Universidade do Vale do Paraíba Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento Aldaíza Salomão Monteiro Efeitos do Laser de Baixa Potência sobre um Modelo Experimental de Cirrose Hepática com CCl 4 São José dos Campos, SP 2006
Universidade do Vale do Paraíba
Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento
Aldaíza Salomão Monteiro
Efeitos do Laser de Baixa Potência sobre um Modelo Experimental de Cirrose
Hepática com CCl4
São José dos Campos, SP
2006
Aldaíza Salomão Monteiro
Efeitos do Laser de Baixa Potência sobre um Modelo Experimental de Cirrose
Hepática com CCl4
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Bioengenharia, como complementação dos créditos necessários para obtenção do título de Mestre em Engenharia Biomédica.
Orientador: Prof. Dr. Wellington Ribeiro
São José dos Campos, SP
2006
FICHA CATALOGRAFICA
Autorizo, exclusivemente para Íins ecadêmicos e cientíÍicos, a
.eprodução total ou perciâl desta disserteção por procèssos
fotocopiedores ou por transmissão eletrônice.
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M774e Monteiro, Aldâiza SalomãoEfeitos do Laser de Baixâ Potência sobre um Modelo
Experimental de Cirrose Hepáticâ com QQlq. I AldaizaSaìomão Monteiro. São José dos Campos: Univap, 200ô.
56f.: i l.; 30cm
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programade Pós-graduação em Bìoengenharia do Instituto dePesquisa e Desenvolvimento-Universidade do Vale doParaÍba,2006.
1. Terapia a laser de baixa intensidade 2. CirroseHeDáticâ 3. Tetracloreto de Carbóno 4. ToxicidadeHepáticâ l. Ribeiro, Wellington ll. Monteiro, AldaízaSalomão
CDU: 621.375.826
13t'12t2006
Banca Exaniinadora:
i
"EFEITOS DO LASER DE BÂIXA POTÊNCIÁ SOBR.E TJM MODELO EXPERM{ENTAL DE
CIRROSE HEPATICA COM CCÌ,"
Aldaíza Salomão Monteiic
j
PÌof. Dr. R(bosEVELT ALVES DA sILvA (UNTVI
PÍof Dr. WDLLINGTON RIBEIRO (lNrVAP)-
Prof. Dra. VALERIA ABRÂNTES P, CARVALEO
Prol Dr. Marcos Tadeu Tavares Pacheco
Dirçtor do IP&D - Univap
Efeitos do Laser de Baixa Potência sobre um Modelo Experimental de Cirrose
Hepática com CCl4
Resumo
A terapia com laser de baixa potência (TLBP) tem sido proposta como terapia reparadora da estrutura e função hepática em ratos parcialmente hepatectomizados. Entretanto os efeitos da TLBP sobre a cirrose hepática ainda não foram avaliados. Os objetivos deste trabalho foram avaliar os efeitos da TLBP na função e estrutura do fígado após a indução da cirrose por tetracloreto de carbono (CCl4). Nós usamos ratos Wistar divididos em cinco grupos, Controle, CCl4, Veículo, TLBP, CCl4, e CCl4+TLBP. Os grupos CCl4 e CCl4+TLBP receberam 0.4g/kg, i.p., três vezes por semana durante 08 semanas. A TLBP consistiu em (pulso contínuo, comprimento de onda 830nm, 35mV, 2,5J/cm2 por ponto), 04 pontos por fígado, 71 segundos por ponto durante 15 dias. A análise histológica e a atividade enzimática do fígado (AST, ALT, ALP, GGT, LDH) foram avaliadas após a TLBP. A TLBP reduziu significantemente o aumento da atividade da AST e LDH induzidas pelo CCl4. TLBP também reduziu as lesões causadas pelo CCl4 demonstradas através da reparação da arquitetura hepática e do número de células de Kupffer. Os resultados sugerem que a TLBP apresenta efeitos regeneradores sobre estrutura e função hepática causados pela administração crônica do CCl4. Palavras-chave: laser de baixa potência, toxicidade hepática, cirrose hepática, CCl4.
Abstract
Low-level laser therapy (LLLT) has been purpose to regenerate liver structure and function in partially hepatectomized rats. However the effects of LLLT on hepatic cirrhosis have been not yet evaluated. The aims of this work were to evaluate the effects of LLLT on liver function and structure after CCl4-induced liver cirrhosis. Wistar rats divided in five groups Control, CCl4Vehicle, LLLT, CCl4 and CCl4+LLLT was used. CCl4 and CCl4+LLLT groups received 0.4g/kg, i.p., three times per week during 08 weeks. LLLT (continuous pulse, wave-lenght 830nm, 35mV, 2,5J/cm2 per point) 4 points for liver, 71 seconds per liver point for 15 days. Histological analysis and enzymatic liver activity (AST, ALT, ALP, GGT, LDH) were evaluated after treatment. LLLT significantly reduced the increased activity of AST and LDH enzymes induced by CCl4. LLLT also reduced the lesion on liver architecture and the number of Kupfer cells induced by CCl4. The results suggest that LLLT presents regenerative effects on liver function and structure followed by CCl4 chronic administration. Key Words: laser therapy, liver toxicity, hepatic cirrhosis, CCl4.
Sumário
1 Introdução 01
1.1 Laser de Baixa Potência ou Laser Não Cirúrgico 05
1.1.1 Laser de Baixa Potência e Regeneração Hepática 06
1.2 Cirrose Hepática e Tetracloreto de Carbono 06
1.3 Avaliação Bioquímica das Funções Hepáticas 08
2 Objetivos 16
3. Material e Métodos 17
3.1 Animais 17
3.2 Grupos Experimentais 17
3.3 Protocolo Experimental 18
3.3.1 Indução da Cirrose 18
3.3.2 Tratamento com Laser de Baixa Potência (Thera Laser®) 18
3.3.3 Anestesia, Sacrifício e Coleta de Tecido Hepático e Sangue 19
3.4 Determinações Bioquímicas para Avaliar a Função Hepática 19
3.5 Histomorfologia e Histomorfometria 20
4 Resultados 24
5 Discussão 34
5 Conclusões 40
Referências Bibliográficas 41
Anexo A (Comitê de Ética em Pesquisa)
1
1. Introdução
Cada vez mais têm crescido o número de estudos com o intuito de se
descobrir novas estratégias terapêuticas que sejam menos onerosas e mais
eficazes. Uma dessas novas estratégias é a utilização do laser de baixa e alta
potência, os quais têm sido utilizados com variados objetivos na área de saúde,
como por exemplo, em cirurgias dos olhos (LIMA et al, 2003), destruição de cálculos
renais (MARIANI, 2004), regeneração de feridas cutâneas (EBERLEIN et al, 2005),
no tratamento de diferentes tipos de dores (CHOW;BARNSLEY, 2005), no
tratamento de alguns tipos de câncer (BETLEJEWSKI et al, 2005) e como
estimulador de regeneração celular (KHADRA, 2005).
A palavra LASER significa “Light Amplification by Stimulated Emission of
Radiation”, que traduzida para a língua portuguesa significa “Amplificação da Luz por
Emissão Estimulada de Radiação” (HARRIS, 1991). A tecnologia laser teve início em
1917, por Albert Einsten, a partir de sua Teoria da “Emissão Estimulada”, a qual se
baseia na Teoria Quântica, proposta em 1890 por Planck, a qual corrobora sobre a
quantidade de energia liberada pelo processo atômico. O primeiro laser foi
desenvolvido por Theodore Maiman, em 1960, nos laboratórios da Hughes, no
estado da Califórnia, EUA. O laser desenvolvido por Theodore produzia um raio de
luz vermelha com um cristal de rubi com comprimento de onda de 694,3nm
(GENOVESE, 2000). Em 1961, com o constante desenvolvimento dos lasers, Javan
e colaboradores desenvolveram um laser a gás (He-Ne) (GENOVESE, 2000).
A utilização do laser possui diversas aplicações, na área médica, entretanto, é
mais utilizado nos processos cirúrgicos e fisioterápicos (laserterapia) (BAXTER,
1991; SANTANA-BLANK et al, 2005; COLLOMBELI et al, 2006). Diversos estudos
têm demonstrado que as interações dos diversos tipos de lasers com diferentes
2
tecidos biológicos resultam em efeitos térmicos, fotoquímicos e não lineares e que o
grau de interação entre laser tecido biológico é determinado pelo comprimento de
onda da luz do laser e pelas características ópticas de cada tecido (PINHEIRO et al,
1998; SANTANA-BLANK et al, 2005; COLLOMBELI et al, 2006). Dessa forma, os
diversos tipos de lasers são absorvidos de maneiras diferentes pelos diferentes
componentes de tecidos biológicos, e algumas áreas do corpo, particularmente os
olhos podem ser afetados de maneira bastante prejudicial se apresentados a uma
irradiação laser. Quanto ao grau de periculosidade dos lasers, a American National
Standards Institute (ANSI), classifica os lasers de acordo com a potência de saída e
comprimento de onda. Essa classificação é dividida em quatro classes:
Classe 1 – lasers sem perigo, cuja potência não é percebida pelos olhos.
Exemplo: leitor de CD.
Classe 2 – lasers perigosos apenas para os olhos. Exemplo: leitor de código
de barras.
