AMPLIFIKASI GEN SULFOHYDROLASE PADA DENGAN …... · spesifik untuk gen sulfohydrolase hasil desain dari data sekuens DNA gen ... Forward primer (10 µM ) Reverse primer (10 µM )

AMPLIFIKASI GEN SULFOHYDROLASE PADA Eucheuma cottonii

DENGAN DESAIN PRIMER DARI Chondrus crispus

Naskah Publikasi

Skripsi

Untuk memenuhi sebagian persyaratan

guna memperoleh gelar Sarjana Sains

Oleh

Shoffi Nur Malihah

M0404015

JURUSAN BIOLOGI

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

UNIVERSITAS SEBELAS MARET

SURAKARTA

2008

2

PERSETUJUAN

NASKAH PUBLIKASI

AMPLIFIKASI GEN SULFOHYDROLASE PADA Eucheuma cottonii

DENGAN DESAIN PRIMER DARI Chondrus crispus

Oleh :

Shoffi Nur Malihah

NIM. M0404015

telah disetujui untuk dipublikasikan

Surakarta, ……………………………….

Menyetujui

Pembimbing I Pembimbing II

Prof. Drs. Sutarno, M.Sc, PhD Dr. Wahyu Purbowasito

NIP. 131 649 948 NIP. 680 001 755

Mengetahui

Ketua Jurusan Biologi

Dra. Endang Anggarwulan, M.Si

NIP. 130 676 864

3

AMPLIFIKASI GEN SULFOHYDROLASE PADA Eucheuma cottonii

DENGAN DESAIN PRIMER DARI Chondrus crispus

SHOFFI NUR MALIHAH

Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam

Universitas Sebelas Maret, Surakarta

ABSTRAK

Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui kemungkinan penggunaan primer

yang didesain menggunakan data sekuens DNA gen sulfohydrolase dari

C. crispus untuk mengamplifikasi gen sulfohydrolase yang terdapat pada

E. cottonii, mengetahui sekuens DNA dari gen tersebut dan mengetahui ada

tidaknya perbedaan antara sekuens DNA gen sulfohydrolase yang terdapat pada

C. crispus dengan yang terdapat pada E. cottonii.

Metode yang dipergunakan adalah dengan mengisolasi RNA dari E. cottonii,

membuat cDNAnya dan mengamplifikasi gen sulfohydrolase pada tanaman ini

melalui OneStep RT-PCR ( Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction

dalam satu tahapan berkesinambungan) dengan menggunakan primer yang

spesifik untuk gen sulfohydrolase hasil desain dari data sekuens DNA gen

sulfohydrolase pada C. crispus. Pita DNA yang diperoleh kemudian dirunut

urutan basanya melalui sequencing dengan Applied Biosystems 3130 Genetic

Analyzer. Pengujian perbedaan urutan basa gen sulfohydrolase pada kedua spesies

ini dilakukan melalui reaksi digesti dengan enzim restriksi FastDigest BamHI.

Proses OneStep RT-PCR dapat menghasilkan pita DNA baik menggunakan

cetakan mRNA maupun cetakan total RNA dari E. cottonii. Ukuran pita yang

diperoleh adalah sekitar 400bp , lebih besar dibandingkan dengan perkiraan

ukuran pada C. crispus yang dibuat desain primernya. Untuk memastikan pita

tersebut adalah pita dari gen sulfohydrolase dilakukan perunutan sekuens DNA

dan pemotongan produk PCR dengan restriksi enzim. Sekuen DNA gen

sulfohydrolase pada E. cottonii belum berhasil didapatkan, karena proses separasi

pita DNA produk RT-PCR yang belum sempurna menyebabkan penumpukan

pembacaan pada elektroferogram. Belum dapat dipastikan apakah pita yang

diperoleh melalui RT-PCR pada sampel E. cottonii adalah benar gen

sulfohydrolase yang dimaksud. Melalui pemeriksaan digesti dengan menggunakan

enzim restriksi FastDigest BamHI, didapat dua potongan, dengan panjang 300 bp

dan 100 bp yang sama dengan panjang potongan pada C.crispus. Dari penelitian

ini dapat disimpulkan bahwa terdapat dua kemungkinan : produk PCR yang

berhasil diamplifikasi dengan primer sulfohydrolase adalah benar gen yang

dimaksud, akan tetapi terdapat perbedaan ukuran dan urutan basa gen antara yang

terdapat pada C. crispus dengan yang terdapat pada E. cottonii atau produk yang

berhasil diamplifikasi dengan primer sulfohydrolase adalah bukan gen yang

dimaksud.

Kata kunci : Gen Sulfohydrolase, desain primer, Chondrus crispus, Eucheuma

cottonii, OneStep RT-PCR

4

Pendahuluan

Eucheuma cottonii (Kappaphycus alvarezii) adalah salah satu jenis rumput

laut yang potensial untuk dibudidayakan sebab memiliki nilai ekonomis penting

sebagai penghasil kappa karaginan. Karaginan merupakan polisakarida yang

berasal dari ekstrak alga, dapat dimanfaatkan sebagai bahan baku untuk industri

farmasi, kosmetik, makanan dan sebagainya (Fennema, 1996).

