Análise da acção do magnésio na respiração mitocondrial e fosforilação oxidativa por controlo da permeabilidade membranar. Introdução Um dos iões mais importantes no organismo humano é o magnésio (Mg 2+ ) devido à sua actividade reguladora. Encontra-se principalmente no citosol mas certos organitos celulares possuem-no na sua constituição em menor percentagem. Entre esses organitos destacamos as mitocôndrias. Estas encontram-se dependentes do magnésio devido às suas funções no metabolismo mitocondrial, na regulação de actividades enzimáticas e no transporte de aniões e catiões. No que toca à regulação de actividades enzimáticas devemos sublinhar que a ATP-sintetase não funciona na ausência de grandes concentrações de magnésio na matriz mitocondrial. Para extrair o magnésio da matriz e poder observar os efeitos na actividade da ATP-intetase pode-se utilizar o ionóforo de catiões A23187 (A23). Materiais e Equipamento Fracção de mitocôndria vegetal (tubérculo de batata) previamente preparada. Sistema de medição de potencial eléctrico (ΔΨ) mitocondrial com eléctrodo de TPP + . Meio de reacção com 250 mM de sacarose, 20 mM de KCl, 2 mM de KH 2 PO 4 , 0.05% de BSA, 10 mM de HEPES, (pH 7.0). 1
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Análise da acção do magnésio na respiração mitocondrial e fosforilação oxidativa por controlo da permeabilidade membranar.
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Análise da acção do magnésio na respiração mitocondrial e fosforilação
oxidativa por controlo da permeabilidade membranar.
Introdução
Um dos iões mais importantes no organismo humano é o magnésio (Mg2+) devido à sua
actividade reguladora. Encontra-se principalmente no citosol mas certos organitos celulares
possuem-no na sua constituição em menor percentagem.
Entre esses organitos destacamos as mitocôndrias. Estas encontram-se dependentes do
magnésio devido às suas funções no metabolismo mitocondrial, na regulação de actividades
enzimáticas e no transporte de aniões e catiões.
No que toca à regulação de actividades enzimáticas devemos sublinhar que a ATP-
sintetase não funciona na ausência de grandes concentrações de magnésio na matriz
mitocondrial.
Para extrair o magnésio da matriz e poder observar os efeitos na actividade da ATP-
intetase pode-se utilizar o ionóforo de catiões A23187 (A23).
Materiais e Equipamento
Fracção de mitocôndria vegetal (tubérculo de batata) previamente preparada.
Sistema de medição de potencial eléctrico (ΔΨ) mitocondrial com eléctrodo de TPP+.
Meio de reacção com 250 mM de sacarose, 20 mM de KCl, 2 mM de KH2PO4, 0.05%
de BSA, 10 mM de HEPES, (pH 7.0).
Soluções:
1 mM de TPP+
100 mM de ADP
100 mM de ATP
1 mM de A23187
1 M de succinato de K
100 mM e 250 mM de MgCl2
100 mM e 250 mM de MnCl2
100 mM e 250 mM de CaCl2
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Resultados
1º Ensaio
Legenda 1: Registos obtidos por utilização de um eléctrodo de TPP+ e representativos da
actividade da ATP-sintetase num meio constituído por mitocôndrias vegetais na presença de 5
mM de MgCl2. As mitocôndrias (0.5 mg) foram adicionadas a 2 ml de meio de reacção
constituído por sacarose 250 mM, KCl 20 mM, BSA 0.05%, HEPES 10 mM, pH 7.2 com
TPPCl 3 µM, onde já foi anteriormente adicionado 0.2 mM de ATP. Após estabilização foram
adicionados ao meio de reacção com mitocôndrias 10 mM de succinato, 300 nmoles de ADP, 1
µM de A23187 e, novamente, 300 nmoles de ADP.
