Análise genética em fungos por meio do ciclo

UERGSGenética de microorganismos

Prof. Dra. Adriana Dantas

Esporos sexuais Designações:

Ascosporos (esporos sexuais dos ascomicetos)

Esporos sexuais ordenados ou não-ordenados

Basidiosporos (basidiomicetos)

Feita com apenas um gene envolvido em suas duas formas alélicas ou com dois ou mais genes.

1 gene – A1 e A2 – possíveis 6 tipos de asco ou seis disposições de tétrade ordenadas

Meiose dentro do asco – 8 esporos sexuais Quatro células repetidas duas a duas

Seis tipos de tétrades – resulta na ocorrência ou não de permutação (crossing-over) entre o gene considerado e o centrômero

Analise desta tétrade permite a determinação da distância entre o gene estudado e o centrômero do cromossomo onde esse gene esta localizado

Selvagem:esporos sexuais pigmentados (pretos) : gene c+

Mutante: esporos sexuais albinos: gene c-

Ascosporos de Sordaria (Ophistokonta: Fungi: Ascomycota) ordenados segundo a orientação das divisoes celulares da meiose

Corpo frutifero de Sordaria (Ophistokonta: Fungi: Ascomycota) cheio de esporos

Ciclo de vida haploide (n=9) Fase curta diploide (2n=18) Hifas multinucleadas

Fusão extremidade das hifas

Celulas binucleadas Mitose

Fertilização - meiose Fusão dos pares de nucleo Celulas monucleadas

diploides Mitose

4 nucleos n = 8 nucleos n Ordem linear

Origem ascas dentro de corpos frutíferos - PERITÉCIOS

Figura 2. Em Sordaria fimicola a produção de um asco contendo 8 ascósporos haplóides (n) a partir de uma céluladiplóide (2n) envolve uma divisão meiótica seguida de uma divisão mitótica. A posição relativa dos ascósporos clarose escuros reflete a ordem das cromátides no núcleo de uma célula em meiose, permitindo a dedução da ocorrênciade permutação entre duas das quatro cromátides (meiose representada à direita), além disso, permite também aidentificação daquelas que efetivamente participaram da permutação (modificado de Stansfield, 1985).

O arranjo reflete diretamente a ordem das cromátides no núcleo de uma célula diplóide em processo de meiose

O processo ordenado permite identificar quais das quatro cromátides participam da permuta entre dois marcadores (1 gene e o centrômero) durante a recombinação intracromossômica

Possibilita o calculo da distancia relativa entre o gene e o centrômero

A distancia relativa entre um determinado gene e o centrômero é feito dividindo-se por dois a porcentagem de ascos recombinantes

% ascos recombinantes = frequência de ascos onde houve permuta entre o gene e o centrômero

Frequência de recombinação = ½ da frequência de quiasmas, uma vez que, 4 produtos de meiose apenas 2 são recombinantes

Numero de ascos recombinantes x 100

Numero total de ascos analisados

Onde, um centimorgans (cM) – 1% de recombinantes

Analise as fotomicrografias recebidas, observe ascos contendo ascósporos no seu interior, ascósporos estes que se originaram do cruzamento entre uma linhagem selvagem (ascósporos escuros) e uma mutante (ascósporos claros) de Sordaria fimicola.

Observe que o arranjo linear de ascósporos claros e escuros difere entre os vários ascos. Analise somente os ascos íntegros, ou seja, com oito ascósporos. Determine a distribuição de ascósporos claros e escuros em pelo menos 20 ascos.

Nos ascos, o arranjo do tipo quatro ascósporos escuros e quatro claros (4m+ : 4m) se forma quando não ocorreu permuta entre o gene marcador e o centrômero.

