AISLAMIENTO DE LA SECUENCIA ADNc DE UN …dgecytm.sep.gob.mx/work/models/dgecytm/Resource/802/1/images/P … · Amplificación IAG-Lv (parcial) = uso cebadores específicos diseñados

AISLAMIENTO DE LA SECUENCIA ADNc DE UN

PÉPTIDO TIPO INSULINA DERIVADO DE LA GLÁNDULA

ANDROGÉNICA (IAG) DE CAMARONES MARINOS DEL

GÉNERO LITOPENAEUS EN COSTA RICA.

1Sancho-Blanco, Carolina.1Umaña-Castro, Rodolfo., 1Solano-González,

Stefany., 2 Rosen, Ohad; 2 Sagi, Amir, 3Alfaro-Montoya, Jorge

Financiamiento por FEES-

2013

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

82 86 90 94 98 2002 2006

Cultivo

Pesca

Producción mundial de camarones

Programas de domesticación y mejoramiento de la

producción

32 %

46 %

50 %

73%

Reproducción controlada

Línea mejorada de

camarones

Cruce

Desove

- Producción de larvas

de ambos sexos

(Laboratorio de post-

larvas)

- Cría y engorde

de PL

- Poblaciones de

individuos ambos

sexos.

Limitante biológica

Dimorfismo sexual regula los rendimientos

productivos de la industria del cultivo mundial.

Inicia en L.vannamei =

10-17g

Creación de poblaciones

monosexuales de hembras

que permitiría producir animales

de mayores tallas

Solución

Glándula Androgénica

Responsable de la diferenciación sexual: Hormona androgénica

tipo insulina

Exclusivo

machos

(2012) Se describe estructura de la glándula

androgénica de varias especies de camarones y

su posible localización.

Ámpula terminal

IAG y abordajes moleculares:

Silenciamiento genético

Conociendo la secuencia de la IAG

Inhibir la expresión de la IAG

Reversión sexual

Lv-IAG

Banzai et al. 2012

Malar-IAG (Macrobrachium lar)

Inhibir la

IAG

Silenciamiento génico: Inhibir expresión IAG Lv-IAG seq.

Complejo

RISC

Dicer

Reconoce ARNm y

busca homólogo

Macho : ZZ o XY ??? Cromosoma sexual homogamético o

heterogamético

Machos (ZZ)

Hembras (ZW)

(IAG+) (IAG-)

Neomacho

ZZ Neohembra

ZW

Hembra (ZW)

Lv-GA+

Neomachos (ZW)

Hembra (ZW)

X

X

Machos (ZZ)

= 100%

(ZW)

25% Machos (ZZ)

50% Hembras (ZW)

25% Hembras

?

WW

Vía práctica para producir hembras

en Litopenaeus

Objetivos

Aislar la secuencia parcial de ADNc que codifica el

péptido específico tipo insulina a partir de la

glándula androgénica de Litopenaeus occidentalis,

Litopenaeus stylirostris y Litopenaeus vannamei,

con el fin de mejorar la producción en estos

peneidos.

Objetivos específicos

Extracción

de ARN

RT-PCR

Determinar

presencia

transcrito

Obtener la

secuencia

de ADNc

Determinar

la identidad

Banzai et al. 2012

Malar-IAG (Macrobrachium lar

Metodología

ANIMALES Y MUESTRAS DE TEJIDOS

Costa central del Pacífico costarricense

Estanques de producción

Ablación bilateral 8 días =20g aprox

Almacenar a -20ºC

Uso inmediato

Extracción de ARN

3 Métodos

Kit Pure Link

(Invitrogen)

SDS-Acetato

de potasio

Fenol-

Cloroformo: A.

isoamílico

Macerados

manualmente

Cordones celulares asociados al

ámpula terminal (CC-AT), ducto

distal (dd), ducto medio (dm) y

hepatopáncreas (hep).

