AMKP KROMATOGRAFI

5/12/2018 AMKP KROMATOGRAFI - slidepdf.com

http://slidepdf.com/reader/full/amkp-kromatografi 1/12

1

KROMATOGRAFI

GAS DAN

KROMATOGRAFI

CAIR KINERJATINGGI

Agung zaimKuliah AMKP JMP

[email protected]

Thank’s to analitical chemistry dept IPB

Kromatografi Metode f isik untuk pemisahan dengan

senyawa yang akan dipisahkah terdistribusi

diantara dua fase yaitu fase diam dan fasegerak dengan arah yang pasti (Definisi IUPAC

1993)

Jenis kromatografi

1. Kromatografi kolom

2. Kromatografi kertas

3. Kromatografi lapis tipis

4. Kromatografi gas-cair

5. Kromatografi cair kinerja tinggi (tekanan tinggi)

REVIEW KROMATOGRAFI

REVIEW KROMATOGRAFI

Tujuan kromatografi

Analitik : menentukan komposisi senyawa kimia dalam sampel

Preparatif : memurnikan dan mengumpulkan satu atau lebihkomponen dalam suatu sampel

REVIEW KROMATOGRAFI

Tujuan kromatografi

Analitik : menentukan komposisi senyawa kimia dalam sampel

Preparatif : memurnikan dan mengumpulkan satu atau lebihkomponen dalam suatu sampel

Klasifikasi kromatografi

Kromatografi Adsorpsi interaksi yang terjadi via ikatan

hidrogen atau interaksi dipol-dipol →→→→ komponen polar non ionik

contohnya: silika gel, alumina

teraktivasiSolut teradsorpsipada permukaanfase diam

Fasediam

REVIEW KROMATOGRAFI

Kromatografi partisi molekul akan tertahan oleh fasediam cair yang melapisi atauterikat pada kolom

Seluruh tipe interaksi antara solutdan pelarut dimungkinkan

tipe fase normal: analit molekul

organik non polar, fase diam lebihpolar dibandingkan fase gerak

tipe fase terbalik: analit molekulorganik polar, fase diam lebih nonpolar dibandingkan fase gerak

contohnya: kolom C18

Kromatografi pertukaran ion fase diamnya berupa ion yangberasosiasi dengan ion (analit)lawannya yang dapat ditukar

sangat penting dalam purifikasi air

dan pemisahan preparatif

REVIEW KROMATOGRAFI



2

REVIEW KROMATOGRAFI

Kromatografi eksklusi fase diam mempunyai pori ∼∼∼∼ukuran dimensi molekular

penyaring

makromolekul

REVIEW KROMATOGRAFI Klasifikasi kromatografi

TEORI KROMATOGRAFI KOLOM

Eluen fase gerak, larutan yang berfungsi mengelusi sampelEluat spesi yang terelusi

masuknya eluen dan sampel → kolom → keluarnya eluat


Ikhtisar proses kromatografi(kolom kemas):

- injeksi saat t0

- pemisahan antara t1

sampai t3

- Deteksi saat t4

Kromatogram →→→→ Plot sinyaldari detektor sebagaifungsi waktu elusi/volume


Profil konsentrasi dari pita solut A dan B pada dua waktu yang berbedadalam migrasinya melewati kolom


Migrasi solut

Kromatogram dari duakomponen yang dipisahkanyang mengilustrasikan duametode dalam meningkatkanpemisahan:

Kromatogram asli dengan pitayang tumpang tindih (a)

Perbaikan denganmeningkatkan keterpisahanspektra (b)

Perbaikan dengan menurunkanlebar pita (c)



3


Kromatografi didasarkan pada partisi komponen-komponen yangmerupakan suatu tipe kesetimbangan dimana komponen-komponenakan terbagi diantara fase diam dan fase gerak

K = koefisien partisi/distribusi

CS = konsentrasi analit dalam fase diam

CM = konsentrasi analit pada fase gerak

• K diinginkan konstan pada berbagai konsentrasi, jika tidak konstan kita

dapat bekerja pada kisaran yang lebih sempit saat K konstan

kromatografi linier

• Pada kromatografi linier laju alir yang tetap dari fase gerak bergerak

sepanjang kolom → K cenderung konstan

• Elusi: proses dimana analit akan melewati kolom dibawa oleh fase

gerak (dapat cair atau gas)