Kandungan karaginan sangat bervariasi tergantung musim, spesies dan

habitat. Syamsuar (2006) melaporkan bahwa kandungan dan komposisi karaginan

juga dipengaruhi oleh jenis rumput laut, fase ( tingkat pertumbuhan ) dan umur

panen. Pada umur 50 hari, E. cottonii menunjukkan kadar rendemen karaginannya

yang tertinggi. Menurut Syahputra (2005), kandungan karaginan dari Indonesia

termasuk terendah (61,5%) dibanding dengan jenis yang dibudidayakan di

Tanzania yang bisa mencapai 72,8%. Untuk itu diperlukan usaha pemuliaan

E. cottonii guna memperoleh tingkat rendemen yang tinggi.

E. cottonii merupakan rumput laut yang masuk ke dalam ordo Gigartinales.

Ordo ini merupakan floridean (termasuk dalam sub kelas Florideophycidae)

dengan talus yang hidup bebas berupa tetrasporofit. Meskipun tetrasporofit ini

akan menghasilkan tetraspora dan membentuk gametofit, namun sejauh ini, belum

terdapat publikasi tentang pemuliaan E. cottonii melalui jalan hibridisasi seksual..

Pemuliaan E. cottonii memerlukan pendekatan bioteknologi karena pemuliaan

melalui jalan hibridisasi seksual belum dapat dilakukan.

Wong dan Craigie (1978) menunjukkan bahwa perubahan µ-karaginan

(prekursor kappa karaginan) menjadi kappa karaginan dikatalisasi oleh enzim

sulfohydrolase. Teknik biologi molekuler akan menawarkan solusi untuk

meningkatkan mutu bibit E. cottonii dengan rekayasa dan over ekspresi dari gen

sulfohydrolase ini sehingga diharapkan dapat diperoleh bibit baru yang memiliki

kemampuan mengkonversi lebih banyak kappa karaginan ( Cheney & Duke,

1995).

Proses over ekspresi gen dilakukan dengan tahap-tahap kloning gen,

pembuatan konstruk, dan transformasi gen. Pada tahapan kloning gen, diperlukan

informasi yang tepat mengenai urutan sekuen DNA gen tersebut diantaranya

5

untuk penentuan jenis enzim restriksi yang akan digunakan untuk memotong gen

tersebut dari genomnya, penentuan ATG, pembuatan konstruk dan sebagainya

( Lewin, 1987 ). Genicot, et al (2003) telah mendaftarkan paten sekuens (baik

asam amino maupun DNA gen) enzim ini pada tahun 2003, namun sekuens

tersebut merupakan sekuens dari Chondrus crispus, sesama alga yang memiliki

hubungan kekerabatan terdekat pada tingkat ordo (Gigartinales) dengan

E. cottonii. Dengan menggunakan data sekuens DNA gen ini dari C. crispus

sebagai acuan untuk desain primer, diharapkan dapat diperoleh sekuens DNA gen

ini pada E. cottonii, dan data ini dapat digunakan untuk melakukan over ekspresi

gen tersebut sehingga kualitas dan kuantitas bibit E. cottonii sebagai penghasil

karaginan Indonesia dapat ditingkatkan. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui

apakah primer yang didesain dari data sekuens DNA gen sulfohydrolase dari

C. crispus dapat digunakan untuk mengamplifikasi gen sulfohydrolase yang

terdapat pada E. cottonii, mengetahui sekuens DNA gen sulfohydrolase pada

E. cottonii dan membandingkan sekuens DNA gen sulfohydrolase antara yang

terdapat pada C. crispus dengan yang terdapat pada E. cottonii.

Bahan dan Metode

A. Bahan

Bahan-bahan yang dipergunakan dalam penelitian ini:

1. Bahan perlakuan : Talus Eucheuma cottonii yang disediakan oleh Lab

Pertanian BPP Bioteknologi BPPT Serpong, Tangerang.

2. Bahan Kimia : Primer 18s rRNA dari Kappaphycus alvarezzi

( Eucheuma cottonii ), Primer untuk Gen Sulfohydrolase yang didesain dari

Chondrus crispus, RNeasy Plant Mini Kit [QIAGEN], Nitrogen cair (LN2),

Dry Ice, Oligotex mRNA Mini Kit [QIAGEN], AccuPower® RT/PCR

PreMix Kit [Bioneer], Agarose, Buffer TAE 1X, Sybr Safe[INVITROGEN

Molecular probes], Marker ( ddH2O, GeneRuller 1 kB DNA Ladder, 6X

Loading Dye Solution) [FERMENTAS], DEPC-treated water 0,1% v/v

[MP Biomedichals,Inc], DEPC (Diethyl Pyrocarbonate), Purifikasi gel/

PCR DNA fragment extraction Kit [GeneAid], EtOH absolut, EtOH 70%

[Merck], FastDigest BamHI [FERMENTAS], β- mercaptoethanol [Merck],

6

NaOAc 3M pH 7, EDTA 125 mM, Alumunium foil, The BigDye Terminator

V.3.1 Cycle Sequencing Kit.

B. Cara Kerja

1. Persiapan Kerja, Bahan dan Alat

Persiapan bahan ini meliputi penyiapan talus E. cottonii yang akan

digunakan sebagai sumber RNA. Segera setelah dipanen, talus dicuci bersih

dengan air laut, dipotong kecil-kecil dengan menggunakan gunting dan

pinset yang steril, dimasukkan ke dalam sterofoam dan disiram dengan

Nitrogen cair. Setelah mengeras, potongan talus itu segera dipindahkan ke

dalam kantong plastik berklip dengan bantuan pinset steril, dilabel dan

disegel. Sesegera mungkin setelah proses ini selesai kantong berisi sampel

tersebut disimpan di dalam dry ice (es kering). Untuk penyimpanan di

laboratorium, sampel disimpan di suhu -80ºC.

Persiapan alat meliputi penyiapan alat gelas, alat plastik, dan tabung

mikrosentrifuse. Semua alat tersebut direndam dalam dH2O yang

mengandung DEPC dengan konsentrasi 0,1% v/v. Dibiarkan selama

semalam, air ditiriskan dari alat, lalu alat dan air sisa perendaman diautoklaf

pada suhu 121ºC selama 15 menit. Kemudian dikeringkan di dalam oven

bersuhu 55º selama 2 hari dan alat-alat siap digunakan.

