría de las modificaciones genéticas no contribuyen al entramado complejo
106
del metabolismo primario, pero son coincidentes con una regulación (upregulation) de
varios grupos de genes de biosíntesis de antibióticos. Los resultados conducen a que es
necesario realizar nuevos cambios a nivel transcripcional, tales como el incremento de
transcripción de genes en la transcripción de genes de glutamina y glutamato sintetasa, y
en los genes que codifican tansportadores de amonio y fosfato. Para los análisis se
compara la información experimental obtenida durante la fase de producción de AC y
cefamicina C para la cepa silvestre y cepas mutantes (obtenidos por mutagénesis al azar
y por IM) y con la información obtenida por simulación variando los flujos durante la
producción de antibióticos [13]. También para un mutante de S. lividans TK 24, se ha
empleado FBA para entender de forma sistémica e interpretativa diferentes
modificaciones a escala genómica, considerando como objetivo celular la maximización
del crecimiento y diferentes estrategias de alimentación al medio. Los resultados
experimentales fueron confrontados con los obtenidos en el modelado metabólico de
acuerdo con las restricciones dadas al sistema y éstos fueron consistentes entre si [122].
107
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scale metabolic flux analysis of Streptomyces lividans growing on a complex medium,‖
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115
CAPITULO 3
PRODUCCIÓN DE ACIDO CLAVULÁNICO POR FERMENTACIÓN DE Streptomyces clavuligerus: EVALUACIÓN DE DIFERENTES MEDIOS DE CULTIVO Y MODELADO MATEMÁTICO.
El ácido clavulánico (AC) es un antibiótico -lactámico con una potente capacidad
inhibidora de la actividad -lactamasa, cuya producción por fermentación presenta bajos
rendimientos. En el presente trabajo se evaluaron cuatro medios de cultivo reportados en
la bibliografía y se compararon con un medio de cultivo desarrollado en esta
investigación para la producción de AC por S. clavuligerus. Asimismo, se estableció
también la concentración óptima de glicerol en el medio seleccionado, y con base en los
resultados obtenidos, se estudió la producción de AC en un biorreactor de laboratorio.
Los resultados obtenidos muestran que medios complejos con presencia de una mezcla
de aminoácidos libres son adecuados para la producción de AC, y que la concentración
de glicerol óptima para la producción de AC es de 50 g L-1
. Concentraciones superiores
a 100 g L-1
causan inhibición de la síntesis del antibiótico. Con el medio complejo y 50 g
L-1
de glicerol, la concentración de AC alcanzada fue de 994 mg L-1
. El proceso puede
ser representado mediante un modelo matemático, que incluye una cinética tipo Contois
para la biomasa y una cinética de formación de producto parcialmente asociado al
crecimiento. El modelo presenta un ajuste significativo con un 95% de nivel de
confianza.
116
3.1. INTRODUCCIÓN
El ácido clavulánico (AC), es una molécula que exhibe una potente actividad inhibitoria
de las enzimas β-lactamasas, por lo que se ha convertido en un importante producto
comercial disponible en combinaciones con antibióticos β-lactámicos como amoxicilina
(Augmentin TM
), tetraciclina (Timentín TM
) [1] y también como producto genérico. Su
efecto inhibidor fue descubierto en 1976 y desde entonces se han realizado exhaustivos
estudios con el fin de mejorar los títulos de antibiótico empleando procesos de
fermentación con la bacteria que naturalmente lo produce, Streptomyces clavuligerus
(Sc).
La productividad del proceso, depende de muchos factores, entre ellos del tipo y
concentración de nutrientes, de las condiciones de operación de la fermentación y de los
propios mecanismos intracelulares de biosíntesis. A pesar de los esfuerzos de los
investigadores que trabajan en el tema alrededor del mundo, aún no se ha conseguido
obtener valores de producción (título) de AC superiores a 1g L-1
[2-3], e incluso en la
gran mayoría de trabajos y después de estudios de optimización estos valores han sido
inferiores a 500 mg L-1
[4-6]. De acuerdo con información de patentes registradas a
nombre de importantes empresas farmacéuticas, se han reportado valores de producción
de AC entre 561 y 1000 mg L-1
[7-8]. Por tanto, es de gran importancia continuar
abordando estudios tendientes a mejorar la producción del AC, lo que permitirá reducir
sus costos y hacerlo más accesible a la población de escasos recursos.
En diferentes estudios publicados, se ha observado el empleo de una gran variedad de
formulaciones de medios para el cultivo de S c [2, 7-12]. Algunos de ellos son
químicamente definidos y otros son medios complejos. Estos últimos favorecen la
117
producción de AC puesto que la bacteria requiere para su biosíntesis la presencia de
aminoácidos [13], los cuales están presentes en sustratos complejos como harina de
cereales o digeridos de proteínas, que presentan la ventaja de ser nutrientes de bajo
costo. Sin embargo, debido a la complejidad del medio y la baja concentración del
producto, su purificación se torna compleja y costosa [8, 14]. Los carbohidratos son la
fuente de carbono y energía preferida por muchos microorganismo, pero Sc presenta
una inusual incapacidad de consumir glucosa y otros carbohidratos simples. La
principales fuentes de carbono para Sc producir antibióticos son los lípidos y el glicerol
[15-17]. Dado que el glicerol ha sido identificado como el precursor de 3 átomos de
carbono para la síntesis de AC [3, 18], en la gran mayoría de trabajos se emplea esta
sustancia como la fuente de carbono.
Debido a la gran heterogeneidad en la composición de los medios de cultivo reportados
en la literatura para la producción de AC, los cuales han sido desarrollados y evaluados,
no siempre a las mismas condiciones, se hace necesario evaluarlos bajo las mismas
condiciones y con la misma especie bacteriana, con el fin de determinar la verdadera
capacidad de estos medios para la producción de AC.
En este trabajo se evaluaron 5 diferentes composiciones de medios de cultivo para
producción de AC bajo las mismas condiciones de cultivo de S c, en Erlenmeyers. Una
vez seleccionado el medio de mayor producción se evaluaron diferentes concentraciones
de la fuente de carbono en Erlenmeyers, y el medio seleccionado se empleó para
producir AC en un biorreactor a escala de laboratorio. Basándose en las características
de los cultivos, se propuso un modelo matemático para describir el comportamiento
cinético de la fermentación.
118
3.2 MATERIALES Y MÉTODOS
3.2. 1. Técnicas microbiológicas.
3.2.1.1. Microorganismo y medio de conservación.
Se empleó un liofilizado de la cepa de Streptomyces clavuligerus ATCC 27064. La
activación se realizó en caldo TSB (Tryptic Soy Broth) incubado a 28 ºC por 36 h. La
cepa activada se almacenó a -80ºC en tubos Eppendorf con medio TSB y glicerol al
40%. Estos tubos se emplearon como semilla para todos los ensayos [19].
3.2.1.2. Medios de cultivo.
Los inóculos empleados para cada ensayo se prepararon mezclando en Erlenmeyers de
500 mL, el contenido de un tubo semilla con 100 mL de medio TSB®, e incubándolos a
28 ºC y 220 rpm por 36 h. Bajo estas condiciones, la DO600nm obtenida osciló entre 0.6 y
0.8[19].
Los medios de cultivo utilizados para evaluar la producción de AC fueron: Medio 1:
Almidón (10 g L-1
), L-asparagina (2 g L-1
), MgSO4.7H2O (0.6 g L-1
), K2HPO4 (4.4 g L-
1), FeSO4.7H2O (1 mg L
-1), MnCl2.4H2O (1mg L
-1), ZnSO4.7H2O (1 mg L
-1) y
CaCl2.3H2O (1.3 mg L-1
). El medio se reguló con MOPS (100 mM) y se ajustó a pH 6.9
[2]. Medio 2: Es una modificación del medio 1, empleando en lugar de almidón, glicerol
a una concentración de 20 g L-1
[20]. Medio 3: glicerol (10 g L-1
), harina de soya (40 g
L-1
), aceite de soya (16 g L-1
), K2HPO4 (1.2 g L-1
), MnCl2.4H2O (1 mg L-1
),
ZnSO4.7H2O (1mg L-1
) y CaCl2.3H2O (1.3 mg L-1
). El medio se reguló con MOPS (100
mM) y se ajustó a pH 6.8 [9]. Medio 4: glicerol (20 g L-1
), harina de soya (5.5 g L-1
) y
K2HPO4 (0.8 g L-1
). El medio se reguló con MOPS (100 mM) y se ajustó a pH 7.0 [10].
119
Medio 5: glicerol (20 g L-1
), harina de soya (15 g L-1
) y casaminoácidos (5 g L-1
). El
medio se reguló con MOPS (100 mM) y se ajustó a pH 7.0 [21]. Antes de su
inoculación, los medios de cultivo se esterilizaron en autoclave a 121 ºC durante 20 min.
3.2.1.3. Métodos experimentales
Se realizaron cinco cultivos de fermentación por triplicado en Erlenmeyers de 500 mL.
A cada frasco se adicionó 100 mL del medio de cultivo a evaluar y la biomasa contenida
en 10 mL de inóculo. Esta biomasa se obtuvo centrifugando 10 mL de inóculo a 5000
rpm por 10 min., eliminando el sobrenadante y resuspendiendo la biomasa con 10 mL de
medio de prueba del Erlenmeyer y retornándolo nuevamente al Erlenmeyer. Los frascos
se sellaron con tapones de algodón para permitir la difusión del oxígeno al cultivo y se
incubaron a 28 ºC y 220 rpm por 36 h.
Con el medio de cultivo seleccionado, se evaluaron tres concentraciones de glicerol: 20
g L-1
(2%), 50 g L-1
(5%) y 100 g L-1
(10%). Los cultivos se realizaron por triplicado
bajo las mismas condiciones operacionales ya descritas.
Para ambos ensayos, al final del periodo de incubación se tomaron muestras para
cuantificar la concentración de biomasa y de AC. Los valores medios de cada ensayo se
compararon estadísticamente mediante la prueba de rangos múltiples de Duncan, con el
fin de determinar las diferencias significativas entre ellos [22, 23].
