AISLAMIENTO, EVALUACIÓN Y SELECCIÓN DE MICROORGANISMOS DEGRADADORES DE PENTAERITRITOL TETRANITRATO (PETN) A PARTIR DE AMBIENTES IMPACTADOS CARLOS ANDRÉS FAJARDO GÓMEZ TRABAJO DE GRADO PARA OPTAR POR EL TÍTULO DE MICROBIÓLOGO INDUSTRIAL PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA CARRERA DE MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL FACULTAD DE CIENCIAS BOGOTÁ D.C, COLOMBIA 2009
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AISLAMIENTO, EVALUACIÓN Y SELECCIÓN DE MICROORGANISMOS DEGRADADORES DE
PENTAERITRITOL TETRANITRATO (PETN) A PARTIR DE AMBIENTES IMPACTADOS
CARLOS ANDRÉS FAJARDO GÓMEZ
TRABAJO DE GRADO PARA OPTAR POR EL TÍTULO DE
MICROBIÓLOGO INDUSTRIAL
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
CARRERA DE MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL
FACULTAD DE CIENCIAS
BOGOTÁ D.C, COLOMBIA
2009
AISLAMIENTO, EVALUACIÓN Y SELECCIÓN DE MICROORGANISMOS DEGRADADORES DE
PENTAERITRITOL TETRANITRATO (PETN) A PARTIR DE AMBIENTES IMPACTADOS.
CARLOS ANDRÉS FAJARDO GÓMEZ
Ingrid Schuler, Ph.D.
Decana Académica
Facultad de Ciencias
Janeth Arias, M.Sc.
Bacterióloga
Directora de Microbiología Industrial
AISLAMIENTO, EVALUACIÓN Y SELECCIÓN DE MICROORGANISMOS DEGRADADORES DE
PENTAERITRITOL TETRANITRATO (PETN) A PARTIR DE AMBIENTES IMPACTADOS.
CARLOS ANDRÉS FAJARDO GÓMEZ
Fabio Roldán, Ph.D.
Director
Ziv Arbeli, Ph.D. Johanna Santamaría, Ph.D.
Par evaluador Par evaluador
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NOTA DE ADVERTENCIA
Artículo 23 de la resolución No 13 de julio de 1946
“La universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en
sus trabajos de tesis. Solo se velara porque no se publique nada contrario al dogma y a la
moral católica y porque las tesis no contengan ataques personales contra persona alguna,
antes bien se vea en ellas el anhelo en buscar la verdad y la justicia”.
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AGRADECIMIENTOS
A mi madre por su paciencia y apoyo en momentos importantes, cuya consigna fue
siempre creer en mis capacidades. A mi padre, que toda su sabiduría y experiencia
estuvo a mi alcance en el mejor de los guías. A mis hermanas que siempre son una
motivación. A Fabio Roldán y todos mis compañeros de la unidad de saneamiento y
biotecnología ambiental que permitieron un muy buen ambiente de aprendizaje y en los
que encontré no solo compañeros de trabajo si no también amigos.
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1. RESUMEN
El uso de explosivos se ha extendido a diferentes áreas, además de la industria militar,
está presente en la minería y la construcción. Esto implica que la demanda de estos
compuestos se haya incrementado al igual que su distribución en diferentes ecosistemas,
bien sea por su uso en detonaciones o por el proceso de producción de los mismos.
El pentaeritritol tetranitrato (PETN) es un compuesto de origen antropogénico usado como
explosivo para fabricar cordones detonantes y mechas. Es una molécula inestable por lo
tanto no es recalcitrante en comparación con otros explosivos, pero en grandes
concentraciones puede llegar a ser un problema ambiental.
El tratamiento de los residuos generados durante la fabricación y uso del PETN se limita a
la incineración y la disposición en vertederos, que representan un riesgo para el ambiente.
Por otro lado, la biorremediación es una alternativa económica y ambientalmente
amigable que permitirá la degradación de este tipo de moléculas.
En el presente trabajo se hizo un aislamiento de microorganismos a partir de ambientes
impactados por el proceso de producción de explosivos. Se realizo un muestreo en 12
puntos de una industria fabricante de explosivos, se utilizaron 3 condiciones de
crecimiento diferentes en las que se evaluó el uso del PETN como fuente de nitrógeno y/o
carbono. Con base en criterios morfológicos se escogieron 134 cepas, las cuales fueron
cultivadas en medio T2 con 100 ppm PETN. Finalmente se obtuvo 7 grupos de cepas, los
cuales presentaron degradaciones significativamente mayores.
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2. INTRODUCCION
Desde la invención de la pólvora en el siglo XIII se ha descubierto una variedad bastante
amplia de formulaciones explosivas, y con el paso del tiempo, dichos compuestos se han
convertido convirtieron en herramientas de amplio uso.
La Primera Guerra Mundial trajo consigo un gran avance en la producción de explosivos,
hecho que implicó que se generaran nuevas moléculas que se podrían clasificar dentro
del grupo de xenobioticos, es decir compuestos cuya estructura no se encuentra en la
naturaleza.
