Programa de Estudios de Posgrado AÁLISIS DE LA ESTRUCTURA GEÉTICA POBLACIOAL DEL DORADO (Coryphaena hippurus; LIAEUS, 1758) E EL OROESTE DEL PACÍFICO MEXICAO Y GOLFO DE CALIFORIA MEDIATE EL USO DE MICROSATÉLITES. T E S I S Que para obtener el grado de Maestro en Ciencias Uso, Manejo y Preservación de los Recursos Naturales (Orientación en Biología marina) p r e s e n t a Miguel Ángel Tripp Valdez La Paz, B.C.S. Agosto de 2009
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AÁLISIS DE LA ESTRUCTURA GEÉTICA POBLACIOAL DEL … · Dr. Ricardo Pérez Enríquez . RESUME El dorado Coryphaena hippurus es un pez pelágico altamente migratorio que ... Ivette,
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P r o g r a ma d e E s t u d io s d e Po sg r a d o
A�ÁLISIS DE LA ESTRUCTURA GE�ÉTICA POBLACIO�AL DEL DORADO (Coryphaena hippurus; LI��AEUS, 1758) E� EL �OROESTE DEL PACÍFICO MEXICA�O Y GOLFO DE CALIFOR�IA MEDIA�TE
EL USO DE MICROSATÉLITES.
T E S I S
Q u e p a r a ob t en e r e l g r ad o d e
Maestro en Ciencias
Uso , Mane jo y Prese rvac ión de los Recursos Natura les
(Or ien tac ión en Bio log ía mar ina )
p r e s e n t a
M i g u e l Á n g e l T r i p p V a l d e z
L a Pa z , B . C .S . Ago s to d e 20 09
Conformación del comité: Comité tutorial y comité revisor de tesis. Dr. Pedro Cruz Hernández- Director de tesis Centro de Investigaciones Biológicas del Noroeste Dr. Francisco Javier García de León- Cotutor Centro de Investigaciones Biológicas del Noroeste Dr. Daniel Lluch Cota- Cotutor Centro de Investigaciones Biológicas del Noroeste Jurado de examen: Dr. Pedro Cruz Hernández Dr. Francisco Javier García de León Dr. Daniel Lluch Cota Suplente: Dr. Ricardo Pérez Enríquez
RESUME� El dorado Coryphaena hippurus es un pez pelágico altamente migratorio que en
México está reservado exclusivamente para la pesca deportiva, sin embargo existen numerosas flotas artesanales que lo capturan de manera ilegal, por lo que existe el interés por abrir la pesca comercial de este recurso. Para establecer un plan de manejo que beneficie a ambos sectores pesqueros es necesario conocer si en el noroeste del Pacífico mexicano y Golfo de California el dorado se encuentra formando una sola población o si se encuentra estructurado en varias poblaciones. Con el objetivo de determinar si existe estructura poblacional, se analizaron individuos de 5 localidades en el 2005 (Cabo San Lucas, Loreto, Guaymas, Puerto Libertad y Topolobampo) y de 8 localidades en el 2006 (Cabo San Lucas, Loreto, Guaymas, Mazatlán, Nayarit, La Paz, Punta Lobos y una muestra Oceánica) con cinco loci microsatélites, los cuales se considera que tienen mayor resolución que otros tipos de marcadores moleculares. Se analizaron los niveles de variabilidad genética (Na, Ne, Ho, He, Fis) de cada localidad en ambos años. Para detectar estructura genética poblacional se calcularon los valores pareados de Fst y simultáneamente se utilizó un método bayesiano de asignación de individuos (STRUCTURE). El número de migrantes entre localidades y el tamaño efectivo poblacional de cada localidad se calculó a partir de las frecuencias alélicas así como por un método de máxima verosimilitud (MIGRATE). Para apoyar estas pruebas también se realizó un Análisis Factorial de Correspondencia, AMOVA y una prueba de aislamiento por distancia. Se encontraron niveles de variabilidad genética elevados, los valores de Fst demostraron que en el 2005 se presentó una ligera pero significativa diferenciación genética entre todas las localidades (Fst entre 0.009 y 0.027) mientras que en el 2006 solamente en tres comparaciones se encontró diferenciación genética (Fst entre -0.012 a 0.016). De las tres localidades que se colectaron en ambos años (Cabo San Lucas, Loreto y Guaymas) solamente Guaymas presentó diferencias genéticas en los años estudiados. Por otro lado, STRUCTURE no logró detectar diferencias genéticas en ambos años. El número de migrantes calculados presentó diferencias según el método empleado, aunque con ambos métodos se observó una cierta tendencia a un mayor flujo hacia la costa oriental del Golfo de California. El análisis factorial, así como el AMOVA y la Prueba de aislamiento por distancia tampoco lograron detectar la presencia de grupos genéticamente diferentes. Por lo tanto se concluye que aunque se observaron diferencias genéticas ligeras pero significativas entre las localidades estudiadas, estas pueden deberse a fenómenos estocásticos debido a la variabilidad ambiental y a la capacidad de dispersión de la especie por lo que el dorado de la región noroeste del Pacífico mexicano se encuentra formando una sola población panmíctica. Palabras clave: Coryphaena hippurus, Estructura poblacional, Microsatélite.
Vo.Bo.
Dr. Pedro Cruz Hernández. Director de Tesis
ABSTRACT
Dolphinfish Coryphaena hippurus is a highly migratory pelagic fish that in Mexico is reserve exclusively to recreational fisheries, although there are many artisanal float that capture this species illegally, so there is an interest in open this resource to commercial fisheries. To establish a management plan that benefit both sectors it is important to know if the dolphinfish in Northwest of the Mexican Pacific and Gulf of California is a single population or its structured in different populations. With the objective of evaluate the population structure, it was analyzed individual form 5 locations in 2005 (Cabo San Lucas, Loreto, Guaymas, Puerto Libertad and Topolobampo) and 8 locations in 2006 (Cabo San Lucas, Loreto, Guaymas, Mazatlán, Nayarit, La Paz, Punta Lobos and an oceanic sample) with five microsatellite loci wish have more resolution power compared to other kinds of molecular markers. It was analyzed the levels of genetic variability of every location for both year (Na, NE, Ho, He and Fis). Genetic population structure was evaluated with Fst values for each population pair and a bayesian method (STRUCTURE) were used simultaneously. The number of migrant between localities and the effective population size were calculated in base of allele frequencies and with a maximum likelihood method (MIGRATE). Also it was made a factorial correspondence analysis, an AMOVA and an isolation by distance test for support the results. It was found high levels of genetic variability in both years, Fst values showed that in 2005 there was a small but significant genetic differentiation between samples (Fst between 0.009 to 0.027), but in 2006 only three comparisons were significant (Fst between -0.012 to 0.016). Of the three localities that were sampled in both years (Cabo San Lucas, Loreto and Guaymas) only Guaymas showed significant genetic differentiation between years. On the other side, STRUCTURE didn’t find any genetic differentiation in both years. The calculated numbers of migrants were different according to the method that was used, however, in both methods there was a certain tendency to a more flux of migrant to the west coast of Gulf of California. The correspondence analysis, AMOVA and the isolation bye distances test couldn’t detect any genetically differentiated group in any of both years sampled. With all this information it is possible to conclude that the dolphinfish of the northwest of the Mexican Pacific and Gulf of California forms a single panmictic population. Keywords: Coryphaena hippurus, Population structure, Microsatellite.
AGRADECIMIE�TOS
Al Centro de Investigaciones Biológicas del Noroestes por la formación académica.
Al Concejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT) por la beca otorgada.
A los proyectos CONAPESCA bajo la responsabilidad de la Dra Juana López y Daniel
Lluch, que financiaron la investigación.
A Pedro por toda su ayuda y por los buenos consejos a lo largo de toda mi formación
académica, y por brindarme su amistad por todo este tiempo, mil gracias.
A Paco por los valiosos comentarios y por todo el apoyo y motivación brindada a lo largo
de la maestría.
A Daniel Lluch por sus revisiones y por permitirme ser parte de este proyecto.
A la Dr. Sofía Ortega y a la M.C. Marcela Zuñiga por su apoyo brindado en la colecta de
muestras así como en los valiosos comentarios y aportaciones a esta tesis.
A mi familia por el apoyo incondicional que me ha brindado y por enseñarme tantas cosas
que me han permitido crecer como persona.
Un especial agradecimiento a toda la banda del laboratorio de genética acuícola (los de
arriba y los de abajo) por hacer del pipeteo y los baños de acrilamida una tarea menos
tediosa de lo que realmente es, por todos los buenos ratos dentro y fuera del laboratorio y
por todo el apoyo brindado durante el tiempo que estuve ahí. A Jair Rangel por el
procesamiento técnico de las muestras del 2005.
A mis compas de la maestría con quienes pase muy buenos ratos, se les estima mucho y
honestamente no creo que hubiera podido caer en un grupo mejor que ustedes, les deseo
mucha suerte en todos sus planes futuros.
A mis brothers Ondrej, Mario, Milton, Sergio (chino) Cintia, Cristina y mis amigos de toda
la vida (bueno, de la Uni pa acá), Ivette, Pelón, Fabiola, Lulú, Nallely, Mabilia, sarahí
quienes han sido verdaderos pilares en mi vida, espero tenerlos a mi lado siempre a pesar
de la distancia.
A mi familia batuquera con quienes he pasado tantos buenos momentos y he tenido
experiencias que jamás hubiera tenido sin ustedes. Que sigamos jugando pregunta y
pregunta otros seis años más!!
Y a todas aquellas personas que de alguna u otra forma me ayudaron a lo largo de mis
estudios, sinceramente GRACIAS.
GLOSARIO.
Alelo: Forma alternativa de un locus. En microsatélites, es una variante con diferente
número de repeticiones de la secuencia motivo.
Alelo nulos: Alelos que no son amplificados en la Reacción en Cadena de la Polimerasa
(PCR) debido a que presentan mutaciones en la región flanqueante de la secuencia por lo
que no son visibles en el gel de electroforesis. La presencia de alelos nulos en una
población puede originar desviación del equilibrio de Hardy-Weinberg hacia un déficit de
heterocigotos.
Análisis de Varianza Molecular (AMOVA): Método estadístico para probar diferencias
genéticas entre grupos o poblaciones que se basa en el análisis de varianza de las
frecuencias genotípicas.
Cadenas de Markov: Modelo que es ajustable para modelar una secuencia de variables
aleatorias, tales como secuencias de pares de bases de nucleótidos en una cadena de ADN,
en la cual la probabilidad que asume el valor de una variable depende del valor de las
variables más recientes que la preceden.
