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MEDIOS DE USO COMÚN EN EL LABORATORIO

A continuación se exponen los medios más utilizados en el laboratorio de Microbiología con sus características.

AGAR SANGRE

Formación:

Medio para propósitos generales, para el aislamiento y cultivo de numerosos microorganismos. Con la adición de sangre, el medio es útil tanto para el aislamiento y cultivo de microorganismos aerobios y anaerobios nutricionalmente exigentes a partir de una gran variedad de muestras, como para la observación de reacciones de hemólisis (es el fenómeno de la desintegración de los glóbulos rojos o hematíes)También, este medio de cultivo, puede utilizarse como medio base para preparar el medio agar chocolate.

Fórmula (en gramos por litro)Infusión de músculo de corazón 375.0Peptona 10.0Cloruro de sodio 5.0Agar 15.0

pH final: 7.3 ± 0.2

Añadir en forma aséptica un 5% de sangre estéril desfibrinada a temperatura ambiente, el agar debe estar a 45°C.

Siembra: Por inoculación directa del material en estudio, sobre la superficie del medio de cultivo.Incubación: El tiempo, temperatura y atmósfera de incubación, dependerán del

microorganismo que se quiera aislar.

Tipo de bacterias:Microorganismos Crecimiento Hemólisis

E. coli Abundante --S. aureus Abundante Beta

S. pyogenes Abundante BetaS. pneumoniae Abundante AlfaS. pneumoniae Abundante Alfa

Crecen gérmenes aerobios y anaerobios rápidamente, así como los del género Cándida. También permite el crecimiento de algunos gérmenes exigentes como estreptococos, pneumococos, Brucella, corinebacterias, Erysipelothrix y Pasteurella.

Medio preparado: ámbar.Medio preparado con 5% de sangre de carnero: rojo cereza.

Almacenamiento:Medio deshidratado: a 10-35 ºC.Medio preparado: a 2-8 ºC.

AGAR CHOCOLATE

Formación:

Este medio utiliza la misma base que el Agar Sangre.

Fórmula (en gramos por litro)Infusión de músculo de corazón 375.0

Peptona 10.0Cloruro de sodio 5.0

Agar 15.0pH final: 7.3 ± 0.2

Después de añadir la sangre y agitando frecuentemente se mantiene el medio de cultivo a 80°C por 10 minutos hasta que adquiera un color pardo chocolatado.

Cómo actúa:

La infusión de músculo de corazón y la peptona, otorgan al medio un alto valor nutritivo, que permite el crecimiento de una gran variedad de microorganismos, aún de aquellos nutricionalmente exigentes. El cloruro de sodio mantiene el balance osmótico.El agregado de sangre al medio de cultivo, en concentración final de 5-10 %, aporta nutrientes para el crecimiento bacteriano, y permite detectar hemólisis.

Tipo de bacterias:

Permiten el aislamiento de gonococos y meningococos, por en el que pueden crecer muchos otros microorganismos exigentes de la mayor parte de los gérmenes encontrados en patología humana o veterinaria

También, para el aislamiento de las Neisserias patógenas y de los Haemophilus.

Microorganismos Crecimiento HemólisisE. coli Abundante --

S. aureus Abundante BetaS. pyogenes Abundante Beta

S. pneumoniae Abundante AlfaS. pneumoniae Abundante Alfa

Siembra: Por inoculación directa del material en estudio, sobre la superficie del medio de cultivo.Incubación: El tiempo, temperatura y atmósfera de incubación, dependerán del microorganismo que se quiera aislar.

AGAR MCCONKEY

Formación:

Este medio se utiliza para el aislamiento de bacilos Gram negativos de fácil desarrollo, aerobios y anaerobios facultativos. Permite diferenciar bacterias que utilizan o no, lactosa en muestras clínicas, de agua y alimentos. Todas las especies de la familia Enterobacteriaceae desarrollan en el mismo. Los microorganismos no fermentadores de lactosa producen colonias incoloras. Se incluye también cristal violeta para inhibir el crecimiento de las bacterias Gram positivas, especialmente estafilococos y enterococos.

Cómo actúa:

Fórmula (en gramos por litro) Instrucciones  Peptona 17.0

Suspender 50 g del polvo por litro de agua destilada. Reposar 5 minutos y mezclar hasta uniformar. Calentar suavemente y hervir 1 a 2 minutos hasta disolver. Esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 minutos.

  Pluripeptona 3.0  Lactosa 10.0  Mezcla de sales biliares 1.5  Cloruro de sodio 5.0  Agar 13.5  Rojo neutro 0.03  Cristal violeta 0.001

pH final: 7.1 ± 0.2

Siembra- Sembrar en superficie. - Utilizando la técnica de Pour Plate: sembrar 1 ml de muestra y agregar aproximadamente 15 ml de medio de cultivo fundido y enfriado a 45-50 ºC.

