Amélioration de la technique DGGE en vue d’identifier des microorganismes sulfato-réducteurs

Amélioration de la technique DGGE en vue d’identifier des microorganismes sulfato-réducteurs

Sous la tutelle de Laurence Casalot

Diagnostic Moléculaire

Audrey BLANCHARDNadège FOISELLE

Le 25 novembre 2008

PCR-DGGE

Technique permettant l’analyse de la diversité bactérienne d’un échantillon après amplification d’un gène donné

Electrophorèse en gel dénaturant, contenant des concentrations variables de dénaturant, formant un gradient de dénaturation

PCR-DGGE Fragments d’ADN double brin plus ou moins

dénaturés en fonction de sa séquence : GC% Enchaînement des acides nucléiques

Ajout d’un îlot GC contenant une succession de G et de C sur 40pb

Ilôt GC

0% dénaturation

Ilôt GC

30% dénaturation 70% dénaturation

Ilôt GC

PCR-DGGE

Comparaison des résultats d’analyses par PCR-Electrophorèse non dénaturante et PCR-DGGE

PCR-DGGE

Comparaison des résultats d’analyses par PCR-Electrophorèse non dénaturante et PCR-DGGE

Gradient dénaturant

30%

70%

DGGEElectrophorèse non dénaturante

PCR-DGGE

Avantages Théoriquement, une bande par

microorganisme présent dans l’échantillon Détection de mutation ponctuelle Séquençage possible des fragments

Inconvénients Fragments de faible taille Parfois difficilement interprétable Temps de migration long

Anciennes techniques d’analyse de la diversité des SRP

PCR-DGGE à partir du gène codant pour l’ARNr 16S

PCR-DGGE à partir du gène dsrB

Limites de la PCR-DGGE sur ARNr 16S

Absence d’amplification pour certaines espèces car les amorces utilisées ne sont pas spécifiques de toutes les espèces bactériennes de SRP

Résultats obtenus non représentatifs de la réelle diversité des SRP dans les prélèvements

Nécessité d’étudier un autre gène plus spécifique des SRP

Gène dsrB Le gène dsrB code pour la sous unité B de la

sulfite réductase (dissimilatory (bi)sulfite reductase) Enzyme clé qui permet la libération d’énergie

pendant la réduction des sulfates Enzyme uniquement présente chez les SRP Séquence du gène très conservée à travers les

différentes espèces Topologie proche pour les arbres phylogénétiques

construits à partir du gène dsrAB et du gène codant pour l’ARNr16S

Limites de la PCR-DGGE sur dsrB

Migration de différents fragments à une même distance Nécessité de cloner les fragments d’ADN extrait

des différentes bandes du gel avant de pouvoir les séquencer

Long et fastidieux lorsqu’un grand nombre d’échantillons est concerné

Limites de la PCR-DGGE sur dsrB

Migration de différents fragments à une même distance

Absence d’amplification pour certains SRP Souches naturellement peu abondantes Mauvaise hybridation de l’amorce sens : jusqu’à 3

nucléotides différents Diminution de la sensibilité due à la présence de

l’îlot GC sur l’amorce sens lors de la PCR

Amélioration de la PCR-DGGE sur dsrB

But de l’équipe de Miletto : Mettre au point une technique permettant l’identification de l’ensemble des SRP d’un échantillon Amplification du gène dsrB de l’ensemble des

SRP présent dans l’échantillon Séparation totale de l’ensemble des différents

fragments d’ADN afin de réaliser un séquençage direct

- amorce sens avec ilôt GC - une amorce antisens

Référence

DémarcheEchantillon de sol

Extraction de l’ADNADN environnemental

PCR dsrAB

Mélange d’amorces : - 3 amorces sens - 4 amorces antisensSélection des amplicons de 1,9kb