La producción de AC se evaluó por duplicado en un biorreactor de laboratorio de 5 L
(Biostat B Braun), con un volumen de trabajo de 3 L e inóculo al 10% v/v. La
fermentación se llevó a cabo a 28ºC, 400 rpm y un flujo de aire de 1 vvm. El pH se
controló en 6.8 +/- 0.2 con soluciones de NaOH (2N) y HCL (2N) adicionadas
120
automáticamente. La espuma se controló adicionando 008 mL L-1
de anti-espumante
(Antifoam A, sigma Aldrich) al inicio de la fermentación. El cultivo se desarrolló por
144 h y se tomaron muestras periódicamente para determinar las concentraciones de
biomasa, glicerol y AC.
3.2.2. Métodos analíticos
Las muestras de la fermentación se centrifugaron a 14000 rpm por 10 min. a 4ºC. Los
pellets se emplearon para determinar la concentración de biomasa y los sobrenadantes se
diluyeron con solución de MOPS (pH 6.8 y 100 mM) y se filtraron a través de
membranas de PTFE de 0.2 µm previo al análisis de AC y glicerol [19].
3.2.2.1. Determinación de biomasa:
El micelio se lavó dos veces con 10 mL de solución salina (NaCl 0.9%) y su biomasa se
determinó indirectamente mediante la técnica colorimétrica de DNA, basada en lectura
de la absorbancia a 600 nm del color azul generado por la reacción de la difenilamina
con la desoxirribosa [19, 24].
3.2.2.2. Determinación de ácido clavulánico:
La concentración de AC se determinó por HPLC empleando el método descrito por
Foulstone and Reading (1982) [25]. El AC presente en cada muestra, fue derivatizado
con imidazol y analizado en un HPLC Agilent/Hewlett Packard Chemstation 1100,
operado con columna C18 μ-Bondapack fase reversa (Waters), una fase móvil
compuesta por una solución de 94% v/v de KH2PO4 (50mM, pH 3.2) y 6% v/v de
metanol, aun flujo de 1mLmin-1
y un detector de arreglo de diodos. El AC derivatizado
se detectó a 311 nm.
121
3.2.2.3. Determinación de glicerol:
La concentración de glicerol se determinó por espectrofotometría a 412 nm, basado en la
reacción de oxidación del glicerol por ácido perclórico [13].
3.2.3. Modelo matemático.
El modelo propuesto para el proceso de producción de AC a partir de Sc, se obtuvo
realizando balances de masa para la biomasa, el sustrato y el producto en un sistema por
lote. Para la velocidad de crecimiento específica se propuso el modelo de Contois, se
representa en la ecuación (1), donde la velocidad específica de crecimiento es
inversamente proporcional a la biomasa. La velocidad de crecimiento microbiano se
representa por la ecuación (2). La velocidad de consumo de glicerol se representa como
una función directa de la velocidad de crecimiento microbiano, ecuación (3) y la
velocidad de producción de AC se representa como una función aditiva de la velocidad
de crecimiento microbiano y la concentración de biomasa, ecuación (4), es decir, se
representa como un metabolito producido con un aporte del metabolismo primario y un
aporte del metabolismo secundario. El retraso en la aparición de AC hasta el inicio del
crecimiento exponencial, se representa con la función de paso (t), siendo cero desde el
inicio del cultivo hasta un tiempo to y para tiempos superiores a to, la función toma un
valor de 1.
SXKs
S
.max
(1)
Xdt
dX.
(2)
122
XYdt
dS
XS
.
(3)
)(.. tXYdt
dP
XP
(4)
Donde X es la concentración de la biomasa (g L-1), S es la concentración de GLC (g L-1),
P es la concentración de AC (mg L-1), µ es la velocidad de crecimiento específica (h-1),
µmax es la velocidad de crecimiento máxima específica (h-1
), KS es la constante de
saturación de Monod (g L-1
), YXS es el rendimiento biomasa en glicerol, YXP es el
rendimiento de biomasa en AC (g mg-1
), α que es una productividad de AC específica
(mg g-1
h-1
) y (t) es una ―función de paso‖ que asume un valor de 0 en los rangos de
tiempo entre 0-48 h y el valor de 1 en el rango de tiempo entre 48-136 h.
La estimación de los parámetros del modelo cinético y la solución numérica de las
ecuaciones diferenciales que representan el modelo, se realizaron empleando el método
de optimización no lineal lsqnonline, basado en el algoritmo de Levenberg-Marquardt,
asociado con la herramienta ODE45 de Matlab 2008b (MathWorks, Cambridge, etc).
3.3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
3.3.1. Evaluación de los medios de cultivo.
Los resultados de la evaluación de los cinco medios de cultivo se presentan en la Figura
3.1. La concentración de AC y el rendimiento de producto en biomasa (YP/X) son las
variables de elección para seleccionar el mejor medio de cultivo. Al realizar un análisis
estadístico empleando el test de rangos múltiples de Duncan, se observó que hay
diferencia significativa entre todos los medios evaluados. Los medios sintéticos (medios
123
1 y 2) presentan una baja producción de AC y un bajo rendimiento en producto. Igual
comportamiento se observó en el medio 3, que contiene harina de soja. El medio 4
presentó un alto rendimiento de AC con base a biomasa producida, pero una baja
concentración durante el cultivo. El medio de cultivo que reportó los más altos valores
de producción de AC fue el medio 5, con 335 mg L-1
, mientras que con los medios
químicamente definidos se alcanzaron valores de 140 mg L-1
.
De acuerdo con resultados de la bibliografía, la producción de AC con los medios
químicamente definidos se encuentra entre 5.6 y 25.4 mg L-1
[2], mientras que con
medios complejos se han alcanzado valores de entre 135 y 742 mg L-1
[3, 10, 26], lo que
coincide con los resultados encontrados en este trabajo. La baja producción de AC en los
medios 1 y 2 se puede explicar por la carencia de suficiente fuente de nitrógeno y la
ausencia de aminoácidos esenciales para su síntesis como leucina, serina, valina,
arginina, ornitina, entre otros, que han sido reportados por diferentes autores y sus
funciones están definidas en la ruta metabólica de biosíntesis de AC [10, 27].
Figura 3. 1. Efecto del uso de diferentes medios de cultivo sobre la producción de ácido clavulánico (AC) en mg L-1 (barras claras) y sobre el rendimiento de producto en mg AC g de biomasa seca -1 (barras oscuras) en cultivos de S. clavuligerus. Los valores de concentración de AC deben multiplicarse por 10.
0
20
40
60
80
100
120
1 2 3 4 5
Medios de cultivo
124
Actualmente para la formulación de medios de cultivo para la producción de AC se
emplean mezclas de aminoácidos con el fin de proveer los nutrientes necesarios para la
síntesis [21, 28], y por esta causa los medios 4 y 5 fueron incluidos en el estudio. El
medio 4 contiene una mezcla compleja de aminoácidos presentes en las proteínas de la
harina de soja, mientras que el medio 5, además de tener los aminoácidos presentes en
harina de soja se suplementa con los aminoácidos libres presentes en los
casaminoácidos. Como se muestra en la figura 3.1, los resultados sugieren que la
presencia de aminoácidos libres incrementa la producción de AC de 100 a 330 mg L-1
.
Un fenómeno similar fue observado en cultivos con harina de soja y con proteína
hidrolizada de soja, donde con este último componente se incrementó la concentración
en un 100% [9]. La presencia de fuentes complejas de aminoácidos al parecer
desfavorece la formación de biomasa incrementando el rendimiento de producto. Podría
pensarse que hay un incremento en el potencial redox (NADH/NADPH) en la célula
dado por la síntesis de aminoácidos y la generación de biomasa, este potencial debe ser
equilibrado al interior de la célula, provocando un cese en el crecimiento y la activación
del metabolismo secundario.
3.3.2. Evaluación de la concentración de glicerol.
Basándose en los resultados de los medios de cultivo, la concentración de glicerol fue
evaluada en el medio 5 y los resultados se presentan en la figura 3.2. Al realizar un
análisis estadístico empleando el test de rangos múltiples de Duncan [22-23] para
comparar las velocidades específicas de crecimiento y concentración de producto, se
observan diferencias significativas entre todos los medios para la velocidad específica de
crecimiento pero no para la concentración del producto entre los medios con 2 y 10% de
125
0
20
40
60
80
100
120
140
2% 5% 10%
Contenido de glicerol
glicerol. Se observó un máximo en la producción de AC con 5% de glicerol alcanzando
994 mg L-1
, mientras que a 2% y 10% de glicerol la producción fue menor. El
rendimiento de producto no presenta este máximo y se observa una disminución del
rendimiento con el aumento de la concentración de glicerol, debido a un aumento en la
formación de biomasa.
Un comportamiento tipo campana de Gauss fue observado en la producción de AC en
función de la concentración de glicerol, también ha sido reportado este comportamiento
por otros autores, quienes indican que altas concentraciones de glicerol inhiben la
producción de ácido clavulánico y reprimen la producción de otros antibióticos en Sc [3,
29- 30].
Figura 3. 2. Efecto de la concentración de glicerol (2, 5 y 10%), empleada como fuente de carbono en cultivos de S. clavuligerus, sobre la producción de ácido clavulánico (AC) en mg L-1 (barras claras) y sobre el rendimiento de producto en mg de AC.g de biomasa seca-1 (barras oscuras), empleando el medio 5. Los valores de concentración de AC deben multiplicarse por 10.
126
3.3.3. Fermentación en biorreactor de laboratorio
Una vez evaluado el medio apropiado para la producción de AC y definida la
concentración de glicerol para este medio, se cultivó S. clavuligerus en un fermentador
con el fin de determinar las cinéticas de crecimiento, de consumo de sustrato y de
producción de AC, y evaluar el modelo matemático propuesto. Los resultados se
presentan en la figura 3. 3. Se observa que el AC se detectó a partir de las 24 h de
cultivo pero fue a partir de las 48 h que comenzó su fase de producción exponencial.
Durante este periodo y hasta las 81 h se observó crecimiento de la biomasa lo que
demuestra que la producción de AC está, en parte, asociada a la producción de biomasa.
Debido a que la concentración de AC es muy baja hasta las 48 h, se asumió en el modelo
que hasta este tiempo la producción era nula. Sin embargo los resultados experimentales
se muestran sin eliminar estos puntos. La velocidad de producción de biomasa cae a cero
cuando la concentración de glicerol está por debajo de 4.6 g L-1
, sin embargo el consumo
de glicerol continúa hasta las 107 h, donde la concentración de glicerol alcanza niveles
por debajo del límite de detección. Esto podría significar que velocidad de producción
de biomasa es en realidad el balance entre formación y disrupción de material celular. A
partir de las 81 h la velocidad de producción de AC experimentó una fuerte reducción
correlacionándose con la presencia de una baja concentración de glicerol. Esta menor
velocidad de producción se mantuvo constante hasta las 126 h. Durante este periodo, la
producción de AC, no estuvo asociada a la velocidad de crecimiento sino a la
concentración de biomasa presente.
127
Figura 3. 3. Cinética de fermentación de S. clavuligerus en un biorreactor de 5L, empleando el medio 5 a una concentración de glicerol de 5%. Los símbolos representan datos experimentales, las líneas continuas representan el ajuste con el modelo matemático propuesto. Símbolos: Glicerol (O), biomasa ( ) y ácido clavulánico (∆).
De acuerdo con el comportamiento del modelo, se puede observar que hay un ajuste
significativo con los datos de consumo de glicerol y de formación de AC y un mejor
ajuste con los datos de producción de biomasa, cuyos valores predichos son menores que
los observados durante la fase de crecimiento. Un mejor ajuste de los valores de biomasa
se observa en la fase estacionaria. Los valores de los parámetros del modelo se presentan
en la Tabla 3.1.
Tabla 3.1. Parámetros del modelo cinético estimados con un 95% de nivel de confianza, que fueron utilizados para la simulación de la fermentación de S. clavuligerus.
Parámetros Valores estimados
µmáx (h-1
) 0.046+/-0.002
Ks (g L-1
) 0.450+/-0.005
Yxs (g g-1
) 0.21+/-0.03
Yxp (g mg-1
) 0.010+/-0.003
α (mg g-1
) 0.0025+/- 0.0002
0
200
400
600
800
1000
1200
0
10
20
30
40
50
60
0 50 100 150
AC
(m
g/L
)
Bio
mas
a y
Gli
cero
l (g
/L)
Tiempo (h)
128
El valor de velocidad específica de crecimiento celular es del mismo orden que algunos
de los valores reportados en la bibliografía [27, 31-32]. Los valores de rendimiento de
producto Yxp obtenidos con el ajuste del modelo fueron similares a los que se presentan
en las figuras 3.1 y 3.2 para el medio 5.
El modelo tipo Contois propuesto comparado con los modelos tipo Modod y Teisser es
el que mejor ajusta a los resultados experimentales (menor error residual, 3.71%) y
permite explicar el comportamiento de la fermentación con base en las hipótesis
postuladas al establecer las cinéticas de biomasa, sustrato y producto. Esto es, la
biomasa y el sustrato limitan la velocidad específica de crecimiento, y el AC es
producido con componentes asociados y no asociados a la velocidad de crecimiento.
A pesar de que los modelos matemáticos son una herramienta importante para desarrollo
de técnicas de optimización y control de procesos [33], existen pocos estudios al
respecto para Streptomyces. Ozergin-Ulgen en 1993, propuso el primer trabajo orientado
en obtener los parámetros cinéticos que describen la actividad de S. coelicolor para
producir actinorrodina en cultivo en lote. El modelo de formación de producto del tipo
Luedeking-Piret, permitió plantear que la producción era asociada al crecimiento [32].
Continuando con esta hipótesis, Baptista y colaboradores en el 2000, utilizaron un
modelo cinético basado en la ecuación de Monod para describir los datos experimentales
de Sc y emplearon un modelo cinético para el producto de efecto mixto, que considera
dos términos asociado y no asociado al crecimiento [34-35]. El modelo propuesto en
este trabajo incluye las consideraciones de estos autores para la formación de producto
observándose un buen ajuste con los resultados experimentales.
129
3.4. CONCLUSIONES
Un medio de cultivo complejo con fuentes de aminoácidos libres o hidrolizados de
proteínas favorece la síntesis de ácido clavulánico. Un medio con estas características, es
el medio 5, evaluado en el presente trabajo. El glicerol empleado como fuente de
carbono mostró un valor óptimo de concentración en 50 g L-1
, dentro de los valores de
concentración evaluados, confirmándose que a altas concentraciones de glicerol inhiben
la síntesis de AC. Los resultados obtenidos en la selección del medio y concentración de
glicerol se emplearon para realizar una fermentación en biorreactor de laboratorio, y el
modelo propuesto simuló con alto grado de ajuste los resultados experimentales,
confirmando la bondad del modelo, que incluye una cinética tipo Contois para la
biomasa y una cinética de formación de producto con componentes de formación
asociado y no asociado al crecimiento.
130
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[22] Duncan, D., ―Multiple range and multiple F-test‖, Biometrics, vol. 11, no. 1, pp. 1-42, 1955
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[24] K. Burton, ―A study of the conditions and mechanism of the diphenylamine reaction for the
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[25] M. Foulstone and C. Reading, ―Assay of amoxicillin and clavulanic acid, the components of
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132
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Mercosur Congress on Chemical Engineering and 4th. Mercosur Congress on Process System
Engineering, pp. 1–10, 2005.
133
CAPÍTULO 4
UNA COMBINACIÓN DE ANÁLISIS DE SENSIBILIDAD Y
AFM MUESTRAN LA IMPORTANCIA DE LA ESTRATEGIA
DE ALIMENTACIÓN DE AMINOÁCIDOS PARA LA
BIOSÍNTESIS DE AC EN Sc.
El análisis de flujo metabólico (AFM) es una herramienta de la IM, cuyo propósito es
proveer un nuevo enfoque de tipo sistémico para el diseño racional de sistemas biológicos
complejos. La aplicación de AFM implica la necesidad de realizar desarrollos matemáticos
que se vuelven robustos y difíciles de manejar a simple vista, por lo que se requiere
herramientas matemáticas que permiten resolver el sistema, y, previo a la experimentación,
poder definir las mejores variables a analizar de acuerdo con un análisis de sensibilidad. En
este trabajo se realizó un análisis de sensibilidad y un AFM, a partir de la representación
matemática de las rutas bioquímicas más importantes, consideradas en la biosíntesis de AC
por Sc. Se observó que los flujos metabólicos medidos que más inciden en el sistema
celular fueron los de las síntesis de los AAs fenilalanina, isoleucina, tirosina y lisina.
También se pudo establecer que, de acuerdo con la distribución de flujos a dos D (0.02 y
0.03 h-1
), la biosíntesis de AC se ve favorecida a una menor D, dando lugar a mayores
valores en los flujos de producción de gliceraldehido-3-fosfato, fosfoenolpiruvato y
piruvato, flujos precursores del ciclo de Krebs y del ciclo de la urea. Se encontró además
que el flujo de producción de ORN afecta directamente la biosíntesis de AC en mayor
grado que el flujo de ARG, lo cual deja ver la importancia del control del flujo de carbono
134
a través del ciclo de la urea, en la biosíntesis de AC.
4.1. INTRODUCCIÓN
Los antibióticos son sintetizados a partir de precursores metabólicos producto del MCC,
por lo que una mayor producción requerirá un adecuado suministro de algunos
metabolitos intermediarios relevantes, resultantes de la actividad de la célula. El
mejoramiento de la producción de antibióticos ha estado ligado a actividades de
mutagénesis aleatoria con importantes avances en los últimos años; uno de los organismos
más estudiados es Sc, especialmente en lo que respecta a sus características genéticas y
proceso de biosíntesis de antibióticos [1-3]. La combinación de aspectos genéticos y el
empleo de técnicas de IM permiten introducir cambios racionales en el metabolismo
central, y propender por el incremento de flujos de precursores metabólicos y cofactores
que permitan mejorar la concentración de un producto de interés [4], o minimizar la
generación de subproductos [5]. El AFM es uno de los núcleos metodológicos de la IM el
cual particularmente ayuda a la optimización de la distribución de flujos metabólicos
(DFM) [6-7].
Algunos trabajos en los cuales se ha empleado el AFM como herramienta para mejorar el
proceso se discuten a continuación. Kirk et al, (2000), realizaron un AFM para conocer la
distribución de flujos en el metabolismo central del carbono (MCC) de Sc, generados al
limitar el medio de cultivo en las FC, FN, FP [8]; esto permitió proponer una estrategia
racional de mejoramiento del medio a través de alimentación de AAs favoreciendo la
disponibilidad del precursor C5 (ARG). En este trabajo también se encontró que, bajo
limitación de nutrientes en el medio, el flujo a través de la vía anaplerótica (carboxilación
de PEP para producir oxaloacetato) era bajo, consistente con la carencia del precursor
135
ARG, desfavoreciendo así una buena producción de AC. Con base en los resultados
obtenidos se propuso que la limitación de carbono restringe el flujo de carbono por la vía
anaplerótica, reduciendo el potencial requerido para que en el ciclo de Krebs se pueda
favorecer la biosíntesis de los AAs precursores de AC. Estudios experimentales que
incluían limitación de N mostraron una reducción de los flujos de los precursores de la
biosíntesis de AC, debido a la reducción de los flujos de la biosíntesis de AAs. En el caso
de estudios con limitación de P, los resultados mostraron altos valores de flujos en los
precursores C3 y C5 que favorecieron la producción de AC [8].