IncubaciónDurante 18-48 horas, a 35-37 ºC, en atmósfera aeróbica

Bacterias:

Microorganismos ColoniasEscherichia coli Rojas con halo turbio

Klebsiella pneumoniae Rosadas mucosasSalmonella typhimurium Incoloras, transparentes

Shigella flexneri Incoloras, transparentesProteus mirabilis Incoloras, transparentes

Enterococcus faecalis Diminutas, incoloras,

opacas

Características del medioMedio preparado: rojo púrpura

Almacenamiento:Medio deshidratado: a 10-35 ºC. Medio preparado: a 2-8 ºC.

AGAR SLMONELLA-SHIGELLA

Formación:

Es un medio de cultivo selectivo y diferencial. La selectividad, está dada por la sales biliares y el verde brillante, que inhiben el desarrollo de bacterias Gram positivas, de la mayoría de los coliformes y el desarrollo invasor del Proteus spp.Es diferencial debido a la fermentación de la lactosa, y a la formación de ácido sulfhídrico a partir del tiosulfato de sodio. Los pocos microorganismos fermentadores de lactosa capaces de desarrollar, acidifican el medio haciendo virar al rojo el indicador de pH, obteniéndose colonias rosadas o rojas sobre un fondo rojizo.

Cómo actúa:

Se diseñó para diferenciar fermentadores de lactosa de los que no la fermentan, proporcionando buena inhibición de coliformes sin restringir el crecimiento de otros bacilos

Gram-negativos (BGN) patógenos.

Fórmula (en gramos por litro) Instrucciones  Pluripeptona 5.0

Suspender 60 g del polvo por litro de agua destilada. Reposar 5 minutos y mezclar hasta homogeneizar. Calentar a ebullición durante 2 o 3 minutos. NO ESTERILIZAR EN AUTOCLAVE. Enfriar a 45-50°C y distribuir unos 20 ml por placa. Secar la superficie del medio unos minutos en la estufa.

  Extracto de carne 5.0  Lactosa 10.0  Mezcla de sales biliares 8.5  Citrato de sodio 8.5  Tiosulfato de sodio 8.5  Citrato férrico 1.0  Agar 13.5  Verde brillante 0.00033  Rojo neutro 0.025

pH final: 7.0 ± 0.2

Siembra: Sembrar por estriado la superficie del medio de cultivo.Recomendaciones: se aconseja sembrar en forma conjunta una placa de agar E.M.B o de agar Mac Conkey.

IncubaciónDurante24-48 horas a 35-37 °C, en aerobiosis.

Bacterias: Salmonella y Shigella (y otros no fermentadores de lactosa)

Bacteria Crecimiento bacterias ColorSalmonella enteritidis Bueno IncoloraProteus mirabilis Aceptable IncoloraShigella flexineri Regular IncoloraEnterococcus faecalis Escaso IncoloraEnterobacter aerogenes Regular Crema/rosa

Medio preparado: rojo naranja.

Almacenamiento: Medio deshidratado: a 10-35 ºC.

AGAR NUTRITIVOMedio de cultivo utilizado para propósitos generales, para el aislamiento de microorganismos poco exigentes en lo que se refiere a requerimientos nutritivos.Su uso está descripto en muchos procedimientos para el análisis de alimentos, aguas y otros materiales de importancia sanitaria.

Formación: Por las características de sus componentes es un medio usado para el cultivo de microorganismos poco exigentes en sus requerimientos nutricionales. No contiene inhibidores del desarrollo bacteriano. La pluripeptona es la fuente de carbono y nitrógeno para el desarrollo bacteriano. El agregado de cloruro de sodio permite el enriquecimiento con sangre de carnero u otras sustancias para facilitar el cultivo de microorganismos exigentes.

Fórmula (en gramos por litro) InstruccionesPluripeptona 5.0 Suspender 31 g de polvo por litro de agua

destilada. Mezclar y dejar reposar 5 minutos. Calentar suavemente agitando y hervir 1 o 2 minutos hasta su disolución. Distribuir y esterilizar a 121°C durante 15 minutos.

Extracto de carne 3.0Cloruro de sodio 8.0

Agar 15.0

pH final: 7.3 ± 0.2

Siembra: En superficie o por la técnica de pour plate, según el uso a que se destine.

Incubación: En aerobiosis, a 35-37 ºC durante 24 horas.

Bacterias:

a-Agar nutritivo:  Microorganismos Crecimiento

P. mirabilis Bueno-excelente

E. coli Bueno-excelenteS. aureus Bueno-excelenteB. cereus Bueno-excelenteE. faecalis Bueno-excelente

P. aeruginosa Bueno-excelente

b-Agar nutritivo suplementado con 5% de sangre de carnero: Microorganismos Crecimiento Hemólisis

S. pyogenes Abundante BetaS. pneumoniae Abundante AlfaS. pneumoniae Abundante Alfa

Medio preparado: ámbar claro a medio ligeramente opalescente. Medio deshidratado: a 10-35 ºC Medio preparado: a 2-8 ºC.

