-
AKTIVITAS EKSTRAK LEMON (Citrus limon) TERHADAPKUANTITAS CD68,
TNFα DAN IL-1 PADA MENCIT BETINA
(Mus musculus) MODEL KANKER PAYUDARA
SKRIPSI
olehCHALISSA NURUZZULFA
135090107111003
JURUSAN BIOLOGIFAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS BRAWIJAYAMALANG
2017
-
AKTIVITAS EKSTRAK LEMON (Citrus limon) TERHADAPKUANTITAS CD68,
TNFα DAN IL-1 PADA MENCIT BETINA
(Mus musculus) MODEL KANKER PAYUDARA
SKRIPSI
Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelarSarjana Sains
dalam Bidang Biologi
olehCHALISSA NURUZZULFA
135090107111003
JURUSAN BIOLOGIFAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS BRAWIJAYAMALANG
2017
-
HALAMAN PENGESAHAN SKRIPSI
AKTIVITAS EKSTRAK LEMON (Citrus limon) TERHADAPKUANTITAS CD68,
TNFα DAN IL-1 PADA MENCIT BETINA
(Mus musculus) MODEL KANKER PAYUDARA
CHALISSA NURUZZULFA135090107111003
Telah dipertahankan di depan Majelis Pengujipada tanggal 17 Juli
2017
dan dinyatakan memenuhi syarat untuk memperoleh gelarSarjana
Sains dalam Bidang Biologi
MenyetujuiPembimbing
Prof. Muhaimin Rifa’i, PhD.Med.Sc.NIP. 196806261997021001
MengetahuiKetua Program Studi S1 Biologi
Fakultas MIPA Universitas Brawijaya
Rodiyati Azrianingsih, S.Si., M.Sc., Ph.DNIP.
197001281994122001
-
iii
HALAMAN PERNYATAAN
Saya yang bertanda tangan di bawah ini:Nama : Chalissa
NuruzzulfaNIM : 135090107111003Jurusan : BiologiPenulis Skripsi
berjudul : Aktivitas Ekstrak Lemon (Citrus limon)
terhadap Kuantitas CD68, TNFα dan Il-1 PadaMencit Betina (Mus
musculus) Model KankerPayudara
Dengan ini menyatakan bahwa:1. Skripsi ini adalah benar-benar
karya sendiri dan bukan hasil
plagiat dari karya orang lain. Karya-karya yang tercantum
dalamDaftar Pustaka Skripsi ini semata-mata digunakan sebagai
acuanatau referensi.
2. Apabila kemudian hari diketahui bahwa isi Skripsi
sayamerupakan hasil plagiat, maka saya bersedia menanggung
segalaresiko.
Demikian pernyataan ini dibuat dengan segala kesadaran.
Malang, 31 Juli 2017Yang menyatakan,
Chalissa Nuruzzulfa135090107111003
-
iv
PEDOMAN PENGGUNAAN SKRIPSI
Skripsi ini tidak dipublikasikan namun terbuka untuk umum
denganketentuan bahwa hak cipta ada pada penulis. Daftar
Pustakadiperkenankan untuk dicatat, tetapi pengutipan hanya dapat
dilakukanseizin penulis dan harus disertai kebiasaan ilmiah untuk
menyebutkannya.
-
v
Aktivitas Ekstrak Lemon (Citrus limon) terhadap Kuantitas
CD68,TNFα dan IL-1 pada Mencit Betina (Mus musculus) Model
Kanker
Payudara
Chalissa Nuruzzulfa, Muhaimin Rifa’iJurusan Biologi, FMIPA,
Universitas Brawijaya, Malang
2017
ABSTRAK
Kanker payudara merupakan sel yang tumbuh abnormal dan
merusakjaringan normal payudara. Kanker payudara berasosiasi dengan
growthfactor kinase dan mengaktivasi faktor transkripsi NF-κB,
yangbertanggung jawab terhadap beberapa pathway dalam
mensekresikansitokin proinflamasi TNFα dan IL-1. Peningkatan tumor
menyebabkanjumlah TAM (tumor-associated macrophages) semakin banyak
dan halini berasosiasi dengan prognosis buruk kanker payudara.
Marker yangdigunakan pada TAM ialah CD68. Penelitian ini bertujuan
untukmengetahui pengaruh ekstrak buah Citrus limon terhadap
kuantitasmakrofag dan sitokin proinflamasi (TNFα dan IL-1),
penelitian inidilakukan dengan enam perlakuan yaitu normal (N),
kontrol negatifdengan induksi DMBA (D) dosis 0,015 mg/kg BB mencit,
pemberianekstrak lemon dengan dosis 50 mg/kg BB (DL50) dan 200 mg/g
BB.Induksi kanker payudara menggunakan DMBA
(7,12Dimethylbenz[a]antracene) dilakukan selama enam minggu. Sample
yangberasal dari spleen diwarnai dengan antibodi intraseluler
danekstraseluler, serta dianalisis dengan flow cytometry. Analisis
datamenggunakan analis statistik ANOVA dan dilanjutkan dengan uji
Tukeypada signifikansi 5 % dengan program SPSS 16.0 for windows.
Hasilmenunjukkan bahwa ekstrak lemon DL200 mampu menurunkan
molekulmakrofag (TAM) dan sitokin proinflamasi (TNFα dan IL-1)
melaluiaktivitas NF-κB secara signifikan. Ekstrak lemon memiliki
kandunganflavonoid, terutama hesperidin yang mampu menginhibisi
aktivitas NF-κB.
Kata Kunci : DMBA, kanker payudara, lemon, makrofag,
sitokinproinflamasi
-
vi
Aktivitas Ekstrak Lemon (Citrus limon) terhadap Kuantitas
CD68,TNFα dan IL-1 pada Mencit Betina (Mus musculus) Model
Kanker
Payudara
Chalissa Nuruzzulfa, Muhaimin Rifa’iJurusan Biologi, FMIPA,
Universitas Brawijaya, Malang
2017
ABSTRACT
Breast cancer is a abnormal cell and damaged normal system of
thebreast. Breast cancer associated with growth factor which can
activateNF-κB, is a transcription factor that activate signalling
pathway ofproinflamatory cytokine TNFα and IL-1. Increased tumor
causes thenumber of TAM (tumor-associated macrophages) increase and
associatedwith poor prognosis. The marker used on TAM is CD68. The
aim of thisresearch is to know the effect of lemon extract on the
quantity ofmacrophages and proinflammatory cytokines (TNFα and
IL-1). Thisresearch was conducted with six normal treatment (N),
negative controlwith DMBA induction (D) with doses 0,015 mg/kg of
weight, lemonextract at 50 mg/kg of weight (DL50) and 200 mg/kg of
weight. Theinduction of breast cancer using DMBA (7.12 Dimethylbenz
[a]antracene) was performed for six weeks. The Samples from spleen
withintracellular and extracellular antibodies and analyzed by flow
cytometry.Data analysis used ANOVA analyzed by SPSS 16.0 for
windowsprogram. The results showed the extract of DL200 able to
decrease themacrophage (TAM) molecule and proinflammatory cytokines
(TNFα andIL-1) through NF-κB activity significantly. Lemon extract
has a flavonoidcontent, especially hesperidin which able to inhibit
NF-κB activity.
Key words: Breast cancer, DMBA, lemon, macrophage,
proinflammatorycytokines
-
vii
KATA PENGANTAR
Puji dan syukur penulis panjatkan kehadirat Allah SWT yang
telahmemberikan rahmat dan Karunia-Nya penulis dapat
menyelesaikanpenyusunan skripsi. Shalawat serta salam semoga tetap
tercurahkankepada Nabi Muhammad SAW dan kepada umatnya hingga akhir
zaman.Penulisan skripsi yang berjudul “Aktivitas Ekstrak Lemon
(Citrus limon)terhadap Kuantitas CD68, TNFα dan Il-1 Pada Mencit
Betina (Musmusculus) Model Kanker Payudara” diajukan untuk memenuhi
salahsyarat untuk memenuhi salah satu syarat dalam memperoleh gelar
SarjanaSains di Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Malang,
UniversitasBrawijaya.
Penyususnan skripsi ini tidak terlepas dari bantuan, bimbingan
dandukungan dari berbagai pihak. Oleh karena itu, dengan segala
kerendahanhati penulis menyampaikan ucapan terimakasih kepada :1.
Prof. Muhaimin Rifa’i S.Si., Ph.D., Med.Sc selaku Dosen
Pembimbing Skripsi, atas bimbingan, dedikasi serta motivasi
kepadapenulis.
2. Drs. Aris Soewondo dan Dr. Sri Widyarti, M.Si selaku
DosenPenguji I dan II.
3. Bapak Ir. Iskandar dan Ibu Evie Sulistyowati, M. Chalif
Nurfaizi,Chafisa Nurfaidza, serta keluarga besar penulis, atas doa,
dukungan,dan semangat kepada penulis sehingga skripsi ini dapat
terselesaikan.
4. Teman-teman terbaik selama kuliah Dea Esaayu M., Ramdhani F.
I.N., Anggita R. I., Restu U. S., Nihayatul L., Melati F.,
LaksmanaCipardhya K. P. S.T, Adelian V. Amd, serta seluruh
temanseperjuangan Biologi angkatan 2013, atas kerjasama dan
dukunganselama perkuliahan
5. Tim Lemon M. Sultonun A., Vetti A., dan Astrid K., serta
kakak-kakak dan rekan satu laboratorium Fisiologi Hewan, atas
kerjasamadan batuan selama penelitian.Semoga Allah SWT memberikan
balasan kepada semuanya. Penulis
menyadari bahwa penulisan skripsi ini masih jauh dari kata
sempurna.Oleh karena itu, Penulis sangat menghargai adanya saran
dan kritik yangmembangun demi penyempurnaan skripsi ini.
Malang, 31 Juli 2017
Penulis
-
viii
DAFTAR ISI
HalamanABSTRAK
.........................................................................................
vABSTRACT
.......................................................................................
viKATA PENGANTAR
.......................................................................
viiDAFTAR ISI
......................................................................................
viiiDAFTAR TABEL
.............................................................................
xDAFTAR GAMBAR
.........................................................................
xiiDAFTAR LAMPIRAN
.....................................................................
xiiiDAFTAR LAMBANG DAN SINGKATAN
................................... xiv
BAB I PENDAHULUAN
..................................................................
11.1 Latar Belakang
..................................................................
11.2 Rumusan Masalah
............................................................. 21.3
Tujuan Penelitian
.............................................................. 21.4
Manfaat Penelitian
............................................................ 2
BAB II TINJAUAN PUSTAKA
....................................................... 32.1 Kanker
Payudara terhadap Imunitas ................................ 32.2
Pengaruh Zat Karsinogenik terhadap Mencit ................... 42.3
Lemon (Citrus limon)
....................................................... 62.4
Makrofag...........................................................................
92.5 Sitokin
..............................................................................
102.6 Histopatologi Kanker Payudara Akibat DMBA ...............
122.7 Flow
Cytometry.................................................................
14
BAB III METODE PENELITIAN
.................................................. 173.1 Waktu dan
Tempat ............................................................
173.2 Deskripsi Hewan coba
..................................................... 173.3
Deskripsi Perlakuan dan Rancangan Penelitian ............... 173.4
Injeksi DMBA dan Lemon
............................................... 183.5 Penetuan
Histopatologi Payudara .................................... 183.6
Isolasi Sel Limfosit
.......................................................... 193.7
Immunostainning antibodi Ekstraseluler dan Intraseluler.. 193.8
Analisa Statistik
...............................................................
203.9 Kerangka Operasional
...................................................... 21
-
ix
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN
........................................... 224.1 Histopatologi
Payudara..........................................................