Quando ocorreu permuta entre o gene marcador e o centrômero, o arranjo dos ascósporos escuros e claros dentro do asco será do tipo 2:2:2:2 que, por sua vez, pode se distribuir em diferentes ordenações:

a) 2 escuros : 2 claros : 2 escuros : 2 claros; b) 2 claros : 2 escuros : 2 claros : 2 escuros; c) 2 escuros : 4 claros : 2 escuros; d) 2 claros : 4 escuros : 2 claros

A1

A2

Quatro ascosporos em um asco com ascosporos ordenados

Gene A: alelos A1 e A2

I II III IV V VI

Tipos I e II: 50% do total (25% I e 25% II)Tipos III e IV: 12,5% de cada

recombinantes

a) para cada par de cromossomos homólogos duplicados e emparelhados somente duas das quatro cromátides sofrem permutação e, portanto, somente metade dos ascósporos resultante é recombinante, pois a outra metade é classificada como sendo do tipo parental (não recombinante);

b) a unidade de distância relativa, denominada centimorgan (cM), corresponde a 1% de recombinantes.

Recombinantes são produzidos sem processo meiótico ou ciclos sexual

Ocorre nos deuteromicetos ou fungos imperfeitos (sem ciclo sexual)

Fusão de hifas e formação de um heterocarions que contém núcleos haplóides.

Apesar de ser raro, o ciclo parassexual é importante na evolução de alguns fungos.

Anastomose (A), heterocariose (B) e cariogamia (C) presentes no ciclo parassexual em fungos 

Consiste na união ocasional de diferentes hifas monocarióticas (de indivíduos diferentes) originando uma hifa heterocariótica em que ocorre fusão nuclear e “crossing-over” mitótico.

Há a formação de aneuplóides por erros mitóticos e então o retorno ao estado haplóide por perda cromossômica.

São formadas hifas homocarióticas recombinantes. Processo não muito comum em condições naturais devido

à existência da incompatibilidade somática que impede que hifas de micélios diferentes se anastomosem ao acaso,

Processo é evolutivamente interpretado como um mecanismo de segurança e preservação do genoma original.

Obtenção de linhagens diplóides com mutantes para coloração de colônias

Duas linhagens haplóides: ade, w (requer adenina e conídios

brancos) paba, bi, y (requer ácido p-aminobenzóico,

biotina e conídios amarelos)Germinação das linhagens, ocorre

anastomose de hifas (pareamento), e formação do HETEROCÁRIO (sem adenina, biotina, ac. p-aminobenzóico)

Os conídios de constituição genética igual a dos conídios que deram origem ao heterocarion não podiam germinar e formar colônias

No entanto, alguma colônias de heterocarions germinam são diplóides pela fusão de núcleos haplóides com divisões mitóticas

Analise no conteúdo de DNA é o dobro do encontrado na linhagem haplóide e presença de setores recombinantes nessas colônias, indicando natureza heterozigótica

Ponto inicial é a heterocariose Fusão de núcleos - originam diplóides

heterozigotos Produção de recombinantes Permutação mitótica e haploidização

Recombinação mitótica foi descrita pela primeira vez por Stern em seu clássico Drosophila

Para Stern, a recombinação se refere apenas aos cruzamentos recíprocos (RCOs) (Figura 1A).

Método para recuperar os dois produtos de RCOs em Saccharomyces cerevisiae.

Método para medir as taxas de espontânea e induziu recombinação mitótica.

Figura 1. Crossovers recíproca e conversão gene.(A)Um RCO é retratado entre cromátides de dois cromossomos homólogos. A segregação padrão resulta em células-filhas que se tornaram homozigotos para a seqüência de distal para o site de crossover. (B-D) Uma visão de close-upa região delineada pelo caixa pontilhada, mostrando diferentes configurações do gene conversão detectável marcadores.(B)n º de conversão, seja porque não houve conversão gene ou o trato era muito pequeno para ser detectado com os marcadores disponíveis. Todos os marcadores são ainda presente em uma proporção de 2:2. (C)Um evento de conversão típico gene produz um padrão que altera alguns dos marcadores (b e c) a proporção de 3:1. Note-se que as caracterisitcas de conversão só pode ser detectada se os dois produtos recíproca (ie, tanto células-filhas) são recuperados e analisados , como feito por Lee et al. (D) Genes que foram total ou parcialmente 04:00. No exemplo mostrado aqui, marcador de b tem segregado 04:00, mas marcador c tem segregado 3:1; este é, portanto, uma 04:00 / 03:01 é uma conversão gene híbrido .