AGAR CALDO NUTRITIVO

Medio de cultivo utilizado para propósitos generales, para el desarrollo de microorganismos con escasos requerimientos nutricionales.Su uso está descripto en muchos procedimientos para el análisis de alimentos, aguas y otros materiales de importancia sanitaria.

Formación: Medio no selectivo, contiene pluripeptona y extracto de carne que constituyen la fuente de carbono y nitrógeno, necesarias para el adecuado desarrollo bacteriano.Puede ser utilizado además, como pre-enriquecimiento en la búsqueda de Salmonella spp., a partir de alimentos, ya que permite recuperar células dañadas, diluir metabolitos tóxicos y sustancias inhibitorias.

Fórmula (en gramos por litro) InstruccionesPluripeptona 5.0 Emplear 8 g de polvo por litro de agua

destilada. Si es necesario, calentar hasta disolver. Distribuir y esterilizar en autoclave a 118-121°C durante 15 minutos.

Extracto de carne 3.0

pH final: 6.9 ± 0.2

Siembra: Por inoculación directa de la muestra o del microorganismo en estudio.Incubación: En aerobiosis, a 35-37 ºC durante 24 horas.

Bacterias:

Examinar los tubos para evaluar el crecimiento por turbiedad. Cuando sea necesario, subcultivar en medios sólidos apropiados y realizar la identificación bioquímica.

Microorganismos Crecimiento

P. mirabilis Bueno

E. coli BuenoS. aureus Bueno

S. epidermidis BuenoS. typhimurium BuenoP. aeruginosa Bueno

Medio preparado: ámbar claro.Almacenamiento: Medio deshidratado: a 10-35 ºC.Medio preparado: a 2-8 ºC.

AGAR SABOURAUD GLUCOSADO

Medio utilizado para el aislamiento, identificación y conservación de hongos patógenos y saprófitos. También es útil para el cultivo de levaduras. .

Formación:Medio de cultivo recomendado para el aislamiento y desarrollo de hongos, particularmente los asociados con infecciones cutáneas (piel, pelo, etc.) . En el medio de cultivo, la pluripeptona y la glucosa, son los nutrientes para el desarrollo de microorganismos. El alto contenido de glucosa, la presencia de cloranfenicol y el pH ácido, favorecen el crecimiento de hongos por sobre el de bacterias.Además, al medio de cultivo, pueden agregarse otros agentes selectivos de crecimiento.

Fórmula (en gramos por litro) InstruccionesPluripeptona 10.0 Suspender 65 g del polvo por litro de agua

destilada. Reposar 5 minutos y mezclar hasta uniformar. Calentar agitando frecuentemente y hervir 1 minuto hasta disolver. Distribuir y esterilizar 15 minutos a 118-121°C. Mantener en lugar fresco, pues la exposición al calor hidroliza los componentes. Distribuir en placas o en tubos con cierre hermético

Glucosa 40.0Cloranfenicol 0.05

Agar 15.0

pH final: 5.6 ± 0.2

Siembra: Depende del uso, puede ser tanto en tubo como en placa. Consultar referencias de métodos recomendados. .

Incubación: El tiempo de incubación dependerá del microorganismo que se esté buscando aislar. .

Bacterias:

Microorganismos CrecimientoSaccharomyces cerevisiae BuenoAspergillus niger BuenoCandida albicans ATCC 10231 Bueno

Medio preparado: ámbar claro, ligeramente opalescente sin ningún precipitado. Almacenamiento: Medio deshidratado: a 10-35 ºC. .Medio preparado: a 2-8 ºC.

AGAR MANITOL salado

Medio de cultivo selectivo y diferencial, utilizado para el aislamiento y diferenciación de estafilococos. Es recomendado para el aislamiento de estafilococos patogénicos a partir de muestras clínicas, alimentos, productos cosméticos y otros materiales de importancia sanitaria.También, este medio puede utilizarse para el cultivo de especies halófilas de Vibrio, si no se dispone de medios apropiados (TCBS Medio, Medio Marino, etc.), aunque algunas especies pueden no desarrollar.

Formación: Se trata de un medio altamente selectivo debido a su alta concentración salina. Los estafilococos coagulasa positiva hidrolizan el manitol acidificando el medio; las colonias aparecen rodeadas de una zona amarilla brillante. Los estafilococos coagulasa negativos, presentan colonias rodeadas de una zona roja o púrpura. Las colonias sospechosas, se repicarán en un medio sin exceso de cloruro de sodio para efectuarles, posteriormente, la prueba de la coagulasa. En el medio de cultivo, el extracto de carne y la pluripeptona, constituyen la fuente de carbono, nitrógeno, vitaminas y minerales, el manitol es el hidrato de carbono fermentable, el cloruro de sodio (que se encuentra en alta concentración) es el agente selectivo que inhibe el desarrollo de la flora acompañante, y el rojo fenol es el indicador de pH. Las bacterias que crecen en un medio con alta concentración de sal y fermentan el manitol, producen ácidos, con lo que se modifica el pH del medio y vira el indicador de pH del color rojo al amarillo.