224.2 Analisis Rata-Rata Jumlah Relatif Sel CD68
........................ 234.3 Analisis Rata-Rata Jumlah Relatif
Sel CD68+TNFα+ ........... 264.4 Analisis Rata-Rata Jumlah Relatif
Sel CD68+IL-1+ .............. 284.5 Hubungan antara ROS dan senyawa
Ekstrak Lemon ............ 30
BAB V KESIMPULAN DAN SARAN
............................................ 335.1 Kesimpulan
............................................................................
335.2 Saran
......................................................................................
33
DAFTAR PUSTAKA
.........................................................................
34
LAMPIRAN........................................................................................
39
-
x
DAFTAR TABEL
Nomor Halaman1 Komposisi flavonoid C. Limon (1 mg/100 mL)
..................... 8
2 Kelompok perlakuan penelitian
...................................... ....... 18
LT3.1Konversi dosis hewan ke manusia berdasaran
luaspermukaan...............................................................................
39
LT4.1 Hasil uji normalitas jumlah relatif sel CD68 pada
masing-masing perlakuan......................................
.............................. 41
LT4.2Hasil uji normalitas jumlah relatif sel CD68 pada
masing-masing perlakuan......................................
.............................. 41
LT4.3 Hasil uji ANOVA jumlah relatif sel CD68 pada masing-masing
perlakuan......................................
.............................. 41
LT4.4Hasil uji Tukey HSD pada jumlah relatif sel CD68
padamasing-masing perlakuan......................................
................. 41
LT5.1Hasil uji normalitas jumlah relatif sel
CD68+TNFα+padamasing-masing
perlakuan...................................... .................
42
LT5.2Hasil uji homogenitas jumlah relatif sel CD68+TNFα+pada
masing-masing
perlakuan............................................... 42
LT5.3 Hasil uji ANOVA jumlah relatif sel CD68+TNFα+
padamasing-masing perlakuan......................................
................. 42
LT5.4Hasil uji TUKEY HSD pada Jumlah Relatif SelCD68+TNFα+ pada
masing-masingperlakuan.................................................................................
42
LT6.1Hasil uji normalitas jumlah relatif sel CD68+IL-1+
padamasing-masing perlakuan......................................
................. 43
LT6.2 Hasil uji homogenitas jumlah relatif sel CD68+IL-1+
padamasing-masing perlakuan......................................
................. 43
-
xi
LT6.3 Hasil uji ANOVA jumlah relatif sel CD68+ IL-1+
padamasing-masing perlakuan......................................
................. 43
LT6.4 Hasil uji TUKEY HSD pada Jumlah relatif sel CD68+IL-1+
pada masing-masing perlakuan......................................
... 43
-
xii
DAFTAR GAMBAR
Nomor Halaman1 Subset Sel T pada Kanker Payudara
...................................... 3
2 Metabolisme DMBA Memicu Formasi DNA Adducts ......... 5
3 Skematik Inflamasi dan Peran Inflamasi dalam
Tumorigenesis
.......................................................................
6
4 Citrus limon
...........................................................................
7
5 Peran Sitokin dalam Beberapa Tahapan Kanker Payudara ...
12
6 Karakterisasi Histopatologi Kanker Payudara Induksi
DMBA
...................................................................................
14
7 Prinsip Flowsitometri
.............................................................
15
8 Kerangka Operasional Penelitian
......................................... 21
9 Histopatologi Karsinoma Payudara
....................................... 22
10 Hasil analisis flow cytometry
CD68........................................ 24
11 Rata-rata jumlah relatif sel CD68+IL-1+
................................. 24
12 Hasil analisis flow cytometry CD68+TNFα+
........................... 27
13 Rata-rata jumlah relatif sel
CD68+TNFα+............................... 28
14 Hasil analisis flow cytometry
CD68+IL-1+.............................. 29
15 Rata-rata jumlah relatif sel CD68+IL-1+
................................. 30
LG16 Rata-rata jumlah relatif sel CD68+IL-1+
................................. 30
-
xiii
DAFTAR LAMPIRAN
NomorHalaman
1 Konversi dosis DMBA dari tikus ke
mencit........................... 39
2 Perhitungan dosis
DMBA....................................................... 39
3 Perhitungan dosis ektrak lemon
............................................. 40
4 Penentuan volume larutan ekstrak lemon
............................... 40
5 Hasil analisis ragam ANOVA dan uji lanjutan Tukey HSDterhadap
jumlah relatif sel CD68 dengan menggunakansoftware SPSS versi 16
for windows...................................... 41
6 Hasil analisis ragam ANOVA dan uji lanjutan Tukey HSDterhadap
jumlah relatif Sel CD68+TNFα+ denganmenggunakan software SPSS versi
16 for windows .............. 42
7 Hasil analisis ragam ANOVA dan uji lanjutan Tukey HSDterhadap
Jumlah Relatif Sel CD68+IL-1+ denganmenggunakan software SPSS versi
16 for windows .............. 43
8 Data akumulasi berat badan mencit selama 8 minggu............
44
9 Keterangan laik etik penelitian.....
.......................................... 45
-
xiv
DAFTAR LAMBANG DAN SINGKATAN
Simbol/Singkatan KeteranganAhR Aryl hydrocarbon ReceptorANOVA
Analysis of VarianceCD Cluster of DifferentiationCdks Cyclin
Dependent KinaseCOX CyclooxygenaseCTLs Cytotoxic T cellDCIS Ductal
Carcinoma in situDMBA 7,12 Dimethylbenz[a]anthraceneDNA
Deoxyribonucleic AcidER Estrogen ReceptorsFITC Fluorescein
IsothiocyanateFOXP3 Forkhead Box P3HE Hematoxylin/eosinHER2 human
epidermal growth factor 2HPLC High-performance liquid
chromatographyIDC Ductal CarcinomaIFN InterferonIL
InterleukinILC Invasive Lobular CarcinomaINOS Nitric oxide synthase
IIRF Interferon Regulatory FactorLAMP Lysosomal Associated
MembraneProteinLCIS Lobular Carcinoma in situLPS
LipopolisakaridaMAPK Mitogen-activated protein kinasemIRNA Micro
Ribonucleic AcidMMP Matrix MetalloproteinaseMyc Myelocytomatosis
oncogeneNF-κB Nuclear Factor Kappa-Light-Chain-
Enhancer of Activated B CellsOxLDL Oxidized Low-density
LipoproteinPAH Polycyclic Aromatic HydrocarbonsPBS
Phosphate-buffered SalinePDGF Platelet-derived growth factorPPARγ
Peroxisome proliferator-activated
-
xv
receptor gammaRb Retinoblastoma ProteinRNA Ribonucleic acidROS
Reactive Oxygen SpeciesTACE TNFα Converting EnzymeTAM
Tumor-Associated MacrophagesTGFβ Transforming growth factor
betaTNFα Tumor necrosis factor alphaVEGF Vascular Endhothelial
Growth Factor
Simbol/Singkatan Keteranganα alphaγ gammaβ beta
-
1
BAB IPENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Kanker payudara adalah keganasan sel pada payudara.
Insidenkanker payudara yang paling sering terjadi pada pada wanita,
baik dinegara maju maupun berkembang (Romadhon, 2013). Pada tahun
2014,WHO mendata kejadian kanker payudara di Indonesia mencapai
50.000,dengan angka kematian sebanyak 20.000 jiwa (WHO, 2014).
Paparan DMBA memicu aktivitasi metabolit untuk
memproduksisenyawa karsinogen berupa dihydrodiol epoksida, yang
memicukerusakan DNA, pembentukan ROS dan bertindak sebagai
perantaraproses inflamasi kronik (Manoharan dkk., 2009). Proses
tersebutmemicu pembentukan dan akumulasi sitokin, kemokin, radikal
bebasdan growth factor. Hal ini menginduksi pembentukan tumor
termasukkerusakan DNA, modifikasi protein dan perbahan profil
ekspresi gen,serta ekspresi mIRNA spesifik (Hussain & Harris,
2007).
Perkembangan tahap kanker payudara dipengaruhi oleh
sitokin.Perbedaan sitokin berperan dalam pembentukan, perkembangan
danmetastasis kanker payudara. Paparan sitokin yang terlalu tinggi
terhadapsel normal dapat memicu adanya fenotip neoplastik.
Aktivitas sitokinproinflamasi seperti IL-6, IL-1 dan TNFα
menyebabkan aktivasi NF-κBdan peningkatan dalam cyclin D1 pada sel
payudara normal, sehinggamenghasilkan jaringan neoplastik (Velaquez
dkk., 2015). Prognosiskanker payudara yang buruk berkoralasi dengan
CD68, yang merupakanmarker yang digunakan pada TAM
(tumor-associated macrophages).TAM meningkatkan perkembangan tumor
dengan invasi tumor, migrasidan angiogenesis (Medrek dkk.,
2012).
Indonesia memiliki keanekaragaman tumbuhan yang memilikipotensi
sebagai tanaman herbal. Salah satu tanaman herbal yang
dapatdimanfaatkan sebagai obat alternatif di masa mendatang ialah
lemon(Citrus limon). Buah lemon mengandung komponen kimiawi
sepertisenyawa fenolik (terutama flavonoid), dan nutrisi (vitamin,
minyakesensial, dan karetenoid). Buah lemon kaya akan kandungan
flavonoidyang dapat berperan dalam mencegah penyakit seperti
obesitas,diabetes, penyakit cardiovaskular dan berbagai tipe kanker
(González-Molina dkk., 2010).
Pengembangan strategi baru dalam mengobati kanker
dipandangsangat perlu untuk dilakukan. Banyak mekanisme senyawa
antikanker
-
2
yang dapat menekan proliferasi sel-sel ganas dengan
menginduksiapoptosis, sehingga pendekatan mekanistik berguna
untukkemoprevensi kanker dan kemoterapi. Namun, terdapat beberapa
efeksamping yang tidak menguntungkan dan adanya resistensi terhadap
agenantikanker yang digunakan. Oleh karena itu, mulai
dikembangkankhasiat dari bahan-bahan alami, salah satunya
menggunakan ekstrakbuah lemon. Buah Citrus memiliki efek
antiproliferatif pada berbagaitipe kanker (Alshatwi dkk.,
2011).
Flavonoid secara efektif menghambat mekanisme NF-κB
danmenghalangi stimulator inflamatori primer (LPS) dan sekunder
(TNFαand IL-1) melalui inhibisi aktivitas IκB kinase (Lin dkk.,
2008).Berdasarkan latar belakang tersebut penelitian ini penting
untukdilakukan, karena lemon mengandung senyawa yang berperan
dalammeningkatkan sistem imun. Penelitian terdahulu melihat efekasi
lemonterhadap kanker payudara secara in vitro. Namun belum ada
penelitiansecara in vivo
1.2 Rumusan Masalah
Penelitian ini dilakukan karena adanya masalah, yaitu
bagaimanaaktivitas ekstrak lemon (Citrus limon) terhadap kuantitas
CD68 dansitokin proinflamasi (TNFα dan IL-1) mencit betina (Mus
musculus)model kanker payudara injeksi DMBA
(7,12Dimethylbenz[a]antracene)?
1.3 Tujuan Penelitian
Tujuan dilakukan penelitian ini untuk mengetahui pengaruhekstrak
lemon terhadap kuantitas CD68 dan sitokin proinflamasi (TNFαdan
IL-1) mencit betina model kanker payudara injeksi DMBA
1.4 Manfaat Penelitian
Manfaat penelitian ini adalah memberikan bukti ilmiahmengenai
keefektifan penggunaan ekstrak buah lemon sebagai agenumtuk
meningkatkan imunitas terhadap kanker payudara, sehinggadapat
dijadikan sebagai alternatif obat di masa mendatang. Selain
itupenelitian ini dapat merangsang peneliti lain dalam
mengembangkanpotensi buah lemon dalam meningkatkan sistem imunitas
terhadapkanker payudara.
-
3
BAB IITINJAUAN PUSTAKA
2.1 Kanker Payudara terhadap Imunitas
Sistem imun innate dilibatkan pada respon awal terhadap
suatupenyakit. Sel tersebut akan melawan patogen dalam berbagai
cara, danmembatasi infeksi melalui beberapa proses, seperti
fagositosis. Sistemimun adaptif dibangun oleh sel T dan sel B, yang
mengekspresikanreseptor antigen spesifik yang telah dibentuk
melalui rekombinasi DNAsomatik terspesialisasi untuk suatu individu
antigen (Varn dkk., 2016).
(Varn dkk., 2016)
Gambar 1. Subset sel T pada kanker payudara
Subset sel T pada kanker payudara yang ditunjukkan pada Gambar1
dibagi menjadi tiga kategori, yaitu CTLs, sel T helper CD4+,
danimmunosuppresive CD4+, FOXP3+CD25+ sel Treg. Sel T
sitotoksikCD8+ terlibat dalam proses lisis sel tumor secara
langsung. Tingginyasel T CD8+ berkorelasi dengan prognosis yang
baik. sel T helper CD4+
-
4
mengalami diferensiasi menjadi sel Th1 yang dapat
meningkatkanaktivitas sel T sitotoksik CD8+ dan mengaktivasi
presentasi antigen padasel dendritik, sehingga meningkatkan
imunitas anti tumor. Namun, selTh2 melakukan hal yang berlawanan
dengan menekan fungsi seldendritik supaya memicu perkembangan
tumor, dan dapat menginhibisiaktivitas sel T CD8+. Aktivitas sel
Th2 dapat dicegah melalui inhibisi IL-13. Pada akhirnya CD4+,
FOXP3+CD25+ menekan fungsi sel Tsitotoksik sel CD8+, dan membantu
menghindari kekebalan terhadaptumor, selain itu dapat menekan
fungsi sel Th. Sel Treg pada jaringan insitu dan invasive karsinoma
duktal lebih tinggi daripada jaringannormal. Peningkatan sel Treg
berkaitan dengan faktor prognosis negatif,yang meliputi ER negatif,
tingginya stadium tumor, dan adanyametastasis (Varn dkk.,
2016).
2.2 Pengaruh Zat Karsinogenik terhadap Mencit
Peningkatan usia, faktor reproduksi, densitas mammorgrafik,
faktorgenetik, dan riwayat keluarga menjadi faktor resiko kanker
payudara.Banyak faktor yang terlibat dalam resiko penyakit kanker
payudara,yaitu paparan bahan kimia (karsinogenik), bahan penambah
padamakanan (penyedap, perasa dan pewarna), western diet dan
infeksi daribakteri dan virus (Thompson ., 2014).
Polycyclic Aromatic Hydrocarbons (PAH) merupakan salah
satukelompok utama pada karsinogen. Zat karsinogen terlibat
dalamtumorigenesis dalam payudara.
DMBA(7,12dimethylbenz[a]anthracene) merupakan prototipe PAH
yangdigunakan untuk menjadikan objek penelitian tumor. Tumor
payudaradapat disimulasikan pada hewan rodentia dengan paparan
DMBAsehingga memicu regulasi Aryl hydrocarbon Receptor (AhR)
yangmerupakan reseptor sitosolik seluler untuk DMBA (Currier dkk.,
2005).
-
5
(Morrissaeau & Hammock, 2008)
Gambar 2. Metabolisme DMBA memicu formasi DNA adducts
Aktivasi ligan menyebabkan AhR berpindah ke dalam nukleus
danberasosiasi dengan kofaktor ARNT, sehingga inti AhR
mengalamipemindahan protein. Kompleks AhR/ARNT yang teraktivasi
berikatanterhadap DNA spesifik pada upstream gen responsif AhR
danmenginduksi transkripsi gen. Tahap awal tumorigenesis diikuti
denganadanya reaksi DMBA dengan sitokrom enzim P-450, yang
melakukanmetabolisme DMBA menjadi mutagenik (dihydrodiol epoxide)
sehinggasegera membentuk DNA adduct karena adanya ikatan kovalen
denganDNA sel yang aktif. Adisi diasosiasikan dengan mutasi DNA
dantransformasi malignan merupakan proses yang terlibat dalam
PAHsebagai mediator karsinogenesis (Currier dkk., 2005).
Perubahan epigenetik dalam ekspresi onkogen dan sinyaltransduksi
berperan penting dalam proses tumorogenesis. TranskripRNA untuk
Cyclin D1 dan c-myc merupakan onkogen penting dalamkanker payudara.
Perlakuan DMBA pada regulator upstream c-myc dancyclin D1
melibatkan jalur sinyal transduksi NF-κB dan Wnt. Cyclin
D1mendorong pertumbuhan sel dengan mengaktifkan cyclin
dependentkinase (Cdks) 4 dan 6, yang memfosforilasi retinoblastoma
protein (Rb)(Currier dkk., 2005).
-
6
(Anggarwal dkk., 2006)
Gambar 3. Skematik Inflamasi dan peran inflamasi dalam
tumorigenesis
Zat mutagenik DMBA menyebabkan stress jaringan sehinggamemicu
sitokin proinflamasi, kemokin, molekul adhesi dan enziminflamasi
untuk membentuk inflamasi kronik. Inflamasi kronikbertindak dalam
berbagai penyakit, salah satunya kanker. Inflamasikronik berkaitan
dengan berbagai tahap yang terlibat dalamtumorigenesis, yang
meliputi transformasi seluler, proliferasi, invasi,angiogenesis dan
metastasis (Anggarwal dkk., 2006).
2.3 Lemon (Citrus limon)
Citrus limon (Gambar 4) tergolong dalam Famili Rutaceae
danberasal dari asia. Lemon dapat tumbuh di seluruh dunia pada
ikilimtropis, semi-tropis, dan wilayah dengan suhu hangat.
Klasifikasi lemonialah sebagai berikut (Courteau, 2013):
Kingdom : PlantaeDivisi : MagnoliophytaKelas : MagnoliopsidaOrdo
: SapindalesFamili : RutaceaeGenus : CitrusSpesies : Citrus
limon
-
7
Buah Citrus memiliki kandungan vitamin C yang tinggi.
Citrusberperan sebagai neutraceuticals karena mengandung senyawa
bioaktifberupa flavonoid, limonoid, komarin, asam fenolik dan
vitamin. Hal inimenyebabkan komponen citrus sangat diapresiasi
dalam menjagakesehatan tubuh manusia dan aplikasi industri,
terutama dalam industrifarmasi, makanan dan kosmetik
(Ledesma-Escobar dkk., 2016).
(Floratoskana, 2017)
Gambar 4. Citrus limon
Limonoids dapat mengobati berbagai tipe kanker pada
manusiaseperti kanker usus, pankreas, payudara, lueukimia, hati
danneurablastoma. Selain itu, limnoids berguna untuk mencegah
penyakitserangan jantung dan inflamasi. adanya furan dan struktur
lengkapcincin A berkontribusi dalam pencegahan kanker dan aktivitas
antiimflamasi. Metabolit sekunder dapat mengobati berbagai tipe
kankerpada manusia seperti kanker usus, pankreas, payudara,
lueukimia, hatidan neurablastoma. Selain itu, limnoids berguna
untuk mencegahpenyakit serangan jantung dan inflamasi. adanya furan
dan strukturlengkap cincin A berkontribusi dalam pencegahan kanker
dan aktivitasantiimflamasi (Kim dkk., 2013).
Menurut González-Molina dkk. (2010) buah lemon memilikikomponen
bahan kimia alami yang dapat mendorong daya tahan tubuh.Buah lemon
banyak mengandung flavonoid yang berfungsi dalamkeseimbangan diet,
mencegah penyakit, seperti obesitas, diabetes,penyakit
kardiovaskular dan beberapa tipe kanker. Flavonoid
-
8
merupakan kelompok metabolit sekunder. Flavonoid tersusun atas
duacincin aromatik (A dan B), yang dihubungkan melalui cincin
pyroneatau hydropyrone (C), flavon atau flavanon. Kandungan
flavonoid padaCitrus ada dalam bentuk glikosida atau aglycone.
Flavonoid dalam juicemengandung derivat glicosil (flavonoid
glikosida, FGs). Bentukglikosida dari derivat di-glikosida dan
L-rhamnosyl D-glucosyl,diklasifikasikan menjadi dua tipe, yaitu
neohesperidoside danrutinoside, dihubungkan melalui ikatan α-1,2
atau α-1,6 interglikosidik.Flavonoid yang telah diidentifikasi
dalam Citrus sp. terbagi menjadi tigakelompok, yaitu flavanon,
flavon, dan flavonol. Flavonon merupakanasam lemah. Senyawa
flavonon mengandung hesperidin dan eriocitrin.Senyawa ini
terdistribusi di seluruh bagian lemon. Flavon dalam
Citrusmengandung chrysoeriol 6,8-di-glucoside, apingenin
7(malonylapiosyl)-glucoside dan diosmetin 8-C-d-glucoside.
Flovonolpada sari lemon mengandung rutin dan myrelcetin, quercetin
dankaempferol. Hal ini didukung oleh penelitian yang dilakukan
olehGattuso dkk. (2007) bahwa terdapat jumlah senyawa flavonon
yangcukup signifikan, yaitu hesperidin (20,5 mg/100 ml) dan
eriocitrin (16,7mg/100 ml). Beragam senyawa flavonoid yang
terkandung di dalam C.Limon ialtercantum pada Tabel 1.
Tabel 1. Komposisi flavonoid C. Limon (mg/100 mL)
(Gattuso dkk., 2007)
Kandungan flavonoid pada Citrus sangat amat dan obat non
toksik.Flavonoid berperan dalam modulator tirosin kinase hal ini
berimplikasidalam pengobatan kanker. Eriocitin dari buah Citrus
menginduksiapoptosis (melalui caspase-3) dalam sel HL-60. Selain
itu, hesperidinmenunjukkan aktivitas antiproliferasi. Penelitian
lain menunjukkanbahwan hesperedin dan diosmin efektif sebagai agen
chemopreventive
-
9
pada karsinogen kandung kemih. Lemon berpotensi dalam
aktivitasantiproliferasi HepG2 pada pertumbuhan sel kanker hati.
Eriocitrindapat berperan sebagai senyawa inhibitor melawan 5- dan
12-lipogenase yang terlibat dalam biosintesis berbagai bioregulator
yangerat kaitannya dengan patogenesis beberapa penyakit, misalnya
kanker.D-limone menunjukkan peran chemopreventive dalam uji
preklinikmodel karsinoma hepatoseluler. Peran D-limone melawan sel
kankerdengan menginduksi sitokrom sitokrom isoenzim P450. D-limone
jugamerupakan kandidat dalam chemoprevention kanker kulit,
meskipunmenyebabkan dermatitis, terutama ketika teroksidasi. Selain
itu, D-limone menunjukkan efek antiangiogenik, proapoptosis,
mencegahpertumbuhan tumor dan metastasis pada kanker lambung
(González-Molina dkk., 2010).
2.4 Makrofag
Makrofag merupakan derivat dari prekursor bone marrow
yangberkembang menjadi monosit, yang selanjutnya akan
berkembangmenjadi makrofag. Fungsi utama makrofag ialam untuk
mencernaantigen dari luar yang masuk ke dalam tubuh, termasuk
mikroba danantigen lain. Makrofag tidak hanya esensial terhadap
sistem imunitas,tetapi untuk perkembangan dan keseimbangan jaringan
(Duque &Descoteaux, 2014).
Makrofag yang berada di lingkungan tumor berkorelasi denganTAM,
yang diketahui bertanggung jawab terhadap pengeluaranbeberapa
faktor pertumbuhan, sitokin, kemokin, dan mediatorinflamatori.
VEGF, PDGF, dan IL-10 merupakan beberapa faktor yangterlibat dalam
pertumbuhan tumor, progresi tumor, dan metastasis.TAM merupakan
molekul yang berasal dari monosit. Aktivasi TAMberasal dari respon
terhadap sitokin prroinflamasi (TNFα, IFNγ, dan IL-12) dan
antiinflamasi (IL-4 dan IL-10), serta LPS
(Lipopolisakarida).Makrofag dibagi menjadi dua bentuk
terpolarisasi, yaitu M1 dan M2.Makrofag M1 berperan sebagai
aktivitas antitumor, sedangkan M2berperan dalam sekresi sitokin
antiinflamasi, meningkatkan invasi tumordan metastsis. Makrofag M1
diaktivasi oleh IFNγ, LPS dan TNFα.Fenotip makrofag M1
mensekresikan IL-1, TNFα dan IL-12. Sedangkanmakrofag M2
mensekresikan IL-10 dan menghambat APC, sertaproliferasi sel T.
Makrofag M2 dalam berbagai pertumbuhan sel tumordan meningkatkan
daya tahan tumor, serta berperan secara vital dalamproses
angiogenesis melalui VEGF (mediator angiogenesis) CD68
-
10
merupakan marker pan-makrofag yang digunakan sebagai marker
untukTAM. CD68 mengenali bentuk makrofag M1 sebagai tumoricidal
danM2 sebagai antiinflamasi. Molekul TAM merupakan bentuk
polarisasimakrofag tipe M2 (He dkk., 2014; Almatroodi dkk.,
2016).
CD68 merupakan protein transmembran terglikosilasi, terdiri
darisejumlah besar N-glikosilat prolin pada domain ekstraseluler
(271-a.a),domain transmembran (TM, 25-a.a), dan domain intraseluler
pendek (2-a.a). Transmembran tipe I diklasifikasikan sebagai
LysosomalAssociated Membrane Protein (LAMP), karena meskipun dapat
jugadideteksi pada membran plasma sel, lebih tinggi diekspresikan
dalamlisosom. Gen yang mengkode CD68 terdiri dari 6 ekson dengan
sebuahpromotor yang berkontribusi untuk spesifitas makrofag dengan
tempatpengikatan untuk Interferon Regulatory Factor (IRF), Elf-1,
Fli-1 danPU (McCoy, 2012).
CD68 berperan dalam berbagai proses seluler yaitu,
sebagaifagositosis, metabolisme lisosomal, interaksi patogen dengan
sel danlemahnya ikatan densitas lipoprotein. CD68 dapat ditemukan
padapermukaan sel dan mampu atau secara cepat internalisasi
untukdilibatkan sebagai reseptor scavenger pada oxLDL (McCoy,
2012).
Menurut Li dkk. (2015) tingginya jumlah CD68 berkorelasi
denganbesarnya ukuran tumor, tinggi stadium T (Tumor diameter), N
(Noduslymph), dan M (Metastasis) serta positif HER-2. Selain itu,
adanyaindikasi upregulation RAS dan makrofag CD68+ berkorelasi
denganangiogenesis. Angiogenesis merupakan pembentukan pembuluh
darahbaru dari endotelium pada pembuluh darah yang sudah ada. Hal
inimenyebabkan perkembangan metastasis, melalui sel malignan ke
dalamsirkulasi.
2.5 Sitokin
Pada tumor terdapat sel tumor, imun, stromal, dan inflamasi,
yangmengandung sitokin, growth factor, dan molekul adhesi. Sel-sel
tersebutmemicu pertumbuhan tumor dan metastasis. Interaksi antar
sel tersebutberperan penting dalam inflamasi dan proses pro
angiogenesis, sertamemicu proliferasi sel tumor (Lewis dkk.,
2006).
Sitokin meregulasi pertumbuhan, signalling, dan diferensiasi
selstromal dan tumor. Sitokin yang diproduksi oleh sel kanker
berfungsiuntuk menciptakan kondisi pertumbuhan optimal bagi
tumormicroenvironment, sedangkan sitokin yang dihasilkan oleh sel
stromalakan mempengaruhi sel ganas. Sitokin yang diinduksi oleh
hipoksia,
-
11
menandakan adanya pertumbuhan sel kanker, meliputi
Vascularendhothelial Growth Factor (VEGF), TNF, IL-1 dan IL-6
(Velaquezdkk., 2015).
TNF (merujuk pada TNFα) merupakan suatu protein yang terdiri157
asam amino dan disintesis sebagai suatu protein yang terikat
padamembra (pro TNF), yang dapat dilepas oleh TNFα Converting
Enzyme(TACE). TNFα berperan penting dalam aktivitas seluler,
sepertiproliferasi, survival, diferensiasi dan kematian sel. TNFα
berfungsidalam molekul proinflamasi dan disekresi oleh sel
inflamatori, yangterlibat dalam inflamasi, berasosiasi dengan
karsinogenesis (Wang &Lin, 2008). Hal ini didukung oleh
Velaquez dkk. (2015), ekspresi kronikTNFα pada kanker payudara akan
memicu pertumbuhan tumor, namunhasil ini akan berbeda jika
dilakukan secara in vitro dengan cell line.TNFα akan menginduksi
apoptosis, menghambat prolifersi,meningkatkan migrasi, invasi serta
resistensi terhadap chemotherapeuticdalam sel MCF-7.
TNFα memiliki peran therapeutic. Namun, ketika didisregulasi
dandisekresi di dalam sirkulasi, TNFα berperan dalam mediasi
berbagaipenyakit, termasuk kanker. TNFα menjadi mediator utama
prosesinflamasi dan menginduksi mediator inflamatori lain dan
protease yangmengatur respon inflamasi. TNFα diproduksi oleh tumor
dan berperansebagai promotor tumor endogen. TNFα mampu menginduksi
faktorangiogenesis dalam sel glioma malignan, sehingga
meningkatkanangiogenesis dan progresi tumor. Terdapat marker up
regulasi (RNAdan protein) TNFα, IL-8 dan VEGF dalam sel glioma
seelah pemberianstimulus dengan TNFα. TNFα dapat meningkatkan
invasivenessbeberapa karsinoma atau menstimulasi epitel dalam
menyembuhkanluka secara in vivo. TNFα dapat menjadi mediasi
makrofag dalammenginduksi angiogenesis. Aktivitas angiogenik
diproduksi olehperitonial murin makrofag yang teraktivasi
sepenuhnya dinetralisasioleh antibodi poloklonal terhadap TNFα
(Anggarwal dkk., 2006).
-
12
(Velaquez dkk., 2015)Gambar 5. Peran sitokin dalam beberapa
tahapan kanker payudara
Sitokin lain yang berperan dalam pementukan kanker ialah
IL-1,yang merupakan sitokin pleiotropik yang dapat menentukan
keadaanfisiologis dan patologis. Famili IL-1 terdiri dari tiga
protein, duadiantaranya merupakan agonis, IL-1α dan IL-1β, serta
yang ketigamerupakan antagonis, reseptor IL-1 (IL-1ra). IL-1α dan
IL-1β berbedadalam aktivitas dan sekresi. IL-1α terletak dalam
sitosol atau membransel, sedangkan IL-1β disekresi secara
ekstraselelur. Terdapat dua macamtipe reseptor IL-1 yaitu, IL-1
receptor type I (IL-1RI) dan IL-1 receptortype II (IL-1RII). IL-1RI
terekspresi pada seluruh tipe sel dan berikatandengan IL-1α, serta
bertanggung jawab terhadap sinyal transduksi IL-1.IL-1RII berperan
antagonis dan biasanya ditemukan dengan limfosit B,netrofil dan
monosit, serta berikatan dengan IL-1β.
2.6 Histopatologi Kanker Payudara Akibat DMBA
Kelenjar mamae membentuk struktur percabangan yang menjadilobus
dan terdiri dari dua komponen utama, yaitu Terminal Duct–Lobular
Unit (TDLU) dan Large Duct System. TDLU dibentuk olehlobus dan
duktus terminal. Bagian tersebut dihubungkan oleh
saluransubsegmental, yang kemudian akan menuju aluran segmental dan
kesaluran pengumpul (Laktiferus dan galaktoforus), serta akan
bermuarapada nipple (Rosai & Ackerman, 2011). Payudara tersusun
atas
-
13
epitelium dan stroma yang terspesialisasi yang dapat menimbulkan
lesijinak dan ganas pada organ (Kumar & Abbas, 2015).
Kanker payudara adalah keganasan sel pada payudara.
Karsinomapayudara dibagi menjadi dua yaitu karsinoma in situ dan
karsinomainvasif. Letaknya dapat dibedakan menjadi dua yaitu,
lobular danduktal. Kanker payudara tipe invasif dibagi menjadi dua
yaitu, InvasiveDuctal Carcinoma (IDC) dan Invasive Lobular
Carcinoma (ILC). Tipenoninvasive dibagi menjadi dua, yaitu Ductal
Carcinoma in situ (DCIS)dan Lobular Carcinoma in situ (LCIS). Tipe
DCIS akan muncul disekitar saluran payudara dan tidak masuk ke
dalam jaringan payudara,sedangkan tipe IDC muncul dalam saluran
susu payudara. Sel kankermerusak seluruh jalan melalui dinding
saluran menuju jaringan lemakpayudara dan diikuti oleh metastasis
pada tubuh bagian lain. Tipe IDCdibagi menjadi beberapa subtipe
yaitu karsinoma adenosistik,adenosquamos, medular, musinosum,
papilaris, mikropapilaris, tubular,dan metaplastik. Sel karsinoma
tipe LCIS tetap pada lobulus, sedangkanpada tipe ILC terjadi pada
kelenjar susu dan sel kanker melakukanmetastasis (Barh dkk.,
2014).
Variasi morfologi DCIS terdiri dari papillary,
comedocarcinoma,solid, micropapillary, dan cystic hypersecretory.
DCIS tipecomedocarcinoma dikarakterisasi dengan adanya sel
pleomorfik (besar)yang berasosiasi dengan nekrosis. Ukuran
comedocarcinoma relatifbesar dan menjadi jelas. Secara mikroskopik,
duktus menunjukanpertumbuhan pada pleomorfik sel tumor (besar) dan
disertai denganaktivitas mitosis, serta tidak adanya jaringan ikat.
Pada tipe ini terdapatjaringan yang mengalami nekrosis dan menjadi
tanda penting dalamdiagnosa (Rosai & Ackerman, 2011).
Secara mikroskopik, sel tumor pada IDC dapat tumbuh
menyebar,well-defined nests, memanjang, atau sel individu. Sel
tumor bervariasipada ukuran dan bentuk, serta lebih pleomorfik dari
pada bentuk ILC.Nuclei dan Nucleoli lebih menonjol dan lebih banyak
mitosis. Areanekrosis terjadi sekitar 60 % kasus (Rosai &
Ackerman, 2011).
Secara mikroskopik, sel tumor pada LCIS memiliki
karakteristiklobulus besar dan terisi seragam, bulat, sel berukuran
kecil hingga besardengan bentuk bulat dan inti normochromatic. Pada
suatu kasus LCIS,jarang atau tidak ada pleomorfism, aktivitas
mittosis dan nekrosis (Rosai& Ackerman, 2011).
Penelitian yang dilakukan oleh Samy dkk. (2006) menunjukkanbahwa
tikus yang diinduksi DMBA mengalami lesi yang berkembangpada
kelenjar mamae yang berimplikasi pada karsinoma. Secara
-
14
histopatologi mengungkapkan bahwa karsinoma menunjukkan
bentuknuklear. Sedangakan, penelitian yang dilakuakan oleh Minari
dkk.(2016), adanya DMBA menginduksi atropi kelenjar seromukosa
disekitar fibrosa stromal dan hiperplasia kelenjar serosa dan
mucin. Selainitu, terdapat karsinoma yang muncul dari duktal
kelenjar mamae.Penelitian lain yang dilakukan oleh Nicolas dkk.
(2005) menunjukkanbahwa hitologi tumor payudara induksi DMBA ialah
karsinomasquamos atau adenosquamos.
(a) (b)(Siddiqui dkk., 2013)
Gambar 6. Karakterisasi histopatologi kanker payudara induksi
DMBA.Keterangan : (a) Karsinoma Adenosquamos & (b)Karsinoma
duktal
Preparat melintang Gambar 6.a menunjukkan terdapat
pelebaranjaringan (ectactic) duktal oleh epitelium squamos
berlapis. Selain ituterdapat jaringan padat dengan berbagai ukuran
yang seringkali disertaikeratinisasi dan inflamasi stromal.
Jaringan preparat Gambar 6bmenunjukkan jaringan padat dan nuclear
pleomorfism moderate, sertainflamasi stromal ringan (Shiddiqui
dkk., 2013).
2.7 Flow Cytometry
Flowsitometri merupakan suatu alat yang digunakan
untukmenganalisis berbagai parameter sel individu dari heterogen
populasi.Flowsitometri digunakan dalam berbagai aplikasi seperti
immuno-phenotyping, analisis DNA, proliferasi dan fluoresent
protein (Picot
-
15
dkk.,2012). Flowsitometri mengukur beberapa karakteristik
suatupartikel individu yang bergerak pada suatu aliran fluida.
Flowsitometrimemberikan analisis yang cepat terhadap beberapa
karakteristik seltunggal. Informasi yang diperoleh bersifat
kualitatif dan kuantitatif(Brown & Witter, 2000).
Ribuan sel per sekon satu demi satu melalui satu atau lebih
sorotanlaser pada flow cytometry, yang akan diukur penyebaran
cahaya padabeberapa sudut dan emisi fluorensen. Terdapat tiga
bagian dalam flowcytometry (Gambar 7), yaitu (Picot dkk., 2012) :1.
Sistem fluiditas menginduksi fokus hydodinamik2. Sumber eksitasi
dan sistem emisi optikal dari filter panjanggelombang
untuk mendeteksi adanya bagian optikal3. Sistem elektronik
digital yang dianalisis dengan softwere komputer
(Picot dkk., 2012)Gambar 7. Prinsip flowsitometri
Flow cytometry mengukur secara optikal dan karakteristik
fluoresenssel tunggal. Ciri fisik, seperti ukuran dan kompleksitas
internal dapatmenjelaskan populasi sel. Pewarnaan fluoresens
berikatan dengankomponen seluler yang berbeda seperti DNA atau RNA.
Selain itu,
-
16
antibodi terkonjugasi ke pewarnaan fluoresens yang berikatan
proteinspesifik pada membran sel atau di dalam sel. Ketika sel yang
telahdilabel dilewati oleh sumber cahaya, molekul fluoresens
menjadi energiyang lebih tinggi. Setelah kembali pada keadaan diam,
flurokrommemancarkan energi cahaya pada panjang gelombang
tinggi.Penggunaan beberapa flurokrom, masing-masing dengan
eksitasipanjang gelombang yang mirip dan perbedaan emisi
panjanggelombang, sehingga memungkinkan beberapa sifat sel dapat
diukursecara terus menerus. Pewarnaan yang biasanya digunakan
ialahpropium iodida, fikoeritrin, dan fluorescein (Brown &
witter, 2000).
-
17
BAB IIIMETODE PENELITIAN
3.1 Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilakukan pada bulan Oktober 2016 sampai
denganMei 2017 bertempat di Laboratorium Fisiologi, Struktur
danPerkembangan Hewan, Fakultas Matematika dan Ilmu
PengetahuanAlam, Jurusan Biologi, Universitas Brawijaya,
Malang.
3.2 Deskripsi Hewan coba
Hewan coba yang digunakan ialah mencit (Mus musculus) BALB/cyang
berumur tujuh hingga delapan minggu. Hewan coba yangdigunakan
berjenis kelamin betina. Mencit yang digunakan memilikiberat badan
standar yaitu >20g. Mencit pada penelitian ini dalamkondisi
memiliki kanker payudara dengan injeksi zat karsinogenikmenggunakan
DMBA (7,12 dimethylbenz[a]anthracene). Mencitdirawat dengan dijaga
kebersihannya, sehingga tidak ada patogen asingyang masuk ke dalam
tubuh mencit. Mencit ditimbang setiap akanmemulai perlakuan,
sehingga bisa dijadikan acuan untuk menentukanvolume larutan yang
masuk ke dalam tubuh mencit.
3.3 Deskripsi Perlakuan dan Rancangan Penelitian
Rancangan penelitian ini menggunakan desain Rancangan
AcakLengkap (RAL). Penelitian menggunakan 16 ekor mencit.
Penentuandesain RAL berdasarkan mencit yang digunakan berumur tujuh
hinggadelapan minggu yang diberi empat perlakuan dengan empat
kaliulangan. Masing-masing perlakuan tidak dipengaruhi oleh faktor
lain(makanan, suhu dan sebagainya) sehingga tidak perlu
dikelompokkan.Berikut ini merupakan kelompok perlakuan (Tabel
2).
-
18
Tabel 2. Kelompok perlakuan penelitianKelompok perlakuan
Keterangan
Normal (N) Kontrol tanpa perlakuanKontrol Negatif (D) Perlakuan
DMBA, tanpa
perlakuan ekstrak lemonEkstrak lemon dosis 50 mg/ml
(DL50)Perlakuan DMBA, menggunakan
ekstrak lemon dosis 50 mg/mlEkstrak lemon dosis 200 mg/ml
(DL200)Perlakuan DMBA, menggunakanekstrak lemon dosis 200
mg/ml
3.4 Injeksi DMBA dan Lemon
Induksi DMBA dilakukan selama enam minggu dengan
injeksisubkutan. Injeksi dilakukan satu minggu sekali. Injeksi
DMBAdilakukan pada daerah sekitar payudara. Pelarut untuk DMBA
ialahminyak jagung (Currier dkk., 2005). Dosis induksi DMBA
secarasubkutan ialah 7,5 mg/kg BB tikus dan apabila dikonversi
untuk dosismencit ialah 0,015 mg/g BB dengan dilarutkan dalam 0,1
mL. Volumelarutan DMBA yang diinjeksikan mengacu pada berat badan
mecit.Berat badan setiap perlakuan kemudian dijadikan rerata, lalu
beratbadan individu mencit yang akan diinjeksikan dibagi berat
rerata sesuaidengan kelompok perlakuan dan dikalikan 100 µl (Tieppo
dkk., 2007).
Bagian lemon yang digunakan pada penelitian ini adalah
bagianbuah (lengkap). Kemudian lemon dihancurkan dengan
menggunakanblender dan disaring dengan menggunakan kertas saring.
Filtrat di freezedry sehingga didapatkan ekstrak lemon berbentuk
pasta. Ekstrak lemondisimpan dalam kondisi dingin dengan suhu 4
oC.
Ekstrak kandungan lemon yang diberikan pada mencit setiap
harisebesar 50 dan 200 mg/kg BB selama 14 hari. Injeksi lemon
dilakukansecara oral dengan menggunakan pelarut yang digunakan
ialah aquades.Perhitungan volume lemon yang diinjeksikan pada
mencit dihitung beratbadan mencit. Berat badan setiap perlakuan
kemudian dijadikan rerata,lalu berat badan individu mencit yang
akan diinjeksikan dibagi beratrerata sesuai dengan kelompok
perlakuan dan dikalikan 500 µl (Patildkk., 2009).
3.5 Penetuan Histopatologi Payudara
Jaringan payudara mencit yang telah diinduksi DMBA selama
6minggu akan dibuat preparat histopatologis. Jaringan yang akan
dibuat
-
19
preparat berasal dari jaringan di sekitar payudara dan berada
padalapisan kedua setelah lapisan kulit.
Jaringan payudara yang telah diambil dilakukan fiksasi
dalamformalin 40 % dan ditanam (embedding) di dalam parafin,
dipotongdengan menggunakan mikrotom sekitar 4-5 µm dan diwarnai
denganhematoxylin/eosin (HE). Potongan diamati di bawah mikroskop
denganperbesaran 40 dan 100 kali.
3.6 Isolasi Sel Limfosit
Semua kelompok perlakuan mencit dilakukan dislokasi bagianleher.
Mencit difiksasi dengan menggunakan jarum. Abdomen
mencitdibersihkan dengan menggunakan alkohol 70 %. Mencit dibedah
daribagian dorsal kiri hingga ventral. Spleen diambil dan dicuci
dua kalidengan menggunakan PBS supaya tidak ada lemak yang
menempelpada spleen. Organ diletakkan pada cawan yang berisi 1 mL
PBS dandigerus dengan menggunakan spuit ujung tumpul searah dengan
jarumjam. Spleen yang telah digerus dimasukkan ke dalam propilen 15
ml.Kemudian disentrifugasi pada kecepatan 2500 rpm dengan suhu 10
oCselama 5 menit. Pelet ditambahkan 1 ml PBS dan
dihomogenisasidengan cara pipetting.
3.7 Immunostainning antibodi Ekstraseluler dan Intraseluler
Pewarnaan Antibodi dilakukan secara ektraseluler dan
intraseluler.Pewarnaan antibodi ekstraseluler dilakukan dengan
pelet yangditambahkan 1 ml PBS kemudian diambil 60 µL dan
ditambahkandengan PBS 300 µL. Kemudian disentrifugasi dengan
kecepatan 2500rpm, 10 oC selama 5 menit. Supernatan dibuang dan
pelet ditambahkan50 µL antibodi, serta diresuspensi dan diinkubasi
selama 20 menit.Antibodi monoklonal yang digunakan ialah
Fluorescein isothiocyanate(FITC) anti mouse CD68, Pychoerythrin
(PE) rat anti mouse TNFα, danPE/Cy5 rat anti mouse IL-1.
Selanjutnya sampel yang telah diinkubasiantibodi sekunder
dipindahkan ke dalam kuvet dan ditambahkan 400 µLuntuk dilakukan
flow cytometry. Pewarnaan antibodi intraselulerdilakukan dengan
microtube yang berisi pelet dan PBS 100 µLditambahkan dengan
cytofix (fiksatif) 50 µL, serta diinkubasi selama20 menit. Kemudian
suspensi sel ditambahkan washperm 500 µL dandiresuspensi agar sisa
cytofix dapat hilang. Setelah itu, suspensidisentrifugasi dengan
kecepatan 2500 rpm, suhu 10 oC selama 5 menit.
-
20
microtube ditambahkan antibodi 50 µL CD68. Empat
microtubetersebut diinkubasi selama 20 menit. Pelet dipisahkan dari
supernatan,kemudian pelet ditambahkan antibodi intraseluler
sebanyak 50 µL. Peletyang telah ditambahkan antibodi intraseluler,
diikubasi selama 20 menitdidalam ice box. Masing-masing suspensi
sel (yang telah diberipewarnaan antibodi intraseluler) dipindahkan
ke dalam kuvet danditambahkan 400 µL PBS. Suspensi sel yang
terdapat dalam kuvetdibaca dengan flow cytometry (Khasanaah &
Rifa’i, 2012).
3.8 Analisa Statistik
Analisis flow cytometry dilakukan dengan menggunakan softwareBD
CELLQUEST ProTM, sehingga diperoleh jumlah relatif sel
CD68;CD68+TNFα+; dan CD68+IL1+. Analisis statistik dengan
menggunakanprosedur ANOVA. Jenis ANOVA yang digunakan ialah One
WayANOVA dengan nilai signifikansi sebesar 5 % dan menggunakan
ujiTukey HSD untuk mengetahui uji beda nyata. Analisis statistik
denganmenggunakan program SPSS versi 16 for Windows.
-
21
3.9 Kerangka Operasional
Gambar 8. Kerangka operasional penelitian
-
22
BAB IVHASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Histopatologi Payudara
Berdasarkan hasil histopatologi preparat jaringan
payudaradidapatkan bahwa mencit yang diberi perlakuan DMBA selama
6minggu mengalami karsinoma invasive. Hal tersebut dibuktikan
olehpreparat Gambar 9.
(a) (b)
(c) (d)
Gambar 9. Histopatologi karsinoma payudara. Keterangan : (a) dan
(b)Perbesaran100x & (c) dan (d) perbesaran 400x.
Gambar 9 menunjukkan bahwa adanya perubahan bentuk
duktus.Sel-sel epitel mulai merambat keluar dari duktus. Menurut
Rosai &
-
23
Ackerman (2011), in situ duktus karsinoma dikarakterisasi
denganadanya sel pleomorfik (besar) yang berasosiasi dengan
nekrosis. Secaramikroskopik, duktus menunjukan pertumbuhan pada
pleomorfik seltumor (besar) dan diserta dengan aktivitas mitosis,
serta tidak adanyajaringan ikat. Terdapat jaringan yang mengalami
nekrosis dan menjaditanda penting dalam diagnosis. Sel tumor pada
invasif duktus karsinomadapat tumbuh menyebar, well-defined nests,
memanjang, atau selindividu. Sel tumor bervariasi pada ukuran dan
bentuk, serta lebihpleomorfik dari pada bentuk invasif lobular
karsinoma. Karakterisasikarsinoma in situ ditandai dengan
proliferasi sel epitel yang berada disekitar membran basal, adanya
peningkatan jumlah fibroblas danpeningkatan angiogenesis. Tingginya
fibroblas dan menekannya selmyoepitel menyebabkan progresi
kanrsinoma in situ menjadi invasive.
4.2 Analisis Rata-Rata Jumlah Relatif Sel CD68
Sel CD68 merupakan molekul protein spesifik pada
makrofag.Berdasarkan hasil analisis flow cytometry pada spleen,
diketahui bahwajumlah relatif sel CD68 (Gambar 10 dan 11) pada
perlakuan kontrolnegatif (D) memiliki jumlah relatif yang paling
tinggi jikadibandingakan dengan kelompok perlakuan lainnya yaitu
sebesar 7,51%. Nilai terrsebut tidak memiliki beda nyata dengan
perlakuan D yaitusebesar 6,32 % (memiliki notasi yang sama yaitu c
pada Gambar 11).Kelompok perlakuan normal (N) memiliki jumlah
relatif rata-rata selCD68 yang paling rendah dan berbeda secara
nyata dengan perlakuanlainnya yaitu sebesar 1,75 % (ditunjukkan
dengan notasi a pada gambar11). Kelompok perlakuan mencit kanker
dan diberi perlakuan lemondosis 200 mg/kg BB menunjukkan perbedaan
secara nyata denganperlakuan normal dan DMBA yaitu sebesar 3,72 %
(ditunjukkan dengannotasi b pada gambar 11).
Berdasarkan Gambar 11 menunjukkan bahwa kelompok perlakuanDL200
produksi sel makrofag pada organ spleen menurun secarasignifikan.
Meskipun jumlah relatif sel makrofag tidak berbeda secaranyata
dengan perlakuan normal, kelompok perlakuan DL200 mampumenurunkan
jumlah sel CD68 hingga berbeda dari perlakuan DMBAdan mencit kanker
yang diberi dosis 50 mg/kg BB. Menurut Li dkk.(2015) adanya
peningkatan sel CD68 berkorelasi dengan terjadinyaangiogenesis.
Penurunan jumlah CD68 pada kelompok perlakuanDL200 menunjukkan
bahwa ekstrak lemon dengan dosis 200 mg/kg BBmampu menurunkan
proses angiogenesis pada sel kanker. Peningkatan
-
24
dosis perlu dilakukan untuk mengetahui dosis yang lebih tinggi
dalamproses penurunan CD68 hingga mendekati perlakuan normal.
Gambar 10. Hasil analisis Flow cytometry sel makrofag CD68
Gambar 11. Rata-rata jumlah relatif sel CD68. Keterangan : N:
Normal,D: DMBA, DL50: Dosis ekstrak lemon 50 mg/kg BB,DL200: Dosis
ekstrak lemon 200 mg/kg BB). Huruf yangberbeda menunjukkan beda
nyata berdasarkan Uji Tukey
HSD
-
25
CD68 merupakan marker pan-makrofag yang digunakan sebagaimarker
untuk TAM. CD68 mengenali bentuk makrofag M1 sebagaitumoricidal dan
M2 sebagai antiinflamasi. Molekul TAM merupakanbentuk polarisasi
makrofag tipe M2. Kedua populasi makrofag tersebutmemiliki profil
sitokin yang berbeda, M1 memproduksi kelebihan stressoksidatif dan
mensekresi sitokin proinflamasi TNFα, IL-1 dan IL-6,sedangkan M2
mensekresikan sitokin antiinflamasi IL-4, IL-10, dan IL-13 (He,
2014; Mittal dkk., 2014).
Aktivasi makrofag M1 berkorelasi dengan respon inflamasi
TNFα.Aktivasi TNFα bergantung pada interaksi TNF dan TNFR yang
memicudownstream signalling MAPK dan IKK, yang kemudian
mengaktivasiNF-κB. H2O2 merupakan bentuk ROS yang dapat
mengakumulasi NF-κB ketika distimulasi oleh TNFα. H2O2 akan
mengoksidasi sisteinkatalitik fosfatase MAPK dan memicu aktivasi
MAPK cascade yangmeliputi JNK dan P38 MAPK. Kelebihan H2O2
meningkatkan aktivasiIKK dan fosfolirisasi tirosin IκBα, sehingga
memicu jalur sinyal NF-κB.ROS lain seperti O2
- mampu mempengaruhi diferensiasi makrofagmenjadi M2 (Tan dkk.,
2016).
Polarisasi makrofag berasosiasi dengan pertumbuhan tumor.
TAMmenyerupai makrofag M2, dibuktikan dengan berkurangnya
sitokinproinflamasi IL-12, TNFα dan IL-1B, serta tinggainya
sitokinantiinflamasi IL-10 dan TGFβ. Makrofag M2 mendukung
adanyaangiogenesis. Sel tumor menarik monosit dari sirkulasi ke
jaringantumor, dengan mensekresikan CCL-2 dan CSF1. Monosit
tersebutberdiferensiasi menjadi TAM yang akan mengakumulasi
vascularisasiyang buruk, area hypoxic, dan meningkatkan progresi
tumor secaralangsung dengan mendukung proliferasi sel tumor. Secara
tidaklangsung perkembangan tumor didukung oleh produksi
proteasesepperti MMP-9 untuk menurunkan matriks ekstraseluler
danmengeluarkan growth factor (VEGF A, FGF2, dan PDGF)
untukproliferasi sel endotel dan formasi mikrovessel, Selain itu,
TAMberfungsi dalam perekrutan sel leukosit dari sirkulasi darah
untukembentuk jalur metastase (Jetlen dkk., 2013).
Aktivasi NF-κB dikarakterisasi oleh adanya subunit IKK.
KompleksIKK terdiri dari dua subunit kinase, IKKα (IKK1) dan IKKβ
(IKK2),dan IKKγ. IKKβ menekan fenotip proinflamasi M1 dan
meningkatkanmakrofag tipe M2. Defisisensi IKKβ akan menunjukkan
peningkatanekspresi MHC II, iNOS, dan IL-12, sehingga mengaktivasi
makrofagtipe M1. Aktivasi NF-κB dikarakterisasi oleh adanya subunit
IKK(Lawrence, 2009).
-
26
Menurut Blaylock (2015) NF-κB akan mengaktivasi
perubahanmakrofag fenotip M1 menjadi fenotip M2 (protumor).
TAMmeningkatkan angiogenesis dan meningkatkan immune escape,
yangselanjutnya akan terjadi metastasis. Adanya fenotip makrofag M2
padatumor stroma akan meningkatkan ukuran tumor, invasi,
faktorprognostik buruk pada penderita kanker payudara. Beberapa
flavonoiddapat menghambat aktivasi NF-κB, seperti hesperidin,
apigenin, danluteolin. Inhibisi NF-κB akan menstimulasi aktivitas
antitumor olehmakrofag tipe M1 dan menigkatkan perubahan makrofag
tipe M2(protumor) menjadi tipe M1.
Pengujian kandungan ekstrak lemon perlu dilakukan lebih
lanjut,seperti menggunakan uji High Performance Liquid
Chromathography(HPLC), karena ekstrak lemon hanya dilarutkan dengan
menggunakanair. HPLC merupakan suatu metode untuk
memisahkan,mengidentifikasi dan menentukan kuantitas masing-masing
komponendalam suatu bahan. Sample yang dianalisis dengan HPLC
harusberbentuk zat cair. (Rubiyanto, 2017)
4.3 Analisis Rata-Rata Jumlah Relatif Sel CD68+TNFα+
TNFα secara umum diproduksi oleh makrofag, tetapi juga
olehberbagai jaringan lain seperti sel limfoid, sel mast, sel
endotelial,jaringan fibroblas dan neuronal (Wajant dkk., 2013).
Ketika makrofagterpapar respon inflamasi, maka akan mensekresi
sitokin proinflmanasiseperti TNFα, IL-1, IL-6 IL8, dan IL-12 (Duque
& Descoteaux, 2014).Hasil analisis flow cytometry dan analisis
statistik jumlah relatif selmakrofag yang mengekspresikan TNFα dari
organ spleen ditunjukkanoleh gambar 12 dan 13. Berdasarkan Gambar
13 menunjukkan bahwakelompok perlakuan mencit kanker memiliki
jumlah makrofag yangmempresentasikan TNFα paling tinggi yaitu
sebesar 24, 98 % namuntidak berbeda nyata pada kelompok perlakuan
mencit kanker yangdiberi ekstrak lemon dosis 50 mg/kg BB yaitu
sebesar 22, 49 % (ditunjukkan dengan notasi c). Rata-rata jumlah
relatif sel makrofag yangmempresentasikan TNFα yang dimiliki oleh
kelompok perlakuannormal (N) lebih rendah dibanding dengan seluruh
perlakuan yaitusebesar 7.67 % dan berbeda secara nyata dengan
perlakuan lainnya(ditunjukkan oleh notasi a). Terjadi penurunan
jumlah sel relatifmakrofag yang mengekspresikan TNFα pada perlakuan
DL200 sebesar18,57 %. Jumlah relatif sel pada kelompok perlakuan
DL50 tidakmenunjukkan beda nyata terhadap perlakuan DL200 dan D.
Hal ini
-
27
menunjukkan bahwa perlakuan DL200 mampu mengurangi
produksisitokin proinflamasi.
Respon inflamasi bermanfaat ketika diproduksi dalam jumlah
yangtepat tetapi bersifat toksik ketika kelebihan produksi IL-1 dan
TNF.Sitokin proinflamasi yang berlebihan memicu karakteristik
responinflamasi shock sepsis dan berbagai kegagalan organ (Duque
&Descoteaux, 2014).
Gambar 12. Hasil analisis Flow cytometry sel makrofag
CD68+TNFα+
-
28
Gambar 13. Rata-rata jumlah relatif sel CD68+TNFα+. Keterangan :
N:Normal, D: DMBA, DL50: Dosis ekstrak lemon 50 mg/kgBB, L200:
Dosis ekstrak lemon 200 mg/kg BB. Hurufyangberbeda menunjukkan beda
nyata berdasarkan Uji Tukey
HSD
Sitokin proinflamasi TNFα terekspresi tinggi dalam
karsinomapayudara. TNFα pada kanker payudara mendukung pertumbuhan
tumor.Beberapa sel yang mengekspresikan TNFα dalam karsinoma
payudaraberkorelasi dengan peningkatan grade tumor dan keterlibatan
nodusdalam metastasis (Kamel dkk., 2012).
NF-κB berperan dalam regulator ekspresi gen proinflamasi.
Sintesisbeberapa sitokin TNF-α, IL-1β, IL-6, dan IL-8 dimediasi
oleh NF-κB.protein IKK yang berperan pada aktivasi NF-κB,
meningkatkan TNF-αdan IL-1 (Tak & Firestein, 2001). Hesperidin
dapat berperan sebagaiantiinflamasi dan memiliki target terhadap
komponen inflamasi, sepertiIL-6, TNF-α IL-1 dan yang berperan dalam
progresi tumor (Devi dkk.,2015).
4.4 Analisis Rata-rata Jumlah Relatif Sel CD68+IL-1+
IL-1 terdiri dari beberapa protein, salah satunya ialah IL-1β.
IL-1yang disekresi oleh makrofag merupakan komponen stromal
dalamkanker payudara (Hou dkk., 2011; Tan dkk., 2016). Hasil
analisis flowcytometry dan analisis statistik jumlah relatif sel
makrofag yangmengekspresikan IL-1 dari organ spleen ditunjukkan
pada Gambar 14
-
29
dan 15. Berdasarkan Gambar 15 menunjukkan bahwa
kelompokperlakuan mencit kanker memiliki jumlah makrofag
yangmempresentasikan TNFα paling tinggi yaitu sebesar 33,13 %
danberbeda secara nyata dengan perlakuan lainnya (ditunjukkan
dengannotasi b). Rata-rata jumlah relatif sel makrofag yang
mempresentasikanIL-1 yang dimiliki oleh kelompok perlakuan normal
(N) lebih rendahdibanding dengan perlakuan lainnya yaitu sebesar
14,87 % namun tidakberbeda secara nyata dengan kelompok perlakuan
mencit kanker yangdiberi dosis lemon 50 mg/ Kg BB sebesar 21,54 %
dan 200 mg/kg BBsebesar 20, 98 % (ditunjukkan oleh notasi a). Hasil
tersebutmenunjukkan bahwa pada perlakuan ekstrak lemon hampir
mendekatinormal. Ekstrak lemon dengan dosis 50 dan 200 mg/kg BB
mampumengurangi kelebihan sitokin proinflamasi molekul IL-1.
Gambar 14. Hasil analisis Flow cytometry sel makrofag
CD68+IL-1+
-
30
Gambar 15. Rata-rata jumlah relatif sel CD68+IL-1+. Keterangan :
N:Normal, D: DMBA, DL50: Dosis ekstrak lemon 50mg/kg BB, DL200:
Dosis ekstrak lemon 200 mg/kg BB.Huruf yang berbeda menunjukkan
beda nyataberdasarkan Uji Tukey HSD
IL-1 dapat melakukan up regulasi di beberapa tumor
danberimplikasi pada pertumbuhan tumor melalui gen metastasis
danangiogenesis dan growth factor. Tingginya konsentrasi IL-1
berkorelasidengan semakin virulent fenotip tumor. IL-1 menginduksi
ekspresi genmetastasis seperti Matrix Metalloproteinase (MMP) dan
menstimulasiprotein terdekat untuk memproduksi protein angiogenik
dan growthfactor seperti VEGF, IL-8, IL-6, TNFα, dan TGFβ (Lewis
dkk., 2006).Hesperidin dapat berperan sebagai antiinflamasi dan
memiliki targetterhadap komponen inflamasi, seperti IL-6, TNF-α
IL-1 dan yangberperan dalam progresi tumor (Devi dkk., 2015).
4.5 Hubungan Antara ROS, Sitokin Proinflamasi dan SenyawaEkstrak
LemonROS merupakan kelompok molekul yang terdiri dari
superoksida
(O2-), radikal hidroksil, COX-2, iNOS dan hidrogen peroksida
(H2O2).Molekul tersebut disintesis dalam sel melalui metabolisme
oksigen.Tingkat seluler ROS dimodulasi oleh keseimbangan antar
proses seluleryang memproduksi dan menghilangkannya. ROS
dihilangkan oleh
-
31
beberapa enzim antioksidan seperti SOD, Katalase,
thiredoxin,glutathione peroksidase dan peroxdoxin. ROS yang
terlibat dalam stresoksidatif dikarakterisasi dengan meningkatnya
tingkat ROS yangmemicu kerusakan protein, lipid dan DNA.
Peningkatan ROS selulerterjadi karena adanya disfungsi mitokondria
sehingga meningkatnyakonsentrasi ROS, oksidasi protein, lipid, dan
DNA, keseimbangan redoxdan stres oksidatif. Jalur sinyal MAPK dan
NF-κB meningkat dalam selinflamasi dan berperan dalam peningkatan
ekspresi iNOS, COX-2,TNFα, dan IL-6 (Morgan dkk., 2008; Hoesel
& Schmid, 2014; Perezdkk., 2015).
Inflamasi berperan dalam inisiasi tumor dengan memicu
produksiROS, kerusakan DNA, dan meningkatkan laju mutasi.
Inflamasimemicu sekresi growth factor, seperti EGF dan FGF. Apabila
sudahmemasuki inflamasi kronik maka akan memicu angiogenesis, hal
inidikarenakan adanya tumor yang mensekresikan sitokin
proinflamasi,seperti IL-6, IL-1a, IL-1b, dan TNFα. Sitokin
proinflamasi tersebutdapat memicu upregulasi COX-2 yang kemudian
meningkatkan ekspresiVEGF dalam sel tumor, menyebabkan
angiogenesis. Cyclooxygenase-2(COX-2) diregulasi oleh growth factor
dan berbagai sitokin, yangkemudian bertanggung jawab selama
inflamasi dan mendukung faktortranskripsi NFκB (Sobolewski dkk.,
2010; Velaquez dkk., 2015).
Aktivasi NF-κB menghasilkan upregulasi anti apoptosis
yangkemudian mendukung ketahanan hidup sel tumor dengan
stressfisiologis dan memicu respon inflamasi. NF-κB menginduksi
sitokinyang meregulasi respon imun (seperti TNFα, IL-1, IL-6 dan
IL-8), danmemicu pengarahan leukosit ke tempat inflamasi. Respon
imun innateneutrofil melepaskan ROS untuk membunuh patogen
dapatmenyebabkan kerusakan DNA dan menimbulkan efek samping
berupamutasi genetik, sehingga memicu inisiasi tumor. Selain itu,
sinyal NF-κB ditunjukkan untuk berkontribusi pada perkembangan
kanker denganmengendalikan epitel hingga transisi mesenkim dan
metastasis. NF-κBberkontribusi pada perkembangan tumor dengan
mengendalikanvaskularisasi tumor melalui upregulasi VEGF dan
reseptornya (Hoesel& Schmid, 2013).
Proliferasi sel dan apoptosis diregulasi oleh NF-κB dan P53
tumorsupresor. NF-κB merupakan jalur sinyal yang berperan penting
dalamapoptosis, proliferasi, diferensiasi dan perkembangan.
Aktivasi NF-κBberkaitan dengan tumorigenesis. Sel kanker
menghindari apoptosisdengan menstimulasi jalur NF-κB yang mendukung
terhadap resistensiapoptosis. Salah satu senyawa kandungan ekstrak
lemon, hisperidin
-
32
menginduksi growth arrest dan apoptosis dengan berikatan
denganPPARγ, p53, dan NF-κB. PPARγ memicu inhibisi fosforilasi IκB
danmengaktivasi NF-κB. Inhibisi NF-κB dapat mendukung
apoptosis.Hisperidin mampu meningkatkan senyawa antioksidan SOD,
katalase,vitamin E dan vitamin C (Devi dkk., 2015).
-
33
BAB VKESIMPULAN DAN SARAN
5.1 Kesimpulan
Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa ekstrak lemon
denganmenggunakan pelarut aquades yang diberikan pada mencit
betinaBALB/c selama 14 hari mampu menurunkan produksi sel
makrofagCD68+, CD68+TNFα+, CD68+IL1+. Hasil statistika menunjukkan
bahwapemberian ekstrak lemon dosis 50 mg/kg BB terhadap jumlah
relatif selmakrofag dan TNFα tidak berpengaruh nyata, sedangkan
berbeda nyatapada pemberian ekstrak lemon dosis 200 mg/kg BB.
Pemberian ektraklemon dosis 50 dan 200 mg/kg BB terhadap jumlah
relatif sel IL-1berpengaruh secara nyata.
5.2 Saran
Penelitian lebih lanjut perlu dilakukan supaya
mengetahuimekanisme ekstrak lemon terhadap sel kanker lebih lanjut
denganmenambahkan parameter seperti NF-κB. Penelitian ini juga
perlumenambahkan analisis High Performance Liquid
Chromathography(HPLC) untuk mengetahui kandungan senyawa yang
terkandung dalambuah lemon. Variasi dosis yang berbeda dari ekstrak
lemon perluditambahkan agar dapat mengoptimalkan hasil penelitian
lebih lanjut.
-
34
DAFTAR PUSTAKA
Almatroodi, S. A., McDonald, C. F., Darby, I. A. & Pounioti,
D.S.2016. Characterization of M1/M2 Tumour-AssociatedMacrophages
(TAMs) and Th1/Th2 Cytokine Profiles inPatients with NSCLC. Cancer
Microenvironment 9(1): 1–11
Alshatwi, A. A., Shafi, G., Hasan, T. N., Hazzeni, A. A. A.,
Alsaif,M.A., Alfawaz, M. A., Lei, K. Y., & Munshi, A.
2011.Apoptosis-mediated inhibition of human breast cancer
cellproliferation by lemon citrus extract asian pacific.
JournalCancer Preview. 12:1555-1559.
Anggarwal, B. B., Shishodia, S., Sandur, S. K., Pandey, M. K.
& Sethi,G. 2006. Inflammation and cancer: How hot is the
link?.Biochemical Pharmacology 72:1605–1621.
Barh, D., Carpi, A., Verma, M., & Gunduz, M. 2014.
Cancerbiomarkers: minimal and noninvasive early diagnosis
andprognosis. CRC press. New York.
Blaylock, R. L. 2015. Cancer microenvironment, inflammation
andcancer stem cells: A hypothesis for a paradigm change and
newtargets in cancer control. Surgical Neurology
International92:1-14.
Brown, M. & Witter, C. 2000. Flow cytometry: Principles and
clinicalapplications in hematology. Clinical Chemistry
46(8):1221–1229.
Courteau, J. 2013. Citrus limon (L.) Burm. f. (pro.
sp.).http://eol.org/pages/582200/overview. Diakses 7 Januari
2017.
Currier, N., Farago, M., Solomon, S. E., Ying, H., Xiao, Z. J.,
Demicco,E. G., Dominguez, I., Sherr, D. H., Chang, D. L. F.,
Sonenshein,G. E., Seldin, D. C. & Cardiff, R. 2005. Oncogenic
signalingpathways activated in dmba-induced mouse mammary
tumors.Journal of Toxicologic Pathology 33:726-737.
Devi, K. P., Rajavel, T., Nabavi, S. F., Setzer, W. N., Ahmadi,
A.,Mansouri, K., & Nabavi, S. M. 2015. Hesperidin: A
promisinganti cancer agent from nature. Industrial Crops and
Products76:582-589.
Duque, G. A., & Descoteaux, A. 2014. Macrophage
cytokines:Involvement in immunity and infectious disease. Frontiers
inimuununology 5(491):1-9
-
35
Floratoskana. 2017. Citrus limon 'Lunario' - Lemon,
Four-Seasons.https://flora-toskana.com/en/citrus-plants/188-citrus-limon-lunario-vier-jahreszeiten-zitrone.html.
Diakses 7 Januari 2017.
Gattuso, G., Barreca, D., Gargiulli, C., Leuzzi, U. &
Caristi, C. 2007.Flavonoid composition of citrus juices. Molecules
12:1641–1673.
González-Molina, E., Domínguez-Perles, R., Moreno, D.A., &
García-Viguera, C. 2010. Natural bioactive compounds of Citrus
limonfor food and health. Journal of Pharmaceutical and
BiomedicalAnalysis. 51:327–345.
He, K., Zhang, L., Huang, C., Ma, S., Wang, Y., Wang, W.,
Zhao,Z.,Liu, B., Zhao, Y., Zhang,W., & Sun, Z. 2014. CD163+
tumor-associated macrophages correlated with poor prognosis
andcancer stem cells in oral squamous cell carcinoma.
BioMedResearch International. 2014:1-9.
Hoesel, B., & Schmid, J. A. 2014. The complexity of NF-κB
signalingin inflammation and cancer. Biomed central 2013: 12:
86
Hou, Z., Falcone, D. J., Subbaramaiah, K., & Dannenberg, A.
J. 2011.Macrophages induce COX-2 expression in breast cancer
cells:role of IL-1β autoamplification. Carcinogenesis 32(5):
695–702
Hussain, P. S & Harris, C. C. 2007. Inflammation and cancer:
Anancient link with novel potentials. International Union
AgainstCancer 121: 2373–2380.
Jayakumar, J.K., Nirmala, P., Praveen K. B.A., & Kumar, A.P.
2014.Evaluation of protective effect of myricetin, a bioflavonoid
indimethyl benzanthracene-induced breast cancer in femaleWistar
rats. South Asian J Cancer. 3(2):107-111
Jetlen, N., Verbuggen, S., Gijbels, M. J., Post, M. J., Winther,
M. P. J.,& Donners, M. M. P. C. 2013. Anti Inflamatory M2, but
not proinflamatory M1 macrophage promote angiogenesis in
vivo.Angiogenesis. 2013:1-10
Kamel, M., Shouman, S., El-Merzebany, M., Kilic, G., Veenstra,
T.,Patel, D. 2012. Effect of TNFα on estrogen metabolic pathwaysin
breast cancer cells Journal of Cancer. 3:310-321.
Khasanah, Q. & Rifa'i, M. 2014. Activity of dexamethasone
therapy onpro-inflammatory cytokines profile of Balb/c mice with
biliaryatresia. Jurnal Biotropika 2(2): 92 -97.
Kim, J., Jayaprakasha, G. K., & Patil, B. S. 2013. Limonoids
and theiranti-proliferative and antiaromatase properties in human
breastcancer cells. Journal of Food & Function 4:258-265.
-
36
Kumar, V. & Abbas, A. K. 2015. Robbins & cotran
pathologic basisof disease 9th edition. Elsevier Canada.
Lawrence, T. 2009. The Nuclear Factor NF-κB pathway
ininflammation. Cold Spring Harbor Perspective in
Biology1(6):1-10.
Ledesma-Escobar, C.A., Priego-Capote, F., & De Castro, M. D.
L.2016. Effect of sample pretreatment on the extraction of
lemon(Citrus limon) components. Talanta 91: 153-173.
Lewis, A.M., Varghese, S., Xu, H., & Alexander, H. R.
2006.Interleukin-1 and cancer progression: The emerging role
ofinterleukin-1 receptor antagonist as a novel therapeutic agent
incancer treatment. Journal of translational medicine 4(48):
1-12.
Li, W., Liang, R, Zhou, C., Wu, Meng-Yao, L.L., Yuan, Gao-Feng,
W.,Ming-Yun, X., Shou, L., Gong, F., Chen, K., Duan, W. &
Tao,M. 2015. The association between expressions of RAS andCD68 in
the angiogenesis of breast cancers. Journal of cancercell 15(17):
3-10.
Lin, Y., Shi, R., Wang, X., & Shen, H. 2008. Luteolin, a
flavonoid withpotentials for cancer prevention and therapy. Current
CancerDrug Targets 8(7): 634–646.
Macdonald, F., Ford, C. H. J. & Casson, A. G. 2005.
Molecular biologyof cancer. BIOS Scientific Publishers. Canada.
Manoharan, S., Balakrishnan, S., Menon V. P., Alias, L.M., &
Reena,A. R. 2009. Chemopreventive efficacy of curcumin and
piperineduring 7,12-dimethylbenz [a]anthracene-induced
hamsterbuccal pouch carcinogenesis. Singapore Medical Journal
50(2): 139-146.
McCoy, E., Welch, D., Feng, X. 2012. Potential Role of CD68 in
BreastCancer Bone Metastasis. American National Standards
Institute98(8): 1-19
Medrek, C., Ponten, F., Jirstrom, K., & Leandersson, K.
2012. Thepresence of tumor associated macrophages in tumor stroma
as aprognostic marker for breast cancer patients. BioMed
CentralCancer 12 (306): 2-9.
Minari, J. B., Ogar, G. O., & Bello, A. J. 2016.
Antiproliferativepotential of aqueous leaf extract of mucuna
pruriens on dmba-induced breast cancer in female albino rats. The
EgyptianJournal of Medical Human Genetics 17(4): 331-343.
-
37
Mittal, M., Siddiqui, M. R., Tran, K., Reddy, S.p. & Malik,
A. B. 2014.Reactive Oxygen Species in inflammation and tissue
injury.Antioxidant Redox Signal. 20(7): 1126–1167
Morgan, M. J., Kim, Y., & Liu, Z. 2008. TNFα and reactive
oxygenspecies in necrotic cell death. Cell Research 18:343-349
Morrissaeau, C. & Hammock, B. D. 2008. Gerry Brooks and
epoxidehydrolases: Four decades to a pharmaceutical. PestManagement
Science 64: 594–609.
Nicolas, C., Sandra, E.S,. Elizabeth, G.D., Donny, L.F.C.,
Marganit, F.,Haoqiang, Y. 2005. Oncogenic signaling pathways
activated indmba-induced mouse mammary tumors. Toxicol
Pathology2(33): 726.
Patil, J.R., Jayaprakasha, G.C., Murthy, C. K. N., Tichy, S.E.,
Chetti,M., B., & Patil, B.S. 2009. Apoptosis-mediated
proliferationinhibition of human colon cancer cells by volatile
principles ofCitrus aurantifolia. Food Chemistry 114:
1351–1358.
Perez, L., Mourroux, R. & Guittaut, M. 2015. Interplay
between ROSand autophagy in cancer cells, from tumor initiation to
cancertherapy. Redox Biology 4(2015): 184–192
Picot, J., Guerin, C., L., Kim, C. L., Boulanger, C. M. 2012.
Flowcytometry: Retrospective, fundamentals and
recentinstrumentation. Journal of Cytotechnology 64: 109–130.
Romadhon, Y.A. 2013. Gangguan Siklus Sel & Mutasi Gen
padaKanker Payudara. Opini 40:786-789.
Rosai, J. & Ackerman. 2011. Surgical pathology 10th edition.
Elsevier.Canada.
Rubiyanto, D. 2017. Metode kromatografi: prinsip dasar,
praktikumdan pendekatan pembelajaran kromatografi.
Deepublish.Yogyakarta
Samy, R. P., Gopalakrishnakone, P., & Ignacimuthu, S. 2006.
Anti-tumor promoting potential of luteolin against
7,12-dimethylbenz(a)anthracene-induced mammary tumors in
rats.Chemico-Biological Interaction 164: 1-14.
Siddiqui, R. A., Harvey, K. A., Walker, C., Altenburg, J., Xu,
Z., Tery,C., Camarillo, I., Jones-Jall, Y., & Mariash, C.
2013.Characterization of synergistic anti-cancer effects
ofdocosahexaenoic acid and curcumin on dmba-inducedmammary
tumorigenesis in mice. BMC Cancer 418(13):1-16.
Sobolewski, C., Cerella, C., Dicato, M., Ghibelli, L., &
Diederich, M.2010. The Role of Cyclooxygenase-2 in Cell
Proliferation and
-
38
Cell Death in Human Malignancies. International Journal ofCell
Biology. 2010:1-21
Tak, P. P. & Firestein, G. S. 2001. NF-κB: A key role in
inflammatorydiseases. Journal of Clinical Investigation 107(1):
1–11.
Tan, H., Wang, N., Li, S., Hong, M., Wang, X., & Feng, Y.
2016. TheReactive Oxygen Species in macrophage
polarization:Reflecting its dual role in progression and treatment
of humandiseases. Oxidative Medicine and Cellular Longevity 2016:
1-16
Thompson, A. M. 2014. Molecular pathways: Preclinical models
andclinical trials with metformin in breast cancer. Clinical
CancerResearch 20(10): 2508-2515
Tieppo, J., Vercelino, R., Dias, A.S., Vas, Silva M. F.,
Silveira, T. R.,Marroni, C.A., Marroni, N.P., Henriques, J.A.,
Picada, J.N. & .2007. Evaluation of the protective effects of
quercetin in thehepatopulmonary syndrome. Food Chemical Toxicology
45(7):1140-1146.
Varn, F. S., Mullins, D. W., Pulido, H. A., Fiering, S., &
Cheng, C.2016. Adaptive immunity programmes in breast cancer.
Journalof Immunology 150: 25–34.
Velaquez, M. E., Saloma, P. O., Arreola, M. I. P., Castro, K. E.
N.,Castro, J. I. & Montor, J. M. 2015. The role of cytokine
inbreast cancer cevelopment and progression. Journal ofInterferon
& Cytokine Research 35(1):1-10.
Wajant, H., Pfizenmaier, K., & Scheurich, P. 2003. Tumor
necrosissignalling. Cell death and differentiation 10:45-65
Wang, X. & Lin, Y. 2008. Tumor necrosis factor and cancer,
buddies orfoe. National Institutes of Health 29(11): 1275-1288.
WHO. 2014. Cancer country profile in
Indonesia.http://www.who.int/cancer/country-profiles/idn_en.pdf?ua=1
.Diakses 7 Januari 2017.
BAGIAN DEPAN.pdfBAB I.pdfBAB II.pdfBAB III.pdfBAB IV.pdfBAB
V.pdfDAFTAR PUSTAKA (1).pdf