M

S

C

CK =


waktu retensi/retention time (tR):waktu yang dibutuhkan molekul yangtertahan pada fase diam untukmencapai detektor

waktu mati/dead time (tM): waktu yangdibutuhkan molekul yang tak tertahanpada fase diam untuk mencapai detektor

volume retensi: volume fase gerakyang dibutuhkan untuk menggerakkanmolekul dari saat injeksi hinggamencapai detektor

Baseline width (w): lebar pita senyawayang terukur pada garis dasar

Terminologi pada Kromatogram

Tipe Kromatografi

Kromatografi Gas• Fase gerak = gas (umumnya He)• Fase diam = kolom yang dilapisi atau dikemas oleh

suatu bahan (umumnya partisi)

Kromatografi Cair (KC atau KCKT)• Fase gerak = pelarut (air atau pelarut organik)• Fase diam = kolom lapis kemas (partisi, prtukaran

ion, dan size exclusion)

Kromatografi Cair Superkritis• Fase gerak = cairan superkritis (CO2)• Fase diam = kolom lapis kemas

Aplikasi Kromatografi

Analisis kualitatif

waktu retensi

Analisis kuantitatif

Sinyal yang diukur tinggi pita atau lebar pita

Macamnya:

Kalibrasi eksternal satu standar atau multistandar

Metode adisi standarMetode standar internal

KROMATOGRAFI GAS


Kromatografi Gas

Suatu teknik kromatografi dengan sampel dapat diuapkan (umumnyakomponen volatil) saat diinjeksikan dalam suatu sistem pemanas dan

terelusi pada kolom kemas atau kapiler oleh fase gerak lembam

Terdapat dua tipe KG yaitu:1. Kromatografi Gas-Padat2. Kromatografi Gas-Cair

Skema kromatografi gas(Diambil dari Buku Principles

of Instrumental Analysis ,

Skoog et al . 1998)



4

Kromatografi Gas

Keuntungan KG:

1. Analisisnya cepat (umumnya dapat dilakukan dalam beberapa menit

saja)

2. Resolusinya tinggi

3. Detektornya sensitif

4. Akurasi dalam analisis kuantitatif tinggi (% SBR 1-5%)

5. Sistemnya otomatis

6. Non-destruktif

7. Sampel yang diperlukan kecil (µl)

8. Hasil analisis terpercaya dan relatif sederhana

Kromatografi Gas

Kromatografi Gas

Kelemahan KG:

1. Hanya untuk komponen volatil atau yang dapat diuapkan

2. Tidak baik untuk komponen yang labil akibat suhu yang tinggi

3. Beberapa komponen dalam sampel mungkin membutuhkan preparasi

yang rumit seperti analisis asam lemak

Fase Gerak

- Tidak berinteraksi dengan sampel

- Pemilhannya bergantung pada detektor yang digunakan

konduktivitas thermal →→→→ He

ionisasi nyala →→→→ He atau N2

Penangkapan elektron →→→→ tidak terdapat udara, O2, N2 bebas atau Ar +5 % CH4

- Harus murni

Kromatografi GasPengontrol Laju Gas Pembawa (Fase Gerak)

Kontrol laju ∼ 10 to 50 psi dengan regulator

Regulator bervariasi dalam kualitas, material dan proses kontrolnya.