Classe 3a – lasers de média potência, perigosos se o feixe de luz for incidido
sobre os olhos através de lentes ópticas. Exemplo: ponteiras laser.
Classe 3b – lasers de média potência, perigosos se simplesmente forem
vistos diretamente. Exemplo: laser de diodo.
Classe 4 – lasers de alta potência ou laser cirúrgico, os quais causam dano
ocular não apenas por contato direto, mas também quando refletidos, sendo
danosos à pele e inflamáveis. Na prática cirúrgica, tem sido utilizado com objetivos
de cortar, vaporizar, coagular e esterilizar. Exemplo: laser de CO2.
A luz é um fenômeno ondulatório formado pelos fótons, que são pequenos
pacotes de energia eletromagnética. A energia eletromagnética propaga-se através
de ondas eletromagnéticas e são caracterizadas por seu comprimento de onda,
3
freqüência e energia. O comprimento de onda é a distância entre duas sucessivas
cristas do espectro eletromagnético, o que determina cor do espectro e é mensurada
em nanômetros. Os comprimentos de onda da energia laser apresentam espectros
variados, partindo do comprimento de onda ultravioleta (ondas curtas) até o
infravermelho longo (ondas longas). A amplitude de uma onda é a altura do topo da
crista indicando a força da onda. A freqüência é a medida do número de cristas que
passam por um determinado ponto durante o período de um segundo, e é expressa
em Hertz (Hz). A energia, mensurada em Joules (J), refere-se ao número de fótons
incidentes no alvo. A densidade de energia (DE) é a energia depositada por unidade
de volume, normalmente dada em Joules/cm3. A potência é a energia distribuída por
unidade de tempo e é normalmente apresentada em Joules/segundo ou Watts (W).
A irradiância é a potência por unidade de área, normalmente expressa em watts/cm2
(GENOVESE, 2000).
4
Figura 1 – Distribuição do Espectro Eletromagnético
Fonte:http://lasp.colorado.edu/cassini/images/Electromagnetic%2520Spectrum.jpg&imgrefurl
5
1.1 Laser de Baixa Potência ou Laser Não Cirúrgico
Os lasers de baixa potência emitem radiações eletromagnéticas de baixa
potência e possuem ação fotoquímica e fotobiológica, como por exemplos
analgésica, antiinflamatória e bioestimuladora (PINHEIRO et al, 1998; GENOVESE,
2000; MATERA et al, 2003; SANTANA-BLANK et al, 2005; COLLOMBELI et al,
2006). A terapia com laser de baixa potência utiliza porções do espectro visível e
infravermelho da luz, pois as primeiras pesquisas foram realizadas com lasers de
rubi, argônio e hélio-neônio, as quais pertencem ao espectro visível (DOIRON;
PROFIO 1985). Só recentemente, lasers de diodo semicondutor de arseneto de
gálio (GaAs) e arseneto de gálio e alumínio (GaAlAs) no espectro infravermelho têm
sido mais utilizados (TAM, 2005; NG et al, 2005). Inicialmente, os aparelhos de laser
desenvolviam uma potência de até 1mW, o que exigia um prolongado tempo de
aplicação. Atualmente, os aparelhos de laser desenvolvem uma potência entre 10 e
90mW, o que diminuiu significativamente o tempo de aplicação.
Um exemplo clássico de laser de baixa potência é o laser de hélio-neônio
(He-Ne), o qual surgiu na década de 70 e emite luz em torno de 630nm. Este tipo de
laser trabalha de modo contínuo ou intervalado (pulsado), a uma potência entre 01 e
10mW. Este laser pode ser aplicado diretamente ou através de fibras ópticas e seu
alcance ou capacidade de penetração é de 06 a 10mm, de acordo com sua potência
(POSTEN et al, 2005).
1.1.1 Laser de Baixa Potência e Regeneração Hepática
6
Os dados referentes aos efeitos da TLBP sobre o fígado demonstram efeitos
anti-inflamatórios, antioxidantes, aceleradores do processo mitótico, reparadores do
“status” energético celular e estimuladores da angiogênese (LIMA et al, 2000; LIMA
et al, 2001; KAO ; SHEEN, 2003; IAKIMENKO et al, 2004). Quando se trata da TLBP
na regeneração hepática, (LIMA et al, 2001) demonstrou que a TLBP acelerou a
regeneração hepática após a indução da cirrose hepática obtida por meio de
ligadura do ducto biliar comum por 04 semanas. Melo et al, (2005), também
demonstram uma melhora da regeneração e função hepática em ratos submetidos à
hepatectomia parcial, utilizando-se de parâmetros bioquímicos (teste de função
mitocondrial) e imunohistoquímicos (nível de regeneração celular por antígeno de
proliferação nuclear celular – PCNA). Por outro lado, Kao e Sheen, (2003),
demonstraram em cultura de células hepáticas de ratos Sprague-Dawley, que a
irradiação com o laser de baixa potência, aumentou a expressão de glutationa
reduzida e diminuiu o conteúdo de glutationa total, e aumentou os níveis de
peroxidação lipídica, indicando um aumento no estresse oxidativo, levando a danos
na estrutura e função do hepatócito.
1.2 Cirrose Hepática e Tetracloreto de Carbono
A cirrose hepática constitui no estágio final de diversas hepatopatias crônicas
de variadas etiologias (LIMA et al, 2001). A cirrose hepática é definida
histopatologicamente pela existência de nódulos de regeneração circundados por
pontes de tecido fibroso, caracterizando alteração estrutural difusa (GAYOTTO;
ALVES, 2001; LIMA et al, 2001). Classicamente, as cirroses hepáticas podem ser
classificadas através de três aspectos: morfológicos (1), etiológicos (2) e clínicos (3).
6
7
De acordo com os caracteres morfológicos, a cirrose pode ser classificada em
micronodular, macronodular ou mista. A cirrose micronodular é caracterizada pela
presença de septos fibrosos espessos e regulares que envolvem pequenos nódulos,
com discreta variação de tamanho, até um máximo de 3mm de diâmetro (GAYOTTO
; ALVES, 2001). A cirrose macronodular é caracterizada pela presença de septos
fibrosos espessos e regulares que envolvem nódulos de tamanho variados,
normalmente maiores que 3mm de diâmetro (GAYOTTO; ALVES, 2001). A cirrose
mista apresenta características micro e macronodulares, e é resultante de
processos regenerativos de cirrose micronodular (GAYOTTO; ALVES, 2001). Os
principais caracteres etiológicos da cirrose hepática são etilismo crônico, vírus
das hepatites B, C e D, congestão venosa crônica, obstrução de fluxo hepático
venoso, síndrome de Budd-Chiari, pericardite constritiva, doença venoclusiva,
colestase prolongada intra e extra-hepática, cirrose biliar primária e
secundária, colangite esclerosante primária, síndromes ductopênicas da
criança e do adulto, diversas alterações metabólicas, hepatite auto-imune,
drogas e medicamentos, agentes tóxicos, curto-circuito intestinal e cirrose
infantil da Índia. Cirroses de etiologias não conhecidas ou criptogênicas
preferencialmente acomentem mulheres idosas com função hepática razoavelmente
preservada (GAYOTTO ; ALVES, 2001). A classificação clínica mais conhecida e
utilizada divide a cirrose em compensada e descompensada. As compensadas são
caracterizadas pela ausência de grandes complicações, como colestase, ascite,
hemorragia digestiva e encefalopatia hepática, cujo surgimento é devido tanto à
insuficiência hepatocelular como à hipertensão portal (GAYOTTO ; ALVES, 2001).
O tetracloreto de carbono (CCl4) é uma potente droga hepatotóxica que
ocasiona dano hepático por intermédio de radicais livres formados durante a sua
8
metabolização: o triclorometil (CCl3) e o tricloro-metilperoxil (OOCCl3) (TOLEDO et
al, 1993; PERES et al, 2000). A indução do sistema de enzimas oxidativas, através
da administração de fenobarbital, intensifica a necrose hepática produzida pelo CCl4
(McLEAN et al, 1969; JIMENEZ et al, 1992). O primeiro estudo avaliando a cirrose
por CCl4 foi descrito por Cameron e Karunarate, em 1936. Este modelo permite, em
longo prazo, a obtenção de modificações histológicas e hemodinâmicas
características da cirrose hepática e da hipertensão portal, verificadas em humanos
e parece ser o mais apropriado para o estudo da formação da cirrose hepática e do
líquido de ascite. Na cirrose têm sido descritas alterações nos mecanismos
oxidantes/antioxidantes, que se encontra em desequilíbrio e contribuem em grande
parte para a necrose hepática (JIMENEZ et al, 1992; ALEYNIK et al, 1997; PEREZ
et al, 2000). Os produtos originários da peroxidação lipídica parecem estimular a
expressão dos genes responsáveis pela síntese de colágeno, um dos principais
componentes da fibrose (LOPEZ-NOVOA et al, 1976; LOUIS et al, 1998;
HELLERBRAND et al, 1999).