Banque de clonesdsrAB

SéquencesdsrB

Clonage

Séquençage

AmpliconsdsrB

PCR dsrB

- amorce sens avec ilôt GC - une amorce antisens

PCR dsrBAmplicons

dsrB

Nested PCR

Nested PCR Principe

Amplification par PCR avec un premier couple d’amorces

Amplification par PCR avec un second couple d’amorces

DémarcheEchantillon de sol

Extraction de l’ADNADN environnemental

PCR dsrABSélection des amplicons de 1,9kb

Banque de clonesdsrAB

SéquencesdsrB

Clonage

Séquençage

AmpliconsdsrB

PCR dsrB

PCR dsrBAmplicons

dsrB

DGGE

PCR dsrB

- amorce sens avec ilôt GC - une amorce antisens

SéquencesdsrBSéquençag

e

PCR dsrBAmpliconsdsrB

Résultats PCR-DGGE sur dsrB

Approche directe

Nested PCR

Banque de clones (référence)

Résultats PCR-DGGE sur dsrB

Approche directe

Nested PCR

Banque de clones (référence)

Résultats obtenus en nested PCR ne semblent pas présenter d’artefact dû à l’approche utilisée

Augmentation du nombre de bandes détectables avec les stratégies de nested PCR et de clonage (90% de bandes communes)

Diminution du biais introduit par la PCR : détection des souches peu abondantes

Meilleure sensibilité

Conditions de migration PCR-DGGE

La qualité des résultats obtenus en PCR-DGGE ne dépend pas uniquement de la stratégie d’amplification Temps de migration élevé Voltage adapté Gradient de dénaturant adapté

Migration 30h à 75V Gradient de dénaturant compris entre 35 et 80%

Analyse phylogénétique de dsrB

Construction de l’arbre phylogénétique 97 séquences protéiques de dsrAB extraites de

GenBank Méthode des distances

Ajout manuel des séquences protéiques partielles déduites de dsrB méthode de parcimonie

Mise en évidence d’une grande diversité des SRP dans l’échantillon Confirme les résultats obtenus en DGGE

Analyse phylogénétique de dsrB

Abondance relative des différentes familles de SRP

FamilleAbondance relative

(%)

Clones DGGE

Desulbobacteraceae 53 59

Desulfovibrionales 0 0

Desulfomonile tiedjei gr. 8 7

Desulfobacterium anilini gr. 6 7

Firmicutes xénologues 0 0

Desulfobulbaceae 6 24

Syntrophobacteraceae 8 3

Desulfobacca acetoxidans 11 0

Firmicutes orthologues 6 0

Autes 3 0

Résultats comparables d’une technique d’étude à l’autre

Analyse phylogénétique de dsrB

Abondance relative des différentes familles de SRP

FamilleAbondance relative

(%)

Clones DGGE

Desulbobacteraceae 53 59

Desulfovibrionales 0 0

Desulfomonile tiedjei gr. 8 7

Desulfobacterium anilini gr. 6 7

Firmicutes xénologues 0 0

Desulfobulbaceae 6 24

Syntrophobacteraceae 8 3

Desulfobacca acetoxidans 11 0

Firmicutes orthologues 6 0

Autes 3 0 Souches peu abondantes dans l’échantillon traité

Validation de cette technique

Etude des variations de compositions de microcosmes Echantillon de vase prélevé en zone intertidale en

Belgique Traité avec un régime de marée Utilisation d’une eau a une salinité différente Traitement de 4 semaines

Validation de cette technique

Résultats

Mise en évidence de l’enrichissement sélectif en SRP de l’espèce Desulfosarcina

Confirme le résultat obtenu par une autre technique

Référence

DémarcheEchantillon de sol

Extraction de l’ADNADN environnemental

PCR dsrAB

Mélange d’amorces : - 3 amorces sens - 4 amorces antisensSélection des amplicons de 1,9kb

Banque de clonesdsrAB

SéquencesdsrB1

Clonage

Séquençage

AmpliconsdsrB

PCR dsrB

- amorce sens avec ilôt GC - une amorce antisens

PCR dsrBAmplicons

dsrB

DGGE

PCR dsrB - amorce sens avec ilôt GC - une amorce antisens

- amorce sens avec ilôt GC - une amorce antisens

SéquencesdsrB2Séquençag

e

Nested PCR