Fórmula (en gramos por litro) Instrucciones  Extracto de carne 1.0

Suspender 111 g de polvo por litro de agua destilada. Reposar 5 minutos y mezclar calentando a ebullición durante 1 o 2 minutos. Distribuir y esterilizar en autoclave a 118-121°C durante 15 minutos.

  Pluripeptona 10.0  d-Manitol 10.0  Cloruro de sodio 75.0  Agar 15.0  Rojo de fenol 0.025pH final: 7.4 ± 0.2

Siembra: Sembrar en superficie un inóculo denso de la muestra.

Incubación: De rutina: durante 18-24 horas a 35-37 °C, en aerobiosis.Se recomienda la incubación durante 3 días a 32 °C, en aerobiosis.

Bacterias:

Microorganismos Crecimiento Características de las coloniasStaphylococcus aureus Excelente Amarilla

Staphylococcus epidermidis Bueno RojaEscherichia coli Inhibido Inhibido

Klebsiella pneumoniae Inhibido Inhibido

Medio preparado: rojo Almacenamiento: Medio deshidratado: a 10-35 ºC. Medio preparado: a 2-8 ºC.

AGAR MULLER HINTON

Este medio de cultivo ha sido recomendado universalmente para la prueba de sensibilidad a los antimicrobianos. Además es útil con el agregado de sangre para el cultivo y aislamiento de microorganismos nutricionalmente exigentes.

Formación:El Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI), ex National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS), recomendó su uso en forma rutinaria para la realización del antibiograma en medio sólido, debido a una serie de factores que se detallan a continuación: presenta buena reproducibilidad lote a lote en las pruebas de sensibilidad, su contenido en inhibidores de sulfonamidas, trimetoprima y tetraciclina es bajo, la mayoría de los patógenos crece satisfactoriamente y una gran cantidad de datos han sido evaluados y avalados usando este medio de cultivo.Cuando se suplementa con sangre de carnero al 5%, es útil para realizar las pruebas de sensibilidad a los antimicrobianos en especies de estreptococos.

Fórmula (en gramos por litro) InstruccionesInfusión de carne 300.0 Suspender 37 g del medio deshidratado en un litro de agua

destilada. Dejar embeber de 10 a 15 minutos. Calentar con agitación frecuente y hervir durante 1 minuto. Esterilizar a 121°C durante 15 minutos. Enfriar a 45°-50°C y distribuir a cajas de Petri (o agregar los suplementos que se desee) hasta un nivel de 4 mm sobre una superficie horizontal (25-30 ml en placas de 9 cm de diámetro).

Peptona ácida de caseína 17.5Almidón 1.5

Agar 15.0

pH final: 7.3 ± 0.1

Siembra: de tipo “prueba de sensibilidad a los antimicrobianos”.Incubación: de tipo “prueba de sensibilidad a los antimicrobianos”, la metodología apropiada.

Bacterias:

Para el control de precisión y exactitud del agar de Mueller Hinton se usan las siguientes cepas control: S. aureus            E. coli                  P. aeruginosa     E. faecalis         

Para evaluar el desempeño de inhibidores de beta lactamasa, se utiliza la cepa control:E. coli                

Medio preparado: ámbar.Almacenamiento:Medio deshidratado: a 10-35 ºC.Medio preparado: a 2-8 ºC.

AGAR BASE (Baird Parker)

Medio de alta especificidad diagnóstica, selectivo y diferencial para el aislamiento y recuento de estafilococos coagulasa positiva en alimentos y otros materiales de importancia sanitaria. Los estafilococos coagulasa positiva reducen el telurito a teluro y originan colonias de color grisáceo-negro, y dan reacción sobre la yema de huevo produciendo alrededor de la colonia una zona opaca que a menudo tiene una zona clara más externa

Fórmula (en gramos por litro) InstruccionesPeptona de caseína 10.0 Suspender 60 g del medio deshidratado en 940ml de agua

destilada. Dejar en reposo 5 a 10 minutos. Calentar agitando frecuentemente y hervir durante 1 minuto. Distribuir y esterilizar en autoclave a 121°C (15 libras) durante 15 minutos. Enfriar a 45°-50°C y agregar 50 ml de la emulsión de yema de huevo y 10ml de la solución de telurito (Código B03-601-61). Homogeneizar y distribuir en cajas de Petri.

Extracto de carne 5.0Extracto de levadura 1.0Cloruro de litio 5.0Agar 17.0Glicina 12.0Piruvato de sodio 10.0

pH final: 6.8 ± 0.2

Siembra: Dejar secar la superficie de la placa preparada y extender 0.1 ml de la dilución de la muestra a analizar. Incubación: 24-48 horas a 35-37 °C, en aerobiosis.