1.3 Avaliação Bioquímica das Funções Hepáticas
As enzimas Aspartato Aminotransferase (AST) e Alanina
Aminotransferase (ALT) catalisam a transferência reversível dos grupos amino de
um aminoácido para o a-cetoglutarato, formando cetoácido e ácido glutâmico
(GAYOTO; ALVES, 2001). Para que essas reações ocorram é necessário a
presença de uma coenzima denominada piridoxal fosfato. As reações catalisadas
pelas aminotranferases exercem papéis centrais tanto na síntese como na
degradação de aminoácidos. Além disso, como essas reações envolvem a
8
9
interconversão dos aminoácidos a piruvato ou ácidos dicarboxílicos, atuam como
uma ponte entre o metabolismo dos aminoácidos e carboidratos (TUTOR-CRESPO
et al, 2004). Essas aminotranferases estão distribuídas amplamente nos tecidos. As
atividades mais elevadas da AST encontram-se no miocárdio, fígado, músculo
esquelético, com pequenas quantidades nos rins, pâncreas, baço, cérebro, pulmões
e eritrócitos. A AST e a ALT são encontradas em abundância nos hepatócitos.
Assim, uma vez que haja uma lesão dos hepatócitos, estas enzimas são liberadas
para a circulação. A ALT é encontrada principalmente no citoplasma do hepatócito,
enquanto que 80% da AST dos hepatócitos estão presentes nas mitocôndrias
(GAYOTO; ALVES, 2001). Por este motivo, grandes elevações nos níveis séricos da
AST, quando associado com outros indicadores (bioquímicos e histológicos) de dano
hepático, podem representar dano mitocondrial dos hepatócitos. Em dano
hepatocelular leve a forma encontrada no soro é predominantemente citoplasmática,
enquanto em lesões mais graves há liberação da enzima mitocondrial, elevando a
relação AST/ALT ou Índice deRitis para Índice maior que 1. Na cirrose hepática,
principalmente no início do estabelecimento da cirrose, níveis de até 05 vezes os
limites superiores podem ser encontrados. Entretanto, normalmente os valores
diminuem para níveis próximos aos da normalidade após um longo período da
doença, devido a mecanismos adaptativos do fígado.
A Gama-glutamiltransferase (GGT) catalisa a transferência de um grupo
gama-glutamil de um peptídeo para outro peptídeo ou para um aminoácido
produzindo aminoácidos gama-glutamil e cistenil-glicina. Esta enzima está envolvida
no transporte de aminoácidos e peptídeos através das membranas celulares, na
síntese protéica e na regulação dos níveis de glutatião tecidual (ROSALKI 1975). A
GGT é encontrada no fígado, rins, intestino, próstata, pâncreas, cérebro e coração.
9
10
Apesar da atividade enzimática ser maior nos rins, a enzima presente no soro é de
origem, principalmente, do sistema hepatobiliar. No fígado, a GGT está localizada
nos canalículos das células hepáticas e, particularmente, nas células epiteliais que
revestem os ductos biliares (ROSALKI, 1975). A GGT está presente em grandes
quantidades no retículo endoplasmático agranular e, portanto, elevações em seus
níveis séricos quando associados a outros indicadores (bioquímicos e histológicos),
podem representar alteração ultra-estrutural ao nível do retículo endoplasmático
agranular.
A Fosfatase Alcalina (Falc) compreende um grupo de enzimas
fosfohidrolases que possuem atividade máxima em pH alcalino próximo de 10
(ROSS et al, 1951). Nestas condições, esta enzima catalisa a hidrólise de ésteres do
ácido fosfórico. Existem várias isoenzimas da Falc em praticamente todos os
tecidos, localizando-se na membrana celular (FISHMAN, 1974). Encontra-se em
maiores quantidades nas células do epitélio intestinal, ossos, fígado, túbulos renais e
placenta (GOLDFISCHER et al, 1964; HUGON; BORGERS, 1966). A concentração
sérica de Falc em animais jovens é 2 a 3 vezes maior do que em adultos (KAPLAN,
1972). Em gestantes, o aumento pode ser de 300% do normal, devido a sua
presença na placenta (HULSTAERT et al, 1973). A isoforma hepática da Falc, a
Falc-1, é a que predomina no plasma, fazendo com que esta enzima tenha maior
importância no diagnóstico da doença hepatobiliar, de forma que numa colestase,
por exemplo, quanto maior a atividade detectável de Falc, maior o grau de obstrução
biliar. Por outro lado, a isoenzima Falc óssea, Falc-2, também é encontrada no
plasma, juntamente com a Falc-1, obrigando, dessa forma, em casos de doenças
ósseas, o fracionamento dessas isoenzimas através do teste de estabilidade do 10
11
calor e pelo fracionamento eletroforético, uma vez que a isoenzima Falc-1 é termo
estável e a isoenzima Falc-2 é inativada pelo calor (MOSS, 1986).
A Lactato Desidrogenase (LDH) é uma enzima da classe das oxirredutases
que catalisa a reação reversível do lactato a piruvato, em presença da coenzima
NAD+ que atua como doador ou aceptor de hidrogênio. A LDH está presente em
todas as células do organismo, sendo mais abundante no miocárdio, fígado,
músculo esquelético, rins e eritrócitos. Os níveis teciduais de LDH são,
aproximadamente, 500x maiores do que os encontrados no soro e lesões nesses
tecidos provocam elevações plasmáticas significantes desta enzima. Isoenzimas da
LDH – devido à presença da lactato desidrogenase em vários tecidos, aumentos dos
teores séricos da mesma é um achado inespecífico. É possível obter informações de
maior significado clínico pela separação da LDH em cinco frações isoenzimáticas. As
isoenzimas da LDH são designadas de acordo com a sua mobilidade eletroforética.
Cada isoenzima é um tetrâmetro formado por quatro subunidades chamadas H para
a cadeia de polipeptídica cardíaca e M para a cadeia polipeptídica muscular-
esquelética. As cinco isoenzimas encontradas no soro são a LDH-1 (HHHH) (14 a
26% - miocárdio e eritrócitos), a LDH-2 (HHHM) (29 a 39% - miocárdio e eritrócitos),
a LDH-3 (HHMM) (20 a 26% - pulmão, linfócitos, baço e pâncreas), a LDH-4
(HMMM) (8 a 16% - fígado e músculo esquelético) e a LDH-5 (MMMM) (6 a 16% -
fígado e músculo esquelético). A hemólise produzida durante a coleta e/ou
manipulação de sangue, pode elevar as frações da LDH-1 e LDH-2 (CABAUD;
WRÓBLEWSKI, 1981).
As Proteínas Totais compreendem um grupo de proteínas plasmáticas, onde
as principais proteínas são, a albumina, as globulinas (a-1, a-2, ß e ?), e o
fibrinogênio. Essas proteínas estão envolvidas em inúmeras funções, como 11
12
manutenção da pressão osmótica e da viscosidade do sangue, transporte de
nutrientes, metabólitos, hormônios, fármacos e produtos de excreção, regulação do
pH sanguíneo, além de participação na coagulação. Diversos fatores, como por
exemplo, desidratação, transtornos gastrintestinais, renais, hemorragias, deficiências
nutricionais e hepatopatias podem elevar ou diminuir os níveis das proteínas totais
além dos limites da normalidade. Em estados de inanição, muita proteína de
reserva, especialmente dos músculos e do fígado, é degradada para servir de fonte
de glicose, ao mesmo tempo em que ocorre diminuição das proteínas totais do
plasma, provocando queda na osmolaridade plasmática, o que resulta em saída de
líquidos da corrente sanguínea para os tecidos (edema). Normalmente, dietas com
teores inferiores a 10% de proteínas causam diminuição dos níveis protéicos no
sangue.
A Albumina é a proteína mais abundante no plasma, perfazendo cerca de
50% do total das proteínas. É sintetizada no fígado (cerca de 120mg/kg diariamente)
e contribui com 80% da osmolaridade do plasma sanguíneo, consistindo também,
uma importante reserva protéica, bem como um transportador de ácidos graxos
livres, aminoácidos, metais, cálcio, hormônios e bilirrubina (GUYTON, 2002). A
albumina também tem função importante na regulação do pH sanguíneo, atuando
como ânion. As únicas causas do aumento da concentração de albumina plasmática
(hiperalbuminia) é a desidratação ou choque. A concentração de albumina
plasmática diminuída (hipoalbuminia) pode ocorrer em várias situações, como por
exemplo, em doenças hepáticas crônicas, na doença renal, em estados de
desnutrição, em infecções prolongadas, em queimaduras graves, ou em hemorragia
grave (WILKINSON, 1963). Quando os níveis de albumina estão diminuídos e os de
globulinas, particularmente de ?-globulina aumentados, podemos afirmar que uma 12
13
doença hepática crônica está estabelecida primariamente associada à uma
diminuição da síntese de albumina (WILKINSON, 1963).
As Globulinas são constituídas por um grupo de proteínas denominadas alfa-
1-globulina, alfa-2-globulina, beta-globulina e gama-globulina. Essas proteínas
desempenham inúmeras funções no organismo, mas principalmente no sistema
imunológico inato e adquirido. Constituindo a alfa-1-globulina, a alfa-1-antitripsina
responde por cerca de 90% dessas proteínas. A deficiência da alfa-1-antitripsina
está associada ao enfisema pulmonar e à cirrose hepática. Só é detectável pela
eletroforese quando homozigótica; os estados heterozigóticos só podem ser
identificados por técnicas imunoenzimáticas que também são utilizadas para
confirmação das deficiências homozigóticas. É uma das proteínas de fase aguda e
pode ser encontrada em outros fluidos orgânicos, como lágrimas, sêmen, bile e
líquido amniótico. Nos 10% restantes, estão a alfa-1-glicoproteína ácida, a
alfafetoproteína e outras proteínas. Os níveis se elevam nas doenças inflamatórias
agudas e crônicas, neoplasias, após traumas ou cirurgias e durante a gravidez ou
estrogenioterapia. Nos hepatocarcinomas, a elevação pode acontecer pelo aumento
da alfafetoproteína. As alfa-2-globulinas incluem a haptoglobina, a alfa-2-
macroglobulina e a ceruloplasmina. Raramente encontram-se alterações nessa
banda eletroforética, já que a diminuição de um componente é compensada pelos
demais mesmo dentro da faixa de referência. Níveis elevados de alfa-2-
macroglobulina associados à diminuição da albumina acontecem na síndrome
nefrótica. Os níveis de haptoglobina e de ceruloplasmina podem apresentar-se
elevados em numerosas situações que levam à reação de fase aguda. Os níveis de
haptoglobina apresentam-se diminuídos nas hepatopatias graves, na anemia
megaloblástica, nas situações de aumento da hemoglobina livre, como na hemólise 13
14
de eritrócitos ou na reabsorção de grandes hematomas e na terapia com estrogênios
e corticóides. Os níveis de ceruloplasmina aumentam na estrogenioterapia e se
encontram diminuídos na doença de Wilson, na desnutrição, na síndrome nefrótica e
nas enteropatias com perda de proteína. As beta-globulinas são compostas pelas
beta-lipoproteínas (LDL), transferrina, C3 e outros componentes do complemento,
beta-2-microglobulina e antitrombina III. A redução dessa banda não é freqüente.
A anemia por deficiência de ferro leva ao aumento da transferrina. O hipotireoidismo,
a cirrose biliar, as nefroses e alguns casos de diabetes mellitus podem se evidenciar
pelo aumento de colesterol e conseqüente aumento das beta-lipoproteínas (LDL). A
beta-globulina está freqüentemente elevada nos casos de icterícia obstrutiva e
menos freqüentemente em alguns casos de hepatite. Quase sempre, está elevada
nos casos de cirrose hepática. Nesses casos, pode aparecer junto com
sobreposição ou fusão das bandas beta e gama pelo aumento de IgA, que ocorre
nas cirroses hepáticas, infecções de pele ou trato respiratório e na artrite
reumatóide. Elevações causadas provavelmente pelo aumento dos componentes do
complemento podem ocorrer em hipertensão maligna, doença de Cushing,
poliarterite nodosa e carcinomas. As gamaglobulinas são compostas pelas
imunoglobulinas, predominantemente pela IgG. As imunoglobulinas A, M, D, E e
proteína C reativa encontram-se na área de junção beta-gama. A ausência ou a
diminuição da banda gama indica imunodeficiências congênitas ou adquiridas. O
aumento dessa banda sugere o aumento policlonal das gamaglobulinas associadas
a doenças inflamatórias crônicas, reações imunes, doenças hepáticas ou neoplasias
disseminadas. Bandas oligoclonais podem eventualmente ser observada em
infecções virais crônicas, em algumas infecções bacterianas como as pneumonias
por pneumococos e as hepatites crônicas ativas. Tuberculose, sarcoidose,
15
linfogranuloma venéreo e sífilis terciária são doenças crônicas que levam ao
aumento dessa banda. Artrite reumatóide, lúpus eritematoso sistêmico e outras
colagenoses podem apresentar níveis normais à acentuadamente aumentados,
dependendo da fase de atividade da doença. Níveis aumentados também são
encontrados em linfomas malignos, doença de Hodgkin e leucemia linfocítica
crônica. Tipicamente, a macroglobulinemia de Waldenström e o mieloma múltiplo
exibem um pico homogêneo que pode ou não resultar do aumento total da área
gama. As hepatopatias cursam freqüentemente com aumento da banda das
gamaglobulinas. Na hepatite, verifica-se um aumento das beta e gamaglobulinas
com redução da albumina. Nas cirroses, o padrão mais sugestivo consiste na
elevação da gamaglobulina de base ampla, juntamente com a fusão da beta e da
gamaglobulina, sem a individualização dos picos da chamada ponte beta -gama.
Apenas cerca de 20% dos cirróticos apresentam a fusão completa, e cerca de 3%
apresentam a fusão parcial.
16
2. Objetivos
Verificar os efeitos de 15 dias de terapia com laser de baixa potência sobre a
estrutura e função do fígado de ratos tratados por 08 semanas com tetracloreto de
carbono.
17
3. Material e Métodos
3.1 Animais
Foram utilizados 72 ratos machos da linhagem Wistar, adultos jovens, obtidos
do biotério da Universidade Estadual de São Paulo (UNESP), campus de Botucatu.
Os animais foram mantidos em condições controladas de temperatura (22° a 25°C),
umidade (50-70%) e luminosidade (12h/claro 12h/escuro). Os animais tiveram
acesso “ad libtum” a água e ração (Purina/Brasil).
3.2 Grupos Experimentais
Os animais foram distribuídos da seguinte maneira:
01 – Controle – 12 animais – administração de solução salina 0,9% (1ml),
intra-peritonial, com o objetivo de verificar os efeitos do estresse de manipulação dos
animais sobre o fígado.
02 – Veículo (Nujol®) – 10 animais – administração do veículo (oléo mineral)
da marca Nujol® (1ml), intra-peritonial.
03 – Laser – 08 animais – administração de salina 0,9% (1ml), intra-peritonial
e também da administração do laser conforme demonstrado no item 3.3 com o
objetivo de avaliar os efeitos do laser sobre um fígado normal de ratos.
04 – Tetracloreto de Carbono (CCl4) – 10 animais – administração intra-
peritonial de 0,4g/kg/dia peso corporal de CCl4, diluído na proporção de 1:6
(CCl4/veículo) em óleo mineral Nujol®.
18
05 – Tetracloreto de Carbono (CCl4) + Laser – 10 animais – administração
intra-peritonial de 0,4g/kg de peso corporal de CCl4, diluído na proporção de 1:6
(CCl4/veículo) em óleo mineral Nujol® somado à terapia conforme protocolo no item
3.3 Protocolo Experimental
3.3.1 Indução da Cirrose
Os grupos tratados com CCl4 receberam a dose de 0,4g/kg, via intra-
peritonial, três vezes por semana, durante 08 semanas.
3.3.2 Tratamento com Laser de Baixa Potência (Thera Laser®)
Vinte e quatro horas após o último dia da administração i.p. de CCl4, iniciou-se
o tratamento com o laser de baixa potência, o qual foi realizado durante quinze dias
consecutivos, com os animais acordados, sem nenhum tipo de anestesia,
transcutâneo, seguindo os seguintes parâmetros:
Tempo de Irradiação: 71 segundos por ponto.
Quantidade de Pontos: 04 pontos distribuídos no fígado, totalizando 4 minutos e 44
segundos, pulso contínuo.
Comprimento de Onda (?): 830nm.
Potência: 35mW.
Densidade de Energia: 2,5J/cm2 por ponto.
3.3.3 Anestesia, Sacrifício e Coleta de Tecido Hepático e Sangue
19
Os animais foram anestesiados com Ketamina (75mg/kg) e Xilazina
(40mg/kg). Uma vez anestesiados, foi realizada uma incisão na linha mediana, de 3-
4 cm, próximo do apêndice xifóide (laparatomia), onde foram coletados amostras de
sangue via veia cava inferior e todo o tecido hepático. O tecido hepático foi
imediatamente pesado, cortado e fixado em formol 10% durante 24 horas para
posterior processamento e análise histomorfométrica. Os 5ml de sangue foram
coletados e centrifugados a 3000rpm, e o soro foi utilizado para determinações
bioquímicas com o intuito de avaliar a função hepática.
3.4 Determinações Bioquímicas para Avaliar a Função Hepática
As determinações bioquímicas foram realizadas através de kits comerciais da
marca Analisa®, por meio de um espectrofotômetro Hitachi, modelo U-2001. Foram
avaliados os seguintes parâmetros:
3.4.1 Aspartato Aminotransferase (AST)
Realizado segundo o método descrito por (BERGMEYER, 1983).
3.4.2 Alanina Aminotransferase (ALT)
Realizado segundo o método descrito por (BERGMEYER, 1983).
3.4.3 Fosfatase Alcalina (ALP)
Realizado segundo o método descrito por (ROY, 1970).
3.4.4 Gamma-Glutamyltransferase (GGT)
Realizado segundo o método proposto pelo Expert Panel on Enzymes of the
Comisson of Standards of the IFCC, descrito por (BERGMEYER, 1983).
3.4.5 Proteínas Totais
20
Realizado utilizando-se o método descrito por (LOWRY, 1951).
3.4.6 Albumina
Realizado segundo o método descrito por (NOGUEIRA, 1990).
3.4.7 Globulinas Totais
Realizado pela diferença entre os valores de proteínas totais subtraídos os valores
de albumina.
3.4.8 Lactato Desidrogenase (LDH)
Realizado segundo o método descrito por (CABAUD ; WRÓBLEWSKI, 1981).