2. Ekstraksi total RNA Talus Eucheuma cottonii

Ekstraksi total RNA berdasarkan metode RNeasy Plant Mini Kit dari

QIAGEN. Total RNA hasil ekstraksi ini kemudian di ukur konsentrasinya

dan diukur kemurniannya (A260/280) dengan menggunakan bantuan

Nanodrop spektrofotometer.

3. Purifikasi poly(A)+

RNA (mRNA) dari total RNA

Purifikasi poly(A)+

RNA (mRNA) dari total RNA berdasarkan metode

Oligotex mRNA Mini Kit dari QIAGEN.

4. One-step RT-PCR ( RT-PCR dalam satu tahap)

Metode yang dipakai adalah metode dari AccuPower® RT/PCR PreMix

dari Bioneer. Komponen RT-PCR sudah dipersiapkan di dalam kit ini

sebagai campuran siap pakai berwujud lyophilized dan berwarna biru akibat

7

penambahan tracking dye. Komponen RT-PCR tersebut meliputi : M-MLV

( Moloney- Murine Leukemia Virus ) Reverse Transcriptase, DNA

polymerase termostabil, dNTPs, dapar reaksi, penghambat RNase, suatu

cairan penanda migrasi ( tracking dye), dan suatu penstabil. Kit ini

digunakan untuk sintesis cDNA dari salinan RNA yang rendah

( http://eng.bioneer.com/ , 2008 ).

Primer yang digunakan untuk mengamplifikasi gen pengkode

sulfohydrolase I adalah : FSH I 5’-GGCTCACCTACGTTCTTTTG-3’ dan

RSH I 5’-AGACCTACTCAACCTTCCTG-3’. Sedangkan sebagai kontrol

ekspresi gen digunakan kontrol 18s rRNA dengan urutan berikut :

F_alv 18s rRNA 5’-CAACCTGGTTGATCCTGCCAGT-3’ dan R_alv 18s

rRNA 5’-GTAGGTGAACCTGCAGAAGGATC-3’.

Tabel 1. Rumus volume reaksi untuk Onestep RT-PCR dengan AccuPower®

RT/PCR PreMix dari Bioneer :

Nama reaksi Template

RNA

Nama primer

yang

digunakan

Forward

primer

(10 µM )

Reverse

primer

(10 µM )

RNase-

free

water

Volume

total

reaksi

Gen Pengkode

Sulfohydrolase

Total

RNA :

5 µL

Sulfohydrolase

I

2 µL

2 µL

11 µL

20 µL

mRNA :

16 µL

2 µL

2 µL

-

20 µL

Kontrol

18s rRNA

Total

RNA :

5 µL

18s rRNA

Kappaphycus

alvarezii

2 µL

2 µL

11 µL

20 µL

mRNA :

16 µL

2 µL

2 µL

-

20 µL

Proses RT-PCR dilakukan menggunakan mesin PCR dengan tahapan :

Transkripsi Balik: 42ºC selama 60 menit; Inaktivasi reverse transcriptase /

PraPCR : 94ºC selama 5 menit; Denaturasi : 94ºC selama 1 menit;

Annealing : 55ºC, 60ºC (gradient) selama 1 menit; Ekstensi/ Polimerasi :

8

72ºC selama 1 menit; Siklus sebanyak 40 kali diakhiri; PascaPCR : 72ºC

selama 10 menit

Produk PCR yang diperoleh kemudian divisualisasikan melalui gel

elektroforesis.

5. Pengujian Melalui Gel Elektroferesis

Elektroforesis dilakukan dengan menggunakan gel agarosa yang dibuat

dengan konsentrasi 1% (b/v) [Fermentas Top Vision LE GQ Agarose]

dengan agen pewarna adalah Sybr Safe[INVITROGEN Molecular probes]..

Dalam proses pengujian dengan menggunakan gel elektroforesis, bahan

yang harus disiapkan adalah sebagai berikut :

Loading Dye ( mengandung Bromphenol Blue sebagai penanda

laju migrasi dan sukrosa sebagai pemberat agar DNA tidak

melayang –layang).

Marker DNA ( dibuat dengan mencampur 60 µL ddH2O, 90 µL

GeneRuller 1 kB DNA ladder, dan 30 µL 6X Loading Dye

solution) sebanyak 6 µLuntuk sekali running elektroforesis.

Sampel dicampur dengan loading dye, dimasukkan ke dalam sumuran

pada agar, lalu tank ditutup dengan arah elektroda yang sesuai.

Elektroforesis dimulai dengan running pada 100 volt selama 0,5 jam.

Hasilnya dipaparkan di bawah UV transilluminator dan didokumentasikan.

6. Ekstraksi dan Pemurnian Gel Elektroforesis

Pita DNA pada gel yang diperoleh dari elektroforesis produk RT-PCR

dengan primer dari gen pengkode sulfohydrolase dipotong dari gel

kemudian dimurnikan dengan menggunakan perangkat pemurnian Purifikasi

gel/ PCR DNA fragment extraction Kit [GeneAid] . Untuk mengetahui

kualitas dan kuantitas DNA hasil pemurnian ini, dapat dilakukan

pengukuran dengan Nanodrop spektrofotometer.

7. PCR untuk Reaksi Cycle Sequencing

PCR untuk reaksi cycle sequencing menggunakan The BigDye

Terminator V.3.1 Cycle Sequencing Kit [Applied Biosystems].

9

Dibuat campuran berikut ini dalam tabung PCR 0,2 mL.