Bushell et al, (2006), realizaron cultivos en continuo con medio basal y con medio
enriquecido por la adición de AAs individuales y mezclados, buscando favorecer la
producción de AC; para la estrategia de selección de estos AAs emplearon como
herramienta el AFM. Mediante la adición de AAs sintetizados a partir de ASP, ASN y
THR, entre otros, se incrementaron los flujos de la vía de síntesis de ARG, generando un
aumento de 5 veces el rendimiento de AC, con respecto al medio sin adición de estos AAs
[9].
Con el fin de estudiar el comportamiento del metabolismo celular ante cambios en
condiciones ambientales, se ha desarrollado un método basado en análisis de sensibilidad,
teniendo en cuenta la estequiometria, de la red metabólica propuesta. Empleando este
método se ha logrado analizar el efecto de perturbaciones en los flujos medidos sobre el
sistema y también el efecto de cambios de la composición de la biomasa sobre las
reacciones metabólicas calculadas [10]. Daae e Ison (1999), encontraron que un cambio en
el flujo de oxígeno es el que genera mayor impacto sobre la distribución de flujos del
sistema [10]. Además, demostraron que el uso de la composición de la biomasa de E. coli,
136
como modelo de biomasa para para S. lividans, es una buena aproximación, ya que no
afecta significativamente el patrón de flujos calculados en el metabolismo de S. lividans.
De esta manera es aceptable adoptar la composición de biomasa de E. coli para
representar la biomasa de S. lividans en estudios de IM [10].
Dada la importancia que amerita el estudio de medios y su efecto en la distribución de
flujos metabólicos (DFM), en el presente trabajo se analiza la producción de AC en medio
continuo, usando una cepa salvaje de Sc y diversas estrategias de enriquecimiento de
medios. Adicionalmente se estudia la DFM como resultado directo de la adición de AAs y
de la tasa de dilución (D), y se hace una descripción cuantitativa del efecto de la variación
de flujos metabólicos individuales sobre la acumulación de AC.
4.2. MATERIALES Y MÉTODOS:
En la figura 4.1 se presenta de manera esquemática la metodología empleada para llevar a
cabo la recopilación de datos experimentales para realizar el AFM; el trabajo experimental
consideró un proceso en continuo y la cuantificación de los flujos en estado estacionario,
tomando el promedio de tres tiempos de residencia, después de estado estacionario del
proceso.
4.2.1. Técnicas microbiológicas.
4.2.1.1. Microorganismo y medio de conservación.
Se empleó un liofilizado de la cepa Streptomyces clavuligerus (Sc) ATCC 27064. La
activación se realizó en caldo TSB a 28 ºC por 36 h. La cepa activada se almacenó a -80 ºC
en tubos eppendorff con medio TSB/glicerol al 40%. Estos tubos se emplearon como
semilla para todos los ensayos [11].
137
Figura 4.1. Representación esquemática del proceso de producción de AC en lote y en continuo. Siglas: AC: Acido clavulánico, Sc. Streptomyces clavuligerus, MP: Medio de
producción de AC, X, biomasa; AAs, aminoácidos; GLC, glicerol; , tiempo de residencia; D, tasa de dilución, V: volumen del cultivo T: temperatura, t: tiempo del cultivo
4.2.1.2. Medios de cultivo.
Para la preparación del preinóculo se empleó el medio de cultivo TSB (Triptone Soy Broth)
que está compuesto de: Bactotriptona (digerido pancreático de caseína) 17 g L-1
, Bacto
Soytone (digerido de harina de soja) 3 g L-1
, glucosa 2.5 g L-1
, NaCl 5 g L-1
y K2HPO4 2.5 g
L-1
.
Para realizar el modelado metabólico se requiere de un medio químicamente definido, por
esto se seleccionó el medio 2 trabajado en el capítulo 3. Los ensayos de fermentación se
realizaron con un medio de producción (MP) conteniendo la siguiente composición:
Glicerol 20 g L-1
, MgSO47H2O 1.23 g L-1
, K2HPO4 3.5 g L-1
, asparagina 2 g L-1
y 1 mL L-1
de solución de elementos traza. La composición de la solución de los elementos traza fue:
Análisis de AC,
X, AA, GLC, PO4 para AFM
MP
Productos
(AC) Lote:
Bioflo 110, 3L, V: 1L de MP
T:28°C, pH: 6.8+/-0.2, t: 100 h
500 rpm, agitadores Rushton
Flujo de aire: 1 vvm.
Continuo:
Bioflo 110, 3L, V: 1L de MP
T:28°C, pH: 6.8+/-0.2, t lote: 36-40 h
Continuo hasta 6 , D: 0.03 y 0.02 h-1 500-1200 rpm, agitadores Rushton
Flujo de aire: 1 vvm.
Botón de 10 mL Centrifugado a 23°C
10 min a 4000 rpm
Inóculo en MP
V: 100 mL,
Erlenmeyer con 4
bafles,
T:28°C, 220rpm, pH:7
t: 24-36 h
X= 8 +/- 1 g L-1 Stock de Sc.
Medio TSB con
Glicerol al 40% T : -80ºC
Tubo semilla
Preinóculo, Medio TSB V: 100 mL
Erlenmeyer con 4 bafles
T: 28°C, 220 rpm, pH: 7
t: 24-36 h
X = 8 +/- 1 g L-1
100 mL de inóculo
138
FeSO4.7H2O 1 g L-1
, MnCl2.4H2O 1g L-1
, ZnSO4.7H2O 1 g L-1
y CaCl2.3H2O 1.3 g L-1
. El
medio de producción fue ajustado a pH 6.9 con solución buffer MOPS (buffer [3-(N-
VAL, ALA, LEU, ORN, ASN, CYS, MET, THR, LYS, PRO, ILE, GLY, OAA, PYR,
aKG y GAP, lo que da la posibilidad de seleccionar y hacer diferentes análisis de
sensibilidad, considerando alguno de estos como sustratos o como producto. Algunos de
estos metabolitos seleccionados presentan una mayor conectividad (metabolitos presentes
en gran cantidad reacciones) con respecto a otros metabolitos intermediarios en el MCC
[25].
4.3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
4.3.1. Cultivos en biorreactor en lote y continuo, para la producción
de AC.
En la figura 4.3 se presentan los resultados obtenidos durante el cultivo de Sc en medio
químicamente definido. Se observa una fase de producción de AC no asociada a la fase de
crecimiento que alcanza una máxima concentración de 62.3 mg L-1
, a las 72 h de cultivo. El
descenso en este valor después de las 72 h se puede explicar por agotamiento de los
nutrientes, en especial de la FN, una justificación puede ser que el AC por ser tan
inestable y contener N en su estructura, la Sc lo emplee como fuente alternativa de N [26].
Otra justificación puede deberse a que este producto, en su forma natural, es químicamente
148
inestable; ya se conoce a través de algunos estudios cinéticos, que hay unas velocidades de
producción y de degradación simultáneas de AC, siendo en la idiofase más alta la
producción que la degradación y en la trofofase estas se invierten, la velocidad de
degradación es mayor que la velocidad de producción, por lo que se nota el declive en la
curva cinética para la producción de AC por parte de Sc [27]. De acuerdo con la cinética
observada se puede establecer que entre las 36 y 42 h, la ASN, que es la única FN, se
encuentra en condiciones de limitación y a las 48 h se ha consumido completamente.
Durante el tiempo de cultivo estudiado, no se observó limitación de P ni de FC. El OD se
mantuvo a concentraciones superiores al 50% del valor se la saturación (datos no
reportados).
Figura 4. 3. Cinética de fermentación de S. clavuligerus en un biorreactor de 3L, Cultivo en lote. OD superior al 50%, 500rpm, 28ºC, 1vvm, pH 7, medio químicamente definido.
Los símbolos representan los datos experimentales. Símbolos: Glicerol (O), biomasa (□),
ácido clavulánico (∆), fosfato (◊) y asparagina (•).
0
20
40
60
0
4
8
12
16
20
24
0 24 48 72 96
AC
(m
g L
-1)
Bio
mas
a y s
ust
rato
s (g
L-1
)
Tiempo (h)
149
El modelo que mejor se ajusta a los datos experimentales empleando el medio
químicamente definido es el modelo cinético tipo Monod (menor error residual, 4% ). Los
valores de los parámetros del modelo se presentan en la Tabla 4.1.
Tabla 4.1. Parámetros del modelo cinético estimados con un 95% de nivel de confianza, que fueron
utilizados para la simulación de la fermentación de S. clavuligerus
Parámetros Valores estimados
µmáx (h-1
) 0.041 ± 0.005
Ks (g L-1
) 0.12 ± 0.01
Yxs (g g-1
) 0.38 ± 0.00
Yxp (g mg-1
) 0.15 ± 0.02
α (mg g-1
)
Kd (h-1
)
0.00015 ± 0.00012
0.0085 ± 0.0004
El valor de velocidad específica de crecimiento celular es del mismo orden que algunos de
los valores reportados en la bibliografía [9, 24] y el reportado en el capítulo 3. El valor de
Ks, es menor que el obtenido en el capítulo 3 y para ambos casos este valor bajo muestra la
afinidad del microorganismo por el sustrato. El valor de rendimiento de producto Yxp es
un orden de magnitud mayor que el obtenido en el medio complejo, correspondiente esto
con los bajos rendimientos de producto que se obtienen para un medio de cultivo de estas
características.
El parámetro cinético µmax es muy importante para establecer las condiciones de operación
del proceso en modo continuo. Para trabajar en continuo la D debe ser inferior al 80% del
valor de la máxima velocidad específica de crecimiento (µmax) obtenida en lote. De
150
acuerdo con la literatura, a menor D se obtiene mayor producción de AC [9]. En estas
fermentaciones se obtuvo un agotamiento de nitrógeno después de las 50 h de iniciado el
cultivo, en este tiempo no se encontró limitación de P ni de GLC y se evidencia un
crecimiento exponencial de producción de AC. Para iniciar los ensayos en modo continuo,
se puso en marcha un proceso en lote y se tomó como base de tiempo para iniciar la
alimentación de nutrientes y salida de productos un tiempo entre 40 y 48 h, tiempo en el
cual se presenta una desaceleración de producción de biomasa, agotamiento de la fuente de
nitrógeno y máxima producción de AC, características estas dadas en cultivos de
metabolito secundarios.
En la Tabla 4.2 se muestran los resultados de los flujos medidos a las dos tasas de dilución
evaluadas. Después de alcanzar el estado estacionario, los valores obtenidos fueron
normalizados con respecto al flujo de glicerol a la mayor tasa de dilución con dos
propósitos, uno mitigar errores de cálculo y para facilitar la comparación entre las dos
condiciones. Estos valores serán utilizados para determinar la DFM calculados.
De estos resultados se puede notar que al reducir la tasa de dilución se obtiene una mayor
producción de AC (dos veces), lo que correlaciona con observaciones hechas por otros
autores [9]. También se observa que al reducir la tasa de dilución se genera una mayor
demanda de glicerol y de oxígeno, y se incrementa la demanda de la FN (ASN).
La velocidades de síntesis de los AAs, en su mayoría, fueron mayores a menor D, como es
el caso de νPHE, νTRP, νILE, νASN, νGLY y νALA, correlacionando con una menor νX, que pasó
de 1.17 a 0.78 g L-1
, cuando se cambió D, de 0.03 a 0.02 h-1
.
151
Tabla 4. 2. Valores de flujos extracelulares medidos, obtenidos a dos tasas de dilución. Para efectos de AFM se seleccionaron los flujos normalizados.
flujos medidos
(mmolg-1h-1)
TASA DILUCIÓN D (h-1
)
0.03 0.02 0.03 0.02
sin normalizar normalizado
vGLC (ν1) 0.3522 0.6895 100 195.7
vPHE (ν7) 4.6 E-05 5.33 E-05 0.013 0.015
νTYR (ν8) 7.21E-05 2.17 E-05 0.021 0.006
νTRP (ν9) 0.0000 6.67 E-05 0.0000 0.0189
νVAL (ν12) 8.2 E-05 8.33 E-05 0.0233 0.0237
νASN (ν21) 3.03E-07 2.5 E-04 8.59E-05 0.0710
νILE (ν26) 5.33E-05 7.33 E-05 0.0151 0.0208
νPRO (ν29) 5.6 E-05 2.67 E-05 0.0159 0.0076
νX (ν32) 1.17 0.78 332 221
νO2 (ν41) 0.1740 0.2175 49.4 61.8
νGLY (ν43) 0.0000 8.33 E-05 0.0000 0.0237
νNH4 (ν47) 0.06 0.05 17.2 14.2
νALA (ν13) 1.7E-04 0.04827 0.000143 0.0406
4.3.2. Análisis cuantitativo del comportamiento metabólico intracelular.
El modelo estequiométrico propuesto, mostrado en la figura 4.2 y apéndice A1, presenta
un grupo de ecuaciones lineales independientes que conforman una matriz de 60 x 47, con
un número de condición de 42, indicando que la matriz tiene baja sensibilidad a posibles
errores experimentales de los flujos medidos. Como se disponía de suficiente información
experimental para agotar los F, se trabajó un sistema determinado. Para la selección de los
flujos a medir se tuvo en cuenta el análisis de sensibilidad aplicando la ecuación (26)
(capítulo 2).
En la tabla 4.3 se presentan los resultados obtenidos para el análisis de sensibilidad del
modelo metabólico con 13 flujos medidos, y en la tabla B1 del apéndice B, se muestra un
análisis de sensibilidad con 6 compuestos adicionales, considerándolos como posibles
152
flujos medidos. El análisis de sensibilidad con estos compuestos adicionales se realizó con
el fin de determinar su efecto sobre el sistema metabólico definido y además determinar
cuál matriz de flujos calculados presenta el menor número de condición (ver Apéndice B).
En la primera columna de la tabla 4.3 están indicados los flujos a calcular y en la primera
fila los flujos propuestos a medir. Cada celda de la tabla muestra el efecto o la sensibilidad
de un flujo calculado con respecto a cambios en un flujo medido. Este coeficiente, permite
determinar cuál de las perturbaciones generadas en los flujos medidos genera el cambio
más significativo en los flujos calculados, o lo que es lo mismo, cuál de los flujos
calculados presenta mayor sensibilidad a cambios finitos en los valores de los flujos
medidos. En la última fila de la tabla se presenta el efecto total de cada flujo medido sobre
el sistema metabólico, es decir sobre todos los flujos calculados.
De los flujos medidos con los que se obtiene un menor número de condición, los flujos de
νPHE, νILE y νTYR, son los que generan un mayor efecto sobre el sistema metabólico
propuesto, alcanzando cuantitativamente un 55% del efecto global de todos los 13 flujos
medidos.
Sin embargo, con todos los flujos medidos y analizando su sensibilidad sobre el sistema,
(Tabla 4.3 y Tabla B1), se observa que el mayor efecto de un flujo sobre el sistema recae
153
Tabla 4. 3. Análisis de sensibilidad para los flujos calculados (c) con respecto a
cambios en los flujos medidos (m). El nombre del flujo que se toma como medido está en la fila superior y los resultados de los flujos calculados están en la primera columna. El valor de cada casilla corresponde al cociente .
* El acumulado corresponde a la sumatoria de la sensibilidad para cada flujo medido.
Flujos
νc PHE ILE TYR TRP VAL GLC PRO O2X ALA ASN NH4 GLY
νLYS* PYR + GLU+ 2NADPH + ATP + ASP + SUCCOA<==>LYS +CO2+aKG + SUC 0.2182
* Corresponde a las reacciones netas de ILE (suma de reacciones de biosíntesis de ASPSEMALD, THR e
ILE, equivalente a las reacciones 22, 24 y 26, respectivamente) y de LYS (suma de reacciones de
biosíntesis ASPSEMALD y LYS que corresponden a 22 y 25, respectivamente).
Al reducir la tasa de dilución, se observan también mayores valores en algunos flujos de
la vía glicolítica como son ν3PG, νPEP y νPYR que generan una mayor disponibilidad de
carbono en el MCC. El flujo anaplerótico (ν6), se encuentra muy activo en ambas D,
siendo éste el que logra promover la actividad metabólica en el ciclo de Krebs, más que
el ν11, que es la vía principal de flujo de carbono. En la figura 4.4 también se observa
que hay un gasto de PYR, a la D más alta, orientado hacia otros metabolitos como X,
LYS, ILE, LEU, ALA y VAL, lo que ocasiona una restricción en el flujo de carbono
hacia el ciclo de Krebs, dando lugar a una limitación en los precursores OAA y aKG.
163
GAP
PEP
PYR
ACCOA
TCA
aKG
OAA
ORN
ARGASP
GLU
CA
F6P
G6P R5P
RIB5P
X
PHE
TYR
ASPSEMALD
LYS
16129
16.2-11.9
GLC
NADPH
NADH
NADPH(NADH)
NADP(NAD) + ATP
3PG
SUCCOA
Figura 4. 4. Distribución de flujos metabólicos de la producción de AC a partir de Streptomyces clavuligerus (Sc). Los valores de los flujos correspondientes a la tasa de dilución 0.02 h-1 se nuestra en la parte superior de cada flujo, y los correspondientes a la tasa 0.03 h-1 en la parte inferior. Las siglas se presentan en la lista de abreviaciones.
El aKG es precursor de GLU el cual favorece la biosíntesis de ORN; los flujos en esta
dirección aumentan al aumentar la D, mientras que se observa un efecto inverso a
menores tasas de dilución. El rol de GAP, PEP y PYR, en la síntesis de AC ha sido
ampliamente discutido por diversos autores [9, 24]. Los altos flujos de estos
intermediarios del metabolismo glicolítico generan altos flujos de carbono en el ciclo de
Krebs, necesarios para la posterior formación ARG como precursor de AC.
164
Un aspecto difícil de establecer a la luz de los resultados, es la generación de ATP en
concentración suficiente para mantener activa la red metabólica completa [28]. En los
resultados mostrados en la figura 4.5, se observa una relación inversa entre el flujo de
ATP y el de AC, lo cual está de acuerdo con las reacciones establecidas en la tabla 4.3,
en donde el ATP debe estar disponible como sustrato mientras que el AC está disponible
como producto. Lo anterior es consistente con lo observado en otros trabajos, donde en
cultivos de S. lividans, se encontró una relación inversa entre la presencia de ATP
intracelular y la acumulación de antibióticos [34].
Los valores de los flujos obtenidos para ORN y AC, a las D evaluadas, fueron iguales
(figura 4.4) por lo que se puede inferir que el flujo de ORN, más que el de ARG, es
limitante para la biosíntesis de AC. Esto se observa claramente a la mayor D, en donde
a pesar de estar disponible el precursor de ARG y haber limitación del flujo de ORN, no
se vio favorecida la biosíntesis de AC. Ya en trabajos previos, otros autores habían
reportado que el simple aumento en los niveles de acumulación de ARG, no conducía
de manera directa a la mayor producción de AC [14, 24].
4.4. CONCLUSIONES
A partir de la combinación de un análisis de sensibilidad y de flujo metabólico, fue
posible establecer la incidencia de la velocidad de formación de diversos flujos de
aminoácidos y/o productos metabólicos, sobre la distribución de flujos metabólicos
dirigidos a la formación de ácido clavulánico, a partir de Streptomyces clavuligerus. El
sistema celular fue representado a partir de una modelo matemático que consideraba 60
reacciones bioquímicas, representativas de las capacidades metabólicas de Streptomyces
clavuligerus.
165
De manera general se observó que, para lograr altos rendimientos en la formación de
AC, se debe garantizar una buena disponibilidad de los flujos de los metabolitos
intermediarios, GAP, PEP, PYR, OAA y ORN. Para la red metabólica propuesta se
encontró que los flujos metabólicos medidos que más afectan el sistema celular son los
flujos de PHE, TYR, ILE. A su vez, los flujos calculados que más se ven afectados por
los flujos medidos corresponden a los flujos generadores de NADPH, tanto por la vía
oxidativa de la pentosa fosfato, como por la reacción de transhidrogenación de NADPH.
A partir del análisis de sensibilidad, también fue posible observar que a pesar de ser
algunos compuestos puntos nodales de mucha conectividad en la red metabólica
propuesta (OXA, aKG, GAP, ARG, ORN y ASP) no constituyen etapas
significativamente incidentes en la distribución del flujo de carbono, durante el proceso
de síntesis de AC. Finalmente, se encontró que el flujo de la ornitina, más que el flujo de
arginina, afecta directamente la biosíntesis de AC, dejando ver la importancia del control
del flujo de carbono a través del ciclo de la urea, en la biosíntesis de AC.
166
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169
CAPITULO 5
ANÁLISIS DE BALANCE DE FLUJOS (FBA) EN LA
PRODUCCIÓN DE AC EN Streptomyces clavuligerus.
El Análisis de Balances de flujos (FBA) es una herramienta que facilita el estudio de
procesos metabólicos permitiendo proponer estrategias para el mejoramiento de la
producción de metabolitos en biotecnología. Se empleó FBA para analizar la red
metabólica estequiométrica correspondiente a Sc, que tiene en cuenta las reacciones más
representativas que involucran catabolismo y anabolismo en la biosíntesis de AC a partir
de Sc. Se empleó la teoría de optimización para cuantificar todos los flujos y así poder
entender las limitaciones que tiene la célula impuestas por su estequiometria, además de
entender como influye el flujo a través de cada ruta en el comportamiento global del
metabolismo. La solución matemática del modelo metabólico se realizó aplicando
criterios de maximización de tres funciones objetivo (FOBJ): la velocidad específica de
crecimiento, los requerimientos de energía como ATP y formación de producto. Se
observó que la maximización de ATP, muestra la mejor aproximación del modelo
metabólico a valores experimentales. Posteriormente se empleó FBA con maximización
de ATP como objetivo celular para predecir bajo condiciones de limitación de nutrientes
(glicerol, amonio, oxígeno y fosfato) el efecto sobre las velocidades específicas de
crecimiento y de producción de AC específicas. Con los resultados obtenidos bajo las
limitaciones de nutrientes se puede inferir que las condiciones de limitación de amonio y
de fosfato son las que más favorecen la biosíntesis de AC, y mientras que los flujos
170
internos que más afectan la biosíntesis de AC por la limitación de los nutrientes
(concentraciones en el medio de C, N, P y O2 en cantidades menores a las requeridas por
la célula para su mantenimiento) son los flujos νORN y el flujo que alimenta al ciclo de
Krebs, ν12.
5.1. INTRODUCCIÓN
Una de las herramientas fundamentales en IM es el análisis de balances de flujos
(FBA), con el cual se logra determinar una DFM en una célula y su análisis permite
entender el comportamiento metabólico del microorganismo en función del interés
deseado para la síntesis de metabolitos, eliminación de subproductos entre otros. En los
últimos años se ha logrado un incremento en el desarrollo de la metodología FBA a nivel
experimental, con la incorporación de técnicas de análisis para detectar marcadores
isotópicos por GC-MS o NMR, y a nivel computacional como el uso de software para
analizar redes metabólicas extensas y algoritmos matemáticos mejorados [1-2]. Existen
pocos trabajos en los cuales se ha aplicado modelado metabólico con el objetivo de
incrementar la producción de AC [3- 4].
La descripción del metabolismo se representa por un modelo estequiométrico que puede
incluir varios cientos de reacciones. Estas reacciones implican una serie de restricciones
al comportamiento celular y cada una de ellas representa un flujo metabólico activo.
Es por esto que un entendimiento de la estequiometria es crucial para identificar y
caracterizar el comportamiento celular a nivel de la distribución de los flujos
metabólicos. Cuando la célula crece en un medio de cultivo definido, la metodología
FBA también permite evaluar cómo la adición o remoción de nutrientes puede afectar la
171
DFM y con esto, la síntesis de metabolitos de interés. La estrategia para realizar esta
predicción parte de la identificación de la red metabólica de la célula del
microorganismo de interés, la cual es normalmente muy grande y contiene más
metabolitos que reacciones estequiométricas. Para la determinación de los flujos
metabólicos del modelo metabólico propuesto se requiere la medición experimental de
algunos flujos para agotar los grados de libertad del sistema. Sin embargo a menudo esto
no es posible, con lo que el sistema se torna subdeterminado requiriendo para su
solución técnicas de optimización. Los métodos matemáticos de optimización se
emplean para maximizar o minimizar una FOBJ biológica, permitiendo así la obtención
de los flujos metabólicos del modelo. La identificación de un modelo metabólico
subdeterminado y su solución con estrategias de optimización, se conoce como análisis
de balance de flujo (FBA-flux Balance Analysis) [5].
Existen varios trabajos reportados en la literatura aplicando FBA tendientes a identificar
condiciones de alta producción de antibióticos con cepas del género Streptomyces. En
estos trabajos se han evaluado estrategias para la formulación de medios de cultivo,
resolviendo el modelo con funciones objetivo basadas en el crecimiento de la biomasa
bacteriana [6-7].
Se han realizado estudios con FBA para evaluar los efectos del cambio en la FC y en los
AAs (GLU, ASP, THR y ARG), que permitieron encontrar condiciones óptimas para
incrementar el rendimiento del producto de interés [3, 6, 8]. Estos estudios se basaron en
el empleo de una FOBJ basada en el crecimiento de la biomasa
La función objetivo a ser optimizada (maximizada o minimizada) en el sistema, el
modelo de reacciones estequiométricas que describen el metabolismo y la definición de
172
algunos flujos medidos, como el flujo de carbono y de producto de interés por ejemplo,
son restricciones que limitan el espacio de solución del sistema para encontrar un óptimo
[2, 6]. La FOBJ que más ha sido empleada para estudios con FBA es la tasa de
crecimiento específico, lo cual es consistente con la ventaja evolutiva de las especies de
rápido crecimiento. La función objetivo de biomasa se define como una ecuación
estequiométrica a partir de la las macromoléculas que la componen, generando también
una demanda metabólica de metabolitos para el crecimiento [2]. Otras FOBJ que han
sido consideradas para el análisis del metabolismo de Streptomyces por FBA han sido la
producción de ATP [6- 7] y la formación de producto de interés [9-10].
Este trabajo pretende evaluar el efecto de la variación de los flujos de las fuentes de C,
N, P, O2, sobre las velocidades de crecimiento de Sc y la producción de AC empleando
FBA con el fin de identificar condiciones de cultivo adecuadas aplicables a escala de
laboratorio. Para realizar el FBA, previamente se evaluaron tres FOBJ metabólicas
(producción de biomasa, de energía (ATP) y formación de AC) con el fin de seleccionar
la que permita alcanzar resultados más ajustados respecto de valores experimentales
tomados de la bibliografía.
5.2. METODOLOGÍA:
5.2.1. Planteamiento de la red metabólica.
El modelo metabólico estequiométrico empleado en el presente trabajo consistió de 100
reacciones que involucraban 92 metabolitos [11]. Estas reacciones se presentan en el
apéndice A1 y una representación sintética a modo de mapa metabólico se presenta en la
figura 5.1. Para este caso no se consideraron las reacciones de transporte de
aminoácidos.
173
SUC, UREA,C
O2,NH4
ADP
NADPH
ATP
AC
aKG, CO2NADPH,ATP
ACext
X
UREA
ORN
Fu
GLN
CARBP
ARGSUCC
ARG
CITRU
NADPHaKG,
GAP
PEP
PYR
ACCOA
TCA
aKGSUC
FUM
OAA
NH4
F6P
G6P R5P
X5P RiB5P
E4P
SED7P
NADH
VAL
ALA
CO2, NADH
CO2
LYS
NH4
CO2,NADPH
NADH
, NADPH
NADPH
GCL
GCL3P
MAL
3PG
CO2, NADH
HSER
HOMCYS
ME
THR
AKMETVAL
ASPSEMALD
2METBUTCOAILE
LLDIAPIMASN
UTP
PRO
NA
DP
H
GLN
CO2
SUCCOA
GLU
ASP
CO2
DHAP
CO2
NH4
LEU
3METBUTCOA
NAG1P
SER
GLY, METHF
CYS
aKI
aIPM 3METBUTCOA
GLU aKGGLU aKG
TRP
TYR
PHE
CHOR
GLN, PRPP
CO2, GAP,GLU,PYR
GLU aKG,CO2
GLU aKG,CO2
F16P
GLITEICH
CO2ISOPPGLITEICH
CDP,
CTP
E4P
HIS
PRPP
GLN
aKG
AICAR
GTP
dGTP
GLN,GLY,ASP\CO2
FUGLU
ASP, GLN
GLU
O2 CO
2
GCLext
PO4
NADHMK9H
97
98
84
3
4
9
10
90
23 11
12
1314
15
16
91
29
36
37
38
39
40
93
44
45
7
6
5
17
96
2
1
100
85
28
24
26
27
30
NADPPH
ATPEXT
CITOPLASMA
MEDIO EXTRACELULAR
Figura 5.1. Representación sintética de la red bioquímica empleada para modelado metabólico en Sc. vi indica el flujo de cada reacción y el subíndice i se refiere a una reacción específica .
174
El modelo tiene en consideración las reacciones del modelo planteado en el capítulo 4, a
excepción de la reacción de biomasa. La reacción de síntesis de biomasa empleada para FBA
es propia para Sc, y se cuenta con información acerca de su composición macromolecular.
Además se describen más reacciones de síntesis de aminoácidos, se detallan más las
reacciones involucradas en el ciclo de la urea y que conectan el ciclo de la urea con el ciclo de
Krebs. La gluconeogénesis involucra las reacciones en el MCC que corresponden a los flujos
5 a 10 y 90. La vía PP involucra los flujos 17 a 22 y el ciclo de Krebs involucra los
flujos 12 a 16 y 91 común en la mayoría de Streptomyces sp [12]. También se tuvo en
cuenta la biosíntesis de todos los precursores involucrados en la producción de biomasa de Sc
(85) [11-12], el ciclo de la urea (38 a 40 y 93) [3, 13] y biosíntesis de AC (84) [14].