3.5 Análise Histomorfológica e Histomorfométrica
Após a coleta de todo o tecido hepático, o mesmo foi pesado, cortado e
imediatamente fixado em formol 10% por 24 horas. Após 24 horas de fixação os
cortes foram desidratados e diafanizados gradativamente em banhos de álcool,
começando em 50%, progredindo até o álcool absoluto 100%. Após a série de
banhos, os cortes foram tratados com substituto do xilol, para que a amostra do
tecido se tornasse translúcida. Assim, os cortes foram colocados em recipientes
adequados com Paraplast fundido por 24 hs para a impregnação do tecido. Após a
impregnação do corte histológico, foi realizada a inclusão do material, o qual foi
colocado num pequeno recipiente (fôrma de plástico para gelo) e coberto com o
Paraplast fundido por inteiro, e foi deixado para solidificar, formando um bloco
contendo o tecido. Os blocos contendo os tecidos foram cortados num micrótomo
(LEICA RM 2125RT), em fatias de 05 micrômetros os quais foram então embebidos
num meio adequado. Os cortes foram então colocados em lâminas de vidro com a
extremidade fosca (PERFECTA). A parafina foi removida dos cortes e o tecido foi re-
21
hidratado e corado. A coloração foi realizada utilizando-se os corantes
hidrossolúveis Hematoxilina de Harris-Eosina para análise quantitativa da arquitetura
hepática e qualitativa da inflamação. O Tricômico de Masson foi utilizado para a
avaliação qualitativa das áreas de fibrose através. Após a coloração o corte foi
novamente desidratado, para que a lamínula (PERFECTA) fosse fixada, utilizando
um meio de montagem permanente adequado (ENTHELLAN-MERCK). Após este
processo de montagem das lâminas, as mesmas foram fotografadas em microscópio
óptico trinocular Olympus, Modelo CH30. A análise morfométrica foi realizada no
mesmo microscópio utilizando-se uma ocular reticulada de 50 retas e 100 pontos de
área conhecida.
3.5.1 Análise Histomorfológica
Devido a limitações financeiras, não foi possível realizar a coloração com o
Tricrômico de Masson para cada um dos animais, por meio da qual gostaria de
quantificar as áreas de colágeno nas áreas fibróticas, realizando um estudo
morfométrico mais abrangente. Por esta razão, apenas três lâminas de cada grupo
experimental foram coradas com o Tricrômico de Masson, o que possibilitou apenas
uma análise qualitativa das áreas de fibrose, onde avaliamos 20 campos em
aumento de 200x por lâmina.
3.5.2 Análise Histomorfométrica
Para a realização da análise morfométrica foi utilizada uma ocular reticulada
de 50 retas e 100 pontos, para as seguintes análises:
22
3.5.2.1 Número de Binucleações (Taxa Mitótica), realizado segundo Silva
Júnior et al, (1991) e Lima et al, (2001)
Esta análise foi realizada com o objetivo de verificarmos se a TLBP
estimularia ou não a divisão dos hepatócitos. Utilizando-se as lâminas coradas com
H/E, num aumento de 400x, realizamos a contagem, em 10 campos para cada corte,
do número de hepatócitos binucleados. Em cada um dos 10 campos analisados, a
área analisada correspondeu a 62500µm2.
3.5.2.2 Número de Hepatócitos
Esta análise foi realizada com o objetivo de verificarmos se a TLBP estimulou
ou não a hiperplasia hepatocitária. Utilizando-se as lâminas coradas com H/E, num
aumento de 400x, realizamos a contagem, em 10 campos para cada corte, do
número de hepatócitos. Em cada um dos 10 campos analisados, a área analisada
correspondeu a 62500µm2.
3.5.2.3 Número de Células de Kupffer (macrófagos)
Esta análise foi realizada com o objetivo de verificarmos se o tratamento com
CCl4 aumenta a inflamação com predominância de macrófagos e também os efeitos
da TLBP sobre o recrutamento de macrófagos para a área inflamada. Utilizando-se
as lâminas coradas com H/E, num aumento de 400x, realizamos a contagem, em 10
campos para cada corte, do número de células de Kupffer. Em cada um dos 10
campos analisados, a área analisada correspondeu a 62500µm2.
23
3.5.2.4 Número de Células Perisinusoidais
Esta análise foi utilizada com o objetivo de verificar se uma hiperplasia destas
células ocorreria decorrente do tratamento com CCl4 e também da TLBP, uma vez
que as células perisinusoidais participam do processo de síntese de matriz
extracelular. Utilizando-se as lâminas coradas com H/E, num aumento de 400x,
realizamos a contagem, em 10 campos para cada corte, do número de células
perisinusoidais. Em cada um dos 10 campos analisados, a área analisada
correspondeu a 62500µm2.
22
24
4. Resultados
O gráfico 01 representa os níveis séricos da enzima AST.
Controle Veículo Laser CCL4 CCL4 + Laser0
25
50
75
100
125
150
175 *U
/L
Gráfico 1- Representa os níveis séricos da AST em U/L. Os valores representam a média do grupo e erro padrão. A diferença estatística é significativa (p
25
O gráfico 03 representa os níveis séricos da enzima GGT
Controle Veículo Laser CCL4 CCL4+Laser0.02.55.07.5
10.012.515.017.520.022.525.0
**
U/L
Gráfico 03- Representa os níveis séricos da GGT em U/L. Os valores representam a média
do grupo e erro padrão. A diferença estatística é significativa quando comparados os grupos Controle
x CCL4 (p
26
O gráfico 05 representa os níveis séricos da enzima LDH
Controle Veículo Laser CCL4 CCL4+Laser0
25
50
75
100
125
150
175
200
225 *U
/L
Gráfico 05- Representa os níveis séricos da LDH em U/L. Os valores representam a média do grupo e erro padrão. A diferença estatística é significativa quando comparados os grupos Controle x CCL4 (p
27
O gráfico 07 representa os níveis séricos de Albumina
Controle Veículo Laser CCL4 CCL4+Laser0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
g/dl
Gráfico 07- Representa os níveis séricos de Albumina em g/dl. Os valores representam a média do grupo e erro padrão. A análise estatística não apresentou diferença significativa quando comparados os cinco grupos experimentais.
O gráfico 08 representa os níveis séricos de Globulinas
Controle Veículo Laser CCL4 CCL4+Laser0.0
1.5
3.0
4.5
6.0
g/dl
Gráfico 08- Representa os níveis séricos de Globulinas em g/dl. Os valores representam a média do grupo e erro padrão. A análise estatística não apresentou diferença significativa quando comparados os cinco grupos experimentais.
28
O gráfico 09 representa o número de Hepatócitos
Controle Veículo Laser CCL4 CCL4+Laser0
5
10
15
20
25
30
*N
° d
e H
epat
óci
tos/
62,5
mm
2
Gráfico 09- Representa o número de hepatócitos por 62,5mm2. Os valores representam a média do grupo e erro padrão. A análise estatística apresentou diferença significativa quando comparados os grupos Laser x Controle (p
29
O gráfico 11 representa o número de Células Perisinusoidais
Controle Veículo Laser CCL4 CCL4+Laser0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
N°
de
Cél
ula
sP
eris
inus
oida
is/6
2,5m
m2
Gráfico 11- Representa o número de células Perisinusoidais por 62,5mm2. Os valores representam a média do grupo e erro padrão. A análise estatística não apresentou diferença significativa quando comparados os cinco grupos experimentais.
O gráfico 12 representa o número de Células de Kupffer
Control Vehicle Laser CCL4 CCL4+Laser0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0*
N°
de C
élul
as d
eK
upff
er/6
2,5m
m2
Gráfico 12- Representa o número de células de Kupffer por 1mm2. Os valores representam a média do grupo e erro padrão. A análise estatística apresentou diferença significativa quando comparados os grupos Controle x CCL4 (p
30
A figura 13 (fotomicrografia com aumento de 400x) de um rato do grupo Controle. Coloração Tricômico de Masson.
As setas brancas indicam as fibras colágenas do sistema porta hepático, as quais
demonstram normalidade na sua distribuição. Nesta fotomicrografia também
podemos verificar uma distribuição considerada normal do parênquima hepático.
A figura 14 (fotomicrografia com aumento de 200x) de um rato do grupo Veículo. Coloração Tricômico de Masson.
31
As setas brancas indicam as fibras colágenas do sistema porta hepático. A seta
verde aponta para uma célula de Kupfer. A seta laranja aponta para três células
Perisinusoidais. Nesta fotomicrografia também verificamos a normalidade tanto na
distribuição de fibras de colágeno do sistema porta quanto na arquitetura do
parênquima hepático.
.
A figura 15 (fotomicrografia com aumento de 200x) de um rato do grupo Laser. Coloração Tricômico
de Masson
As setas brancas indicam as fibras colágenas do sistema porta hepático. A seta verde aponta para
uma célula de Kupfer. A seta laranja aponta para três células Perisinusoidais. Nesta fotomicrografia
observamos uma distribuição considerada normal de colágeno no sistema porta e também no
parênquima hepático.
30
32
A figura 16 (fotomicrografia com aumento de 200x) de um rato do grupo CCl4. Coloração Tricômico
de Masson.
As setas brancas indicam os septos fibrosos no parênquima hepático, as quais apontam para uma
típica área de cirrose, caracterizada por nódulos de regeneração circundados por pontes de tecido
fibroso. As setas laranjas apontam para áreas de necrose.
A figura 17 (fotomicrografia com aumento de 200x) de um rato do grupo CCl4. Coloração Tricômico de Masson.
33
As setas brancas indicam as áreas fibrosadas do sistema porta hepático. Notar que nas áreas de
fibrose há presença de intenso infiltrado inflamatório.
A figura 18 (fotomicrografia com aumento de 100x) de um rato do grupo CCl4+Laser. Coloração Tricômico de Masson.
As setas brancas indicam áreas de fibrose. As setas laranjas indicam para o parênquima hepático,
que se apresenta reorganizado e íntegro quando comparado ao grupo CCl4. Notar que no
parênquima hepático não se encontram mais as áreas de fibrose como no grupo CCl4. Percebemos
também que as (poucas) áreas de fibrose não estão deterioradas como no grupo CCl4.
34
A figura 19 (fotomicrografia com aumento de 400x) de um rato do grupo CCl4+Laser. Coloração Tricômico de Masson.
As setas brancas apontam para áreas de fibrose no parênquima hepático, mas com colágeno
preservado. As setas laranjas indicam para o parênquima hepático, que se apresenta reorganizado e
íntegro quando comparado ao grupo CCl4.
35
5. Discussão
Em relação à enzima AST, os resultados demonstram que o método de
indução da cirrose hepática utilizado foi capaz de provocar alterações significativas
nos níveis séricos da AST quando comparados os grupos Controle x CCl4.
Entretanto, os valores obtidos da AST não se apresentaram tão elevados como os
demonstrado por outros autores (LIMA et al, 2001; KAMALAKKANNAN et al, 2005).
Acreditamos que esses resultados se devem à alta dose de CCl4 (0,4g/kg) e ao
longo período utilizado para a indução da cirrose (08 semanas), diferente daqueles
utilizados por outros autores, que utilizaram doses menores e períodos mais curtos
para a indução da cirrose hepática. Entretanto, utilizamos um protocolo mais longo
(08 semanas) com o intuito de encontrarmos mais acertadamente o estabelecimento
da cirrose em cada um dos animais dos grupos tratados com CCl4. Singer et al,
(1995), demonstraram que níveis séricos extremamente aumentados das
aminotranferases são encontrados principalmente em processos tóxicos agudos, e
que tendem a diminuir quando há uma cronificação da exposição ao agente tóxico.
Nossos resultados também demonstram que a TLBP, demonstrado através dos
valores do grupo CCl4+Laser foi capaz de diminuir significativamente os valores da
AST para níveis próximos da normalidade, sugerindo um efeito hepatoregenerador
da TLBP, particularmente no que diz respeito à função mitocondrial, uma vez que
80% da AST hepatocitária encontra-se na mitocôndria do hepatócito. Estes
resultados também corroboram com os dados sobre os efeitos da TLBP sobre a
função mitocondrial de fígados cirróticos obtidos por LIMA et al, 2001. Portanto,
sugerimos através dos resultados obtidos em nossos experimentos, que a TLBP
auxilia na restauração da função mitocondrial, por algum mecanismo ainda não
36
elucidado, e que este efeito restaurador parece ser benéfico e importante no
processo regenerativo do fígado cirrótico. Com o objetivo de verificar possíveis
alterações na distribuição e estrutura das mitocôndrias nos hepatócitos, estudos de
microscopia eletrônica de transmissão serão realizados.
Em relação à enzima ALT, quando comparados os grupos Controle x CCl4, os
resultados demonstram que o modelo de indução de cirrose hepática utilizado foi
capaz de elevar significativamente os níveis da ALT. Quando comparados os grupos
Controle x CCl4+Laser verificamos que a TLBP não foi capaz de reduzir a lesão
hepática demonstrada através dos níveis aumentados da ALT e ainda que a TLBP
piorou o dano hepático elevando ainda mais os níveis da ALT, o que foi confirmado
quando comparados os valores dos grupos CCl4 x CCl4+Laser, os quais
encontraram-se significativamente mais elevados no grupo CCl4+Laser do que no
CCl4. Estes resultados sugerem que a TLBP nas condições utilizadas piorou a
função hepática por mecanismo ainda não conhecido. Uma vez que a ALT
hepatocitária encontra-se principalmente no citoplasma e que para que ocorra um
aumento dos seus níveis séricos é necessário um dano na membrana celular, o qual
pode ser causado por um aumento no estresse oxidativo, realizaremos um estudo
imunohistoquímico para o “prostaglandina-like” 8-isoprostano (o mais sensível
marcador da peroxidação lipídica), com o objetivo de avaliar se a TLBP leva a
alterações nos componentes lipoprotéicos das membranas celulares (DEBASHIS et
al, 2000).
No estudo da GGT, os resultados demonstram que o modelo de indução de
cirrose hepática utilizado foi capaz de elevar significativamente os níveis séricos da
GGT. Os resultados também demonstram que a TLBP não melhorou a função
hepática por não diminuir os elevados níveis de GGT decorrentes da cirrose. Neste
37
caso, entretanto, a TLBP não piorou a função hepática, como ocorrido no caso da
ALT. Sendo a GGT uma enzima encontrada principalmente no retículo
endoplasmático agranular e nos canículos dos hepatócitos, podemos sugerir que a
TLBP, nas condições utilizadas, não produziu efeito benéfico na regeneração do
retículo endoplasmático agranular e na permeabilidade dos canalículos dos
hepatócitos (GIANNINI et al, 2001; 2005). Com o objetivo de verificar possíveis
efeitos do CCL4 e da TLBP na estrutura e distribuição do retículo endoplasmático
agranular e dos canalículos dos hepatócitos, um estudo ultraestrutural e
histomorfométrico da distribuição, possíveis congestões e do diâmetro dos
canalículos também serão realizados.
O estudo da FALC demonstrou que o modelo de indução da cirrose hepática
com CCL4 foi capaz de elevar significativamente os níveis séricos da FALC e que a
TLBP não foi capaz de reduzí-los. Dessa forma, os níveis aumentados da FALC
sugerem que a cirrose hepática induzida com CCL4 leva a dano na membrana
celular, uma vez que a FALC encontra-se na membrana celular e no epitélio dos
ductos biliares, e também que possivelmente existe um grau aumentado de
obstrução biliar, uma vez níveis aumentados de FALC representam este quadro
(SCHLAEGER et al, 1982; MOSS, 1997). Os resultados também sugerem que a
TLBP não foi capaz de proporcionar a regeneração da membrana dos hepatócitos e
também dos canalículos biliares, possivelmente lesados devido ao tratamento com
CCL4.
Os níveis séricos da LDH demonstraram que o modelo de indução da cirrose
hepática foi capaz de elevar significativamente os níveis séricos da LDH, o que,
segundo a literatura, indica um processo isquêmico hepático (SECTO et al, 2000).
Os resultados demonstraram também que a TLBP foi capaz de diminuir os níveis
38
séricos da LDH, provavelmente através da diminuição da isquemia, o que será
verificado posteriormente através de um estudo histomorfométrico dos vasos e
canalículos hepáticos.
Em relação à síntese hepática de proteínas, os resultados demonstram que o
modelo de indução da cirrose hepática utilizado e que a TLBP (tanto em fígados
sadios quanto em fígados cirróticos) não alteram a capacidade de síntese protéica
dos hepatócitos, sendo verificados através dos níveis séricos de proteínas totais,
albumina e globulinas. Estes dados diferem do trabalho de OHTA et al, 1999, os
quais demonstraram uma pequena diminuição nos níveis séricos de albumina após
06 e 08 semanas de tratamento com tetracloreto de carbono. Por outro lado,
Holecek et al, (1995), demonstram que a indução de cirrose hepática com
tetracloreto de carbono leva a uma elevação dos níveis de alguns aminoácidos e
diminuição de alguns outros, não perfazendo um pool aumentado das proteínas
totais.
A análise histológica com o objetivo de verificar os efeitos da TLBP na cirrose
instalada demonstrou diminuição da degradação de colágeno para o grupo CCL4 +
Laser. Este achado é de suma importância quando pensamos na progressão da
cirrose hepática, pois segundo Gayoto e Alves, (2003) e Lee et al (2005), o aumento
da degradação do colágeno de áreas fibróticas leva a uma perpetuação do
desarranjo estrutural com conseqüente e irreversível perda da função hepática.
Quanto aos mecanismos pelos quais a TLBP diminuiu a degradação de colágeno,
ainda desconhecemos. Entretanto, estaremos realizando um estudo
imunohistoquímico com o objetivo de avaliar os níveis de algumas citocinas e
metaloproteinases e seus respectivos inibidores que poderiam estar sendo ativados
ou suprimidos decorrentes da TLBP, pois segundo Bansal et al, (2005), Senties-
39
Gomez et al, (2005) e Zheng et al, (2005) o modelo de indução de cirrose hepática
via CCL4, ativa e inibe diversas citocinas, metaloproteinases e seus respectivos
inibidores.