Cadenas de Markov Monte Carlo (MCMC): Método que se basa en la simulación de un
tipo de proceso estocástico para estudiar las propiedades de una distribución de
probabilidad que no puede ser estudiada fácilmente por métodos analíticos. Una Cadena de
Markov genera una serie de variables aleatorias de manera que la distribución de
probabilidad de estados futuros está completamente determinada por el estado actual de la
cadena. Bajo ciertas condiciones, la cadena llegara a un estado estacionario de manera que
si se corre por un periodo suficiente, la cadena visitará una distribución de probabilidad
específica.
Coalescencia: Teoría que describa la genealogía de cromosomas o genes. Bajo diversos
escenarios de historias de vida (generaciones discretas, generaciones traslapables,
reproducción no azarosa, etc.) tomando en cuenta ciertos límites, la distribución estadística
de la longitud de la rama en una genealogía sigue una forma simple y la teoría de
coalescencia describe dicha distribución.
Corrección de Bonferroni: Procedimiento no parametrico en el cual es empleado para
reducir el error tipo I (rechazar una hipótesis nula verdadera) cuando se realizan múltiples
pruebas o comparaciones.
Desequilibrio de ligamiento: Cuando los alelos de diferentes loci se encuentran ligados no
existe una segregación independiente de los mismos, lo cual trae consigo que a nivel
poblacional se observen genotipos comunes entre individuos. El caso extremo de
desequilibrio de ligamiento ocurre cuando los loci se encuentran en el mismo cromosoma y
muy cercanos por lo que la frecuencia de recombinación es muy baja. Sin embargo en
poblaciones naturales adaptadas a un medio ambiente se pueden dar asociaciones entre
alelos de diferentes loci en diferentes cromosomas debido a procesos de selección natural.
Diferenciación genética: Grado de divergencia entre los indicadores de diversidad
genética (diversidad alélica, heterocigosidad, etc.) entre dos poblaciones o especies.
Distancia genética: Es una medida de las diferencias entre las frecuencias alélicas en dos
poblaciones o especies.
Diversidad genética: Es el grado de variación genética en una población, especie o entre
un grupo de especies medido en heterocigosidad, diversidad alélica o heredabilidad.
Efecto Wahlund: Reducción en la heterocigosidad en relación a lo esperado según el
equilibrio de Hardy-Weinberg en una población separada en varias sub poblaciones
parcialmente aisladas.
Equilibrio de Hardy-Weinberg: Es el equilibrio alcanzando en las frecuencias alélicas en
una población panmíctica donde no hay perturbaciones por efecto de la mutación,
migración, selección o deriva. Si dos alelos A1 y A2 tienen frecuencias p y q, las
frecuencias en equilibrio de Hardy-Weinberg para los genotipos A1A1, A1A2 y A2A2 serán
p2, 2pq y q2, respectivamente.
Estructura genética poblacional: Ocurre cuando en dos o más sitios colectados presentan
un grado de diferenciación genética tal que se consideran como sub poblaciones diferentes.
Heterocigoto: Individuo con dos alelos diferentes en un locus.
Heterocigotos, déficit o exceso: Cuando la heterocigosidad observada (Ho) y la esperada
(He) bajo el equilibrio de Hardy-Weinberg no coinciden, presentándose un déficit cuando
la Ho es menor a la He, y un exceso en el caso contrario.
Heterocigosidad: Número de individuos heterocigotos para un locus dividido entre el
número total de individuos de la muestra.
Heterocigosidad esperada. Proporción de organismos heterocigotos calculada a partir del
equilibrio de Hardy-Weinberg. Su cálculo implica la obtención de las frecuencias
genotípicas a partir de las frecuencias alélicas siguiendo un binomio al cuadrado (p + q)2,
en donde p y q son las frecuencias alélicas y 2pq corresponderá a la frecuencia de
heterocigotos.
Heterocigosidad observada. Proporción de organismos heterocigotos calculada a partir de
los genotipos observados en una muestra poblacional.
Homocigoto: Individuo con dos copias del mismo alelo en un locus.
Índice de fijación Fst: Proporción de la endogamia total en una población como
consecuencia de la diferenciación entre sub poblaciones.
Inferencia Bayesiana: Método estadístico en el cual no hay una distinción lógica entre los
parámetros del modelo y los datos, sino que ambos son variables aleatorias con una
distribución de probabilidad conjunta, la cual es especificada por un modelo probabilístico.
La estadística bayesiana involucra manipular estas distribuciones para hacer inferencias
sobre los parámetros o el modelo de probabilidad dados los datos. El principal objetivo de
la inferencia bayesiana es calcular la distribución Posteriori de los parámetros, la cual es la
distribución condicional de los parámetros dado los datos.
Isoterma: Línea que une puntos en un mapa de igual o constante temperatura.
Locus (plural: Loci): Segmento de ADN en un cromosoma. Este segmento puede
codificar un producto, tener una función regulatoria o ser una región de ADN definida por
un método molecular, P. ej: microsatélite.
Máxima verosimilitud: Método estadístico empleado para ajustar un modelo estadístico a
los datos en donde se busca maximizar su probabilidad en base aciertosparámetros, es
decir, maximizar la verosimilitud en función de los parámetros para un set de datos fijos.
Microsatélite: Secuencias cortas (de 1 a 6 pares de bases) repetidas en tándem en un
número de veces variables y que se encuentran en forma abundante y dispersa dentro del
genoma. Estos marcadores por lo general presentan polimorfismos y heterocigosidades
elevadas en una población, por lo que son muy informativos para determinar la variabilidad
y estructura genética poblacional.
�úmero de alelos efectivos (ne): Número de alelos que en igual frecuencia que resultarían
en la misma homocigosidad que el número de alelos observados. Se obtiene del cálculo:
ne=1/∑pi2, donde pi es la frecuencia del i-esimo alelo.
Población: Grupo de organismos de la misma especie que habitan en un área geográfica
restringida y que tienen la capacidad de reproducirse con cualquier otro miembro de dicho
grupo.
Población panmíctica: Es aquella en donde todos los individuos de la población tienen la
misma probabilidad a aparearse.
Polimorfismo: Presencia de diferentes variantes alélicas para un mismo locus en una
muestra poblacional. Se dice que un locus es polimórfico cuando presenta al menos dos
alelos, y específicamente para microsatélites un locus de moderado a elevado polimorfismo
puede presentar de 10 a 20 alelos.
Prueba de asignación de individuos: Método en el cual se calcula la probabilidad de que
los genotipos multilocus de un individuo pertenezcan a una población dada las frecuencias
alélicas de la misma.
Reacción en cadena de la polimerasa (PCR): Método utilizado para realizar copias de
segmentos específicos de ADN (amplificar). El ADN es desnaturalizado por temperaturas
elevadas, se añaden las regiones flanqueantes (primers) y la secuencia es copiada por medio
de una enzima polimerasa termoestable (Taq). Este proceso se lleva a cabo en una serie de
30 a 40 ciclos en un termociclador. 30 ciclos producirán un factor de amplificación de 100
millones de copias.
Riqueza alélica (AR): Número promedio de alelos por locus independiente del tamaño de
muestra.
Stock: Si bien existen diversas definiciones de stock, dentro de las pesquerías stock es un
grupo de individuos que se encuentran en un área específica en un tiempo específico, sin
importar su integridad genética y el cual puede incluir miembros de distintas
subpoblaciones. Por otro lado, desde el punto de vista genético, un stock es una unidad
aislada reproductivamente y genéticamente diferenciada de otras, en donde unos cuantos
migrantes por generación son suficientes para evitar la diferenciación genética.
Tamaño efectivo poblacional (�e): Es el tamaño de una población idealizada (estable,
panmíctica y estacionaria) que tendría el mismo grado de endogamia y deriva génica
observado en la población verdadera.
ÍNDICE GENERAL 1. INTRODUCCIÓN. ............................................................................................................. 1�
1.1. Aspectos generales de la biología de la especie. ........................................................ 1�
1.2. Diversidad genética y estructura poblacional en peces de importancía comercial. ..... 4�
1.3. Marcadores moleculares en el estudio de variabilidad genética. ................................. 6�
Tabla I: Composición de microsatélites (Genbank) para C. hippurus y primers para su
amplificación por PCR (Robert W. Chapman, com. pers.). ............................................. 25 Tabla II: Variabilidad genética de C. hippurus en las localidades colectadas en el 2005. Se
muestra el tamaño de muestra (N), número de alelos (Na), alelos efectivos (ne), riqueza alélica (AR), Heterocigosidad esperada (He), heterocigosidad observada (Ho) y el índice de fijación (Fis). * En desequilibrio de Hardy-Weinberg con P<0.01 ............................. 34
Tabla III: Variabilidad genética de C. hippurus en las localidades colectadas en el 2006.
Se muestra el tamaño de muestra (N), número de alelos (Na), alelos efectivos (ne), riqueza alélica (AR), Heterocigosidad esperada (He), heterocigosidad observada (Ho) y el índice de fijación (Fis). * En desequilibrio de Hardy-Weinberg con P<0.01 .............. 35
Tabla IV: Valores de significancia de la prueba de Wilcoxon entre las localidades del
2005. ................................................................................................................................. 39 Tabla V: Valores de significancia de la prueba de Wilcoxon entre las localidades del
2006… .............................................................................................................................. 39 Tabla VI: Comparaciones pareadas de los valores de Fst para las localidades del 2005.
Debajo de la diagonal se muestra el valor Fst y por encima de la diagonal el valor P..... 44 Tabla VII: Comparaciones pareadas de los valores de Fst para las localidades del 2006.