Bacterias:Microorganismos Crecimiento Apariencia

E. coli Inhibido ---P. mirabilis Bueno Colonias marrones sin zona clara u opaca alrededor

S. aureus Bueno a excelenteColonias negras con borde incoloro, convexas, rodeadas

de una zona opaca, con una zona clara externa.

S. epidermidis Escaso o buenoColonias negras, de tamaño irregular. Zona opaca

alrededor de la colonia (no hay zona clara).

Medio preparado: ámbar claro opalescente (sin el agregado de yema de huevo).Almacenamiento: Medio deshidratado: a 10-35 ºC.Medio preparado: a 2-8 ºC.

AGAR PSEUDOMONA P.

Medio de cultivo utilizado para el aislamiento, la detección y la diferenciación de especies de Pseudomonas spp., en base a la producción de piocianina. Conocido también como medio King A.

Formación:En el medio de cultivo, la peptona de gelatina aporta los nutrientes necesarios para el desarrollo bacteriano, la glicerina favorece la producción de pigmentos, las sales de magnesio y potasio estimulan la producción de piocianina y piorrubina e inhiben la producción de fluoresceína.

Fórmula (en gramos por litro) Instrucciones  Peptona de gelatina 20.0 Suspender 46.4 g del polvo en un litro de agua destilada.

Agregar 10 ml de glicerina. Calentar con agitación constante para homogeneizar el producto. Llevar a ebullición para que se disuelva por completo. Distribuir y esterilizar 15 minutos a 121 ºC.

  Sulfato de potasio 10.0  Cloruro de magnesio 1.4

  Agar 15.0

pH final: 7.0 ± 0.2

Siembra: A partir de un cultivo puro de 18-24 horas, del cual se sospeche la presencia de Pseudomonas spp., tomar una colonia y estriar la superficie del medio.Incubación: Durante 18-24 horas a 35-37 ºC, en aerobiosis. Si no se observa crecimiento, reincubar a 25-30 ºC, o dejar a 22 ºC y observar diariamente hasta 7 días.

Bacterias: Un resultado positivo es por observación de los pigmentos piocianina y/o piorrubina.

Cepa Crecimiento Producción de Fluoresceína Producción de Piocianina

P. aeruginosa Bueno + +P. fluorescens Bueno + -

P. putida Bueno + -P. mallei Bueno - -

P. stutzeri Bueno - -S. maltophilia Bueno - -

B. cepacia Bueno - -Escherichia coli Bueno - -

Limitaciones- La ausencia de piocianina no descarta que el microorganismo aislado sea P. aeruginosa.- Bajas cantidades de piocianina pueden no ser evidenciadas, por eso, ante la sospechade su presencia, se recomienda agregar al medio de cultivo unas gotas de cloroformo, para exaltar la visualización del pigmento. .- La presencia concomitante de piorrubina y/o piomelanina, puede afectar la visualización del color característico de la piocianina. .- La producción de pigmento, puede aumentarse dejando los tubos conteniendo medio de cultivo a 22 ºC luego de haberlos incubado previamente toda la noche a 35-37 ºC.  Medio preparado: color blanco-amarillo transparenteAlmacenamiento: Medio deshidratado: a 10-35 ºC. .Medio preparado: a 2-8 ºC.

AGAR E.M.B.

Este medio (también denominado E.A.M.) es utilizado para el aislamiento selectivo de enterobacterias, bacilos Gram negativos de rápido desarrollo y escasas exigencias nutricionales. Permite el desarrollo de todas las especies de la familia Enterobacteriaceae.

Formación: La diferenciación entre organismos capaces de utilizar la lactosa y/o sacarosa, y aquellos que son incapaces de hacerlo, está dada por los indicadores eosina y azul de metileno; éstos ejercen un efecto inhibitorio sobre muchas bacterias Gram positivas. Muchas cepas de Escherichia coli y Citrobacter spp., presentan un característico brillo metálico. Las cepas que utilizan la lactosa poseen centro oscuro con periferia azulada o rosada, mientras que las que no lo hacen son incoloras. Este medio permite el crecimiento de Candida spp. como colonias rosadas y puntiformes; la siembra en profundidad permite el desarrollo de clamidosporas en C. albicans. Enterococcus spp. crece en este medio como colonias puntiformes y transparentes, mientras que Acinetobacter spp. y otras bacterias oxidativas pueden dar colonias de color azul lavanda; esto puede ocurrir aunque las cepas no sean capaces de acidificar a partir de lactosa al 0.5% y ello se debe a la incorporación de azul de metileno a sus membranas. En este medio se obtiene además, un buen desarrollo de especies de Salmonella y Shigella.

Fórmula (en gramos por litro) Instrucciones  Peptona  10.0

Suspender 36 g del polvo en un litro de agua destilada. Reposar 5 minutos; mezclar, calentando a ebullición durante 1 o 2 minutos hasta su disolución. Esterilizar en autoclave a no más de 121°C durante 15 minutos. Enfriar a 45°C y distribuir agitando suavemente.