Umumnya digunakan 2 regulator dengan material dari stainless steel

Laju alir dicek oleh soap bubble meter agar dihasilkan laju yang akuratLaju gas pembawa ∼ 25-150 ml/menit untuk kolom terkemas

∼ 1-25 ml/menit untuk kolom open tubular

Kromatografi GasInjektor bagian alat KG yang berfungsi sebagai tempat untuk

memasukkan sampel

menguapkan sampel agar dapat dibawa oleh gaspembawa ke dalam kolom pemisahan

Tinjektor > 500C diatas Tkolom

Septum haruslah:

- stabil pada suhu injektor

- diganti secara reguler

Liner

Sebagai tempat untukmenguapkan sampel,umumnya dibuat dari gelas

Kromatografi Gas

Metode injeksi

Spli t injection teknik in jeksi sampel ke dalam kolom dimana hanyasedikit (0,1-1%) sampel yang masuk ke dalam kolom

Splitless injection teknik injeksi sampel ke dalam kolom dengan jumlahsampel yang masuk ke kelom lebih banyak

On-column injection injeksi dilakukan langsung ke dalam kolom, umumnyadigunakan untuk senyawa yang tak stabil secarathermal



5

Kromatografi Gas

Syringe digunakan untuk memasukkan sampel cair atau gasdengan volume diketahui

adapter dapat digunakan untuk mengontrol volume yang

dinjeksikan

Tersedia dalam beberapa tipe:

- jarum yang tetap (fixed needle)

- jarum yang dapat digerakkan (removable needle)

- Panjang dan sudut jarumnya

Kromatografi Gas

Teknik injeksi yang tidak tepat dapat menyebabkan ketidakakuratan hasilanalisis

Langkah pertama yaitu syringe terisi hanya oleh sampel (tanpa gelembung

udara) dan diinjeksikan secara cepat dan konsisten agar menghasilkan

ketelitian yang baik

Kromatografi Gas

Metode pemasukan sampel pada syringe

Ukuran sampel

Cair → umumnya antara 0,1-10 µl

Gas → umumnya 0,5-5 ml

Presisi injeksi dengan menggunakan syringe ± 1%

Kromatografi GasKolom

Kolom pada kromatografi gas di tempatkan pada oven agar suhu selama prosespemisahan tetap konstan

Kromatografi Gas

Tipe kolom:Kemas tabung dari baja, kaca, silika, atau teflon yang didalamnya diisi

dengan fase diam (umumnya tanah diatomae)

Open tubular fase diam melapisi dinding kolom saja

Kapiler fase diam melapisi dinding kolom dan panjang kolomantara 2-50 m, yang umum dipakai panjangnya 30 m

kolom kemas

Kromatografi Gas

Selektivitas pada KG bergantung kepada jenis fase diam yang digunakan

Elusi dalam KG terutama ditentukan lewat titik didih senyawa yang akan

dipisahkan sehingga senyawa dalam sampel dengan perbedaan titik didihyang besar akan mudah untuk dipisahkan. Akan tetapi jika pebedaannya

kecil maka perlu juga memilih fase diam yang selektif untuk salah satusenyawa dalam memisahkannya selain sistem elusinya

Secara umum senyawa nonpolar akan mudah dipisahkan dengan fase diam

nonpolar demikian pula untuk yang polar

Kriteria utama dalam pemilihan fase diam yaitu secara kimia inert, stabil

terhadap perbedaan suhu, volatilitas rendah, dan polaritas yang sesuaidengan senyawa yang akan dipisahkan,



6

Kromatografi Gas Kromatografi Gas

Suhu terprogram

Kontrol dalam suhu kolom sangat penting untuk diperhatikan untukmemperoleh pemisahan yang baik pada KG sehingga untuk alasan ini kolom

ditempatkan pada oven termostat

Jika suhu oven dibuat konstan selama analisis maka sering disebut sebagaipemisahan isothermal . Secara normal, suhu diset sedikit dibawah titik didihsenyawa yang mempunyai titik didih terendah untuk meningkatkan interaksinyadengan fase diam

Salah satu kesulitan dalam pemisahan menggunakan suhu oven yang konstanadalah pemisahan untuk komponen yang mempunyai titik didih tinggi dapatmenyebabkan waktu retensi menjadi lebih lama

Suhu terprogram dapat mengatasi masalah ini. Suhu awal diset dibawah titikdidih senyawa yang memiliki titik didih terendah dan setelah itu suhu dinaikkansecara perlahan dengan kenaikan yang seragam atau dibuat berseri beberapa

tahap.