Debajo de la diagonal se muestra el valor Fst y por encima de la diagonal el valor P. valores en negritas indican que son significativos con P<0.002 ...................................... 45
Tabla VIII: Comparaciones pareadas de los valores de Fst para las localidades colectadas
en años consecutivos. Debajo de la diagonal se muestra el valor Fst y por encima de la diagonal el valor P. valores en negritas indican que son significativos con P<0.007 ...... 46
Tabla IX: Análisis de varianza molecular (AMOVA) de estructura genética poblacional de
C. hippourus. Valores de P en negritas indican que el valor del estadístico F es significativamente diferente de 0. ..................................................................................... 47
Tabla X: Número de migrantes �m por generación en las localidades del 2005. ............... 53 Tabla XI: Número de migrantes �m por generación en las localidades del 2006. ............. 54 Tabla XII: Estimación de los parámetros Θ y Μ a partir del método de máxima
verosimilitud para las localidades del 2005. ..................................................................... 55 Tabla XIII: Calculo de los valores de Ne y Nm a partir de los estimadores Θ y Μ para las
localidades del 2005 considerando una µ de 10-4. ............................................................ 56
Tabla XIV: Estimación de los parámetros Θ y Μ a partir del método de máxima verosimilitud para las localidades del 2006. ..................................................................... 57
Tabla XV: Calculo de los valores de Ne y Nm a partir de los estimadores Θ y Μ para las
localidades del 2006 considerando una µ de 10-4. ............................................................ 58
LISTA DE FIGURAS. Fig. 1: Zonas de muestreo de C. hippurus. Las estrellas indican las localidades del 2005, los
círculos, las localidades del 2006 y los cuadros indican las localidades colectadas en ambos años. n, número de individuos colectados y en paréntesis se muestra la abreviación de cada localidad. .......................................................................................... 23
Fig.2: Valores promedios de: (a) Número de alelos (Na) y riqueza alélica (AR); (b)
Heterocigosidad esperada (He) y Heterocigosidad observada (Ho) para las localidades del 2005. ........................................................................................................................... 37
Fig.3: Valores promedios de: (a) Número de alelos (Na) y riqueza alélica (AR); (b)
Heterocigosidad esperada (He) y Heterocigosidad observada (Ho) para las localidades del 2006. ........................................................................................................................... 38
Fig. 4: Análisis Factorial de Correspondencia de las localidades del 2005 ......................... 42 Fig. 5: Análisis Factorial de Correspondencia de las localidades del 2006. ....................... 43 Fig. 6: Número de poblaciones, K, de C. hippurus inferidas a partir del cálculo de LnP(D)
en el 2005. ........................................................................................................................ 48 Fig. 7: Número de poblaciones, K, de C. hippurus inferidas a partir del cálculo de LnP(D)
en el 2006. ........................................................................................................................ 49 Fig. 8: Aislamiento por distancia de las localidades del 2005. ............................................ 50 Fig. 9: Aislamiento por distancia de las localidades del 2006 incluyendo muestra oceánica.
.......................................................................................................................................... 51 Fig. 10: Aislamiento por distancia de las localidades del 2006 excluyendo la muestra
1.1. Aspectos generales de la biología de la especie.
El dorado Coryphaena hippurus (Linnaeus, 1758) es un pez pelágico perteneciente a la
familia Coryphaenidae que se distribuye en las regiones tropical y subtropical de todos los
océanos del mundo, siendo residente permanente de más del 30% de la capa superficial del
océano y hasta un 15% adicional en ciertas temporadas (Palko et al., 1982; Norton, 1999).
Esta especie presenta un marcado dimorfismo sexual en donde los machos comienzan a
desarrollar una cresta fronto-nucal cuando alcanzan una talla de entre 40 y 60cm de longitud
furcal, en tanto que las hembras no forman dicha cresta (Rose y Hassler, 1974). En individuos del
Atlántico se ha estimado que la madurez sexual se alcanza alrededor de los 50cm de longitud
furcal para ambos sexos, aunque se ha encontrado que las hembras empiezan a maduran a partir
de los 35cm (Beardsley, 1967; Wu et al., 2001). La proporción de sexos rara vez es de 1:1 y esta
puede variar según la temporada, pero en general el porcentaje de hembras está por encima del
60% (Wu et al., 2001).
En diversos estudios se ha encontrado que el dorado puede desovar múltiples veces a lo
largo de todo el año aunque se han observado picos de mayor abundancias, los cuales varían
según la región, así por ejemplo en las costas de Taiwán la mayor abundancia de juveniles ocurre
de febrero a marzo (Wu et al., 2001), en Florida se presentan picos de abundancia entre enero y
marzo (Beardsley, 1967), mientras que en las costas de California los picos de abundancia se
presentan entre julio y octubre (Norton y Crooke, 1994). Para la región del Golfo de California se
2
han encontrado las mayores abundancias en los meses cálidos, de agosto a diciembre (Zuñiga-
Flores et al., 2008). Sánchez-Reyes (2008) menciona que el Golfo de California es una zona de
desove con evidente influencia de la isoterma de los 28°C durante el verano y otoño, mientras
que durante la primavera la isoterma de los 24°C tiene mayor influencia.
En lo referente a la alimentación, se considera que el dorado es un depredador oportunista
dado que tiene un espectro trófico muy amplio, siendo sus principales presas calamares,
langostilla y peces pequeños, además se ha encontrado que dentro del Golfo de California no
existen diferencias en los patrones de alimentación entre machos y hembras, aunque se sabe que
los individuos de mayor tamaño, por lo general machos, tienden a migrar hacia zonas más
alejadas de la costa en busca de alimento de mayor tamaño, en tanto que las hembras y juveniles
se mantienen cercanos a la costa (Tripp-Valdez, 2005).
Esta especie es considerada como altamente migratoria con una capacidad de
desplazamiento de hasta 440km (Kingsford y Defries, 1999), tolera temperaturas desde los 15°C
hasta los 29°C, aunque su óptimo se encuentra entre los 25 y 28°C y su distribución está limitada
por la isoterma de los 20°C (Madrid y Beltrán-Pimienta, 2001; Peralta-Bravo, 2006).
Particularmente en el Pacífico mexicano, esta especie se encuentra desde el Golfo de
Tehuantepec hasta el sur de la Península de Baja California así como dentro del Golfo de
California (Zuñiga-Flores et al., 2008).
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Dada su amplia distribución, el dorado es objeto de pesquerías tanto recreativas como
comerciales en diversas regiones del mundo. Es de importancia comercial en países como
Ecuador (Patterson y Martínez, 1991), Venezuela (Arocha et al., 1999), Japón (Sakamoto y
Kojima, 1999), Túnez (Zaouali y Missaoui, 1999) y Taiwán (Wu et al., 2001), donde es
capturado mediante una flota dirigida o como captura incidental en las pesquerías del Atún. Sin
embargo, en todas estas pesquerías se ha observado una marcada estacionalidad en la
disponibilidad del recurso lo cual puede estar relacionado con disponibilidad de hábitat como
consecuencia de las variaciones en la temperatura superficial del mar (Norton, 1999; Kraul,
1999).
En México, el dorado está reservado por ley para la pesca deportiva en una franja de 50
millas náuticas a partir de la línea base desde la cual se mide el mar territorial (DOF, 1992). Este
decreto se genera a raíz de que la pesca recreativa genera importantes ganancias económicas en
diversas regiones del país en donde se practica dicha actividad, como es el caso de Cabo San
Lucas, en donde se obtuvieron ganancias de más de 50 millones de dólares anuales durante el
periodo de 1990 a 1995 considerando los servicios de transporte y hospedaje así como de venta
de artículos de pesca (Zuñiga-Flores, 2004).
Por otro lado, la calidad de la carne del dorado ha generado también una gran demanda
para su consumo humano, por lo que actualmente existen numerosas flotas artesanales que lo
explotan de forma ilegal. En las costas de Mazatlán, Sinaloa, las capturas de dorado por parte de
los pescadores ribereños durante 1992 constituyeron un 55% del total de las capturas (Saucedo-
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Barrón, 1992). En La Paz, B.C.S., en el mes de septiembre de 1988 la pesca de dorado representó
hasta un 65% de las capturas totales de la flota de una cooperativa pesquera (Torres-Alfaro,
1996).
1.2. Diversidad genética y estructura poblacional en peces de importancia comercial.
Las poblaciones de la mayoría de las especies naturales muestran un cierto grado de
diferenciación genética la cual puede estar dada por la interacción de una gran variedad de
agentes no excluyentes unos de otros. Estos pueden ser la presencia de barreras ambientales,
procesos históricos, diferentes historias de vida y la distancia geográfica entre subpoblaciones.
Dichos factores pueden moldear de alguna manera la información genética entre subpoblaciones
de una especie, lo que se conoce como estructuración genética. (Balloux y Lugon-Moulin, 2002).
Dicha estructura genética entre subpoblaciones puede llevar a que se originen unidades
con características autónomas. Por lo general, en el medio terrestre y dulceacuícola las
poblaciones están bien delimitadas unas de otras y regularmente están separadas por barreras
geográficas evidentes que evitan el entrecruzamiento y la mezcla entre poblaciones. Sin embargo,
en el medio marino estas barreras no están claramente delimitadas o están ausentes. Además, la
gran superficie del mar así como el continuo movimiento de las masas oceánicas favorecen el
intercambio de individuos entre poblaciones (Knusten et al., 2003).
Los peces pelágicos presentan además ciertas características que pueden disminuir la
diferenciación genética entre poblaciones de una especie. Entre estas se encuentra la elevada
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capacidad reproductiva así como el tamaño efectivo poblacional grande. Sin embargo, el
principal factor que influye en el grado de diferenciación genética en estas especies es su
capacidad de dispersión, ya sea por transporte pasivo de las larvas o por migración activa de los
adultos (Rocha-Olivares et al., 2006; González y Zardoya, 2007). Las especies con mayor
capacidad de dispersión, por lo general muestran niveles más altos de flujo genético entre
poblaciones y por lo tanto tendrán niveles bajos de diferenciación genética (Ward, 2006).
A pesar de esto, algunos estudios realizados en especies pelágicas han encontrado una
cierta diferenciación genética entre poblaciones, que si bien es pequeña, es estadísticamente
significativa. Como ejemplos de esto podemos mencionar el caso del atún Thunnus obesus
(Alvarado-Bremer et al., 1998) y la sardina Sardina pilchardus (González y Zardoya, 2007).
Esta diferenciación genética encontrada entre las poblaciones puede deberse a diversas razones
como pueden ser un comportamiento filopátrico de los individuos, retención de larvas en zonas
específicas o adaptación local a ciertas condiciones oceanográficas o a barreras conductuales
como puede ser el desove en distintas temporadas (So et al., 2006). De igual manera, algunos
factores oceanográficos como las corrientes pueden actuar como barrera para el flujo genético
entre poblaciones (Knutsen et al., 2003; González et al., 2008).
Dada la gran importancia comercial que poseen las especies pelágicas, entre las que se
incluye el dorado, es necesario realizar estudios relacionados con la genética poblacional, ya que
la presencia o ausencia de estructura poblacional es reflejo de la cantidad de información genética
intercambiada entre subpoblaciones (Balloux y Lugon-Moulin, 2002). A su vez, esta
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información, resulta de gran utilidad tanto en el manejo de las pesquerías así como en la
conservación de las especies pelágicas de importancia comercial pues permiten identificar
diferentes stocks de una especie, determinar qué tanta información genética se está transmitiendo
entre stocks y cuál es el efecto de las pesquerías sobre dicha información genética (Waples, 1998;
Hoarau et al., 2005).
De aquí surge la problemática en cuanto a las diferencias en el concepto de stock. La
definición más simple indica que un stock es un grupo de individuos que se encuentran en un
área específica en un tiempo específico, sin importar su integridad genética y el cual puede
incluir miembros de distintas subpoblaciones (Beggs y Waldman, 1999; Ward, 2000). En
contraste con esta definición, el concepto genético de stock considera las diferencias genéticas y
el aislamiento reproductivo entre individuos de dos o más áreas específicas, tomando en cuenta el
grado de flujo genético entre individuos en lugar de solo la selección local (Ward, 2000). Esta
definición de stock usualmente es usada alternativamente al concepto de población, sin embargo,
el concepto de stock está más relacionado al manejo de las especies (Beggs y Waldman, 1999).