Por que a recombinação mitótica, que pode ser prejudicial, ocorre?

A maioria RCOs espontânea são iniciadas pelo DNA dupla vertente-breaks (LAP).

É provável que vários tipos de lesões de DNA pode ser importante para eventos de recombinação mitótica espontânea.

Além disso, alguns agentes recombinantes (tais como a radiação ultravioleta) estão pensados para produzir perdas quando o DNA é replicado é cortado .

Assim, a questão de porque torna-se amarrado com a questão de quando.

Em que ponto do ciclo celular que recombinação mitótica ocorre? Enquanto que recombinação meiótica ocorre durante a meiose, a recombinação

mitótica mais provavelmente não ocorre durante a mitose, mas durante interfase. Análise de conversão do gene tratos associados RCOs fornece pistas sobre quando

durante a interfase mitótica recombinação ocorre. O gene de conversão é uma troca não-recíproca da informação genética.

Conversão gene normal entre cromossomos homólogos produz uma proporção de 3:1 de alelos (Figura 1C);

No entanto, também detectados 03:01 / 04:00 como genes híbridos (Figura 1D). Se tratando de 04:00 mais prováveis quando ocorre uma quebra antes de DNA

replicação,, mas ocorre no reparo, após replicação. A replicação de um cromátides quebradas resulta em cromátides irmãs que são

quebradas na mesma posição. Uma vez que ambos estão quebrados, o cromossomo homólogo deve ser utilizado como um modelo de reparação.

Se ambos os cromátides quebradas no reparo foram do cromossomo homólogos, um híbrido 04:00 ou 04:00 / 03:01 é produzido, dependendo ou não ambos os trechos serem idênticos.

A alta freqüência de 04:00 e 03:01 / 04:00 sugere que uma fração considerável da quebras que resulta em RCOs ocorrer antes replicação.

Qual é o mecanismo molecular pelo recombinação mitótica que é realizado?O gene RCOs com diferentes comprimentos na conversão gênica pode ser produzido por diferentes mecanismos.

Conversão curta pode resultado de uma via de reparo envolvendo formação heteroduplex seguido por reparo mismatch (mutação).

A heteroduplex é um região de DNA composto de fios que são derivadas de dois cromossomos diferentes.

Polimorfismos entre os dois cromossomos irá resultar em desencontros, e reparar essas inconsistências podem resultar na conversão de gene.

Embora esse mecanismo tenha sido comprovada a ser importante para conversão do gene meiótica, na qual os genes de conversão são normalmente 1-2 kb de comprimento, ele pode produzir a longas conversões (média de 12 kb).

Existem hotspots de recombinação mitótica como existem para recombinação meiótica?

Acredita-se que alguns sitios chamados comum locais frágeis (QCA) A maioria dos estudos de QCA têm contado com o uso de inibidores de

replicação para aumentar a freqüência de breaks, seguida de detecção citológica.

Os sitios de RCOs, e, portanto, os locais iniciais da espontânea danos, são distribuídos ao acaso.

Porém, a existência de uma região com RCOs elevados. O fato de que tal poderia hotspot ser detectada pelo exame de apenas

1% do genoma faz com que esta descoberta mais intrigante ainda. O que faz certas regiões mais propensas a quebra de mitose e

recombinação de outros? Concentrando-se em regiões propensas a danos espontânea, ao

contrário para danos induzidos.

A distancia entre os loci para o corpo amarelo (y) e o centrômero pode produzir no local twin (manchas chamuscados e amarelo) remendos de tecido onde as células recombinantes (clones da célula original que tinha recombinação mitótica) são homozigotos para qualquer y do ou alelo do sn.