Kromatografi Gas Kromatografi Gas

Detektor

Detektor yang ideal mempunyai karakteristik:

- Limit deteksi yang rendah- Reprodusibel (akurasinya baik)

- Memberikan respon yang linear dengan kisaran yang lebar dalampenentuan konsentrasi analit

- responsif terhadap semua senyawa kimia atau sebagian (kelas senyawa)

- insensitif pada perubahan laju alir, tekanan, dan temperatur

- Nondestruktif- Stabil terhadap pengaruh derau dan drift Macamnya: - Detektor ionisasi nyala (Flame Ionization Detector )

- Detektor konduktivitas termal (Thermal conductivity detector )

- Detektor elektrotermal (Electrothermal Detector )- detektor fotometrik nyala (Flame photometric detector )- detektor nitrogen fosfor (Nitrogen phosphorus detector )- FTIR dan MS (hyphenated technique /teknik gabungan)

Sensitivitas detektor



7

Detektor Ionisasi Nyala (FID)

♦ Detektor yang paling umum digunakan pada KG

♦ Mempunyai sensitivitas yang baik untuk hampir semua senyawa organik

♦ Spesifik untuk sampel (komponen) yang mudah terbakar

♦ Destruktif

♦ Limit deteksi ∼ 5 pg/detik dan kisaran linear ∼107

Cara deteksi: Produksi ion pada nyala akan menghasilkan arus yangkemudian diukur

Komponen yang memberikan respon atau tidak sama sekali pada FID yaitu:gas mulia, NH3, CS2, NOx, CO, O2, H2O, CO2, N2, komponen perhalogenasi,

asam format, dan formaldehida

Cara kerja:

- efluen kolom akan bercampur denganudara dan terbakar pada nyala hidrogendan akan memproduksi ion dan elektronyang akan menghasilkan arus listrik

- potensial beberapa ratus volt diberikandiantara burner tip dan collector electrode yang terletak di atas nyala yang akanmenghasilkan arus (∼10 - 12 Å).

- arus yang dihasilkan kemudian diperkuatdan diukur

- sinyal yang terbaca kira-kira proporsionalterhadap jumlah atom karbon yangtereduksi pada nyala

- karena FID hanya berespon terhadap jumlah atom karbon yang masuk ke dalamdetektor per unit waktu maka detektor inilebih sensitif terhadap massa dibandingkankonsentrasi

Respon didasarkan kepada jumlah atom karbon dan jikadalam senyawa yang dipisahkan terdapat halogen atauoksigen maka akan mereduksi pembakaran

Industri Makanan dan Minuman

KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI


Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) atau High Performance Liquid Chromatography (HPLC)

Cakupan KCKT – teknik separasi analitis yang paling banyak

digunakan → analisis kualitatif maupun kuantitatif

Sensitivitas baik, dapat digunakan untuk analat yang nonvolatilhingga yang mudah terdekomposisi

Contoh analat: asam amino, protein, asam nukleat, hidrokarbon,karbohidrat, obat,pestisida, antibiotik, metabolit sekunder(alkaloid, flavonoid, terpenoid, steroid dsb), spesi organologam,senyawaan anorganik.

PENDAHULUAN



8

TIPE PEMISAHAN KK vs KCKT

Kromatografi cair konvensional (KK)• Menggunakan material pendukung

nonrigid dan lebih besar

• Ukuran partikel dp: > 150 µm, ukuran

kolom dc: 10 ~ 50 mm, panjang kolomL: 50 ~ 500 cm, laju alir F: < 1mL/min

• Gravitasi, H ↑, N ↓• Efisiensi sistem yang kurang baik

KCKT

• Menggunakan material pendukungyang kecil, uniform, dan rigid

• Ukuran partikel dp < 40 µm, umumnya3-10 µm dalam praktiknya

• Good system efficiencies and smallplate heights, narrow peaks, shorterseparation times