A continuación se describen las reacciones metabólicas que fueron incorporadas al modelo y
que no están incluidas en el modelo propuesto en el capítulo 4.
Síntesis de biomasa: La reacción estequiométrica para la síntesis de biomasa de Sc se basó en
su contenido macromolecular el cual está representado en la siguiente ecuación
estequiométrica [10]:
= 0.075CARBO + 0.01 DNA + 0.065 GLYTEICH + 0.15 LIPID + 0.1 PEPGLY + 0.5 PROTEIN + 0.1 RNA
Teniendo en cuenta la reacción de síntesis de cada contenido macromolecular se genera la
ecuación de biosíntesis de biomasa representada por la reacción ν85 del Apéndice A1.
La composición elemental de la biomasa de Sc para los elementos C, H, N, O y P, está dada
por CH1.77N0.22O0.51P0.02 (PM 25.68 g mol-1
) [8].
Biosíntesis de aminoácidos: Los aminoácidos considerados en el modelo metabólico fueron
todos aquellos involucrados en la relación estequiométrica de biomasa [11], en el ciclo de la
175
urea [11] y en la biosíntesis AC [14] y en la vía de la PP [11,14].
Ciclo de la urea: Además de los metabolitos que se tuvieron en cuenta en el modelo del
capítulo 4, se tuvo en cuenta la síntesis de carbamoil fosfato y síntesis de sus precursores [11,
14].
Requerimientos de energía: Los cofactores moleculares ATP, NADH, NADPH, son
indispensables, debido a su importancia en la reacciones de abastecimiento energético y como
puntos de interconexión entre las reacciones del catabolismo y anabolismo. Las reacciones de
abastecimiento energético tienen como propósito, generar energía libre de Gibbs,
principalmente en forma de ATP, y generar poder reductor (o equivalentes de reducción),
principalmente en forma del cofactor NADPH, el cual es requerido en las reacciones
biosíntesis y para formación de metabolitos precursores en la biosíntesis de biomasa [15].
Para el modelo metabólico se consideraron además otras reacciones de biosíntesis de
nucleótidos y los componentes de energía de polimerización para construcción de bloques
(reacciones 24, 25, 63 a 71, 77, 79, 87 y 88) [11]. Un mayor detalle de estas
reacciones se puede encontrar en: (http://www.biomedcentral.com/content/supplementary/1471-2105-1-1-
s2.pdf).
5.2.2. Análisis de balances de flujos metabólicos (FBA).
La matriz estequiométrica empleada en este capítulo corresponde a las dimensiones (100 x
91), con 8 grados de libertad. Para lograr que el sistema quede determinado se deben medir
experimentalmente 8 flujos metabólicos. En este capítulo, se aborda un análisis del efecto de
algunos flujos de nutrientes esenciales para el microorganismo y por esto se requiere permitir
producir AC. Aunque el mejor ajuste se haya obtenido con la maximización de la biomasa, las
condiciones metabólicas proporcionadas por esta suposición, no son las adecuadas para la
producción de AC, ya que este metabolito se produce en condiciones de baja velocidad de
crecimiento, comportamiento propio del metabolismo secundario. De otro lado, la
optimización celular maximizando el flujo de producción de ATP, también muestra un ajuste
importante a los resultados experimentales de flujo de CO2 y biomasa. El flujo de biomasa
simulado con la función ATP, tiene el mismo valor que el obtenido con la función objetivo de
maximización de biomasa, lo cual es completamente consistente ya que la maximización de la
biomasa demanda un máximo de producción de ATP y la maximización de ATP genera una
máxima producción de biomasa, puesto que estos dos flujos son directamente proporcionales
entre sí. De otro lado, la función objetivo producción de ATP exhibe un valor de flujo de AC
mayor que cero y más cercano a los que debe dar experimentalmente, ya que solo es un orden
de magnitud superior al valor experimental. Otras simulaciones realizadas con esta misma
función objetivo, a tasas de dilución mayores que 0.03 h-1
(datos no mostrados) mostraron que
la producción de AC se reduce al aumentar la tasa de dilución, lo que también es consistente
con resultados experimentales observados para AC [3]. Para el objetivo celular de maximizar
AC, a pesar de no haber un error considerable en el flujo de CO2, se observa un valor de flujo
de AC tres órdenes de magnitud superior al valor experimental, por lo que para fines de
análisis, esta función no conduce a una aproximación deseable. De acuerdo con todas estas
consideraciones y a pesar de ser matemáticamente mejor modelo de predicción la
optimización de biomasa específica, no lo es desde un punto de vista biológico. Además,
algunos reportes para predecir comportamiento de Streptomyces sp, han mostrado este
objetivo celular como una buena aproximación al metabolismo secundario [6-7]. Por lo que la
182
PEP
PYR
ACCOA
aKGSUC
FU
OAA
UREA
ORN
ARG ASP
GLU
GLN
AC
10
12
23
MAL
GLC
GAP
3PG
37
30
29
44
CARBP
CITRU
pp
TCA
FOBJ de maximización de ATP es adoptada para continuar los estudios del efecto de los flujos
de nutrientes.
5.3.2. Efecto de los flujos de nutrientes (C, O2, N, P) sobre la producción
de biomasa y AC y sobre algunos flujos metabólicos intracelulares.
Los resultados del efecto de la variación de los flujos de carbono (GLC), nitrógeno (NH4),
oxígeno (O2) y fósforo (PO4-2
), se presentan en las figuras 5.3 a 5.6 respectivamente. El efecto
de estos cuatro flujos de nutrientes esenciales para Sc, se complementa con un análisis del
cambio en algunos de los flujos internos más representativos de la red metabólica. Estos flujos
internos se muestran esquemáticamente en la figura 5.2.
Figura 5.2. Representación simplificada de la red metabólica de Sc, incluyendo los flujos intracelulares más representativos.
183
El efecto de cambios en el flujo de la FC se muestra en la figura 5.3A. Allí se observa que al
disminuir el flujo de GLC a valores inferiores al requerimiento celular estequiométrico se
genera una menor producción de AC, mientras que la velocidad específica de crecimiento de
biomasa se mantiene constante. La reducción en la producción de AC con la reducción del
flujo de carbono es consistente con resultados obtenidos por otros autores en donde incluso a
flujos de consumo muy bajos de carbono, el flujo de AC llega a ser cero [13]. El resultado
observado durante la simulación en donde la velocidad específica de crecimiento se mantiene
constante al incrementar la limitación de carbono, es un fenómeno atípico dado que, tal como
lo explica la ecuación de Monod, la velocidad de biomasa debería disminuir conforme
disminuye la FC en condiciones de limitación. Este comportamiento atípico solo podría
explicarse si el rendimiento de biomasa en sustrato (YXS) se incrementa a medida que la fuente
de carbono disminuye, sin embargo no se encontraron estudios experimentales al respecto para
confrontar este resultado.
Con relación a los flujos internos, una reducción en el flujo de consumo de la FC (GLC),
ocasiona una disminución en la mayoría de estos flujos como se puede observar en la figura
5.4B. La reducción de la producción de AC, se genera por la disminución de sus flujos
precursores como 29, 36 y 39. También se observa un incremento en la actividad del ciclo de
Krebs lo que es consistente con la maximización de la función objetivo de producción de ATP
y lo cual genera una reducción en los flujos periféricos al ciclo como se observa en la
importante reducción del 29 de producción de glutamato. Dado los flujos 12, 17, 29 y 44,
son flujos precursores de metabolitos de biomasa, se observa que algunos de ellos se
incrementan y otros disminuyen durante la simulación de una reducción en el flujo de
184
carbono, con lo cual se puede esperar un equilibrio en la síntesis de biomasa que la conlleve a
permanecer constante
Figura 5.3. Efecto de la disminución del flujo de glicerol (mmol g-1 h-1), sobre el flujo de AC y de biomasa (gráfica A) y sobre los flujos internos (gráfica B), "In Silico" para Sc. Símbolos:
(○) flujo de ácido clavulánico (mmol g-1 h-1); (□) flujo de biomasa (h-1).
Los resultados del efecto la reducción del flujo de N (NH4) se presentan en la figura 5.4. En la
figura 5.4A, se observa que en el intervalo de flujos de nitrógeno entre 1.2 y 0.3, el flujo de
AC es constante y máximo con respecto a valores de flujo de nitrógeno superiores e inferiores
-100
-80
-60
-40
-20
0
20
40
v84 v10 v12 v17 v23 v29 v30 v36 v37 v39 v44
Cam
bio
en e
l f
lujo
(%
)
Flujos intracelulares
Gráfica B
0.000
0.005
0.010
0.015
0.020
0.025
0.030
0.035
0 1 2 3 4 5 6
Flu
jo A
C
y
Flujo de glicerol
Gráfica A
185
Figura 5.4. Efecto de la disminución del flujo de amonio (mmol g-1 h-1), sobre el flujo de AC y de biomasa (gráfica A) y sobre los flujos internos (gráfica B), " In Silico" para S. clavuligerus.