1.3. Marcadores moleculares en el estudio de variabilidad genética.
La conservación de la diversidad genética es un componente esencial en los programas de
manejo de las especies marinas de importancia comercial como es el caso del dorado. Ya sea que
se estudie para fines de explotación o de conservación, es importante conocer la diversidad
genética de los stocks y el flujo de la misma entre diferentes stocks. En la actualidad existe una
7
gran variedad de marcadores moleculares que permiten cumplir estos objetivos (O´Conell y
Wright, 1997).
Un marcador molecular puede definirse como un gen, proteína o fragmento de ADN que
nos permite distinguir individuos, poblaciones o especies (Frankham et al., 2004). De los
distintos marcadores moleculares que existen en la actualidad, los más utilizados en estudios de
diversidad genética son los microsatélites, los cuales son secuencias cortas (de 1 a 6 pares de
bases,pb) repetidas en tándem en un número de veces variables y que se encuentran en forma
abundante y dispersa dentro del genoma (O´Conell y Wright, 1997) y pueden ser identificados
fácilmente mediante PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa) usando secuencias flanqueantes
(iniciadores o primers).
Una de las principales características que distinguen a los microsatélites sobre otro tipo de
marcador molecular es su elevado polimorfismo el cual está dado por la alta tasa de tasa de
mutación la cual ha sido estimada de 10-6 hasta 10-2 por generación (Zane et al., 2002). Aunque
aún no se ha determinado como ocurren exactamente estos eventos de mutación, se cree que la
forma más probable es que se originen a partir de errores durante la replicación del ADN en un
proceso conocido como “desplazamiento” (Slippage) en donde un des-apareamiento de la
secuencia de ADN origina la pérdida o ganancia de una repetición del microsatélite con lo cual se
generan nuevos alelos en la población (Schlötterer, 1998).
8
Gracias al uso de marcadores moleculares, tales como los microsatélites es posible
obtener una gran cantidad de información genética de las poblaciones naturales a partir de la
estimación de ciertos parámetros, como pueden ser las frecuencias alélicas de cada subpoblación
así como los niveles de heterocigosidad, es decir la proporción de individuos de la muestra que
son heterocigotos (Frankham et al., 2004). Esta información permite estimar el grado de
adecuación de la especie a su ambiente y en el caso de que esta presente una estructura, permite
valorar la conectividad o los niveles de flujo genético entre poblaciones a partir del estadístico Fst
propuesto por Wright (1951).
El estadístico Fst puede ser definido como la correlación entre dos alelos seleccionados al
azar al interior de las subpoblaciones en relación a los alelos colectados al azar de la población
total. Si consideramos dos subpoblaciones y un locus con dos alelos y bajo el equilibrio entre la
mutación y deriva, el Fst puede alcanzar valores que van de cero a uno, donde un valor de uno
indica que las dos subpoblaciones son completamente homocigotas con alelos diferentes fijado,
en tanto que un valor de cero indica que ambas subpoblaciones tienen frecuencias alélicas iguales
(Balloux y Lugon-Moulin, 2002).
Los estadísticos F de Wright siguen siendo utilizados como parámetro estándar para
definir el grado de diferenciación entre subpoblaciones pre-definidas y a su vez para estimar las
tasas de migración (Pearse y Crandall, 2004). Sin embargo, en la última década, el incremento en
el poder de los computadores ha permitido desarrollar nuevos métodos estadísticos para el
análisis de poblaciones los cuales se basan principalmente en modelos bayesianos y de máxima
9
verosimilitud (Beaumont y Rannala, 2004; Pearse y Crandall, 2004; Excoffier y Heckel, 2006).
Gracias a estos nuevos métodos es posible determinar el número de poblaciones o grupos
diferentes en una muestra sin necesidad de tener información previa del origen de los individuos
(Pritchard et al., 2000) o estimar el tamaño efectivo poblacional y tasas de inmigración entre
subpoblaciones a partir de métodos de coalescencia (Beerli y Felsenstein, 2001).
10
2. A�TECEDE�TES
2.1. Pesquerías y migraciones estacionales de C. hippurus.
Debido a la importancia comercial del dorado en diversas regiones del mundo existe un
particular interés en describir sus movimientos estacionales así como los periodos en donde se
obtienen las mayores abundancias en su captura. Muchos de estos estudios han demostrado una
marcada estacionalidad del recurso la cual está relacionada con movimientos migratorios
asociados a cambios en los parámetros ambientales.
En las costas de California se ha encontrado que la mayor abundancia se presenta en los
meses de junio a septiembre, en donde el mayor porcentaje de captura ocurre en agosto (Norton y
Crooke, 1994). Estas variaciones estacionales están asociados con la acumulación de agua
caliente cerca de la costa facilitando la migración del dorado. Por otro lado, en las costas de
Hawaii, Kraul (1999) también encontró una estacionalidad en las pesquerías de dorado asociados
a movimientos migratorios. Estos patrones de abundancia están relacionados con la temperatura
superficial del mar ya que el dorado se desplaza al norte o al sur en una estrecha correlación con
la isoterma de los 23°C.
Lasso y Zapata (1999) encontraron una tendencia similar a la anterior en las costas de
Colombia y Panamá, sin embargo, en este caso las mayores capturas se presentaron en los
primeros tres meses del año, lo cual está relacionado con el avance de la corriente nor-ecuatorial
hacia el sur, permitiendo la entrada de agua de las corrientes de California y Perú. Esta
11
información, junto con los índices de reproducción, proporción de sexos y estudios larvales
realizados en esta región, sugiere que los patrones de migración están estrechamente relacionados
con la actividad de desove (Lasso y Zapata, 1999).
Dentro del Golfo de California, Zuñiga-Flores et al. (2008) analizaron las capturas de la
pesca recreativa en la región de Cabo San Lucas durante el periodo de 1990 al 2000 encontrando
que no existe variación interanual en las capturas pero si existe variación estacional en donde las
mayores capturas se obtuvieron durante la temporada de verano-otoño, es decir, la mayor
abundancia de dorado está asociado a una elevada temperatura superficial del mar.
García-Melgar (1995) realizó una evaluación del ciclo reproductivo de dorado a partir de
individuos colectados en la región de Cabo San Lucas, B.C.S. con individuos obtenidos por pesca
deportiva. El observó que la temporada de desove de estos individuos se extendió por todo el año
en esta zona con un pico pronunciado durante el invierno hasta principios de primavera y propuso
que las migraciones de estos individuos está más relacionada con la temperatura del mar y
hábitos alimenticios que a la reproducción.
Sánchez-Reyes (2008) evaluó la distribución de larvas de C. hippurus a partir de 232
muestras de zooplancton superficial obtenidas de nueve cruceros oceanográficos en el periodo de
1990 a 1996 realizados en el Pacífico oriental Mexicano, principalmente frente a las costas de
Colima, Jalisco, Baja California y hasta Topolobampo. En este estudio se encontró un total de
167 larvas de dorado, la mayoría de ellas en estadio de preflexión, lo que corrobora que esta zona
12
del Pacífico constituye un sitio de desove. Al relacionar la abundancia de las larvas encontradas
con la temperatura superficial del mar, se observa que hay una estrecha relación entre el área de
desove con la isoterma de los 28°C durante el verano y otoño y con la isoterma de los 24°C
durante el invierno.
2.2. Identificación de estructura genética poblacional en peces de importancia comercial
mediante marcadores moleculares.
Uno de los grandes retos dentro del manejo de las pesquerías de peces de importancia
comercial es la identificación de estructura poblacional, de manera que se pueda dar un manejo
apropiado para cada población y evitar una posible sobreexplotación. Sin embargo esto puede
llegar a ser complicado, sobre todo en las especies que tienen una distribución mundial y con
capacidad de desplazarse a grandes distancias. Es a partir de la segunda mitad del siglo XX que
los marcadores moleculares comienzan a utilizarse dentro de las pesquerías con el objetivo de
identificar diferentes stocks. Estos métodos consistían en identificar diferencias en los grupos
sanguíneos o en variantes de proteínas. Sin embargo el avance más significativo en el uso de
marcadores moleculares fue el desarrollo de la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) lo
cual permitió desarrollar marcadores más precisos como es el caso de los microsatélites (Ward,
2000).
13
En la actualidad, el uso de microsatélites en especies de peces pelágicos ha permitido
definir stocks pesqueros con mayor precisión que con otro tipo de estudios. Appleyard et al.
(2001) trabajaron con el atún aleta amarilla Thunnus albacares y lograron identificar ligeras
diferencias genéticas entre ocho localidades del Océano Pacífico utilizando cinco loci
microsatélite. Posteriormente, Diaz-Jaimes y Uribe-Alcocer (2006) reafirmaron esto al analizar
muestras de T. albacares de cinco sitios dentro del Pacífico con ocho loci microsatélite
encontrando diferencias genéticas entre las muestras del sur y las del norte del Pacífico. Otro
ejemplo es el marlín azul Makaira nigricans con el cual Bounaccorsi et al. (2001) identificaron
diferencias genéticas entre muestras del Pacífico y muestras del Atlántico utilizando tanto ADN
mitocondrial como Microsatélites. Por otro lado, O´Reilly et al. (2004) analizaron muestras del
abadejo del Atlántico Theragra chalcogramma de 6 sitios del Pacífico norte y Mar de Bering con
14 loci microsatélite encontrando diferencias genéticas entre dichas localidades.
En todos los casos mencionados anteriormente se observó estructura poblacional a escala
interoceánica, sin embargo, también existen estudios donde se evaluaron escalas geográficas
menores. Knutsen et al. (2003) analizaron muestras de bacalao del Atlántico Gadus morhua en
las costas de Noruega dentro de un área geográfica de 300 km utilizando 10 loci microsatélite y
encontraron que existe una ligera pero significativa diferenciación genética entre cada una de las
localidades colectadas. Shaw et al. (1999) también detectaron diferencias genéticas del arenque
de Atlántico Clupea harengus entre localidades del sur de Noruega e Islandia con cuatro
microsatélites. En el Mediterráneo, Carlsson et al. (2004) detectaron que los individuos de atún
aleta azul T. thynnus thynnus de la parte oriental de la cuenca presentan ligeras diferencias
14
genéticas en comparación con el resto, esto analizando nueve microsatélites en tres localidades
dentro del Mediterráneo.
Por otro lado, existen trabajos en donde las herramientas moleculares no lograron detectar
diferencias poblacionales, como es el caso del trabajo de González et al. (2008) quienes
analizaron muestras del atún de ojo grande Thunnus obesus dentro del Océano Pacífico, Atlántico
e Índico con nueve microsatélites en donde observaron que no existen diferencias genéticas a
nivel interoceánico.