5X Buffer 2 µL

FSH I (1,6 pmol) 2 µL

BigDye V.3.1 2 µL

Rnase-free water 3 µL

template DNA 1 µL +

10 µL

Semua bahan dicampur dengan pipet, lalu di spin down. Mesin PCR di

set dengan program berikut :

PraPCR : 96ºC selama 2 menit; Denaturasi : 96ºC selama 10 detik;

Annealing : 50ºC selama 30 detik; Ekstensi/ Polimerasi : 60ºC selama 4

menit; Siklus sebanyak 35 kali, diakhiri pada suhu 4ºC.

Sampel dimasukkan ke dalam mesin PCR, mesin PCR dijalankan.

Setelah selesai dilanjutkan dengan pemurnian hasil reaksi sequencing.

8. Pemurnian Hasil Reaksi Sequencing

Sebanyak 10µL produk PCR hasil reaksi sequencing dalam tabung PCR

ditambah dengan 10µL Rnase free-water, 2µL NaOAc 3M pH 7 , 2µL

EDTA 125 mM dan 50µL etanol absolut bersuhu -20ºC. Tabung dibolak-

balik sebanyak 4 kali dan diinkubasi pada suhu kamar selama 15 menit

dengan dibungkus alumunium foil. Kemudian di sentrifugasi pada kecepatan

5000 Xg selama 30 menit pada suhu 4ºC. Supernatannya dibuang dan

ditambah dengan 70µL etanol 70% bersuhu -20ºC. Dicampur dengan

perlahan. Disentrifugasi pada kecepatan 3000Xg selama 15 menit pada suhu

4ºC. Supernatannya dibuang, sisa etanol dikeringkan dengan tisu steril.

Tabung PCR itu kemudian dimasukkan ke dalam desikator dan di vakum

selama 10 menit untuk menguapkan etanol secara sempurna. Selanjutnya

ditambah 10 µL Rnase free-water. Divortex selama 10 detik. Hasil

pemurnian ini digunakan untuk sequencing DNA.

9. Sequencing DNA

Hasil pemurnian dari reaksi sequencing dimasukkan ke dalam mesin

sequencing Sequencer ABI 3130. Data yang diperoleh merupakan data

10

sekuen DNA gen Sulfohydrolase dari Eucheuma cottonii. Data tersebut

dibandingkan dengan data sekuen DNA gen sulfohydrolase dari Chondrus

crispus.

10. Pemotongan dengan Enzim Restriksi FastDigest BamHI

Tahapan ini dilakukan untuk mengetahui apakah terdapat perbedaan

sekuen antara pita DNA hasil amplifikasi menggunakan primer gen

pengkode sulfohydrolase pada E. cottonii dengan data sekuen gen

pengkode sulfohydrolase pada Chondrus crispus. Pemotongan dilakukan

dengan enzim yang dapat memotong sekuen gen pengkode sulfohydrolase

pada Chondrus crispus. Pada penelitian ini dipilih enzim restriksi

FastDigest BamHI dari Fermentas.

Campuran reaksi restriksinya adalah sebagai berikut :

DNA (~ 0,2 µg ) 2µL

RNase free-water 15µL

10X FastDigest dapar 2µL

Enzim FastDigest BamHI 1µL +

Total reaksi 20µL

Reaksi dicampur, di spindown dan diinkubasi pada suhu 37ºC selama 1

jam. Untuk menghentikan reaksi , sebanyak 4µL 6X Loading Dye Solution

ditambahkan ke dalam reaksi restriksi lalu dicampur. Hasil restriksi

kemudian di visualisasikan melalui gel elektroforesis.

Hasil dan Pembahasan

Tabel 2. Hasil pengukuran konsentrasi total RNA dengan Nanodrop

spektrofotometer

11

Gambar 1. Kurva pembacaan konsentrasi total RNA dengan Nanodrop

spektrofotometer.

Dari pembacaan tersebut dapat diperkirakan konsentrasi RNA pada sampel

1 adalah ~ 157 ng/µL dengan A260/A280 ~2,14 dan pada sampel 2 adalah ~164

ng/µL dengan A260/280 ~2,15.

Primer yang dipergunakan untuk mengamplifikasi gen pengkode

sulfohydrolase I adalah : FSH I 5’-GGCTCACCTACGTTCTTTTG-3’ dan

RSH I 5’-AGACCTACTCAACCTTCCTG-3’. Sepasang primer ini dirancang dari

data sekuen gen pengkode sulfohydrolase pada C. crispus. Primer ini dirancang

secara manual dari 300 basa awal setelah 4 basa pertama dari awal kodon start

(ATG) pada data sekuen tersebut. Yang dipergunakan hanya sekuen dari ujung 5’

sepanjang 300 basa ke arah ujung 3’, sebab semakin ke arah akhir ujung 3’,

kemungkinan sekuennya cocok semakin kecil. Berikut ini adalah data sekuen gen

tersebut pada C. crispus dan letak sepasang primer yang telah dirancang pada data

sekuen tersebut ( Gambar 2).

12

Gambar 2. Letak primer gen pengkode sulfohydrolase I pada data sekuen gen

pengkode sulfohydrolase ( SEQ ID NO 17 ) pada C. crispus.