PCR-TRANSCRIPCIÓN REVERSA

Síntesis de la primera hebra (ADNc) usando un cebador OligodT (T(24)VN)

Amplificación IAG-Lv (parcial) = uso cebadores específicos diseñados a partir de JQ670898.1 (GenBank), cebadores degenerados diseñados mediante el software bioinformático Primer3

Control positivo= EFT-2

5´GTCTTCGTGCAGGAGAAACTCG 3´ y 5´CGACGAGGGCACCATCAGTTA 3´. (Manor et al. 2007)

dm: ducto medio

dd: ducto distal

Hep:

hepatopáncreas

Figura 1.Análisis RT-PCR para tejido específico del gen constitutivo factor de

elongación (EFT-2) en Litopenaeus occidentalis utilizando diferentes métodos de

extracción de ARN total. Los carriles 2-4 corresponden a la extracción con Fenol-

Cloroformo-Alcohol isoamílico (PCI) de ducto medio (dm), ducto distal (dd) y

hepatopáncreas (hep). Los carriles 5-7: SDS/Acetato de Potasio (SDS-AcK) de dm,

dd y hep. Los carriles 9-11: Kit comercial PureLink™ (Ambion) de dm, dd y hep.

Carriles 1 y 8: marcador de peso molecular 1Kb, carriles 12-14: sin carga.

Electroforesis de agarosa al 2%, TBE 1X.

Discusión

ARN de alta calidad es esencial para RT-PCR (Umaña et al., 2013).

Efectividad de los métodos de extracción

SDS-AcK= simple, reproducible, económico y no tóxico

PureLink™ (Ambion) mostró amplificaciones con una intensidad superior, para todos los tejidos ensayados, en comparación con los otros métodos de aislamiento de ARN.

Figura 2. Análisis RT-PCR de tejido específico de cordones celulares asociados

al ámpula terminal (CC-AT), de Litopenaeus vannamei. A) Carriles 2-3,

amplificación del ADNc de un fragmento del transcripto codificante para la

hormona tipo insulina de la glándula androgénica (Lv-IAG), carril 4, gen

constitutivo factor de elongación (EFT-2) como control positivo. Electroforesis de

agarosa al 2%., TBE 1X. B) El ARN molde se extrajo a partir de ámpulas

terminales de individuos machos de L. vannamei ablacionados.

Tejido

Cordones

celulares

asociados al

ámpula terminal

(CC-AT) 350 pb

Discusión

El Fragmento obtenido de la IAG 350 pb, resultados concuerda

con los obtenidos por Garza-Torres (2011).

Li y colaboradores (2012) reportaron un fragmento de IAG en

Fenneropenaeus chinensis con un tamaño aproximado de 781

pb.

Mareddy y colaboradores (2011) identificaron en Penaeus

monodon un trascripto parcial codificante de 300pb.

Banzai y colaboradores (2011) En Marsupenaeus japonicus,

aislaron un fragmento de 813pb..

Secuenciación de los amplicones Lv-IAG para definir su identidad

en proceso

IAG de L stylirostris y L. occidentalis

Uso del kit Gene Racer para obtener la secuencia completa en la

tres especies

Conclusiones

Se ensayó diferentes métodos de extracción de ARN total, determinando que el protocolo basando en el kit comercial es el que genera mejores rendimientos, sin embargo, el método inorgánico arroja resultados prometedores.

Se realizó la puesta a punto del ensayo RT-PCR para diferentes tejidos en camarones marinos, empleando cebadores específicos dirigidos a un gen constitutivo y a la IAG

Se aisló una secuencia parcial de ADNc derivada de cordones celulares asociados al ámpula terminal de machos ablacionados, la cual se presume que pertenece al transcripto codificante del péptido específico tipo insulina de la glándula androgénica de Litopenaeus vannamei.

Se inició el proceso de secuenciación del transcripto codificante parcial obtenido de la glándula androgénica de machos de Litopenaeus vannamei ablacionados.

Preguntas

Gracias por su atención