El uso de explosivos se ha extendido a diferentes áreas. En la minería se usan en el
proceso de excavación para romper, destruir o debilitar materiales de gran dureza,
normalmente rocas. De igual forma son utilizados en construcciones de diversas obras
civiles, para eliminar obstáculos u obtener materiales para la construcción. Por otra parte
el conflicto armado global representa grandes demandas e implica mayor distribución de
los explosivos en diferentes ecosistemas, bien sea por su uso en detonaciones o por el
proceso de producción de los mismos (1).
El riesgo que el ambiente sea contaminado con explosivos se presenta desde el proceso
de fabricación en donde las aguas residuales y desechos, tienen trazas de estos
compuestos además de otras sustancias que pueden contaminar el ambiente. Otro
problema con el uso de explosivos se presenta cuando no se detonan, lo que forma
lixiviados. Pero no solo implica riesgos ambientales también sociales porque en este
proceso existe además la posibilidad que ocurra un accidente al detonar con su
manipulación
El pentaeritritol tetranitrato (PETN) es un compuesto explosivo usado para fabricar
cordones detonantes y mechas. Se sintetiza a partir de la nitración de pentaeritritol. Al ser
de origen antropogénico se reducen las posibilidades que las comunidades bacterianas
de los ecosistemas, que son afectados con este explosivo, tengan la capacidad de
degradarlo. Sin embargo una exposición prolongada al contaminante puede generar
adaptación en los microorganismos que pueden llegar a utilizarlo en su metabolismo
primario (2)
El objetivo de este trabajo es realizar una búsqueda sistemática de microorganismos con
capacidad degradadora de PETN a partir de muestras de suelo y lodos provenientes de
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una industria productora de explosivos, esto con el fin de aislar posibles cepas
bacterianas con la capacidad metabólica para realizar la degradación total o parcial del
PETN. El aislamiento se realizo en medios de cultivo sólidos suplementados con PETN, y
se verificó la capacidad degradadora mediante la implementación de la técnica de
cromatografía líquida de alta eficiencia (HPLC).
3. JUSTIFICACION
Hasta hace poco los métodos que se utilizaban para la eliminación de estos compuestos
se limitaban a la incineración y el uso de vertederos, pero estos no dejan de ser un riesgo
ambiental. La incineración produce gases tóxicos y con la implementación de vertederos
la contaminación se puede extender movilizándose a través de aguas subterráneas (3).
Una alternativa para el tratamiento de contaminantes xenobióticos como los explosivos,
es la biodegradación. Se han encontrado microorganismos capaces de degradar
sustancias tan complejas como lo son los hidrocarburos y los pesticidas, para convertirlos
en moléculas menos toxicas o mineralizarlos totalmente.
El pentaeritritol tetranitrato (PETN) es un compuesto explosivo usado para fabricar
cordones detonantes y mechas. Se sintetiza a partir de la nitración de pentaeritritol. Al ser
de origen antropogénico se reducen las posibilidades que las comunidades bacterianas,
de los ecosistemas que son afectados con este explosivo, tengan la capacidad de
degradarlo. Sin embargo una exposición prolongada al contaminante puede generar
adaptación en los microorganismos que pueden llegar a utilizarlo en su metabolismo
primario (2).
Se hace mucha investigación en el proceso de biodegradación de compuestos
explosivos, sin embargo la degradación de PETN no ha sido suficientemente estudiada y
son pocas las publicaciones existentes en este tema. Es por esto que investigaciones
como esta, en la que se contribuye con información sobre la degradación de PETN son
necesarias.
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4. REFERENTES CONCEPTUALES
4.1 BIODEGRADACIÓN
El proceso de biodegradación generalmente envuelve el rompimiento de moléculas
orgánicas contaminantes, usualmente por acción bacteriana. Proceso en el cual las
moléculas que experimentan la biodegradación, son utilizadas para generar biomasa y
energía. El resultado es la alteración en la estructura original del compuesto, el cual
puede convertirse en una molécula menos compleja que la original, además que
características como la toxicidad y la movilidad pueden verse afectadas
(biotransformación). En el mejor de los casos, la biodegradación de un compuesto da
lugar a la mineralización completa hasta CO2.
La biodegradación de la mayoría de los contaminantes orgánicos ocurre mas rápido bajo
condiciones aerobias, cuando el oxigeno presente es usado como aceptor final de
electrones. Sin embargo en condiciones anaerobias también puede observarse
biodegradación, con la participación de otros aceptores de electrones como lo son el
nitrato (NO3) y el sulfato (SO4-2).
La biodegradabilidad definida como la susceptibilidad de las moléculas a la alteración por
el metabolismo microbiano depende del proceso de adaptación de los microorganismos,
en donde el tiempo de contacto del contaminante con el ambiente juega un papel
importante. Un mayor tiempo de contacto con el contamínate implica mayores
posibilidades de adaptación por parte de las cepas nativas.