Símbolos: (○) flujo de ácido clavulánico (mmol g-1 h-1); (□) flujo de biomasa (h-1).
a este rango. Algunos autores han observado que incrementando el flujo de amonio en
condiciones de exceso, el flujo de AC experimenta una disminución, por lo que se ha
explicado que el nitrógeno reprime su síntesis [13, 18]. Esta observación es consistente con los
resultados de las simulaciones de este trabajo. Es interesante resaltar el resultado de encontrar
también una disminución del flujo de AC a muy bajos valores de flujo de amonio, por debajo
de 0.3. Este comportamiento también se ha observado a nivel experimental en el cual, una alta
0.000
0.005
0.010
0.015
0.020
0.025
0.030
0.035
0.040
0.045
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0
Flu
jo A
C
y
Flujo de amonio
Gráfica A
-120
-100
-80
-60
-40
-20
0
20
40
v84 v10 v12 v17 v23 v29 v30 v36 v37 v39 v44
Cam
bio
en e
l f
lujo
(%
)
Flujos intracelulares
*5
Gráfica B
500 %
186
limitación de nitrógeno genera que el microorganismo consuma AC como FN y se
experimente un flujo medido menor [19], sin embargo, aunque el modelo genera una
tendencia de acuerdo con la evidencia experimental, este resultado no es generado por una
representación adecuada del microorganismo in silico, dado que el modelo metabólico no
incluye reacciones de consumo de AC.
También se observa que el flujo de biomasa se reduce linealmente con el incremento de la
limitación de nitrógeno, que dentro del modelo se evidencia por la alta sensibilidad que tiene
el flujo de biomasa con respecto al de amonio. Igualmente este fenómeno se ha evidenciado
experimentalmente, en donde cultivos continuos de Sc alimentados bajo la misma tasa de
dilución pero reduciendo alternativamente el flujo de nitrógeno, han mostrado una reducción
significativa de la velocidad de producción de biomasa concomitante con el incremento de la
producción de AC [18].
En la figura 5.4B se observa que hay una reducción del flujo de AC con la reducción del flujo
de nitrógeno. Esto se debe a que en la figura se está tomando la reducción del flujo de
nitrógeno en todo el intervalo de estudio, sin embargo ya se ha dicho que existe un intervalo
donde el flujo de AC es máximo. La actividad del ciclo de Krebs disminuye en un 500% con
forme se limita el flujo de nitrógeno, lo que explica la caída en el flujo de biomasa en más del
87% en el mismo intervalo.
Los resultados del efecto de cambios en el flujo de oxígeno se presentan en la figura 5.5. En la
figura 5.5A, se observa que mientras se disminuye el flujo de consumo de oxígeno entre 13 y
7 no se observa ningún cambio los flujos de biomasa y de AC, sin embargo, una mayor
reducción en el flujo por debajo de 7, genera un aumento exponencial en el flujo de AC
187
Figura 5.5. Efecto de la disminución del flujo de oxígeno (mmol g-1 h-1), sobre el flujo de AC y de biomasa (gráfica A) y sobre los flujos internos (gráfica B), " In Silico" para S. clavuligerus.
Símbolos: (○) flujo de ácido clavulánico (mmol g-1 h-1); (□) flujo de biomasa (h-1).
conjuntamente con una disminución en el flujo de biomasa. Como se observa, el modelo
metabólico muestra un efecto significativo del flujo de oxígeno y permite identificar que una
manera plausible de incrementar la producción de AC es regular la transferencia de oxígeno en
el proceso fermentativo obligando a la célula a consumir oxígeno de acuerdo con la oferta del
mismo. Estas predicciones del modelo son consistentes con resultados experimentales toda vez
0.000
0.005
0.010
0.015
0.020
0.025
0.030
0.035
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
0 3 6 9 12 15
Flu
jo A
C
Flujo de oxígeno
Gráfica A
-120
-100
-80
-60
-40
-20
0
20
40
60
80
100
120
v84 v10 v12 v17 v23 v29 v30 v36 v37 v39 v44
Cam
bio
en
el
flu
jo (
%)
Flujos intracelulares
6000%
Gráfica B
145%217%
3500%5000%
188
que al ser Sc un microorganismo aerobio, una mayor demanda de oxígeno corresponde a un
mayor aumento del flujo de biomasa y dado que el AC es un metabolito secundario,
incrementos en la velocidad de producción de biomasa reducen la producción de AC [3, 20].
En la figura 5.5B se observa que hay un aumento en el flujo de AC muy superior a los valores
reportados experimentalmente, lo que lleva a concluir que son valores poco realistas en cuanto
a la predicción deseada por un modelo. Este resultado es congruente con el aumento
igualmente poco realista de los flujos de los precursores 36, 37, 39. Sin embargo, estos
resultados sirven para analizar de forma cualitativa tendencias sobre los efectos esperados del
flujo de oxígeno. Por ejemplo, una reducción del flujo consumo de oxígeno incrementa la
producción de AC, como fuera mencionado antes. También reduce el flujo de producción de
biomasa el cual está relacionado con los flujos 17 y 30 que también disminuyen. Con
relación al incremento en la actividad en el ciclo de Krebs dada por 12, es difícil encontrar
una explicación coherente sobre este fenómeno debido a la disminución del flujo de consumo
de oxígeno. Al contrario, se esperaba que una reducción del flujo de oxígeno generara una
reducción en el flujo hacia el ciclo de Krebs por la limitación que se generaría en la etapa de la
fosforilación oxidativa impidiendo una adecuada regeneración del NAD+ para volver al ciclo
de Krebs y formación de ATP.
Estos resultados permiten recordar que el estudio realizado es basado en un modelo que ha
sido previamente validado con algunos datos experimentales pero que de ninguna forma puede
tomarse como una herramienta completamente elaborada y es válida para obtener primeras
aproximaciones al comportamiento fisiológico del microorganismo.
Los resultados del efecto del cambio en el flujo de fosfato sobre la producción de AC y flujo
de biomasa, se presentan en la figura 5.6. En la figura 5.6A, se observa que la disminución de
189
Figura 5.6. Efecto de la disminución del flujo de fosfato (mmol g-1 h-1), sobre el flujo de AC y de biomasa (gráfica A) y sobre los flujos internos (gráfica B)," In Silico" para S. clavuligerus.
Símbolos: (○) flujo de ácido clavulánico (mmol.g-1.h-1); (□) flujo de biomasa (h-1).
este flujo de consumo de la fuente de fósforo no genera efectos o cambios significativos en los
flujos de biomasa y AC. Al comparar estos valores de flujo de AC bajo limitación de fosfato
con respecto a los obtenidos por simulación con el modelo metabólico bajo limitación de otros
nutrientes (flujo de glicerol y flujo de amonio), se observa que los valores más altos de flujos
de AC se obtienen justamente bajo esta limitación, aumentando en un 500%. Este valor
-10
-8
-6
-4
-2
0
2
4
6
8
10
v84 v10 v12 v17 v23 v29 v30 v36 v37 v39 v44
Cam
bio
en
el
flu
jo
(%)
Flujos intracelulares
0.027
0.0275
0.028
0.095
0.096
0.097
0.098
0.099
0.100
0.101
0.102
0.0 0.1 0.2 0.3
µ
Flu
jo d
e A
C
Flujo de fosfato
Gráfico A
190
aunque elevado en comparación con los resultados de los flujos de glicerol y nitrógeno, es un
resultado realista ya que la evidencia experimental de diversos autores muestra que la
limitación de fósforo es el detonante principal para incrementarla producción de AC [13]. De
otro lado, bajo las consideraciones de alimentación de fósforo de la figura 5.6A, la biomasa no
se ve afectada.
Los flujos intracelulares muestran muy poca variación con relación al cambio en el flujo de
consumo de fosfato (figura 5.6B), que correlaciona con las mínimas variaciones predicas para
los flujos de AC y de biomasa.
Una reducción del flujo de fósforo, reduce la actividad del ciclo de Krebs y por consiguiente
se incrementa la actividad de las reacciones de bifurcación del ciclo como la de producción de
glutamato 29. Sin embargo, como ya se indicó, los cambios observados son mínimos.
5.4. CONCLUSIONES
El modelo metabólico propuesto para Sc permite realizar análisis preliminares sobre el
comportamiento celular, como para analizar los efectos de variables de interés como el flujo
de carbono, nitrógeno y fósforo sobre variables relevantes como el flujo de biomasa y de AC.
El modelo presenta las mejores predicciones empleando como función objetivo la
maximización de la producción de ATP con respecto a las demás funciones evaluadas,
producción de biomasa y producción de AC.
Bajo las consideraciones de limitación de nutrientes se puede establecer que bajo limitación de
glicerol y amonio, los flujos de AC se ven disminuidos, siendo crítica la limitación de C,
mientras que la limitación de NH4 en cierto rango se mantiene constante el valor de flujo de
AC obteniéndose el máximo valor permitido de acuerdo con las restricciones del modelo
metabólico.
191
Los flujos internos más relevantes a condiciones de limitación de carbono fueron el flujo de
GLU, flujo de la vía PP y el flujo de biosíntesis de GLN. Para el caso de limitación de
nitrógeno los flujos que tuvieron mayor disminución por la disminución del flujo de amonio
fueron los flujos en el ciclo de Krebs con el ν12 y el ν36 correspondientes a biosíntesis de
ORN.
Para los casos de disminución de oxígeno y fósforo se obtuvieron los valores máximos de
flujo de AC. El caso de disminución de flujo de oxígeno el modelo no explica el aumento del
AC. Se encontró que los flujos de mayor aumento fueron los flujos en el ciclo de Krebs y ν36
que corresponde al flujo de ORN. Bajo condiciones de limitación de fosfato, se ve favorecido
el flujo de GLU.
Para el ciclo de la urea, se consideraron los flujos precursores ν36 (flujo de ORN), ν37 (flujo
de CARBP) y ν39 (flujo de ARG-SUC), encontrando que el mayor efecto bajo las
condiciones de limitación de todos los nutrientes está dada por el cambio en el flujo de ORN
más que en los otros dos precursores del ciclo de la urea. Además de verse el mismo cambio
para los ν37 y ν39 para todas las condiciones de limitación.
En conclusión general, la comparación de los resultados experimentales con los resultados
obtenidos por FBA a diferentes funciones objetivo, resulta muy útil, ya que se puede evaluar
el potencial biológico de un cultivo particular. Entre los propósitos de este tipo de estudio está
el poder indicar algún objetivo o estrategia a seguir para la manipulación genética o
modificaciones en el proceso de producción, que permitan disminuir u optimizar los tiempos
destinados para obtener mayores valores en los flujos de AC.
192
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