1 gacagccctc cccaacATGg ggctcaccta cgttcttttg tctgttcttg tcttacaagc

61 aacccacgca cttgccaaag agggatgcga gaccgctata gttggagccg gaattggtgg

121 cgcttattct gccttccgtt tggcaagccc atcagtctgt atctttgaag ccaaccgtcg

181 cccaggaggg cgcatcttga ccgttcggga tccaagcgcc tcgtttctga acttcactat

241 tgaccttggt gcgtatcgct accatcgtgc acaccatcgt cttgtccgcc tcgttgctga

301 agacctactc aaccttcctg tggcttgcta tacggacttg ctcaacaacc gaaaagattg

361 tccggacgcg acgattcgtc tcttttcaac tcgagggaac gtgcttggag ctcttggagg

421 ccggattgct caagacttaa taaagaagta cggaccgttc ctgccatatg tgattcagag

481 gagctttcgg tggggacaag gaaagccctt gaaggaaaga cggacaatgt ctgggttgct

541 aatcgggcca aactcagtaa tcaaagagat ccgagatcgc gttgaggagc ttgagaaaga

601 ggaagactat gcgaaagcga tgcagattgc ggacgaaatc attgcggcaa tgcaagatgg

661 ctcgtacaga ggcatcccgt attcagagat cagtttgatg caagtcgcga tccgtgaagg

721 ctttacgaca gaggagatgc aactggaaac ggacttctca tttctcagca gtgtggaaag

781 gcggcagacg ctagaataca acgggcagct ttcaatcagg caaatggcac tagaaaaggg

841 acttataggg cttaacaatc tagtgacgcc gatggagaag cggcgtggag tgctacgtag

901 agcgggcatg atcacgctcg tggacggcct gcttgagcgg gcgatgaagg gcggtgtgca

961 ggtacaatat gggaagaagg tcgtgagaat tacgcgcacc ggaaatgaga agaggcctat

1021 aagactcaag ttcgaggacg gcgggatggt agaagtgaag aacgtgattc tcaacattgg

1081 caagccgggg ctgattgctc ttgggctgga ctcggagccg atgatgagca ccaaggagcc

1141 tttccggcga gcggtcgagc gaaactttgt gctgagctta tccaagacgt attgtttctg

1201 ggaagacgcg tggtggttga caaagttggg gcaacgggat gggcgtattc aggttccttc

1261 agattcgatg cagtcaatgc gataccacga tggacacgtc gtgtgcaagg acgagagaag

1321 gcttaaaagt tgccgtggcg gattgctcgc gtcgtactcg gggggcgatc agatggggct

1381 tggggctgct ttgcatgcgc acgtgcataa tgctaaaccg tacacaccgc tgacaagcag

1441 tgacaacgta gtgaaattga ttccagggaa gatgtctgga gtagagcaag tatactttga

1501 tgacctgcac gcacaaatca agcgtgtgca caagaggtcg gtggagcgga aggggcttga

1561 cgtggacaag gtgatttcca agccggctat gtgcctattt gcggattggc gggaggtggg

1621 tactcatgcg gccatggggc cgggaaaagg aagaacgaat gtgtacgagt tgtacgctaa

1681 accggttagt gatttgagaa tcgcactggt aaacgaagcg tggagtgggg accaagggtg

1741 ggcggagggg agcttgagaa gcgcagagcg ggcgctgttc caccaattcg gaatggagaa

1801 gccagagtgg atggataagg agtatcaccg gtcggtgatt gagaggtaca accaggggTG

1861 Atttcggcgc gggcatacag tatgcgtgtc gttcgtgaag ttgtagcaaa gggctaatcc

1921 ttccacctgt cgtctcggcg caaagaataa aagctcgaag attagtggtg acgttagaag

1981 taggcataca gaaccaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa

Keterangan :

Huruf yang dicetak merah muda : letak kodon START dan kodon STOP

Huruf yang dicetak hijau muda : letak forward primer dan reverse primer

Huruf yang dicetak coklat

diantara warna hijau muda : sekuen yang terdapat dalam range antara

forward primer hingga reverse primer.

13

Hal-hal yang dijadikan pertimbangan dalam perancangan primer secara

manual adalah sebagai berikut ( Purbowasito, 2007 ) :

1. Panjang primer berkisar antara 18-26 basa.

2. Kandungan GC sekitar 50-60 %.

3. Melting Temperature ( Tm) antara 50-60ºC.

4. Tidak boleh terdapat 4 sekuen basa yang sama berturut-turut.

5. Spesifisitas PCR bergantung pada ujung 3’ primer. Ujung 3’ yang lebih

baik akan menghasilkan sintesis DNA yang lebih efisien. Spesifisitas

dapat ditingkatkan dengan adanya ujung 3’ yang tidak stabil. Sertakan 3

atau 5 basa A atau T pada 5 basa terakhir dari keseluruhan panjang

primer, biarkan primer berakhir pada basa A atau T .

Pada penelitian ini, panjang primer yang dibuat adalah 20mer, dengan

perbandingan AT:GC adalah 50:50, sehingga jumlah AT = GC = 10mer. Tm yang

diperoleh dari rumus perbandingan ini adalah

Tm = { 2(A+T) + 4(G+C) }ºC Tm = { 2(10) + 4(10) }ºC = 60ºC

Oleh karena tidak boleh terdapat 4 sekuen basa yang sama berturut-turut,

maka awal forward primer dimulai pada basa G ke 3 dari 4 basa G berturut-turut

dari awal kodon start. Forward primer berakhir pada basa C dengan jumlah basa

T adalah 4 dari 5 basa terakhir, sedangkan reverse primer berakhir pada basa C

dengan jumlah basa T adalah 2 dari 5 basa terakhir. Komposisi seperti ini tidak

dapat dihindari, karena apabila posisi range primer digeser maju untuk bisa

mendapatkan komposisi akhir basa T atau A yang lebih banyak, semua prasyarat

yang sebelumnya menjadi tidak terpenuhi.