La alteración de las moléculas contaminantes puede ocurrir por (i) ataque enzimático intra
o extracelular, en donde la sustancia diana es usada como fuente de carbono, nitrógeno o
energía. (ii) por ataque enzimático en el cual no se detecta beneficio para el
microorganismo pero igual ocurre la degradación, y es definido como cometabolismo. (3).
4.2. EXPLOSIVO
4.2.1 DEFINICIÓN
Un explosivo es un compuesto químico o una mezcla de compuestos que tiene la
capacidad de experimentar una reacción química de alta velocidad, que libera una gran
cantidad de energía, sin la participación de reactantes externos. Esta liberación de
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energía puede ser disipada como ondas explosivas, propulsión de desechos, o por la
emisión de radiación (4).
4.2.2 PENTAERITRITOL TETRANITRATO (PETN)
El pentaeritritol tetranitrato, PETN (2,2-bis[(nitrooximetil]-1,3-propanodiol dinitrato) es un
explosivo secundario tipo nitrato éster (Figura 1). Hace parte de los denominados altos
explosivos ya que solo pueden detonar por la explosión originada por un explosivo
primario o iniciador (5). En términos generales es un compuesto de baja estabilidad (4) y
es utilizado principalmente como explosivo, en la fabricación de detonadores y cables de
detonación.
Figura 1: Pentaeritritol tetranitrato (2,2-bis[(nitrooximetil]-1,3-propanodiol dinitrato) PETN (Tomado de: Spain et al., 2000)
El área de la medicina es el segundo campo de acción para el PETN en donde es usado
como vasodilatador. Este compuesto fue implementado en la terapia de enfermedades
cardiacas hace más de un siglo. En la actualidad el PETN es utilizado en el control de la
angina pectoris o angina de pecho, que es una enfermedad en el corazón, cuyos
síntomas son similares a los de un ataque cardiaco. (6)
El PETN fue sintetizado por primera vez en 1894 por la nitración de la molécula orgánica
pentaeritritol en presencia de acido sulfúrico como catalizador. Sin embargo, su
producción comercial solo pudo ser lograda hasta que la producción de formaldehído y
acetaldehído, requerido en la síntesis, empezó a estar disponible una década antes de la
segunda guerra mundial. Este compuesto resultaba ser muy sensible al impacto hecho
por el cual se empezó a fabricar una composición que contenía 50 % PETN y 50% TNT
que fue llamada pentolita, producto que presentaba mayor estabilidad. Esta formulación
fue usada para la fabricación de granadas y detonadores (4).
Debido a su baja presión de vapor (1.035×10-10 mmHg) y su baja constante de Henry
(1.2×10-11 atm·m3/mole), es poco probable que el PETN se volatilice fácilmente. Es un
compuesto hidrofóbico, posee una solubilidad en el agua de 6mg/L y tiene un bajo logKow
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de 1.61, características que lo hacen débil a la absorción en materiales orgánicos en
suelos y sedimentos y puede ser transportado a través del agua subterránea,
expandiendo de esta forma la pluma de contaminación (2).
La estructura del PETN (C-O-NO2) es análoga a la de los sulfato esteres (C-O-SO3-) y
fosfato esteres(C-O-PO32) que se encuentran naturalmente en el ambiente. Sin embargo
los nitrato esteres solamente son introducidos en el ambiente por las actividades
humanas.
4.3 BIODEGRADACION DE PETN
Actualmente, se conocen diferentes tratamientos, físicos, químicos y biológicos para tratar
ambientes contaminados con explosivos, entre los que destacan la incineración de suelos,
el compostaje y la biorremediación. Sin embargo, estudios realizados (1) demuestran que
la degradación biológica de compuestos explosivos representa ventajas frente a las otras
soluciones, debido a que es un tratamiento ambientalmente amigable, económico, seguro
para el personal que lo efectúa y efectivo debido a que no traslada el contaminante de un
ambiente a otro, sino que realmente lo trasforma en metabolitos simples e inocuos (7).
Los estudios que se han realizado en degradación de 2,4,6 trinitro tolueno (TNT) (8,9) han
sido mas numerosos en comparación al estudio de la degradación de PETN. Hecho que
hace que aumente la relevancia de una investigación como esta, dentro de la comunidad
científica.
Uno de los mecanismos más importantes en la biodegradación de estos compuestos es la
desnitrificación reductiva por medio de una red de transferencia de dos electrones,
formando un alcohol y un nitrito, como compuestos intermediarios y finalmente dan lugar a
una molécula de tipo ester nitroso. Estas reacciones son catalizadas principalmente por la
familia de enzimas de la old yellow enzyme (OYE), las cuales son flavo enzimas
dependientes de NADPH (Figura 2) (10).
Figura 2: ruta metabólica general de la desnitrificación reductiva de los esteres de nitrato
por flavo enzimas de la familia OYE.
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A esta familia de enzimas también pertenecen la Enterobacter cloacae PB2