Resulta de uma série de não-disjunções.

A exemplo de A. nidulans, um diplóide com 2n cromossomos pode produzir núcleos contendo um cromossomo a menos, fica instável ate atingir n = 8 cromossomos, que é um estado haplóide.

Organismo haplóide e desprovida de um ciclo sexual , impedindo a aplicação de estratégias que use genética clássica para definir genes essenciais.

No entanto, tem sido mostrado previamente que o ciclo parassexual, que depende da química das cepas para a haploidização diplóides artificial , pode ser usado para demonstrar a função essencial de genes.

A. fumigatus heterozigotos diplóide é gerado por substituição ou por gene alvo por mutagênese insercional aleatório e é submetido a haploidização com ou sem a pressão seletiva correspondente ao introduziu mutação.

A ausência de descendentes haplóides sob condições seletiva só é indicativo da inativação de um gene essencial para o crescimento

Ao utilizar este abordagem, foi demonstrado que o gene FKS1 de A. fumigatus, que codifica a 1,3 - D-glucan-sintase, e o gene smcA, codificação de um membro da SMC (estrutural manutenção do cromossomo)que são de família de proteínas, são essenciais para o crescimento A. fumigatus .

A identificação do genoma de genes essenciais, tem sido desenvolvida in vivo por transposons em um sistema de mutagênese.

Transposons são ferramentas moleculares amplamente utilizado in vitro e / ou in vivo para as bactérias e leveduras, mas só muito recentemente eles têm sido aplicados nos fungos filamentosos.

Elementos transponíveis de classe II da família Tc1, foi identificado por como transposons fitopatogênicos no fungo Fusarium oxysporum e tem se mostrado eficiente em espécies de Fusarium, Aspergillus nidulans e Magnaporthe grisea

Muito utilizado para gerar um conjunto de diplóides heterozigotos.

Estratégia para a identificação de genes Estratégia para a identificação de genes essenciais para essenciais para A. fumigatusA. fumigatus..

Diploides estáveis heterozigotos para os marcadores de cor de esporos (w1 r7) éaleatoriamente mutagenizados com o imp160 elemento transponível:: pyrG(imp:: pyr).

Durante haploidização em um meio contendo benomil,ocorre a erda aleatória de cromossomos dá origem a duas subpopulações de corhaplóide conídios (w1 ou r7): um rolamento do alelo do transposon inativado (população A) e um rolamento do alelo selvagem (população B).

A capacidade de formar progênies haplóides em um meio não-seletivos e da incapacidade de fazê-lo em um meio de haploidização seletiva(sem uridina e uracila) leva à identificaçãode cepas mutantes com uma inserção em um gene essencial.

Triagem Triagem parassexual. parassexual.

Haploidização de 10 diplóides pyrG revertentes NIAD em meio não seletivos (A) e seletivo (B).

Segregação aleatória dos cromossomos é visualizada pela produção de conídios haplóide de cores diferentes.

No caso de integração no plasmídeo um gene essencial, o crescimento residual é observada em meio de haploidização seletiva (setas).

Para esses revertentes NIAD pyrG, esporos haplóides obtidos em meio de haploidização não seletivos foram testados para a ausência do elemento transponível para confirmar o fenótipo.

Ciclo Sexual Ciclo parassexual

1. Fusão nuclear em estruturas especializadas nas hifas resultando zigotos diplóides

2. O zigoto formado é efêmero persistindo por apenas uma geração nuclear

3. Meiose com recombinação meiótica no estágio de quatro fios e volta ao estado haplóide

4. Produtos meióticos (ascósporos) são facilmente reconhecíveis e isolados

1. Fusão nuclear rara em qualquer ponto da hifa dando diplóides

2. O diplóide não é efêmero e sofre mitoses dando mais núcleos diplóides

3. Recombinação rara por permuta mitótica. Ocorre haploidização

4. Os recombinantes mitóticos, se utilizados marcadores apropriados, emergem como setores oriundos de colônias diplóides