A análise morfométrica para o número de hepatócitos demonstrou que a
TLBP estimulou a hiperplasia hepatocitária no fígado saudável, mas não em áreas
lesadas. Os resultados também demonstram que o tratamento com CCL4 diminui
significantemente o número de hepatócitos por unidade de área. HAMAJIMA et al,
2003, demonstraram que a TLBP foi capaz de estimular a síntese de osteoblastos
em cultura de células sem nenhuma adição de drogas ou quaisquer outros fatores
que provocassem algum tipo de injúria celular. Assim, nós poderíamos estabelecer
uma hipótese de que a TLBP somente seria capaz de estimular a síntese de células
saudáveis e não de células lesadas, como no caso de nosso estudo, onde grandes
áreas de lesão foram encontradas devido ao tratamento com CCL4, o qual provoca
dentre outros danos, danos nucleares e na síntese protéica Zima e Kalousová,
(2005).
A análise morfométrica para o número de binucleações revelou que tanto o
tratamento com CCL4 (nas condições utilizadas) quanto a TLBP não foram capazes
de provocar alterações significativas no número de binucleações, o qual tem sido
utilizado como um indicador da taxa mitótica celular Lima et al (2001) e Silva Júnior
et al, (1991).
A análise morfométrica do número de células perisinusoidais não apresentou
diferenças significativas entre os grupos. Esperávamos que estas células que
participam ativamente nos processos de síntese dos componentes da matriz
extracelular apresentassem uma maior expressão no grupo CCL4, no qual existem
grandes áreas de fibrose. Entretanto no modelo utilizado, por razões ainda
40
desconhecidas não encontramos aumento da expressão das células perisinusoidais.
Por outro lado, sabe-se que a ativação das células perisinusoidais é subseqüente a
ativação das células de Kupffer, que estão mais expressas neste modelo de cirrose
experimental (JOHNSON et al, 1992; BURT, 1993).
A análise morfométrica do número de células de Kupffer demonstrou um
significativo aumento da sua expressão no grupo CCL4 e uma redução no grupo
CCL4 + Laser. Tem sido sugerido que a ativação das células de Kupffer leva a
produção de mediadores que iniciam uma cascata de eventos levando a cirrose
(LASKIN, 1990). Estas células normalmente protegem os hepatócidos contra
partículas estranhas. Entretanto, quanto ativadas, estas células liberam citocinas,
mediadas por um aumento do cálcio intracelular, com capacidade de matar o
hepatócito (BIRMINEL; DECKER, 1983; DECKERT et al, 1989). Então seria razoável
pensar que bloqueando a ativação das células de Kupffer, nós poderíamos
interromper a sequência de eventos que conduzem a síntese de citocinas citotóxicas
e bloquear a ativação das células perisinusoidais. Em conseqüência, o processo de
fibrose e degradação da matriz extracelular poderiam ser interrompidos.
41
6. Conclusões
Concluímos de acordo com os resultados encontrados que a TLBP, nas condições
em que foi utilizada, apresentou resultados reparadores na estrutura e função do
fígado cirrótico induzido pela administração crônica de CCl4, particularmente na
regressão da degradação de colágeno, na expressão de células de Kupffer e
também na função hepática verificada através da diminuição dos níveis séricos da
AST e da LDH.
42
Referências Bibliográficas
ALEYNIK S.I.; LEO M.A.; MA X.; ALEYNIK M.K.; LIEBER C.S. Polyenylphos- phatidylcholine prevents carbon tetrachloride-induced lipid peroxidation while it attenuates liver fibrosis. J. Hepatol. v.27, n.3, p.554-561, 1997.
BANSAL MB, KOVALOVICH K, GUPTA R, LI W, AGARWAL A, RADBILL B, ALVAREZ CE, SAFADI R, FIEL IB, FRIEDMAN SL, TAUB RA. Interleukin-6 protects hepatocytes from CCl4-mediated necrosis and apoptosis in mice by reducing MMP-2 expression. J. Hepatology. v.42, p. 548–556, 2005.
BAXTER, G.D.; BELL, A.J.; ALLEN, J.M.; RAVEY, J. Low Level Laser Therapy:Current clinical practice in northen Ireland. Physiotherapy. v.77, n.3, p.171-178, 1991.
BETLEJEWSKY, S.; SINKIEWICZ, A.; MACKIEWICZ-NARTOWICZ, H. Long term results of T1, T2 larynx cancer treatment in CO2 laser microssugery. Otolaryngol. Pol. v.59, n.2, p.235-237, 2005.
BIRMINEL, M.; DECKER, K. Ca2+ flux as an initial event in phagocytes by rat Kupffer cells. Eur. J. Biochem. v.131, p.539-543, 1983.
BURT, A.D. Cellular and molecular aspects of hepatic fibrosis. J Pathol. v.170, p.105-114, 1993.
CABAUD P.G.; WRÓBLEWSKI, F. Colorimetric measurement of lactic dehydrogenase activity of body fluids. Am. J. Clin. Path. v.30, p.234-236, 1981.
CAMERON JR.; KARUNARATE W.A.E. Carbon tetrachloride cirrhosis in relation to liver regeneration. J. Pathol. Bacteriol. v.92, p.1-4, 1936.
CEDILLO, A.; MOURELLE, M.; MURIL, P. Effect of colchicine and trimethylcolchicinic acid on CCl4-induced cirrhosis in the rat. Pharmacol Toxicol. v.79,n.5, p.241-246. 1996 Nov.
COLOMBELLI, J.; PEPPERKOK, R.; STELZER, E.H.; REYNAUD, E.G. Laser nanosurgery in cell biology. Med Sci (Paris) v.22, n.(6-7), p.651-658, Jun-Jul, 2006.
43
CHOW, R.T.; BARNSLEY, L. Systematic review of the literature of low-level laser therapy (LLLT) in the management of neck pain. Lasers Surg. Med. n.37,v.1, p.46-52, Jul, 2005.
DEBASHIS, D. et al. Antioxidants properties of colchicines in acute carbon tetrachloride induced rat liver injury and its role in the resolution of established cirrhosis. Biochim. Biophys. Acta. n.1502, p.351-362, 2000.
DECKERT LOHMANN-MATTHES, M.L.; KARCK, U.; PETERS, T.; DECKER, K. Comparative study of cytotoxicity tumor necrosis factor and prostaglandin release after stimulation of rat Kupffer cells, murine Kupffer cells, and murine inflammatory liver macrophages. J. Leuk. Biol. v.45, p.139-146, 1989.
DOIRON D.R.; PROFIO A.E. Laser instrumentation and safety. Clin. Chest Med. v.6, n.2, p.209-217, Jun, 1985.
EBERLEIN, A.; SCHEPLER, H.; SPILKER, G.; ALTMEYER, P.; HARTMANN, B. Erbium:Yag laser treatment of post-burn scars: potentials and limitations. Burns. v.31, n.1, p.15-24, Feb, 2005.
FISHMAN, W.H. Perspectives on alkaline phosphatase isoenzymes. Am. J. Med. v.56, n.5, p.617-650, May, 1974.
GENOVESE, W.J. Revisão Laser. São Paulo. Pancast. 2000.
GIANNINI, E.G. et al. Increased levels of gammaGT suggest the presence of bile duct lesions in patients with chronic hepatitis C: absence of influence of HCV genotype, HCV-RNA serum levels, and HGV infection on this histological damage. Dig.Dis.Sci.v.46, n.3, p.524-529, 2001.
GIANNINI, E.G.; TESTA, R.; SAVARINO, V. Liver enzyme alteration: a guide for clinicians. Can.Med.Ass.J. v.172, n.3, p.367-379, 2005.
GOLDFISCHER, S.; ESSNER, E.; NOVIKOFF, A.B. The localization of phosphatase activities at the level of ultrastructure. J. Histochem. Cytochem. v.12, p.72-95, Feb, 1964.
HARRIS, D.M. Biomolecular mechanisms of biostimulation. J. Clin. Laser Med. Sug. v.9, n.4, p.277-279, Aug, 1991.
44
HELLERBRAND, C.; STEFANOVIC, B.; GIORDANO, F.; BUCHARDT, E.R.; BRENNER, D.A. The role of TGF beta.1 in initiating hepatic stellate cell activation in vivo. J Hepatol. v.30, p.77-87, 1999.
HOLECEK, M.; SKOPEC, F.; SPRONGL, L. Protein metabolism in cirrhotic rats: effect of dietary restriction. Ann. Nutr. Metab. n.39, v.6, p.346-354, 1995.
HUGON J.; BORGERS M. A direct lead method for the electron microscopic visualization of alkaline phosphatase activity. J. Histochem. Cytochem. v.14, n.5, p.429-431, May, 1966.
HULSTAERT C.E.; TORRINGA J.L.; KOUDSTAAL J.; HARDONK M.J.; MOLENAAR J. The characteristic distribution of alkaline phosphatase in the full-term human placenta. An electron cytochemical study. Gynecol. Invest. v.4, n.1, p.23-30, 1973.
IAKIMENKO, I.L.; TSARENKO, T.M.; SIDORIK, E.P. Modulating effect of helium-neon laser radiation on the state of antioxidant and hydroxylation systems of quail liver under X-ray irradiation and chemical intoxication. Ukr. Biokhim. Zh. n.76, v.5, p.115-122, Sep-Oct, 2004.
JIMENEZ W.; CLÀRIA J.; ARROYO V.; RODÉS J. Carbon tetrachloride induced cirrhosis in rats: an useful tool for investigating the patogenesis in chronic liver disease. J. Gastroenterol. Hepatol. v.7, p.90-97, 1992.
JOHNSON, S.J.; HINES, J.E.; BURT, A.D. Macrophage and perisinusoidal cell kinetics in acute liver injury. J Pathol. v.166, p.351-358, 1992.