Para el caso de C. hippurus, hasta la fecha no existen trabajos poblacionales donde se
hayan utilizado microsatélites en ninguna región oceánica, sin embargo en el Mediterraneo, Pla y
Pujolar (1999) realizaron un análisis de individuos capturados de las islas Mallorca, Sicilia y las
Islas Canarias utilizando 30 alozimas. Los resultados mostraron que no existen diferencias entre
las localidades, por lo que estas constituyen una sola población panmíctica. A pesar de esto, los
autores mencionan que dicha conclusión se debe tomar con cautela hasta que se realicen estudios
utilizando ADN mitocondrial o microsatélites.
2.3. Estructura poblacional de C. hippurus en el Golfo de California y �oroeste del Pacífico
mexicano.
En el Noroeste del Pacífico mexicano y dentro del Golfo de California han sido pocos los
estudios en los que se ha tratado de identificar estructura poblacional de C. hippurus. Madrid y
15
Beltrán-Pimienta (2001) analizaron 2,812 individuos provenientes de Sinaloa, Nayarit y BCS
registrando el peso, longitud y sexo de cada individuo. Los resultados que obtuvieron demuestran
una diferencia en la estructura de tallas, así como en la relación peso-longitud entre las
localidades, siendo Cabo San Lucas donde se encontraron las mayores tallas. En este caso, los
autores de este trabajo proponen en base a sus resultados que las localidades colectadas
constituyen poblaciones diferentes, las cuales pudieran tener cierto flujo genético gracias a la
migración de individuos entre poblaciones.
Rocha-Olivares et al. (2006) evaluaron los niveles de variabilidad genética y conectividad
entre poblaciones a partir de muestras de C. hippurus obtenidas de BCS, Sinaloa y Hawái, para lo
cual utilizaron fragmentos de restricción (RFLP´s) del gen mitocondrial NADH1. Los resultados
de este estudio mostraron niveles de estructura genética altamente significativos entre las tres
localidades en donde la población de BCS resulto ser diferente a Sinaloa y Hawaii, pero Sinaloa y
Hawaii, que presentan mayor distancia geográfica, no presentaron diferencias.
Por otro lado, Díaz-Jaimes et al. (2006) también evaluaron la estructura genética
poblacional del dorado en el Pacífico mexicano a partir de muestras obtenidas de BCS, Sonora,
Sinaloa y Chiapas en cuatro años consecutivos utilizando RFLP´S del gen mitocondrial
NADH1. En este caso, no se encontró estructura genética tanto espacial como temporal para las
localidades colectadas y se encontró un flujo genético significativo entre las mismas. Cabe
resaltar que estos resultados son contradictorios con los obtenidos por Rocha-Olivares y
16
colaboradores (2006), así como con Madrid y Beltrán-Pimienta (2001) quienes sugieren la
presencia de poblaciones distintas en el Pacífico mexicano.
17
3. JUSTIFICACIÓ�. El dorado es un recurso pesquero de gran importancia comercial en la región noroeste de
México y que actualmente se encuentra reservado únicamente para la pesca deportiva, generando
una derrama económica en los principales centros turísticos donde se lleva a cabo dicha
actividad. Por otro lado, la pesca artesanal del dorado constituye una importante fuente de
ingresos para los pescadores ribereños que operan ilegalmente en las costas del Golfo de
California y del Pacífico mexicano.
Dada la importancia que tiene la pesca artesanal de dorado en ciertas regiones como
Mazatlán, actualmente se pretende modificar la ley de pesca de manera que el dorado quede fuera
de las especies reservadas para la pesca deportiva permitiendo que este pueda ser explotado por la
pesca comercial. Sin embargo, esto ocasionaría un conflicto de intereses en sectores deportivo y
comercial, por lo que es necesario contar con información básica que ayude a solucionar estos
problemas generando planes de manejo que no afecte a una de las partes.
Para establecer un plan de manejo adecuado para el dorado, es de gran importancia contar
con información de la estructura poblacional y con ello poder definir el número de stocks
pesqueros en la región, ya que si los individuos de localidades diferentes forman parte de un
mismo stock, entonces la presión de la pesca puede afectar a los individuos de una u otra
localidad sin afectar la variabilidad genética global. Por el contrario, si los individuos de
localidades diferentes constituyen stocks diferentes, entonces la pesca en una localidad tendrá un
18
efecto mínimo en la otra y en este caso es posible aplicar medidas de manejo adecuadas para cada
stock de manera que se puedan evitar extinciones locales (Ward et al., 2001). En México han sido
pocos los estudios que se han hecho al respecto y estos no muestran concordancia en determinar
si se trata de una sola población que se distribuye a lo largo del Pacífico mexicano o si se tratan
de poblaciones diferentes; usando ya sea índices de crecimiento (Madrid y Beltran-Pimienta,
2001) o marcadores moleculares (Díaz-Jaimez et al., 2006; Rocha-Olivares et al., 2006).
Los marcadores moleculares de tipo microsatélites no han sido utilizados en estudios
poblacionales de dorado en México. Al comparar con otros marcadores moleculares utilizados en
estudios poblacionales se ha encontrado que los microsatélites son más eficientes en detectar
estructura a pequeña escala (O´Connell y Wright, 1997; Ward, 2000; Larsson et al., 2007). Por
tal motivo, en este trabajo se utilizaron marcadores moleculares de tipo microsatélite para
determinar si existe estructura poblacional de dorado en las costas del noroeste del Pacífico
mexicano tanto espacial como temporal, con lo cual se generaría información importante para el
desarrollo de planes de manejo para este recurso ya que de encontrarse que existen poblaciones
diferentes en el Noroeste del Pacífico, entonces sería posible abrir la pesca comercial para ciertas
poblaciones sin que afecte de manera significativa la pesca recreativa de otras poblaciones, esto
dependiendo del esfuerzo pesquero aplicado a los stock y la disponibilidad del recurso. Pero de
encontrarse que existe una sola población panmíctica, entonces será necesario establecer medidas
de manejo que no afecten a uno u otro sector pesquero.
19
4. HIPOTESIS
Debido a las características biológicas del dorado (alta capacidad de migración,
alimentación oportunista, y movimientos estacionales) así como a las variaciones de la
temperatura de su hábitat es probable que se encuentre una elevada variabilidad genética,
característica de los pelágicos mayores, así como no diferenciación genética entre las localidades
muestreadas y por último, es probable encontrar diferencias en los niveles de variabilidad
genética y estructura poblacional entre años consecutivos, como consecuencia de eventos
azarosos tanto ambientales como de reclutamiento al stock.
5. OBJETIVO GE�ERAL
Determinar si existen poblaciones genéticamente diferenciadas, tanto espacial como
temporalmente del dorado (Coryphaena hippurus) en las costas del Pacífico mexicano y el Golfo
de California en los años 2005 y 2006, mediante el uso de marcadores moleculares tipo
microsatélites.
20
OBJETIVOS PARTICULARES
• Determinar los niveles de variabilidad genética del dorado en cinco localidades del Golfo
de California en el año 2005 y ocho localidades del Golfo de California y el noroeste del
Pacífico mexicano en el 2006.
• Determinar si existen estructura poblacional, es decir, diferenciación genética entre las
localidades evaluadas en cada año (2005 y 2006).
• Definir si existen diferencias genéticas temporales en tres localidades muestreadas en
años consecutivos (2005-2006).
• Determinar el tamaño efectivo poblacional (Ne) así como el número de migrantes entre
localidades para ambos años.
21
6. MÉTODO.
6.1. Colecta, preservación y almacenaje de las muestras.
6.1.1. Áreas de colecta
Se colectaron individuos de C. hippurus en dos años consecutivos, 2005 y 2006, a lo largo
del Golfo de California y el noroeste del Pacífico mexicano (fig. 1). Para el año 2005 se
colectaron un total de 232 individuos distribuidos en cinco localidades: Puerto Libertad y
Guaymas en Sonora, Topolobambo en Sinaloa, así como Loreto y Cabo San Lucas en Baja
California Sur. Para el año 2006 se colectaron un total de 449 individuos distribuidos en ocho
localidades: Guaymas y Mazatlán en Sinaloa, Peñita de Jaltemba en Nayarit, Cabo San Lucas,
Loreto, La Paz y Punta Lobos en Baja California Sur y una muestra obtenida de un barco atunero
(muestra oceánica). Todas las muestras de ambos años se colectaron en un periodo comprendido
entre agosto y octubre.
6.1.2. Preservación de las muestras
De cada uno de los organismos se disectaron aproximadamente 2 g de tejido muscular,
fijando inmediatamente en 20 ml de etanol al 80 % en frascos de 40 ml. Las muestras fueron
almacenadas a temperatura ambiente hasta su procesamiento.
22
6. 2. Extracción, amplificación y cuantificación de AD�.
6.2.1. Extracción de AD�.
El ADN genómico fue extraído a partir de 5 mg de tejido de cada individuo, usando un Kit
comercial (DNeasy®Tissue-QIAGEN), siguiendo las especificaciones del fabricante. La calidad
del ADN fue verificada mediante geles de agarosa (SIGMA) al 1% teñidos con bromuro de etidio
(SIGMA) en un transiluminador de luz ultra violeta BioDoc-ItTM (UVP). En los mismos geles
se cuantificó el ADN al comparar su intensidad con marcadores de ADN de peso molecular
conocido (lamda-INVITROGEN; con 100, 150 y 200 ng/μl), así como por espectrofotometría
(BIORAD SmartTMSpec 3000).
23
Fig. 1: Zonas de muestreo de C. hippurus. Las estrellas indican las localidades del 2005, los círculos, las localidades del 2006 y los cuadros indican las localidades colectadas en ambos años. n, número de individuos colectados y en paréntesis se muestra la abreviación de cada localidad.
24
6.2.2 Amplificación por PCR
Los marcadores moleculares del dorado fueron amplificados por medio de la reacción en
cadena de la polimerasa (PCR), utilizando cinco loci microsatélites específicos para C. hippurus:
Chi002, Chi008, Chi008A, Chi023 y Chi037 previamente reportados en el Genbank y con las
secuencias de los primers facilitada personalmente por el Dr. Robert W Chapman (Tabla I). La
PCR se llevó a cabo en un termociclador Applied Biosystems en reacciones con un volumen total
de 12.5µl y con las siguientes concentraciones de reactivos: Buffer 1x, MgCl2 3mM, dNTP´s
0.2mM, 0.003mM de cada primer y 0.02 U/µl de Taq polimerasa. Los parámetros de la PCR que
se utilizaron en primera instancia fueron los propuestos por Chapman Com pers, que consistían
en una desnaturalización inicial a 94°C por 3 min seguido de 34 ciclos con 94°C por 45
segundos, 50°C por 45 segundos y 72°C por 1.5 minutos.