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2º Ensaio
Legenda 2: Registos obtidos por utilização de um eléctrodo de TPP+ e representativos da
actividade da ATP-sintetase num meio constituído por mitocôndrias vegetais na ausência de
MgCl2. As mitocôndrias (0.5 mg) foram adicionadas a 2 ml de meio de reacção constituído por
sacarose 250 mM, KCl 20 mM, BSA 0.05%, HEPES 10 mM, pH 7.2 com TPPCl 3 µM, onde
já foi anteriormente adicionado 0.2 mM de ATP. Após estabilização foram adicionados ao
meio de reacção com mitocôndrias 10 mM de succinato, 300 nmoles de ADP, 1 µM de
A23187 e, novamente, 300 nmoles de ADP.
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3º Ensaio
Legenda 3: Registos obtidos por utilização de um eléctrodo de TPP+ e representativos da
actividade da ATP-sintetase num meio constituído por mitocôndrias vegetais na presença de
0.5 mM de MgCl2. As mitocôndrias (0.5 mg) foram adicionadas a 2 ml de meio de reacção
constituído por sacarose 250 mM, KCl 20 mM, BSA 0.05%, HEPES 10 mM, pH 7.2 com
TPPCl 3 µM, onde já foi anteriormente adicionado 0.2 mM de ATP. Após estabilização foram
adicionados ao meio de reacção com mitocôndrias 10 mM de succinato, 300 nmoles de ADP, 1
µM de A23187 e, novamente, 300 nmoles de ADP.
4
4º Ensaio
Legenda 4: Registos obtidos por utilização de um eléctrodo de TPP+ e representativos da
actividade da ATP-sintetase num meio constituído por mitocôndrias vegetais na presença de
0.5 mM de CaCl2 em vez de MgCl2. As mitocôndrias (0.5 mg) foram adicionadas a 2 ml de
meio de reacção constituído por sacarose 250 mM, KCl 20 mM, BSA 0.05%, HEPES 10 mM,
pH 7.2 com TPPCl 3 µM, onde já foi anteriormente adicionado 0.2 mM de ATP. Após
estabilização foram adicionados ao meio de reacção com mitocôndrias 10 mM de succinato,
300 nmoles de ADP, 1 µM de A23187 e, novamente, 300 nmoles de ADP.
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5º Ensaio
Legenda 5: Registos obtidos por utilização de um eléctrodo de TPP+ e representativos da
actividade da ATP – sintetase num meio constituído por mitocôndrias vegetais na presença de
2 mM de MnCl2 em vez de MgCl2. As mitocôndrias (0.5 mg) foram adicionadas a 2 ml de meio
de reacção constituído por sacarose 250 mM, KCl 20 mM, BSA 0.05%, HEPES 10 mM, pH
7.2 com TPPCl 3 µM, onde já foi anteriormente adicionado 0.2 mM de ATP. Após
estabilização foram adicionados ao meio de reacção com mitocôndrias 10 mM de succinato,
300 nmoles de ADP, 1 µM de A23187 e, novamente, 300 nmoles de ADP.
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Unidade de Tempo
2 min
4 min
Discussão
1º Ensaio
Analisando os resultados obtidos podemos assumir que ao serem adicionados os 300
nmoles de ADP ocorreu uma fosforilação oxidativa na matriz mitocondrial relativamente
rápida. De seguida foi adicionado 1µM de A23 cuja função é retirar o magnésio que existe na
matriz mitocondrial para o meio. Para comprovar que a actividade foi realizada com sucesso
adicionou-se novamente 300 nmoles de ADP. Nesse momento verifica-se uma nova
fosforilação oxidativa, com uma velocidade semelhante à primeira. Assume-se então que a
actividade do A23 foi exercida mas sem resultados evidentes, isto porque a concentração de
magnésio no meio apresentava um valor apreciável relativamente à concentração de magnésio
na matriz mitocondrial, não permitindo uma movimentação (significativa) do magnésio para o
exterior.
Portanto, a 5 mM de magnésio a taxa de fosforilação é de 150 nmol ADP foforilado . mg -
1 proteína . minuto-1, como se pode comprovar com os cálculos seguintes: