Aislamiento, identificación y evaluación de hongos entomopatógenos como posibles agentes de control de trips (Thysanoptera: Thripidae) asociados a cultivos de aguacate (Persea americana Miller) Tatiana Inés Restrepo Quiroz Universidad Nacional de Colombia Facultad de Ciencias, Escuela de Biociencias Medellín, Colombia 2015
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Aislamiento, identificación y evaluación de hongos ... · Figura 4-10: Amplificación de productos de PCR del gen ITS (550-650 pb). MP: Marcador de Peso Molecular. 1: Lecanicillium
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Aislamiento, identificación y evaluación de hongos
entomopatógenos como posibles agentes de
control de trips (Thysanoptera: Thripidae)
asociados a cultivos de aguacate (Persea
americana Miller)
Tatiana Inés Restrepo Quiroz
Universidad Nacional de Colombia
Facultad de Ciencias, Escuela de Biociencias
Medellín, Colombia
2015
Aislamiento, identificación y evaluación de hongos
entomopatógenos como posibles agentes de
control de trips (Thysanoptera: Thripidae)
asociados a cultivos de aguacate (Persea
americana Miller)
Tatiana Inés Restrepo Quiroz
Tesis de grado presentada como requisito parcial para optar el título de:
Magíster en Ciencias – Biotecnología
Director:
Rafael Eduardo Arango Isaza, Ph.D. Biología Molecular
Universidad Nacional de Colombia
Facultad de Ciencias, Escuela de Biociencias
Medellín, Colombia
2015
(Dedicatoria)
A Dios por darme la fortaleza para terminar
mis estudios y por brindarme el entusiasmo y
la sabiduría necesaria para concluir y alcanzar
esta meta profesional, la cual es un gran
peldaño en el largo camino del saber.
A mis padres por su incondicional y profundo
apoyo. Por alentarme a seguir adelante, por
ser los mejores modelos a seguir y porque han
sido los primeros en educarme laboral y
espiritualmente. Ellos son la razón más grande
por la que he alcanzado mis sueños y espero
retribuirles todo lo que han hecho para
brindarme siempre lo mejor… Los amo!
Para mis hermanas, sobrinos y novio quienes
son una gran bendición y porque en alguna
etapa de mi vida han estado presentes
conmigo viviendo momentos difíciles y hoy
están celebrando junto a mí este gran logro
como profesional.
Agradecimientos
Un agradecimiento especial a mi director de tesis, Dr. Rafael Arango Isaza, por la
orientación, el seguimiento y la supervisión continúa de esta investigación, además, por
brindarme todos sus conocimientos para que yo desarrollara y culminara este proyecto.
Al Dr. Antoni Rueda Lorza por confiar en mí, por permitirme ser parte de los
investigadores del proyecto y sobre todo por darme la oportunidad de desarrollar mi tesis
durante la ejecución del mismo. Igualmente, a la entomóloga Martha Jazmín Sánchez
Roncancio por la identificación taxonómica de los trips.
A la Corporación para Investigaciones Biológicas (CIB) por facilitarme sus instalaciones
donde pude desarrollar todos mis ensayos de laboratorio. Igualmente, un agradecimiento
de todo corazón a mis compañeros de la Corporación por su valiosa amistad y gran
colaboración.
Mis más sinceros agradecimientos al profesor Guillermo Correa Londoño de la
Universidad Nacional de Colombia y a mis amigos Madelen Giraldo y Carlos Lopera por
todo su apoyo, paciencia y porque fueron personas fundamentales en la finalización de mi
tesis.
A la Universidad Nacional de Colombia (Sede-Medellín) por su formación académica y por
ayudarme a crecer profesionalmente.
A los productores aguacateros ya que sin el aporte de ellos no hubiera sido posible
desarrollar esta investigación y a Colciencias por ser el ente financiador del proyecto.
Lista de contenido
Resumen ....................................................................................................................... VII
Abstract ........................................................................................................................ VIII
Lista de figuras .............................................................................................................. IX
Lista de tablas ................................................................................................................ XI
La diferencia entre las medias en los dos bioensayos (p1=<0.0001 y p2=<0.0001) mostró
diferencias significativas entre todas las concentraciones, excepto para las
concentraciones de 2,20x107 y 2,20x108 conidios/ml, destacándose el tratamiento
2,20x108 conidios/ml con una media de mortalidad más alta que los otros (Anexo D). La
concentración de 2,20x108 conidios/ml causó una mortalidad del 100% en ambos
bioensayos y no se observaron diferencias significativas con la concentración de 2,20x107
conidios/ml que causó una mortalidad del 92 y 96% en los bioensayos uno y dos,
respectivamente. Adicionalmente, se observa que la mortalidad en los tratamientos fue
directamente proporcional a la concentración de conidias suministrada (Figura 4-5).
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Figura 4-5: Porcentaje de mortalidad de Frankliniella spp ocho días después de la inoculación con
diferentes concentraciones de Metarhizium sp. Valores con la misma letra no presentan diferencias
significativas según la prueba Duncan (P ≤ 0.05). Las barras representan el error estándar.
Para las diferentes concentraciones evaluadas de Metarhizium sp, la mortalidad corregida
fluctuó de 27.03 a 100% para el bioensayo uno y entre 30.56 - 100% para el bioensayo
dos. Adicionalmente, para ambos ensayos la concentración de 2,20x108 conidios/ml
causó una mortalidad del 100% y el porcentaje de mortalidad en los controles estuvo por
debajo del 28% (Tabla 4-3).
Tabla 4-3: Porcentaje de mortalidad de Frankliniella spp causado por diferentes
concentraciones de Metarhizium sp, ocho días después de la inoculación
Concentración (conidios/ml)
No. de insectos tratados
No. de insectos muertos
Mortalidad (%)
Mortalidad corregida (%)
Met 1 y Met 2 Met 1 y Met 2 Met 1 Met 2 Met 1 Met 2 Met 1 Met 2
Control 50 13 14 26 28 0 0
2,20X104 50 23 25 46 50 27.03 30.56
2,20X105 50 34 31 68 62 56.76 47.22
2,20X106 50 39 40 78 80 70.27 72.22
2,20X107 50 46 48 92 96 89.19 94.44
2,20X108 50 50 50 100 100 100 100
* Met 1. Bioensayo 1 para Metarhizium sp. ** Met 2. Bioensayo 1 para Metarhizium sp.
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4.3.3 Concentración Letal 50 y Tiempo Letal 50
La estimación de la CL50 para Lecanicillium sp sobre adultos de Frankliniella spp permitió
determinar que a concentraciones de 1.69x105 y 1.02x105 conidios/ml muere el 50% de la
población evaluada en los bioensayos uno y dos, respectivamente. El tiempo letal (TL50)
de Lecanicillium sp para el bioensayo uno fue de 2.4 días y en el bioensayo dos este
disminuyó a 2 días, para la concentración de 2,18x108 conidios/ml (Figura 4-6).
Figura 4-6: Porcentaje de mortalidad de Frankliniella spp después de la inoculación con diferentes concentraciones de Lecanicillium sp según el método Próbit. (A) Bioensayo 1, (B) Bioensayo 2
(A)
(B)
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Para los ensayos de inoculación de adultos con Metarhizium sp se determinó la CL50 y se
encontró que concentraciones 3.91x104 y 3.92x104 conidios/ml pueden matar el 50% de la
población analizada bajo condiciones de laboratorio (Bioensayos 1 y 2). El tiempo letal
(TL50) fue de 2.8 días y 2.6 días para la concentración más alta (2,20x108 conidios/ml) en
los bioensayos uno y dos, respectivamente (Figura 4-7).
Figura 4-7: Porcentaje de mortalidad de Frankliniella spp después de la inoculación con diferentes concentraciones de Metarhizium sp según el método Próbit. (A) Bioensayo 1, (B) Bioensayo 2
(A)
(B)
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El aislamiento identificado como Lecanicillium sp presentó valores de TL50 (2 - 2.4 días)
menores en comparación a los obtenidos con Metarhizium sp (2.6 - 2.8 días), además, al
determinar la CL50 se observó que concentraciones entre 1.02x105 y 1.69x105 conidios/ml
causaron la muerte del 50% de la población de trips evaluada, estos valores sugieren que
Lecanicillium sp es patogénico y altamente promisorio para el control de adultos de
Frankliniella spp en campo. Si se comparan estos resultados con los de autores como
Ekesi et al., (1998) y Zahn & Morse (2013), quienes mencionaron que aislamientos de
Beauveria bassiana y Metarhizium anisopliae evaluados sobre adultos de Megalurothrips
sjostedti y Scirtothrips perseae tuvieron un rango de CL50 que varió entre 1.3x106 y
1.1x107 conidios/ml y valores de TL50 de 2.4 a 8.4 días, podría sugerirse la especificidad
de Lecanicillium sp hacia adultos de Frankliniella spp de aguacate al ser aislamientos
obtenidos a partir del mismo insecto.
4.3.4 Capacidad de esporulación de Lecanicillium sp y
Metarhizium sp
Los cadáveres de Frankliniella spp tratados con Lecanicillium sp se sometieron a cámara
húmeda y dos días después se registró producción de micelio. Las hifas del hongo
terminaron su etapa de colonización y extrusión, perforando las partes intersegmentales
del exoesqueleto de los trips, la salida del hongo se observó especialmente por las
antenas, cabeza y pronoto; y a medida que las hifas fúngicas siguieron creciendo en el
cuerpo de los trips se dio la momificación y posteriormente apareció una esporulación
blanquecina sobre los insectos. Sin embargo, a diferencia de Metarhizium sp, el micelio
emergió en pocas cantidades y el proceso de infección total del insecto por parte del
hongo, se dio en mayor tiempo, con menor producción de esporas (Figura 4-8).
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Figura 4-8: Finalización del ciclo infeccioso de Lecanicillium sp sobre adultos de
Frankliniella spp
Para los ensayos realizados con las diferentes concentraciones de Metarhizium sp y una
vez los cadáveres se sometieron a cámara húmeda, el hongo tardó hasta 4 días en
emerger, sin embargo, se dio salida mínima del micelio a partir del segundo día. Las hifas
del hongo salieron, al igual que para Lecanicillium sp, perforando las partes
intersegmentales del exoesqueleto de los trips y la salida del hongo se observó
específicamente por las antenas, cabeza y pronoto. En todas las cámaras húmedas
donde se registró presencia del hongo sobre el insecto se observó un crecimiento micelial
blanco sobre el cuerpo, seguido por una esporulación abundante de color verde aceituna
(Figura 4-9).
|
Figura 4-9: Finalización del ciclo infeccioso de Metarhizium sp sobre adultos de
Frankliniella spp
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4.4 Identificación molecular de aislamientos con
capacidad entomopatógena
La visualización de los amplicones y el éxito de la PCR se verificaron con una
electroforesis en gel de agarosa al 1% (Figura 4-10) donde se generaron fragmentos del
tamaño esperado de aproximadamente 550-650 pares de bases (pb). Luego de revelar el
gel de electroforesis se realizó la secuenciación de los productos de PCR a través de un
servicio proporcionado por la empresa Macrogen (Seoul, Korea).
Figura 4-10: Amplificación de productos de PCR del gen ITS (550-650 pb). MP: Marcador de Peso Molecular. 1: Lecanicillium sp aislado a partir de trips colectados en campo. 2: Aislamiento recuperado a partir de los bioensayos con Lecanicillium sp. 3: Metarhizium sp aislado a partir de trips colectados en campo. 4: Aislamiento recuperado a partir de los bioensayos con Metarhizium sp. C+: Colletotrichum sp. C-: Control Negativo.
Una vez obtenidas las secuencias completas, fueron depuradas cortando los segmentos
de mala calidad usando el programa Geneious versión 5.4 (Drummond, 2011), seguido
por el ensamble de los reads, obteniendo las secuencias consenso para cada muestra
(Anexo E). Por último, dichas secuencias fueron sometidas a BLAST (NCBI) el cual
mostró un porcentaje de identidad del 100% y un E value de 0.0 con la accesión No.
KC007329.1 (Bonito, Hameed, Krishnan, & Schadt, 2012) que corresponde a
Lecanicillium sp (Figura 4-11). Igualmente, se obtuvo un porcentaje de identidad del 100%
y un E value de 0.0 con la accesión No. FJ545279.1 (Freed & Jin, 2011) que corresponde
a Metarhizium anisopliae (Figura 4-12). Adicionalmente, los hongos recuperados de los
bioensayos fueron así mismo identificados por métodos moleculares, arrojando los
mismos resultados (Tabla 4-4).
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Figura 4-11: Alineamiento de Lecanicillium sp aislado a partir de trips con la accesión del
GenBank: KC007329.1.
Figura 4-12: Alineamiento de Metarhizium sp aislado a partir de trips con la accesión del
GenBank: FJ545279.1.
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Tabla 4-4: Identidad de los aislamientos obtenidos a partir de trips basado en la
amplificación del espacio interno ITS de la región del DNA ribosomal, según BLAST en
NCBI
Muestra Tamaño de
fragmento (pb) BLAST
Número de
accesión
Porcentaje de
identidad E value
1 550-650 Lecanicillium sp KC007329.1 100 0.0
2 550-650 Lecanicillium sp AB378528.1 100 0.0
3 550-650 Metarhizium
anisopliae FJ545279.1 100 0.0
4 550-650 Metarhizium
anisopliae FJ545279.1 99 0.0
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5 Discusión
El aguacate Persea americana Miller pertenece a la familia de las Lauraceas, su
composición genética ha determinado la formación de tres razas: la Mexicana, la
Guatemalteca y la Antillana, de estas tres razas se derivan variedades adaptadas a cada
condición de cultivo, dando frutos con sabores, texturas, colores y olores variados (Bernal
et al., 2008). El aguacate es un producto de gran interés en el mercado mundial,
especialmente la variedad Hass, debido a los diversos atributos nutracéuticos y
sensoriales que posee, especialmente los relacionados con el alto contenido de aceite y
por la presencia de nutrimentos como vitaminas, ácido fólico, biotina, etc, que le confieren
propiedades benéficas para la salud humana, principalmente en la prevención de
enfermedades del sistema circulatorio (Gómez, 2014).
Colombia tiene posibilidades de participar en el escenario internacional del mercado del
aguacate. La producción mundial de aguacate está estimada en 4 millones de toneladas
al año, provenientes de 407.000 hectáreas sembradas. El mercado mundial requiere de 8
millones de toneladas aproximadamente, déficit que se constituye en una oportunidad
para que Colombia pueda entrar con oferta de esta fruta al mercado externo. En el año
2013, Colombia contaba con más de 30.000 hectáreas de aguacate, con una producción
de aproximadamente 203.958 toneladas, que lo ubica como el quinto mayor productor a
nivel mundial (FAO, 2013). Dadas las inmensas posibilidades en el mercado mundial, se
ha dado un gran impulso al sistema de producción tipo exportación, el cual está dirigido al
aguacate Hass, con aproximadamente 8.800 hectáreas en producción en el país, de las
cuales se estima que 3.000 hectáreas, están cultivadas en el departamento de Antioquia
(Gómez, 2014).
Pese a este promisorio panorama y a las postuladas ventajas estratégicas que tiene
Colombia para la exportación de aguacate por oferta ambiental, existen factores que
limitan la competitividad del cultivo con respecto a los demás países productores. Los
problemas de tipo sanitario, entre los que sobresalen las enfermedades ocasionadas por
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hongos patógenos y el ataque de insectos plaga, particularmente los trips, hacen
indispensable la búsqueda de soluciones para responder al reto de la competitividad y
exigencias del mercado. Los trips hacen parte del 10% de los insectos que son
considerados plagas dentro de los 2.5 millones existentes y han sido reconocidos como
plagas de importancia económica en cítricos (Lewis, 1997) y causan graves pérdidas en
aguacate (Bernal et al., 2009).
En el mundo hay descritas alrededor de 5.500 especies de trips en aproximadamente 750
géneros y 9 familias. El suborden Terebrantia comprende ocho de las nueve familias,
incluyendo la familia Thripidae; mientras que el suborden Tubulífera comprende una única
familia, Phlaeothripidae. De todas las especies de trips descritas, el 1% es considerado
perjudicial (Porres, 2008). La familia Thripidae pertenece al orden Thysanoptera y es la de
mayor importancia económica en el cultivo de aguacate ya que en ella se encuentran las
principales especies de trips que causan las lesiones en el fruto. De esta familia es
posible encontrar 1.700 especies en 260 géneros (Mound & Marullo, 1994) y dentro de los
géneros asociados al cultivo de aguacate como perjudiciales cabe mencionar a
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