Uno de los principales problemas que se obtuvieron con la amplificación de los loci
microsatélite fue la aparición de bandas de repetición denominadas stutters, los cuales son errores
que ocurren en la replicación del ADN durante la PCR originando varias bandas repetidas
después del alelo y dificultando la lectura de los genotipos. Los stutters se presentaron
principalmente en el locus Chi002.
Para tratar de disminuir la aparición de estas bandas se siguió la metodología propuesta
por Yoshida et al. (2005), para lo cual cada locus se amplificó con un tiempo de
desnaturalización inicial de 94°C seguido por cinco ciclos de desnaturalización a 94°C por cinco
25
segundo, alineamiento a 59°C por 60 segundos y extensión a 59°C por 60° y posteriormente 20
ciclos con desnaturalización a 94°C por 0 segundos, extensión a 59°C por 60 segundos y
alineamiento a 59°C por 60 segundos. Por último se dejó a 59°C durante una hora.
Finalmente, se probo la utilización de la técnica Multiplex para optimizar el tiempo y la
cantidad de reactivos utilizados en la amplificación. Dicha técnica consiste en agregar varios
primers en una misma reacción de PCR con lo cual se permite visualizar varios loci microsatélite
en un mismo gel (McPherson y Moller, 2000)
Tabla I. Composición de microsatélites (Genbank) para C. hippurus y primers para su amplificación por PCR (Robert W. Chapman, com. pers.).
�ombre Tamaño (pb)
Primers Secuencia Clave de acceso
Chi002 104 F:GAAAAACTCACACGG TCACTT G R:GGCTTGCCAACCTGA GATTA
c) Por región dentro del Golfo de California (4 grupos) �orte (PLI) Vs Centro (TOP,
2005GUA, 2006GUA, 2005LOT, 2006LOT, LAP) Vs Sur (MAZ, 2005CSL,
2005CSL) Vs Oceánico (NAY, PLO, OCE).
En cada uno de estos análisis se utilizaron un total de 10,000 permutaciones.
6.3.4. Asignación de individuos por métodos Bayesianos.
Además de los métodos descritos previamente para detectar estructura poblacional, se
utilizaron métodos bayesianos para inferir el número de poblaciones (K) a partir de la
información de los genotipos de múltiples loci de cada individuo tratando de agrupar a las
poblaciones que se encuentren en equilibrio de Hardy-Weinberg y con equilibrio de ligamiento.
Se utilizó el programa STRUCTRE 2.1 (Pritchard et al., 2000) el cual sigue la
aproximación previamente descrita para inferir el número de poblaciones. Dicho programa asume
un modelo en donde X denota a los genotipos de los individuos colectados, Z denota las
poblaciones de origen de los individuos (que en este caso es desconocida) y P representa las
frecuencias alélicas en todas las poblaciones. De esta manera, a partir de la distribución de
probabilidad Pr(Z, P|X) α Pr(Z) Pr(P) Pr(X|Z, P) se utilizan Cadenas de Markov Monte Carlo
(MCMC) para inferir Z y P en base a las probabilidades a posteriori. Las simulaciones se
llevaron a cabo siguiendo un modelo de mezcla y con frecuencias alélicas correlacionadas, entre
31
poblaciones. Las MCMC consistieron en 1x106 pasos con un periodo de calentamiento (burnin)
de 250,000 pasos. Se probaron valores de K de 1 hasta 8 con 10 iteraciones para cada valor de K.
6.3.5. Aislamiento por distancia.
Se realizó una prueba de Mantel para probar si existía una correlación entre las distancias
geográficas con las distancias genéticas, para lo cual se utilizó el programa en línea ISOLDE el
cual está incorporado en el programa GENEPOP en línea (Raymond y Rousset, 1995;
http://genepop.curtin.edu.au/). En la prueba se consideraron las distancias geográficas en
kilómetros y los valores de Fst linearizados Fst/(1-Fst). Se utilizaron 10,000 permutaciones para
calcular el valor estadístico bajo la hipótesis nula de independencia entre las dos variables, que en
este caso es la distancia geográfica y distancia genética.
6.3.6. Estimación del tamaño efectivo poblacional �e y número de migrantes.
El tamaño efectivo poblacional fue calculado para cada localidad colectada en cada año a
partir de los valores de heterocigosidad esperada siguiendo la formula descrita en Garcia de León
et al. (1997), la cual se basa en el modelo de alelos infinitos y establece que: Ne= (H/1-H)/4µ,
donde H se refiere a los valores de heterocigosidad esperada y µ corresponde a la tasa de
32
mutación del marcador utilizado, que en este caso se consideró una tasa de mutación de 10-4 la
cual ha sido utilizada en trabajos previos (García de León et al., 1997).
El número de migrantes por generación de cada localidad se calculó utilizando dos
métodos: En el primero de ellos, el número de migrantes �m se estimó a partir del modelo de isla
propuesto por Wright (1951) el cual considera una relación entre los migrantes que recibe una
población por generación con los valores de Fst a partir de la formula �m=(1-Fst)/(4Fst) esto
asumiendo equilibrio migración-deriva. La estimación de �m se realizó de manera pareada entre
las localidades de cada año y se consideraron los valores de Fst linearizados Fst/(1-Fst) (Slatkin,
1995).
El segundo método mediante el cual se calculó tanto Ne como �m fue utilizando el
programa MIGRATE 2.8 (Beerli, 2004) que calcula el parámetro poblacional Θ (theta) el cual es
igual a 4Neµ, donde Ne es el tamaño efectivo poblacional y µ es la tasa de mutación, así como el
parámetro de migración Μ que es igual a m/µ, donde m es la tasa de inmigración por generación,
de esta manera es posible calcular �m al multiplicar Θ por Μ. Los análisis se realizaron mediante
el método de máxima verosimilitud bajo el modelo alélico utilizando diez cadenas cortas y dos
cadenas largas con 5,000 y 50,000 genealogías guardadas respectivamente. Se calcularon los
valores de Fst como parámetros de inicio con una tasa de mutación constante y migración
asimétrica. Se realizaron cinco réplicas de cada análisis para verificar la precisión de los
resultados.
33
7. RESULTADOS.
7.1. Variabilidad genética de C. hippurus.
En las localidades del 2005 para el promedio de los cinco loci analizados se encontraron
entre 6 y 18 alelos, una heterocigosidad observada (Ho) entre 0.81 y 0.93 y una heterocigosidad
esperada (He) entre 0.82 y 0.86. Los valores del índice de fijación (Fis) fueron en promedio
negativos, con excepción de Puerto Libertad, lo cual está dado por los valores elevados de
heterocigosidad observada en cada locus (Tabla II). Para las localidades del 2006 se obtuvieron
resultados similares a los del 2005, Na entre 11.40 y 14.2, Ho entre 0.80 y 0.92 y He entre 0.80 y
0.84. Para este año los valores de Fis fueron negativos en todas las localidades con excepción de
Cabo San Lucas (Tabla III).
En la Fig. 2 se muestran los valores promedio de Na y AR (a); así como los valores de Ho
y He (b) para las localidades del 2005. En esta grafica se puede observar que todas las localidades
tienen valores muy similares, con excepción de Loreto quien tiene un valor de Ho ligeramente
superior al del resto de las localidades (Fig.2b). Por otro lado, en la Fig. 3 se grafican los mismos
valores para las localidades del 2006 en donde se observa que para Na y AR los valores son
similares entre las ocho localidades (Fig. 3a) pero en cuanto a los valores de Ho, Mazatlán, Punta
Lobos y la muestra oceánica tienen valores ligeramente por encima del resto (Fig. 3b).
34
Tabla II: Variabilidad genética de C. hippurus en las localidades colectadas en el 2005. Se muestra el tamaño de muestra (N), número de alelos (Na), alelos efectivos (ne), riqueza alélica (AR), Heterocigosidad esperada (He), heterocigosidad observada (Ho) y el índice de fijación (Fis). * En desequilibrio de Hardy-Weinberg con P<0.01 Localidad Estimador Locus
chi002 chi008 chi008a chi023 chi037 Promedio Cabo San Lucas � 57 58 59 58 58 58
ne 4.238 6.782 6.930 8.744 4.260 6.19 AR 10.05 15.70 11.11 16.22 8.67 12.35 Ho 0.77 0.90 0.86 0.96 0.83 0.86 He 0.76 0.85 0.86 0.89 0.77 0.82 Fis 0.002 -0.048 0.001 -0.072 -0.082 -0.04
Promedio � 56 55 56 55 56 55 �a 13 20 15 23 12 16
ne 5.54 7.20 7.28 11.52 5.23 7.36 AR 10.87 15.67 13.37 18.17 10.09 13.63 Ho 0.85 0.86 0.85 0.93 0.89 0.88 He 0.81 0.86 0.86 0.91 0.81 0.85 Fis -0.04 0.01 0.01 -0.01 -0.09 -0.03
35
Tabla III: Variabilidad genética de C. hippurus en las localidades colectadas en el 2006. Se muestra el tamaño de muestra (N), número de alelos (Na), alelos efectivos (ne), riqueza alélica (AR), Heterocigosidad esperada (He), heterocigosidad observada (Ho) y el índice de fijación (Fis). * En desequilibrio de Hardy-Weinberg con P<0.01 Localidad Estimador Locus
chi002 chi008 chi008a chi023 chi037 Promedio Cabo San Lucas � 56 68 63 47 58 58.40
Fig.2: Valores promedios de: (a) Número de alelos (Na) y riqueza alélica (AR); (b) Heterocigosidad esperada (He) y Heterocigosidad observada (Ho) para las localidades del 2005.
a
b
38
Fig.3: Valores promedios de: (a) Número de alelos (Na) y riqueza alélica (AR); (b) Heterocigosidad esperada (He) y Heterocigosidad observada (Ho) para las localidades del 2006.
La Prueba de Wilcoxon permitió verificar los resultados anteriores, indicando que para el
caso de las localidades del 2005, después de la corrección de Bonferroni no existen diferencias
significativas entre las localidades en ninguno de los estimadores que se compararon (P>0.05;
Tabla IV). De igual manera, en las localidades del 2006, después de la corrección de Bonferroni
se encontró que no hay diferencias significativas (P>0.001) en los estimadores de todas las
localidades colectadas (Tabla V).
a
b
39
Tabla IV: Valores de significancia de la prueba de Wilcoxon entre las localidades del 2005. ���������� �� �� � �� �� ��csl Vs lot 0.8551 1.0000 ������� 0.2249 0.8927 1.0000
csl Vs gua 1.0000 1.0000 ������� 0.5002 0.6858 0.3711
csl Vs pli 0.6858 1.0000 ����� 0.1380 0.6858 0.3711
csl Vs top 0.2733 0.3711 ������ 0.2249 0.1380 1.0000
lot Vs gua 0.5839 0.3711 ������ 0.3452 0.1380 1.0000
lot Vs pli 0.2249 1.0000 ������� 0.0431 0.6858 0.3711
lot Vs top 0.4652 1.0000 ������� 0.2249 0.2249 0.3711
gua Vs pli 0.1775 1.0000 ������� 0.3452 0.5002 0.3711
gua Vs top 0.4652 0.0736 ���� �� 0.5002 0.0431 1.0000
pli Vs top 0.4185 0.3711 ����� 0.6858 0.1380 0.3711
Tabla V: Valores de significancia de la prueba de Wilcoxon entre las localidades del 2006. ���������� �� �� � �� �� ��csl Vs lot 1.0000 1.0000 0.5002 0.2249 0.8927 1.0000
csl Vs gua 0.2249 1.0000 0.0796 0.0431 0.6858 0.0736
csl Vs maz 0.1056 0.3711 0.1380 0.0796 0.1380 0.3711
csl Vs nay 0.0679 1.0000 0.6858 0.8927 0.6858 1.0000
csl Vs lap 0.8927 0.3711 0.6858 0.5002 0.1380 1.0000
csl Vs plo 0.5839 0.3711 0.1380 0.1380 0.0796 1.0000
csl Vs oce 1.0000 1.0000 0.5002 0.0431 0.8927 0.0736
lot Vs gua 0.5930 1.0000 0.8927 0.8927 0.8927 1.0000
lot Vs maz 0.0796 1.0000 0.6858 0.0796 0.2249 0.3711
lot Vs nay 0.2733 1.0000 0.6858 0.3452 0.8927 1.0000
lot Vs lap 0.7150 1.0000 0.5002 0.6858 0.3452 0.3711
lot Vs plo 0.2733 0.3711 0.6858 0.8927 0.1380 1.0000
lot Vs oce 1.0000 1.0000 0.3452 0.0431 0.5002 0.0736
gua Vs maz 0.1441 0.0736 0.2249 0.5002 0.0431 1.0000
gua Vs nay 0.2012 1.0000 0.6858 0.3452 0.5002 1.0000
gua Vs lap 0.3452 0.3711 0.8927 0.5002 0.1380 1.0000
gua Vs plo 1.0000 0.3711 0.2249 0.5002 0.2249 1.0000
gua Vs oce 0.5002 1.0000 0.8927 0.1380 0.8927 0.3711
maz Vs nay 0.6858 0.0736 0.0796 0.0431 0.0431 0.3711
maz Vs lap 0.0679 0.3711 0.2249 0.0431 0.0796 1.0000
maz Vs plo 0.1380 0.3711 0.6858 0.3452 0.0796 0.3711
maz Vs oce 0.0796 1.0000 0.3452 0.8927 0.3452 1.0000
40
Tabla V: Continuación. ���������� �� �� � �� �� ��nay Vs lap 0.0679 1.0000 0.6858 0.8927 0.5002 1.0000
nay Vs plo 0.4227 1.0000 0.3452 0.2249 0.6858 0.3711
nay Vs oce 0.2012 0.3711 0.8927 0.0796 0.5002 0.3711
lap Vs plo 0.2012 1.0000 0.6858 0.3452 0.8927 1.0000
lap Vs oce 0.7150 1.0000 0.8927 0.0431 0.2249 0.3711
plo Vs oce 0.2733 0.3711 0.3452 0.3452 0.2249 1.0000
La prueba realizada con el programa GENEPOP para las frecuencias alélicas mostró que
existen diferencias significativas entre las frecuencias alélica entre cada una de las comparaciones
pareadas de las localidades tanto para el 2005 como para el 2006. (P<0.05). Esto significa que a
pesar de que no hubo diferencias en el número de alelos entre todas las localidades del 2005 y en
la mayoría de las localidades del 2006 (prueba de Wilcoxon), las frecuencias con las que se
presentaron dichos alelos si varió de manera significativa entre cada una de las localidades.
El análisis realizado entre las localidades que se colectaron en ambos años (CSL, LOT y
GUA) también mostró diferencias significativas (P<0.05) en todas las comparaciones, es decir,
ninguna de las tres localidades presentó frecuencias alélicas iguales de un año al otro.
41
7.2. Desequilibrio de ligamiento.
Los resultados de esta prueba indicaron que no hay desequilibrio de ligamiento entre los
loci para las localidades del 2005 tras realizar un ajuste secuencial de Bonferroni (P>0.006 ) con
excepción de la comparación pareada entre los loci chi023 con Chi002 y Chi023 con Chi008a
(P<0.006). De igual manera, para las localidades del 2006 no se presento desequilibrio de
ligamiento para ninguna de las comparaciones entre los cinco loci tras realizar un ajuste
secuencial de Bonferroni (P>0.005).
7.3. Análisis factorial de correspondencia.
El análisis factorial realizado con el programa GENETIX para las localidades tanto en el
2005 como en el 2006 muestra que no existen centros de gravedad completamente diferenciados,
sino que hay un traslape entre los centro de gravedad de cada localidad, lo cual podría traducirse
en una ligera diferenciación genética entre las localidades. En la Fig. 3 se muestra el AFC para
las localidades del 2005. En este caso, a pesar de que se observa cierta variación en los datos, no
se pueden distinguir grupos que pudieran indicar diferencias genéticas entre las localidades.
Además, es importante mencionar que el porcentaje de varianza explicada por los tres primeros
ejes es muy bajo, solo de 5.52%.
42
Fig. 4: Análisis Factorial de Correspondencia de las localidades del 2005
Para el caso de las localidades colectadas en el 2006 (Fig. 4) también se observa una
agrupación de los datos, es decir, no se presentan centros de gravedad diferenciados por lo que
podemos decir que en este análisis exploratorio no se presentan diferencias genéticas, sin
embargo esa estructura de datos es escasamente explicada por los tres primeros ejes o factores
(5.27%).
CSL LOT GUA PLI TOP
43
Fig. 5: Análisis Factorial de Correspondencia de las localidades del 2006.
7.4. Estructura genética poblacional.
Los resultados de las comparaciones pareadas para el 2005 de Fst muestran que a pesar de
que se obtuvieron valores bajos (entre 0.009 y 0.027), estos fueron significativos en todas las
comparaciones, lo cual indica una diferenciación genética poblacional ligera pero significativa
entre las localidades que se colectaron en ese año (Tabla VI). De todas las comparaciones, los
mayores valores de Fst se observaron entre Guaymas y Cabo San Lucas así como entre Guaymas
con Topolobampo, ambos casos con un valor de 0.027. Por otro lado, Loreto con Topolobampo
presento el menor valor de Fst con 0.009 (Tabla VI).
CSL LOT GUA MAZ NAY LAP PLO OCE
44
Tabla VI: Comparaciones pareadas de los valores de Fst para las localidades del 2005. Debajo de la diagonal se muestra el valor Fst y por encima de la diagonal el valor P.
En el caso de las localidades del 2006 se obtuvieron valores bajos de Fst al igual que en el
2005, sin embargo después de realizar el ajuste de Bonferroni (con una significancia de P=0.002)
solamente los valores de Fst obtenidos entre la muestra oceánica con Nayarit, Oceánica con Punta
Lobos y Punta Lobos con Nayarit resultaron ser significativos (Tabla VII) mientras que los
valores del resto de las comparaciones no mostraron diferencias genéticas.
45
Tabla VII: Comparaciones pareadas de los valores de Fst para las localidades del 2006. Debajo de la diagonal se muestra el valor Fst y por encima de la diagonal el valor P. valores en negritas indican que son significativos con P<0.002
Al realizar el análisis temporal comparando los tres sitios que fueron colectados tanto en
el 2005 como en el 2006 (Cabo San Lucas, Loreto y Guaymas) se observa que después del ajuste
secuencial de Bonferroni (con una significación de P=0.007) existen diferencias tanto espaciales
como temporales en donde Guaymas resultó ser genéticamente diferente en años consecutivos
(P<0.007) mientras que Loreto y Cabo San Lucas no presentaron cambios en años consecutivos
(P>0.007; Tabla VIII). Loreto en el 2005 resulto ser genéticamente similar a Cabo San Lucas y
Guaymas del 2006, en tanto que Cabo San Lucas y Guaymas del 2005 se diferenciaron
Tabla VIII: Comparaciones pareadas de los valores de Fst para las localidades colectadas en años consecutivos. Debajo de la diagonal se muestra el valor Fst y por encima de la diagonal el valor P. valores en negritas indican que son significativos con P<0.007
El análisis global de Fst para las localidades del 2005 resulto con un valor de 0.019 el cual
fue significativo (P<0.05). Por otro lado en el 2006 se obtuvo un valor de Fst de 0.002 el cual fue
también significativo (P=0.009). En ambos casos, los valores de Fst significativos indican que
existen diferencias genéticas entre algunas de las localidades analizadas. Debido a que en el 2006
la muestra oceánica es la que presenta la mayor diferencia genética (Tabla VII) se realizó
nuevamente la prueba eliminando la muestra oceánica. Esta nueva prueba resulto con un valor de
Fst de -0.0003 y no fue significativo (P=0.264).
El análisis de varianza molecular (AMOVA) mostró que la mayor parte de la varianza
genética en cada uno de los grupos probados se encontró dentro de las poblaciones con valores
superiores al 98% de la varianza total y valores de Fst significativos (p<0.00; Tabla VI) lo que
indica una alta variación entre los individuos.
47
La hipótesis de que las localidades se encuentren genéticamente estructuradas por años
consecutivos (2005 Vs 2006) no fue apoyada por la AMOVA la cual no mostró valores
significativos (P=0.38; Tabla IX). De igual manera, la agrupación de las localidades en Golfo de
California y Océano Pacífico no mostró valores significativos (P=0.35) (Tabla IX) y la tercera
prueba en la cual se agruparon las localidades de acuerdo a la regionalización del Golfo de
California en Norte, Centro, Sur y la parte Oceánica tampoco mostró valores significativo
(P=0.70; Tabla IX).
Tabla IX. Análisis de varianza molecular (AMOVA) de estructura genética poblacional de C. hippourus. Valores de P en negritas indican que el valor del estadístico F es significativamente diferente de 0.
Estructura probada fuente de variación varianza % del total Estadístico F Valor P 1 2005 Vs 2006 (2 grupos)
Entre grupos 0.00042 0.02 FCT= 0.002 0.38 Dentro de los grupos 0.01938 1.03 FSC= 0.0002 0.00 Dentro de las poblaciones 1.85553 98.94 FST= 0.010 0.00
2 Golfo de California Vs Pacífico (2 grupos) Entre grupos 0.00094 0.05 FCT= 0.000 0.35 Dentro de los grupos 0.01922 1.02 FSC= 0.010 0.00 Dentro de las poblaciones 1.85553 98.29 FST= 0.007 0.00
3 Regiones GC (4 grupos) Entre grupos -0.00229 -0.12 FCT= -0.001 0.70 Dentro de los grupos 0.02127 1.13 FSC= 0.011 0.00
Dentro de las poblaciones 1.85555 98.99 FST= 0.010 0.00 La prueba de asignación de individuos a partir del método Bayesiano mediante el
programa STRUCTURE no detectó una estructura poblacional para los individuos de C. hippurus
colectados en ambos años. En la fig. 6 se observan los valores promedio de probabilidad LnP(D)
48
calculados para cada K inferido en las localidades del 2005, en este caso el la mayor probabilidad
se obtuvo con K=1 lo que significa que no se encontraron diferencias genéticas entre los
individuos colectados en este año. En la Fig. 7 se muestran los valores promedios de LnP(D)
calculados para cada K inferido para las muestras colectadas en el 2006 en donde se observa que
la mayor probabilidad se encontró en K=1.
Media
Desv Est 1 2 3 4 5 6 7 8
K
-13000
-12000
-11000
-10000
-9000
-8000
-7000
-6000
LnP
(D)
Fig. 6: Número de poblaciones, K, de C. hippurus inferidas a partir del cálculo de LnP(D) en el
2005.
49
Media
Desv. Est. 1 2 3 4 5 6 7 8
K
-9350
-9300
-9250
-9200
-9150
-9100
-9050
-9000
-8950
-8900
LnP
(D)
Fig. 7: Número de poblaciones, K, de C. hippurus inferidas a partir del cálculo de LnP(D) en el 2006.
50
7.5. Aislamiento por distancia.
La prueba de Mantel para las localidades del 2005 mostró que no existe una correlación
de las distancias geográficas (en Km) y las distancias genéticas (valores de Fst/(1-Fst)) con un
valor de R2=0.0059 y P=0.38 (Fig. 8).
Fig. 8: Aislamiento por distancia de las localidades del 2005.
Para las localidades del 2006, debido a la mayor distancia que existe entre la muestra
oceánica con el resto, se realizó una transformación de la distancia geográfica en Km en una
escala logarítmica (ln) la cual se realizó en el mismo programa ISOLDE. Esta correlación
presentó un valor de R2=0.1485 y no fue significativa (P=0.13) (Fig. 9).
51
Fig. 9: Aislamiento por distancia de las localidades del 2006 incluyendo muestra oceánica.
Como se observa en la Fig. 8, los puntos en donde están los valores de la muestra
oceánica forman una nube aparte del resto, por lo que se decidió realizar nuevamente la prueba
pero ahora sin considerar los datos de la muestra oceánica. Esta prueba resultó con un coeficiente
de correlación aun más bajo que la anterior (R2=0.085) (Fig. 10) y de igual manera no fue
significativa (P=0.15), lo cual nos indica que no existe relación entre la distancia genética y la
distancia geográfica en las localidades.
52
Fig. 10: Aislamiento por distancia de las localidades del 2006 excluyendo la muestra oceánica.
7.6 Estimación del tamaño efectivo poblacional y número de migrantes.
Los valores de Ne calculados para las localidades del 2005 fueron de entre 11,755
individuos para Topolobampo a 15,997 individuos para Guaymas, mientras que para el 2006 se
obtuvieron valores de NE menores ya que estos fueron de 9,865 para la localidad de La Paz hasta
11,740 para la muestra Oceánica.
53
El número de migrantes por generación estimado a partir de los valores de Fst para las
localidades del 2005 resultó en un valor máximo de migrantes de 29.16 entre Loreto y
Topolobampo y un valor mínimo de 9.13 entre Guaymas y Topolobampo (Tabla X).
En las localidades del 2006 el número de migrantes estimado con los valores de Fst fue
mayor en comparación con los estimados en el 2005. El menor número de migrantes fue de 15.02
entre la muestra oceánica y Punta Lobos, y fue precisamente la muestra oceánica la que presentó
el menor número de migrantes con la mayoría de las localidades (Tabla XI ); por otro lado se
obtuvo un número infinito (∞) de migrantes entre CSL y el resto de las localidades (con
excepción de la muestra oceánica), así como en otras cinco de las comparaciones pareadas.
Después del número infinito de migrantes, figuró lo obtenido entre las localidades de Loreto y La
Paz con un valor de 1,785.46 (Tabla XI).
Tabla X: Número de migrantes �m por generación en las localidades del 2005.
CSL LOT GUA PLI TOP CSL - LOT 16.18 - GUA 9.16 10.81 - PLI 12.57 12.90 20.26 - TOP 10.05 29.16 9.13 16.55 -
54
Tabla XI: Número de migrantes �m por generación en las localidades del 2006.
CSL LOT GUA MAZ �AY LAP PLO OCE CSL - LOT ∞ - GUA ∞ 274.48 - MAZ ∞ 53.51 ∞ - �AY ∞ 42.63 76.91 ∞ - LAP ∞ 1,785.46 ∞ ∞ 372.88 - PLO ∞ 19.77 781 25.44 16.49 ∞ - OCE 32.99 29.37 29.91 27.37 15.07 30.61 15.02 -
En cuanto al cálculo de los parámetros poblacionales a partir del uso del programa
MIGRATE, en la tabla XII se muestran los valores de Θ y Μ obtenidos con el método de máxima
verosimilitud. En esta tabla se observa que el máximo valor de Θ lo presenta Loreto con 4.86
mientras que el menor valor lo presenta Guaymas con 2.34. Con respecto a los valores de Μ, los
mayores valores se encuentran entre Guaymas con Loreto y Guaymas con Topolobampo (5.0596
y 5.1013 respectivamente) mientras que el menor valor se observó en Puerto Libertad como
receptora de Cabo San Lucas (0.7292).
55
Tabla XII: Estimación de los parámetros Θ y Μ a partir del método de máxima verosimilitud para las localidades del 2005.
Localidad Θ (4�µ) Μ(m/µ)[+= población receptora]
CSL+ LOT+ GUA+ PLI+ TOP+
CSL 3.43 - 3.6481 3.5203 0.7292 5.0067
LOT 4.86 2.6384 - 4.9382 1.0613 4.1331
GUA 2.34 1.8354 5.0596 - 2.8409 5.1013
PLI 2.83 3.2683 2.9003 3.9681 - 4.4995
TOP 2.74 2.2064 2.1496 3.7932 1.0641 -
A partir del cálculo de los parámetros Θ y Μ, es posible obtener los valores del tamaño
efectivo poblacional de cada localidad así como el número de migrantes por generación entre
cada localidad. Para obtener el valor de Ne a partir de Θ se asumió una tasa mutacional de
microsatélites de 10-4 por locus por generación el cual es el valor que utilizan Gonzalez et al.
(2008) y Gonzalez y Zardoya (2007) para calcular el tamaño efectivo poblacional de T. obesus y
S. pilchardus respectivamente. En la tabla XIII se muestran los valores de Ne y el número de
migrantes por generación entre cada localidad.
56
Tabla XIII: Calculo de los valores de Ne y Nm a partir de los estimadores Θ y Μ para las localidades del 2005 considerando una µ de 10-4.
Localidad �e �m (ΘΜ) [+= población receptora]
CSL+ LOT+ GUA+ PLI+ TOP+
CSL 8,575 - 12.5130 12.0746 2.5012 17.1730
LOT 12,150 12.8226 - 23.9997 5.1579 20.0869
GUA 5,850 4.2948 11.8395 - 6.6477 11.9370
PLI 7,075 9.2493 8.2078 11.2297 - 12.7336
TOP 6,850 6.0455 5.8899 10.3934 2.9156 -
Se obtuvieron valores de Ne entre 5,850 y 12,150 en tanto que el número de migrantes fue
de entre 2.5012 y 23.9997. Se observa que el mayor flujo de individuos ocurre hacia las
localidades de Guaymas y Topolobampo, en tanto que Puerto Libertad está recibiendo una
cantidad reducida de migrantes.
Para las localidades del 2006 se obtuvieron valores de Θ entre 1.43 y 2.27 de las
localidades Oceánica y Mazatlán, respectivamente (Tabla XIV), los cuales fueron menores a los
observados en el 2005. Los valores de Μ obtenidos en este año también son ligeramente menores
a los observados en el 2005, con valores que van de 0.51 a 5.908 (Tabla XI).
57
Tabla XIV: Estimación de los parámetros Θ y Μ a partir del método de máxima verosimilitud para las localidades del 2006.
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A�EXOS.
1. Lista de programas utilizados en los análisis, con su descripción y funciones utilizadas en este trabajo.
Programa Descripción * Funciones utilizadas Liga en línea. GenAlEx 6.1 “Genetic Analysis in Excel”. Programa para
el análisis de genética de poblaciones que corre dentro de MICROSOFT EXCEL. Trabaja con datos de marcadores codominantes, haploides y binarios y permite calcular frecuencias alélicas, heterocigocidades, estadísticos F, pruebas de mantel, AMOVA, entre otros.
Frecuencias alélicas, Heterocigosidades, índices de fijación.
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FSTAT Computa índices de diversidad genética básicos tales como riqueza alélica, estadísticos F, prueba de equilibrio de HW, pruebas de regresión y de mantel.
STATISTICA Programa para el manejo, análisis y visualización de datos estadísticos.
Prueba de Wilcoxon. Licencia requerida.
GenePop Computa índices de diversidad genética básicos tales como riqueza alélica, estadísticos F, prueba de equilibrio de HW, pruebas de regresión y de mantel.
Equilibrio de HW, Diferencias en frecuencias alélicas, desequilibrio de ligamiento y Prueba de Mantel
http://genepop.curtin.edu.au/
GE�ETIX Computa índices de diversidad genética básicos tales como riqueza alélica, estadísticos F, prueba de equilibrio de HW, pruebas de regresión y de mantel.
Arlequin Computa índices de diversidad genética, estadísticos F y distancias genéticas entre poblaciones; prueba de equilibrio de HW, desequilibrio de ligamiento, parámetros poblacionales como migración y prueba de Mantel.
Valores de Fst pareados, tasas de migración a partir de Fst.
http://anthro.unige.ch/software/arlequin/
STRUCTURE Detecta la estructura genética entre un grupo de individuos genotipificados con múltiples loci a partir de una inferencia bayesiana con MCMC.
MIGRATE Estima el tamaño efectivo poblacional y las tasas de migración de una serie de poblaciones. Utilizando solamente marcadores no ligados utilizando inferencia bayesiana o de máxima verosimilitud.
Tamaño efectivo poblacional y tasas de migración entre poblaciones.
http://popgen.scs.fsu.edu/Migrate-n.html
*Excoffier y Heckel (2006)
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2. Graficas de frecuencias alélicas de cada locus para cada localidad colectada en el