Berikut diagram skematik sistem KCKT

Mobile phase

Reservoir Pump Injector Pre -Column Column Detector

Data

INSTRUMENTASI

Skema instrumen KCKT

INSTRUMENTASI

Reservoir fase gerak

Umumnya dilengkapi oleh instrumen untuk menghilangkan gasyang terlarut dalam fase gerak (sistem pompa vakum,penyaringan vakum, distilasi, pemanasan, pengadukan,sonikasi atau pemercikan/ sparging (gas menjalar jauh dengan

adanya gas lembam dan solubilitasnya rendah seperti He)

Penghilangan debu: mengganggu deteksi, penyumbatankolom, merusak sistem pompa

- penyaringan Millipore dengan vakum

Gas perlu dihilangkan karena dapat membentuk gelembungpada kolom, menyebabkan pelebaran pita, dan mengganggukinerja detektor.

INSTRUMENTASI

Sistem elusi

Elusi gradienEluen campuran dengan rasiokomposisi berubah untuk mendapatkan gradien kepolaran

Elusi isokratik Eluen tunggal atau campurandengan komposisi konstan

INSTRUMENTASI



9

Sistem pompa

Syarat-syarat yang harus dipenuhi sistem pompa KCKT:

Tekanan yang dihasilkan tinggi

Keluaran tekanan bebas dari pulsa/ pulse-free output

Laju alir berada pada kisaran 0,1-10 mL/menit

Kontrol laju alir dan keterulangan laju alir baik

Komponen instrumen yang tahan korosi

INSTRUMENTASI

Terdapat 3 jenis sistem pompa:

Pompa piston timbal-balik eluen dipompa dengan gerakan timbal-balik (mundur-

maju) oleh piston

Gambar Pompa piston timbal-balik

INSTRUMENTASI

Displacement pump/pompa pergeseranpompa menyerupai semprit (syringe ) besar yang terdiriatas bejana dan alat penyedot, menghasilkan aliran yangbebas dari viskositas eluen

Keuntungan pompa piston timbal-balik: tekanan yangdihasilkan tinggi, dapat digunakan pada elusi gradien, lajualir yang dihasilkan konstan serta independen dari viskositaseluen dan tekanan balik kolom

Kerugian pompa piston timbal-balik : menghasilkan aliranyang memiliki pulsa

INSTRUMENTASI

Pneumatic pump/pompa pneumatik

eluen dalam kontainer didorong oleh tekanan gas/udara

Pompa jenis ini bebas dari pengaruh viskositas eluendan tekanan balik kolom, namun tidak dapat digunakanuntuk elusi gradien dan tekanan yang dihasilkankurang dari 2000 psi.

Saat ini ketiga sistem pompa tersebut dikontrol dengan komputer dalam pengoperasiannya

INSTRUMENTASI

Sistem Injeksi sampel

Pada awalnya injeksi dilakukan dengan sistem sederhana berupasemprit (syringe ) yang menginjeksikan sampel ke dalam kolommelalui septum elastomerik, namun keterulangannya sangatburuk Saat ini yang banyak digunakan ialah sistem injeksi denganmenggunakan simpal pencuplikan (sampling loop ). Sistem initerintegrasi dalam instrumen KCKT

INSTRUMENTASI

Sistem injeksi simpal

INSTRUMENTASI



10

Kolom

kolom KCKT dapat dikemas dalam bentuk koil ataupun tidak. Beberapabuah kolom dapat digabung (coupling column )

Secara mendasar, jenis kolom untuk KCKT dikategorikan sebagai:

Kolom kemas, ( packed column ) Kolom kapiler (open tubular/capillary column ) Kolom preparatif

Ingat kembali teori PELAT !!! N = L/H

Thermostat kolom, menjaga suhu operasi kolom. Keberadaannyatidak mutlak, tapi sangat berguna untuk analisis senyawa yangmemerlukan suhu tertentu yang konstan saat dipisahkan.