  Lactosa 5.0  Sacarosa 5.0  Fosfato dipotásico 2.0  Agar 13.5  Eosina 0.4  Azul de metileno 0.065

pH final: 7.2 ± 0.2

Siembra: En superficie, por estriado a partir de un inóculo poco denso, para obtener colonias aisladas. En profundidad, para favorecer el desarrollo de clamidosporas. Incubación: De 24 a 48 horas a 35-37 °C, en aerobiosis.

Bacterias:Microorganismos Tipo de ColoniaEscherichia coli Verdosas con brillo metálico y centro negro azulado

Klebsiella pneumoniae Mucosas, rosa púrpura, confluentesProteus mirabilis Incoloras

Enterococcus faecalis Incoloras, pequeñas, puntiformesShigella flexneri Incoloras

Salmonella typhimurium Incoloras

Placas preparadas: color púrpura.La esterilización del medio de cultivo reduce el azul de metileno al color naranja. El color púrpura se restaura por agitación. La presencia de un precipitado en el medio esterilizado es normal y no debe ser removido, ya que es parte esencial del mismo.

Almacenamiento: Medio deshidratado: a 10-35 ºC.Medio preparado: a 2-8 ºC.

AGAR ENTEROCOCUS Pyr - APrueba rápida, utilizada fundamentalmente para la identificación de Streptococcus pyogenes y Enterococcus spp. Es útil para la caracterización preliminar de Streptococcus, Enterococcus y de microorganismos símil estreptococos.

Fundamento:Los discos contienen el sustrato: pirrolidonil-beta-naftilamida, y la prueba consiste en determinar la presencia de la enzima l-pirrolidonil arilamidasa. Los microorganismos que contienen dicha enzima, pueden hidrolizar el sustrato presente en los discos en forma rápida, con liberación del grupo pirrólico, el cual, reacciona con el reactivo revelador: N-N dimetilamino cinamaldehído. Esta es una prueba presuntiva específica tanto para los estreptococos b hemolíticos del grupo A, como para los Enterococcus spp; y permite diferenciar los estreptococos del grupo A de otras especies de Streptococcus.

Siembra: A partir de un cultivo puro, hacer una suspensión densa en 50 µl de solución fisiológica estéril, y agregar un disco de PYR-A-ENTEROCOCOS. .

Incubación: Durante 30 minutos a 35-37 °C, en aerobiosis. Cuando se utiliza para diferenciar Staphylococcus, la incubación se debe realizar, según algunos investigadores, durante 2 horas a 35–37 ºC, en aerobiosis. .-Agregar una gota de reactivo revelador. .-Dejar a temperatura ambiente, hasta 5 minutos.

Bacterias:Positivo: observación de color rosa-rojo en el disco.Negativo: la suspensión y/o el disco permanecen incoloros o de color amarillo.

Microorganismos Hemólisis PYRasa VANCOMICINA (30ug) Disposición

Estreptococo grupo A ß + S Pares o cadenasEstreptococo grupoB ß, g, a - S Pares o cadenasEstreptococo grupo C ß - S Pares o cadenasEstreptococo grupo G ß - S Pares o cadenas

S. grupo viridans a, g - S Pares o cadenasEnterococcus spp. a, ß , g + S Pares o cadenas

Gemella spp. a, g + SPares,tetradas, cadenas,

acúmulosAerococcus viridans a, g + S Pares, tetradas, acúmulos

Pediococcus spp. a, g - R Pares, tetradas, acúmulosLactococcus spp. a, g -(2) S Pares o cadenasLeuconostoc spp. a , g - R Pares o cadenas

Observaciones:

+: Más del 90% de las cepas presentan reacción positiva.

  -: Menos del 10% de las cepas presentan reacción positiva.  * (2) Lactococcus garviae es la única especie de Lactococcus que da la prueba del PYR

positiva.  * Cualquier zona de inhibición alrededor del disco de vancomicina se considera sensible.

Almacenamiento: Conservar a 2-8 °C

AGAR ESTAFILOCOCO medio 110Es un medio selectivo para el aislamiento y diferenciación presuntiva de estafilococos, en base a la producción de pigmentos, la fermentación de manitol y la hidrólisis de gelatina, a partir de alimentos y otras muestras. .

Formación: Staphylococcus aureus es un microorganismo que puede causar intoxicación alimentaria. En el medio de cultivo, el extracto de levadura y la tripteína aportan los nutrientes para el desarrollo de microorganismos. La gelatina es el sustrato de la enzima gelatinasa. La lactosa y el manitol son los hidratos de carbono fermentables. El cloruro de sodio, se encuentra en alta concentración, para inhibir el desarrollo de la flora acompañante excepto Staphylococcus spp., lográndose así un medio selectivo para el desarrollo de estos microorganismos. .