RT-PCR dalam satu tahap dapat dilakukan baik menggunakan cetakan

berupa mRNA maupun total RNA. Metode yang dipergunakan dalam penelitian

ini adalah metode dari AccuPower® RT/PCR PreMix Kit dari Bioneer. Kit ini

mengandung komponen-komponen yang telah dioptimasi sehingga dapat

memungkinkan terjadinya proses transkripsi balik ( RT ) dan amplifikasi PCR

dalam satu tahapan reaksi. Sebagai kontrol proses ekspresi gen yang terdapat pada

cetakan RNA yang dipergunakan sebagai material awal, dipergunakan primer 18s

14

rRNA. Hal ini untuk memastikan bahwa pada sampel RNA yang diekstraksi

benar-benar sedang terjadi proses ekspresi gen.

Berikut ini adalah hasil foto elektroforesis produk RT-PCR ( Gambar 3).

1 M 2 3

500bp

1000bp

1500bp

Keterangan :

1. mRNA dengan primer SH1

2. Total RNA dengan primer 18s

3. mRNA dengan primer 18s

M = Marker 1 kb

1 M 2 3

1500bp

1000bp

500bp

Gambar 3. Hasil elektroforesis produk RT-PCR I

Pada foto tersebut, nampak bahwa proses RT-PCR dengan cetakan mRNA

yang diamplifikasi menggunakan primer Sulfohydrolase I ( SH I ), menghasilkan

pita berukuran mendekati 500bp, namun pita tidak terlihat tegas 1 band. Hal ini

mungkin disebabkan optimasi annealing temperature belum tepat. RT-PCR

cetakan mRNA dengan primer 18s tidak menghasilkan pita sebab pada cetakan

tidak lagi terdapat rRNA yang dapat dikenali oleh primer ini. Sedangkan RT-PCR

cetakan total RNA dengan primer 18s menghasilkan pita tegas berukuran lebih

dari 1000bp namun di bawah 1500bp. Padahal menurut teori seharusnya

berukuran 1767bp. Hasil ini mungkin terjadi akibat terbentuknya self annealing

pada cetakan RNA, sehingga primer tidak mampu mengamplifikasi keseluruhan

panjang cetakan. Dari hasil di atas dapat dikatakan bahwa primer SH I yang di

15

rancang dari data sekuen gen pengkode sulfohydrolase pada C. crispus berhasil

dipergunakan untuk mengamplifikasi gen yang terdapat pada E. cottonii.

Berdasarkan ukuran yang diperoleh ( > 300bp ) terdapat kemungkinan bahwa

panjang sekuen gen tersebut berbeda. Proses ekspresi pada sampel juga dapat

dibuktikan dengan munculnya pita pada RT-PCR menggunakan primer 18s.

Kemudian, dilakukan proses amplifikasi lagi. Dimulai dari tahapan isolasi

RNA hingga RT-PCR lagi. Hal ini selain untuk mengetahui reproducibility dari

penelitian ini, juga untuk mencoba optimasi kembali terhadap proses yang lalu.

Hasil yang diperoleh ditunjukkan pada gambar 4 berikut ini.

Pengulangan yang kedua ini menggunakan 2 variasi suhu annealing, yakni

55°C dan 60°C. Kali ini proses RT-PCR dilakukan pada masing-masing cetakan,

baik total RNA maupun mRNA. Dari hasil di atas dapat dilihat bahwa RT-PCR

pada cetakan mRNA, pada variasi kedua suhu menghasilkan pita smear. Hal ini

dapat disebabkan oleh terdegradasinya sampel pada saat proses isolasi mRNA dari

total RNA. Selanjutnya, hasil RT-PCR pada cetakan total RNA dengan primer

SH I , pada variasi kedua suhu sama-sama menghasilkan beberapa pita, peristiwa

M 1 2 3 M 4 5 6 1 kb 100bp*

500bp

Keterangan :

1. mRNA dengan primer SH1 6. Total RNA dengan primer 18s

2. Total RNA dengan primer SH1 Program PCR :

3. Total RNA dengan primer 18s 1,2,3 : annealing 55°C

4. mRNA dengan primer SH1 4,5,6 : annealing 60°C

5. Total RNA dengan primer SH1

Gambar 4. Hasil elektroforesis produk RT-PCR II

16

ini dapat terjadi disebabkan karena kemungkinan primer SH I ini dapat dikenali

oleh komponen RNA lain selain mRNA, atau terdapat kemiripan sekuens pada

gen lain. Akan tetapi pita paling tegas letak dan ukurannya sama dengan pita yang

diperoleh pada proses RT-PCR I yang menggunakan cetakan mRNA. Pita yang

diperoleh dengan suhu annealing 60ºC terlihat lebih tebal. Sedangkan RT-PCR

pada cetakan total RNA menggunakan primer 18s menghasilkan pita smear. Hal

ini berarti sampel RNA hasil isolasi yang kedua ini telah mengalami degradasi.

Dari hasil pengulangan yang kedua ini dapat dikatakan bahwa sebenarnya primer

SH I dapat dipergunakan untuk mengamplifikasi gen yang terdapat pada

E. cottonii, baik pada cetakan mRNA maupun total RNA, akan tetapi karena

sampel RNA pada hasil pengulangan yang kedua telah mengalami degradasi,

maka proses RT-PCR tidak dapat berjalan optimal dan hasil tersebut tidak dapat

tervisualisasikan dengan baik pada gel elektroforesis.

Dari hasil pengukuran menggunakan Nanodrop spektrofotometer, diperoleh

hasil kuantitas dan kualitas cetakan DNA hasil purifikasi dari gel elektroforesis

sebagai berikut ( Tabel 3):

Tabel 3. Hasil spektrofotometer produk RT-PCR yang telah dimurnikan dari gel

elektroforesis.