KAPLAN M.M. Alkaline phosphatase. N. Engl. J. Med. v.286, v.4, p.200-202, 27 Jan, 1972.
KAO, M.J.; SHEEN, L.Y. Effects of infrared and low-power laser irradiation on cell viability, glutathione and glutathione-related enzyme activities in primary rat hepatocytes. J. Formos Med. Assoc. v.102, n.7, p.486-491, Jul, 2003.
KHADRA, M. The effect of low level laser irradiation o implant-tissue interaction. In vivo and in vitro studies. Swed. Dent. J. Suppl. v.172, p.1-63, 2005.
LASKIN, D.L. Nonparenchymal cells and hepatotoxicity. Semin. Liver Dis. v.10, p.293-304, 1990.
45
LIMA, A.A.L.A.; MELO, C.A.S.; BRASIL, I.R.C.; RAMALHO, L.N.Z.; ZUCOLOTO, S.; BAGNATO, V.S.; SILVA JÚNIOR, O.C. Efeitos do Laser sobre a Cirrose Hepática. Act. Cir. Bras. v.2, supl.15, 2000.
LIMA, A.A.L.A.; RAMALHO, L.N.Z.; ZUCOLOTO, S.; BAGNATO, V.S.; SILVA JÚNIOR, O.C. Estudo do potencial de membrana mitocondrial em ratos cirróticos hepatectomizados após aplicação de laser. Acta Cir. Bras. v.16 supl.1, 2001.
LIMA, V.C.W.; MELLO, P.A.A.; PRATA-JUNIOR, J.A. Ciclofotocoagulação com laser diodo em glaucoma refratário, resultado a longo prazo. Arq. Bras. Oftalmol. v.66, p.449-452, 2003.
LOPEZ-NOVOA J.M.; NAVARRO V.; RODICIO J.L.; HERNANDO L. Cirrhosis experimental de instauración rápida. Cronologia de aparición de las lesiones hepáticas. Patologia. v.9, p.233-240, 1976.
LOUIS H.; VAN LAETHEM J.L.; WU W.; QUERTINMONT E.; DEGRAEF C.; VAN DEN BERG K.; DEMOLS A.; GOLDMAN M.; LE MOINE O.; GEERTS A.; DEVIERE J. Interleukin-10 controls neutrophilic infiltration, hepatic proliferation, and liver fibrosis induced by carbon tetrachloride in mice. Hepatology. v.28, n.6, p.1607-1615, 1998.
MARIANI, A.J. Combined electrohydraulic and holmium:yag laser ureteroscopic nephrolithotripsy for 20 to 40 mm renal calculi. J. Urol. v.172, n.1, p.170-174, 2004.
MATERA J.M.; TATARUNAS, A.C.; OLIVEIRA, S. M. Uso do laser arseneto de gálio (904nm) após excisão artroplástica da cabeça do fêmur em cães. Acta Cir. Bras. v.18, n.2, p.102-105, 2003.
McLEAN E.K.; MCLEAN A.E.M.; SUTTON P.M. An improved method for producing cirrhosis of the liver in rats by simultaneous administration of carbon tetrachloride and phenobarbitone. Br. J. Exp. Path. v.5, p.502-506, 1969.
MELO G.B.; SILVA R.L.; MELO V.A. et al. Enhancement of Liver Regeneration by the Association of Hyptis pectinata with Laser Therapy. Digestive Diseases and Sciences. v.50, n.5, p.949–954, May, 2005.
MOSS D.W. Multiple forms of acid and alkaline phosphatases: genetics, expression and tissue-specific modification. Clin. Chim. Acta. v.161, n.2, p.123-35, 15 Dec, 1986.
46
MOSS, D.W. Physiochemical and pathophysiological factors in the release of membrane-bound alkaline phosphatase from cells. Clin. Chim. Acta. v.257, n.1, p.133-140, 1997.
NG, G.Y.; FUNG, D.T.; LEUNG, M.C.; GUO, X. Comparison of single and multiple applications of GaAlAs laser on rat medial collateral ligament repair. Lasers Surg. Med. v.34, n.3, p.285-289, 2004.
OHTA, Y.; SAHASHI, D.; SASAKI, E.; ISHIGURO, I. Alleviation of carbon tetrachloride-induced chronic liver injury and related dysfunction by L-tryptophan in rats. Ann. Clin. Biochem. n.36, v.(Pt 4), p.504-510, Jul, 1999.
PERES W.; TUÑION M.J.; HERMANN S.; MARRONI N.; GALLEGO J.G. The flavanoid quercetin ameliorates liver damage in rats with biliary obstruction. J. Hepatol. v.33, p.742- 750, 2000.
PINHEIRO, A.L.B.; CAVALCANTI, E.T.; PINHEIRO, T.; ALVES, M.; MIRANDA, E.; DE QUEVEDO, A.; MANZI, C.; VIEIRA, A.; ROLIN, A. Low level laser therapy is an important tool to treat disorders of the maxillofacial region. J. Clin. Laser Med and Surg. v.16, n.4, p.223-226, 1998.
POSTEN, W.; WRONE, D.A.; DOVER, J.S.; ARNDT, K.A.; SILAPUNT, S.; ALAM, M. Low-level laser therapy for wound healing: mechanism and efficacy. Dermatol Surg. v.31, n.3, p.334-340, Mar, 2005.
ROSALKI S.B. Gamma-glutamyl transpeptidase. Adv. Clin. Chem. v.17, p.53-107, 1975.
ROSS M.H.; ELY J.O.; ARCHER J.G. Alkaline phosphatase activity and pH optima. J. Biol. Chem. v.192, n.2, p.561-568, 1951.
SANTANA-BLANK LA, RODRIGUEZ-SANTANA E, SANTANA-RODRIGUEZ KE. Photo-infrared pulsed bio-modulation (PIPBM): a novel mechanism for the enhancement of physiologically reparative responses. Photomed Laser Surg. v.23, n.4, p.416-424, Aug, 2005.
SCHLAEGER, R.; HAUX, D.; KATTERMANN, R. Studies on the mechanism of the increase in serum alkaline phosphatase activity in cholestasis: significance of the hepatic bile acid concentration for the leakage of alkaline phosphatase from rat liver. Enzyme. v.28, n.1, p.3-13, 1982.
47
SECTO, R.K.; FENN, B.; ROCHEY, D.C. Ischemic hepatitis: clinical presentation and pathogenesis. Am. J. Med. v.109, n.2, p.109-113, 2000.
SENTIES-GOMEZ MD, GALVEZ-GASTELUM FJ, MEZA-GARCIA E, ARMENDARIZ-BORUNDA J. Hepatic fibrosis: role of matrix metalloproteases and TGFbeta. Gac Med Mex. v.141, n.4, p.315-322, Jul-Aug, 2005.
SINGER, A.J.; CARRACIO, T.R.; MOFENSON, H.C. The temporal profile of increased transaminase levels in patients with acetaminophen-induced liver dysfunction. Ann. Emerg. Med. v.26, n.1, p.49-53, 1995.
TAM, G. Low power laser therapy and analgesic action. J. Clin. Laser Med. Surg. v.17, n.1, p.29-33, Feb, 1999.
TOLEDO C.; SALMERÓN J.M.; RIMOLA A.; NAVASA M.; ARROYO V.; LLANCH J.; GINÉS A.; GINÉS P.; RODÉS J. Spontaneous bacterial peritonitis in cirrhosis: predictive factors of infection resolution and survival in patients treated with cefotaxime. Hepatology. v.17, p.251-257, 1993.
TUTOR-CRESPO M.J.; HERMIDA J.; TUTOR, J.C. Activation of serum aminotransferases by pyridoxal-5' -phosphate in epileptic patients treated with anticonvulsant drugs. Clin. Biochem. v.37, n.8, p.714-717, Aug, 2004.
ZHENG, W.D.; ZHANG, L,J.;, SHI, M.N.; CHEN, Z.X.; CHEN, Y.X.; HUANG, Y.H.; WANG, X.Z. Expression of matrix metalloproteinase-2 and tissue inhibitor of metalloproteinase-1 in hepatic stellate cells during rat hepatic fibrosis and its intervention by IL-10. World J Gastroenterol. v.11, n.12, p.1753-1758, 2005.
ZIMA T, KALOUSOVÁ, M. Oxidative stress and signal transduction pathways in alcoholic liver disease. Alcoholism: clinical and experimental research. v.9, n.11(suppl), p.110S-115S, Nov, 2005.
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CERTIFICADO
Certificamos que o Protocolo n.' L044l2004lCEP, intitúado "Ação
hepatoprotetord do laser de baixa polência sohre a cirrose hepáticcr induzida
por tetracloreto de carbeno!, sob a responsabilidade do Prof. Dr' WellingÍon
Ribeiro, está de acordo com os Princípios Éticos na Experimentação Animal
(COBEA/Junho de 1991) e segue as Normas Para a Prática Diútico-Científica
da Vivissecção de Animais (Lei 6638 de 08/0511979) sendo, portanto, aprovado
por esla Comissâo de Etica em Pesquisa.
Sào Jose dos Campos- 03 de junio de 2004.
PROF. DR LANDULFO SILI'EIRA JUNIORPresideíte do Comitê de Ética em Pesquisa da UN1VAP
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