Kolom penjaga (Guard column ), berfungsi menyingkirkankontaminan dalam eluen dan matriks sampel yang terikat tidak reversibel pada kolom. Bertujuan memperpanjang umur kolom

INSTRUMENTASI

Kolom

a. Kolom umum terbuat dari tabung bajab. Panjang antara 10 - 30 cmc. Diameter dalam umumnya 4 - 40 mm; untuk

generasi terbaru kolom KCKT saat ini antara1 – 4,6 mmd. Ukuran partikel partikulat (fase diam)

umumnya adalah 5 - 10 mikrometer

INSTRUMENTASI

Detektor

♦ Sifat limbak (bulk property ): membandingkan perubahan

keseluruhan perubahan fisis fase gerak dengan dan tanpa zatyang dielusi

- relatif insensitif

- perlu kontrol suhu yang baik

- contoh: detektor indeks refraksi (refractive index detector , RID)

♦ Sifat solut (solute property ): respon terhadap sifat fisis solut yang

tidak ditunjukkan oleh fase gerak 1000 kali lebih sensitif dari bulkproperty, bisa mendeteksi dalam jumlah ng

INSTRUMENTASI INSTRUMENTASI

Detektor

♦ Detektor fluoresens: radiasi datang-fluoresens lurus/900

senyawa: aromatik polinuklir, steroid, pigmen tumbuhan, vitamin,alkaloid dsb

♦ Detektor elektrokimia: karakteristik voltametri molekul dalam fasegerak polar aq atau alkohol aq pada permukaan elektrode

senyawa: amina aromatik, asam askorbat, asam urat, sistein dsb

♦ Detektor fotometri

absorpsi UV-Vis; UV 254/280 nm; sensitivitas tinggi (ng), tidaksensitif terhadap perubahan suhu, laju alir, komposisi fase gerak

senyawa kimia/biologis: aromatik, senyawa yang mengandungkarbonil, tiokarbonil, nitroso, azo

INSTRUMENTASI

Detektor UV

- Paling umum digunakan

- Sistem sederhana: emisi 254nm yang kuat dari lampumerkuri

- Detektor kualitas tinggikisaran skala penuhabsorbansnya 0.0005-3 unitabsorbans dengan tingkatderau dekat 1% dari skalapenuh

- Baik untuk elusi gradien

dengan pelarut non-penyerap

INSTRUMENTASI



11

Memilih Mode Pemisahan

Solut apakah larut dalam pelarut organik atau air?

INSTRUMENTASI

KCKT Partisi

Fase diam : cair (disangga dengan pengisi kolom)

Fase gerak : air

Sistem :Fase normal• fase diam polar (mis: trietilena glikol, air); fase gerak

nonpolar (mis: heksana, propileter)• kepolaran komponen ↑ → tR ↑• kepolaran fase gerak ↑ → waktu elusi ↓

Fase terbalik • fase diam polar (mis: hidrokarbon); fase gerak polar (mis: air,

metanol, asetonitril)• kepolaran komponen ↑ → tR ↓• kepolaran fase gerak ↑ → waktu elusi ↑

JENIS KCKT

Contoh Aplikasi

APLIKASI KCKT

Aplikasi dari kromatografi bonded-phase

(a) Aditif minuman ringan (b) insektisida organofosfat

APLIKASI KCKT

APLIKASI KCKT

Soal latihan

1. Suatu minuman Whiskey mengandung beberapa komponen alkoholsebagai berikut

SOAL LATIHAN

Senyawaalkohol Konsentrasi(ppm)

Luas areaStandar

Luas area sampel

Methanol 1.25 1.54 x 104 5.69 x 106

Ethanol 0.97 1.90 x 104 8.98 x 106

1-propanol 0,76 0.75 x 104 1.87 x 106

1-butanol 0.32 0.24 x 104 0.56 x 106

Hitung konsentrasi alkohol dalam minuman whiskey dalam



12

SOAL LATIHAN SOAL LATIHAN

3. Suatu minuman multivitamin mengandung vitamin B komplek dan vitamin C yang dianalisis dengan menggunakan HPLCmenghasilkan data sebagai berikut

Senyawa vitamin Konsentrasi(ppm) Luas areaStandar Luas area sampel

Vitamin B 1 10 105674 535678

Vitamin B 2 15 198709 807874

Vitamin B 6 12 156789 157897

Vitamin B 12 10 120765 209989

Vitamin C 50 129875 508769

AMKP KROMATOGRAFI

Documents