No. Nama sampel Konsentrasi DNA A260/A280

1. Produk RT-PCR I dari cetakan mRNA 15 ng/µL 2,0

2. Produk RT-PCR II dari cetakan total

RNA, suhu annealing 55ºC

26,18 ng/µL

1,69

3. Produk RT-PCR II dari cetakan total

RNA, suhu annealing 60ºC

20,97 ng/µL

1,69

Berdasarkan tabel 3. dapat dilihat bahwa secara kuantitas, cetakan DNA

sudah memenuhi syarat untuk dapat dipergunakan dalam reaksi cycle sequencing,

akan tetapi secara kualitas, masih sedikit berada di atas dan di bawah range rasio

A260/A280 yang ditentukan. Proses cycle sequencing ini dilakukan untuk

memperbanyak fragmen PCR dengan pembacaan satu arah saja, menyediakan

rantai akhir agar didapatkan basa spesifik yang diperoleh melalui reaksi

polimerisasi dengan substrat ddNTP. Selanjutnya masing-masing basa akhir itu

17

diwarnai dengan zat yang dapat berpendar sehingga basa akhir yang spesifik itu

dapat dibaca pada mesin sequencer. Perunutan basa DNA dilakukan dengan

menggunakan mesin sequencer HITACHI Applied Biosystems 3130 Genetic

Analyzer. Alat ini menggunakan prinsip elektoforesis kapiler untuk memisahkan

setiap fragmen DNA, basa akhir spesifik yang berpendar akan terbaca dan

ditampilkan langsung pada layar komputer.

Pada tahapan ini, pembacaan urutan DNA ini belum berhasil dilakukan. Dari

ketiga sampel yang dibaca, semuanya memberikan hasil elektroferogram dengan

puncak yang rendah, bahkan menumpuk. Hal ini boleh jadi diakibatkan karena

pemisahan produk RT-PCR pada gel elektroforesis tidak benar-benar memberikan

hasil satu band tunggal. Oleh karena itu untuk mengetahui apakah produk RT-

PCR yang sudah diperoleh itu benar-benar produk yang diinginkan dan untuk

membandingkan urutan basanya dengan gen sulfohydrolase yang terdapat pada

C. crispus, maka pemeriksaan urutan basa itu dapat dilakukan dengan memotong

fragmen produk RT-PCR menggunakan enzim restriksi yang dapat memotong

sekuen gen sulfohydrolase yang terdapat pada C. crispus.

Pada penelitian ini, dipergunakan FastDigest BamHI dari Fermentas. Situs

pengenalan enzim ini terletak pada 5'-GGATCC-3' dan memotong sekuen tersebut

setelah guanine pertama pada setiap pita DNA. Pada C. crispus, enzim ini akan

memotong pada basa ke 192 setelah awal kodon start ( hanya diperhitungkan

sepanjang 400 basa dari kodon start, sebab ukuran produk RT-PCR pada E.

cottonii berkisar pada ukuran tersebut ). Karena ukuran produk RT-PCR pada E.

cottonii berkisar pada ukuran 400 bp ( dibawah 500 bp), maka bila sekuen yang

dimilikinya serupa dengan yang dimiliki C. crispus, enzim FastDigest BamHI

akan memotongnya dan menghasilkan 2 buah pita dengan ukuran yang tidak jauh

berbeda.

18

Hasil pemotongan produk RT-PCR dengan FastDigest BamHI, ditunjukkan

pada gambar 5.

Gambar 5. Hasil restriksi pita produk RT-PCR sulfohydrolase dengan

FastDigest BamHI

Pada gambar 5. hanya terlihat 1 pita pada sumur 1, yakni hasil RT-PCR

dengan sulfohydrolase tanpa restriksi dengan FastDigest Bam HI. Sedangkan

pada sumur yang 2 tidak nampak pita hasil RT-PCR dengan sulfohydrolase tanpa

restriksi dengan FastDigest Bam HI. Pada pemaparan langsung diatas sinar UV,

sebenarnya terlihat 1 pita yang sangat tipis pada sumur 2 yang ukurannya sedikit

lebih kecil bila dibandingkan dengan pita yang terdapat pada sumur 1. Namun,

pengambilan dokumentasi dengan foto tidak dapat menangkap pendaran pita

tersebut. Perbedaan kualitas pendaran ini disebabkan kuantitas DNA yang

M 1 2

Keterangan :

M : Marker 1 kb

1 : Hasil RT-PCR dengan

sulfohydrolase tanpa

restriksi dengan

FastDigest Bam HI

500bp

M 1 2

500bp

2 : Hasil RT-PCR dengan

sulfohydrolase tanpa

restriksi dengan

FastDigest Bam HI

19

terdapat pada sumur 1 dan sumur 2 berbeda. Pada sumur 1, jumlah DNA yang

dirunning mencapai sekitar 120ng dalam 6µL sampel. Sedangkan pada sumur 2,

jumlah DNA hanya sekitar 40ng yang terelusi dalam 20µL sampel (mengikuti

rumus reaksi restriksi). Hal ini juga dipengaruhi oleh penggunaan agen staining

untuk mewarnai pita DNA. Yang dipergunakan adalah Sybr Safe Molecular

Probes dari Invitrogen yang menghasilkan kekuatan pendaran DNA dengan sinar

UV yang lebih rendah dibandingkan Ethidium Bromida. Diperolehnya hasil pita

restriksi yang berbeda ukuran menunjukkan bahwa FastDigest Bam HI dapat

mengenali sekuen pada fragmen produk RT-PCR tersebut. Seharusnya terdapat

lebih dari 1 pita hasil pemotongan, namun yang terlihat hanya 1, hal ini bisa

terjadi kemungkinan karena potongan pita yang lain berukuran jauh lebih kecil

sehingga telah melewati batas bawah gel agarose.