Fórmula (en gramos por litro) InstruccionesExtracto de levadura  2.5

Suspender 149 g del medio en un litro de agua destilada. Reposar 5 minutos y mezclar calentando a ebullición durante 1 o 2 minutos. Esterilizar en autoclave durante 15 minutos a 121°C. Verter en placas y mezclar para dispersar el precipitado.

Tripteína 10.0Gelatina 30.0Lactosa 2.0D-Manitol 10.0Cloruro de sodio 75.0Fosfato dipotásico 5.0Agar 15.0

pH final: 7.0 ± 0.2

Siembra: Directa, en superficie, por estriado o por extensión. Incubación: Durante 48 horas, a 35-37 °C, en aerobiosis. .

Bacterias: 1-Fermentación de manitol: agregar unas gotas de púrpura de bromocresol a las zonas donde se encuentran las colonias sospechosas y en una zona de la placa donde no hay desarrollo bacteriano. Comparar el color desarrollado entre estas dos zonas. Prueba positiva: cambio de color del indicador del medio en la zona de crecimiento bacteriano. El medio sin desarrollo de microorganismos permanece sin cambio.Prueba negativa: no hay diferencias de color entre las zonas de crecimiento bacteriano y la zona sin inocular. .2-Hidrólisis de la gelatina: cubrir la placa 5 ml de una solución saturada de sulfato de amonio y colocar en estufa, a 35-37 ºC, en aerobiosis durante 10 minutos. Positiva: halo transparente alrededor de las colonias. .Negativa: ausencia de halo transparente alrededor de las colonias.

Microorganismo Pigmento Fermentación de manitol Hidrólisis de la gelatina

Prueba de la coagulasa

S. aureus + + + +S. aureus + + + +S. epidermidis - - + -

Medio preparado: ámbar claro, opalescente con precipitado.

Almacenamiento: Medio deshidratado: a 10-35 ºC.Medio preparado: a 2-8 ºC.

AGAR SUERO DE NARANJA

Medio utilizado para el cultivo y recuento de microorganismos acidúricos, particularmente los asociados con el deterioro de jugos de fruta, especialmente de cítricos. También es útil para el cultivo de hongos saprófitos y patógenos.

Formación: En el medio de cultivo, la tripteína y el extracto de levadura aportan los nutrientes necesarios para el adecuado desarrollo bacteriano. La glucosa es el hidrato de carbono fermentable, y el suero de naranja le otorga un ambiente ácido, favorable para el desarrollo de microorganismos tolerantes a las condiciones de acidez.

FórmulaAgar 15 gSuero de naranja 200 mlExtracto de levadura 3.0 gTripteína 10.0 gGlucosa 4.0 gFosfato dipotásico 2.5 gAgua Desmineralizada 800 ml

pH final: 5.5 ± 0.2

Siembra: A partir de la muestra original o de diluciones apropiadas, sembrar 1 ml y agregar 12-15 ml de medio de cultivo fundido y enfriado a 45-50 ºC.

Incubación: A 30 ºC durante 48-72 horas, en aerobiosis y anaerobiosis. Si se busca el desarrollo de hongos, extender la incubación hasta 5 días.

Bacterias:Efectuar el recuento y determinar la morfología de las colonias.

Microorganismos CrecimientoAspergillus niger Bueno

Lactobacillus fermentum BuenoSacharomyces cerevisiae Bueno

Limitaciones: Este medio no es diferencial, por lo tanto es necesario realizar la identificación bioquímica a los cultivos positivos.Medio preparado: ámbar, ligeramente opalescente.Almacenamiento: Conservar entre 2 – 8º C.

AGAR CASOY (PROTEOSA PEPTONA N° 3)

Medio que por su alta calidad nutricional, ha sido recomendado como uno de los más adecuados para el cultivo de diferentes bacterias, especialmente exigentes, tales como Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Haemophilus spp., etc.

Formación: El estudio sobre los valores nutricionales de estas peptonas, indica que la proteosa peptona N° 3, es la mejor de las tres proteosas peptonas para propósito nutricional en la mayoría de las fórmulas de medios de cultivo para microorganismos exigentes. Esta peptona puede también sustituir a la combinación de peptona-infusión de carne en los medios de infusión.

Fórmula (en gramos por litro) InstruccionesProteosa peptona Nº 3 20.0 Suspender 45 g del medio deshidratado en un litro de agua

destilada. Mezclar bien. Dejar reposar de 10 a 15 minutos. Calentar agitando frecuentemente y hervir durante un minuto. Distribuir y esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 minutos. Enfriar y agregar los suplementos que se deseen.

Glucosa 0.5Cloruro de sodio 5.0Fosfato disódico 5.0

Agar 15.0

pH final:7.3 ± 0.2

Siembra: Directa, estriando la superficie del medio.Incubación: El tiempo, temperatura y atmósfera de incubación, dependerán del microorganismo que se esté investigando.