Berdasarkan hasil restriksi ini, beberapa hal yang bisa disimpulkan adalah

terdapat 2 kemungkinan :

1. Produk yang berhasil diamplifikasi dengan primer sulfohydrolase

adalah benar gen yang dimaksud, akan tetapi terdapat perbedaan

ukuran dan urutan basa gen antara yang terdapat pada C. crispus

dengan yang terdapat pada E. cottonii.

2. Produk yang berhasil diamplifikasi dengan primer sulfohydrolase

adalah bukan gen yang dimaksud.

Terdapatnya perbedaan sekuen gen sulfohydrolase antara yang terdapat pada

C. crispus dengan yang terdapat pada E. cottonii sangat mungkin terjadi,

mengingat kekerabatan terdekat di antara keduanya adalah pada tingkat ordo.

Hanya saja, gen tersebut dimungkinkan masih dalam area conserved region

( daerah yang dipelihara) dan masih dipertahankan hingga tingkat beda spesies,

sehingga masih dapat dirunut dengan menggunakan data sekuen dari kerabatnya

tingkat ordo.

Kesimpulan

1. Primer yang didesain menggunakan data sekuens DNA gen sulfohydrolase

dari C. crispus dapat digunakan untuk mengamplifikasi gen yang terdapat

pada E. cottonii. Pita ini bisa diperoleh baik menggunakan cetakan mRNA

20

maupun cetakan total RNA. Ukuran pita yang diperoleh adalah sekitar

400bp, ukuran ini lebih besar dibandingkan dengan perkiraan ukuran pada

C. crispus yang dibuat desain primernya.

2. Sekuens DNA gen sulfohydrolase pada E. cottonii belum berhasil

didapatkan, karena proses separasi pita DNA produk RT-PCR yang belum

sempurna menyebabkan penumpukan pembacaan pada elektroferogram.

Belum dapat dipastikan apakah pita yang diperoleh melalui RT-PCR pada

sampel E. cottonii adalah benar gen sulfohydrolase yang dimaksud, sebab

proses perunutan urutan basanya belum berhasil diperoleh.

3. Melalui pemeriksaan menggunakan digesti dengan enzim restriksi

FastDigest Bam HI, dapat disimpulkan bahwa terdapat 2 kemungkinan dari

penelitian ini:

a. Produk yang berhasil diamplifikasi dengan primer sulfohydrolase

adalah benar gen yang dimaksud, akan tetapi terdapat perbedaan ukuran

dan urutan basa gen antara yang terdapat pada C. crispus dengan yang

terdapat pada E. cottonii.

b. Produk yang berhasil diamplifikasi dengan primer sulfohydrolase

adalah bukan gen yang dimaksud.

Saran

1. Perlu dilakukan optimasi kembali terhadap proses RT-PCR pada

amplifikasi gen sulfohydrolase ini.

2. Agar bisa diperoleh separasi pita DNA yang lebih baik dapat digunakan gel

elektroforesis yang terbuat dari poliakrilamid karena gel poliakrilamid

memiliki kisaran separasi antara 5 hingga 2000bp.

3. Untuk membuktikan apakah pita yang diperoleh adalah benar gen

sulfohydrolase yang dimaksud dapat dilakukan beberapa pilihan cara antara

lain : Hibridisasi Northern, Pembuatan Restriction map, SubKloning

fragmen yang diperoleh pada vektor plasmid yang sesuai dan dilakukan

sekuensing DNA plasmid tersebut.

21

Daftar Pustaka

AccuPower® RT/PCR PreMix. http://eng.bioneer.com/ . Akses : 16092008,10:21

Cheney, D. P. and C. Duke. 1995. Methods for producing improved strains of

seaweed by fusion of spore-protoplasts, and resultant, seaweeds and

phycocolloids. Patent Storm. US Patent Issued on 20 June 1995.

United States Patent 5426040

Fennema , O.R. 1996. Food Chemistry Marcel Dekker. New York http://www.ceamsa.com/

Genicot, S., Bernard K., Philipe P., Brian R., Gerhard D R., Bea P., Odile, R.,

2003. ” Sulfohydrolases, corresponding amino acid and nucleotide

sequences, sulfohydrolase preparations, processes, and products there

of ”. Patent Storm. US Patent Issued on 16 September 2003. United

States Patent 6620604

http://www.ncbi.nlm.nih.gov . Akses : 7/2/2008, 9:43 WIB

Lewin, B. 1987. Genes III. Toronto : John Wiley & Sons Inc

Purbowasito, W. 2007. Desain Primer. Komunikasi Personal. 19062007,14:00.

Serpong,Tangerang

Qiagen., 2006. RNeasy® Mini Handbook..Fourth edition. April 2006.

www.qiagen.com. Akses : 29082008, 11:41

---------. 2002. Oligotex® Handbook. Second edition. May 2002.

www.qiagen.com. Akses : 29082008, 11:50

Syahputra, Y. 2005. Pertumbuhan dan Kandungan Karaginan Budidaya Rumput

Laut Eucheuma cottonii pada Kondisi lingkungan yang Berbeda dan

Perlakuan Jarak Tanam di teluk Lhok Seudu. Disertasi IPB

Syamsuar. 2006. Karakteristik Karaginan Rumput Laut Eucheuma cottonii pada

Berbagai Umur Panen, Konsentrasi KOH dan Lama Ekstraksi.

Disertasi IPB

Wong, K.F. and Craigie, J.S. 1978. “ Sulfohydrolase and Carrageenan

Biosynthesis in Chondrus crispus ( Rhodopyceae ) “. Plant Physiol.61,

663-666