Bacterias:

Microorganismo Crecimiento (*)

N. gonorrhoeae BuenoS. pneumoniae BuenoS. pneumoniae Bueno

S. pyogenes Bueno

(*) Agar chocolate preparado con agar proteosa peptona N° 3.Medio preparado: de ámbar claro a medio opalescente sin el agregado de sangre.

Almacenamiento: Medio deshidratado: a 10-35 ºC.Medio preparado: a 2-8 ºC.

AGAR PARA ANAEROBIOS

T.A.B.    

La recolección de muestras para la investigación de bacterias anaerobias, requiere una metodología particular para lograr que se mantenga un bajo Eh hasta el momento del cultivo. Los métodos convencionales no proporcionan una recuperación óptima de estos microorganismos. La acción del oxígeno atmosférico puede ser anulada si la muestra es bien recogida y procesada en forma adecuada en el laboratorio, empleando sistemas anaeróbicos que impidan el efecto letal del anión superóxido que aparece cuando existe oxígeno en el medio. Es por ello que el transporte de las muestras en frascos o tubos con atmósfera inerte libre de oxígeno, se ha difundido en el mundo entero. Laboratorios Britania presenta el frasco T.A.B., que constituye un medio universal de transporte, porque todo tipo de microorganismos aerobios y anaerobios facultativos o estrictos, pueden sobrevivir perfectamente en él. .

Composición: El frasco T.A.B. contiene solución Ringer pH 7, adicionado de un agente reductor (Cisteína) y SPS (Polianetol sulfonato de sodio) como anticoagulante, y atmósfera balanceada. .

Metodología: La muestra (pus, líquido cefalorraquídeo, etc.) se inyecta a través del tapón de goma previamente desinfectado con tintura de yodo al 2% o Povidona yodada, teniendo la precaución de eliminar el aire contenido en la jeringa y aguja, después de haber obtenido el material, y antes de introducirlo en el frasco T.A.B. Una vez recibida la muestra en el laboratorio, se desinfecta nuevamente el tapón, se aspira con jeringa y agujas estériles y se inocula en los medios de cultivo apropiados, incubando en condiciones aeróbicas y anaeróbicas. .

Métodos recomendados para la recolección de muestras para cultivos anaeróbicos.

PULMONAR: Aspiración transtraqueal, punción pulmonar directa, fibrobroncoscopía, lavado broncoalveolar. . PLEURAL: Toracocéntesis. . APARATO URINARIO: Punción suprapúbica. . ABSCESOS: Punción y aspiración. . APARATO GENITAL FEMENINO Y PELVIPERITONITIS: Utilizar la culdocentesis para obtener la muestra, cuando ello sea posible, después de descontaminar la vagina. ENDOMETRITIS: Utilizar jeringa y pequeño catéter de plástico a través del orificio cervical descontaminado, para aspirar. . TRACTO SINUSAL O DRENAJE DE HERIDA: Aspiración con jeringa y pequeño catéter de plástico, lo más profundamente posible, a través de un orificio de la piel descontaminada.

AGAR ANAEROBIO

Es un medio no selectivo utilizado para el aislamiento y cultivo de microorganismos anaerobios.

Composición: Digerido pancreático de caseína 20,0 g Cloruro de sodio 5,0 gDextrosa 10,0 g Agar 20,0 g Tioglicolato de sodio 2,0 g Sulfoxilato formaldehido de sodio 1,0 g Azul de metileno 2,0 mg Agua destilada c.s.p. 1000 mLpH final 7,2 ± 0,2

Preparación: Suspender 58 g de medio deshidratado en un litro de agua destilada. Mezclar vigorosamente. Calentar agitando frecuentemente y dejar hervir durante 1 minuto para disolver completamente los ingredientes. Esterilizar a 121°C durante 15 minutos.

Distribuir y enfriar a temperatura ambiente antes de su utilización. Fundamento Este medio contiene tioglicolato de sodio y el sulfoxilato formaldehido de sodio como agentes reductores. El azul de metileno sirve como un indicador de anaerobiosis, ya que este compuesto cuando está en presencia de oxígeno es de color azul, e incoloro en su ausencia. Este medio debe ser incubado en condiciones anaeróbicas.

AGAR PATATA GLUCOSA

Medio de cultivo utilizado para el aislamiento y recuento de hongos y levaduras en muestras clínicas, alimentos, cosméticos y otros materiales.

Formación:Tanto la glucosa presente como la infusión de papa favorecen el desarrollo exuberante de hongos y levaduras, mientras que el desarrollo bacteriano es inhibido con el agregado de ácido tartárico luego de la esterilización hasta alcanzar un pH: 3.5 ± 0.2. Una vez agregado el ácido no se puede recalentar ya que el agar se hidroliza.

Siembra: Técnica De PourPlate: sembrar 0.1 o 1 ml y agregar 15 ml del Papa Glucosado Agar fundido y enfriado a 45-50 ºC.

- En superficie: por estriado.

Incubación: En aerobiosis, a 22-25 ºC ó 30-32 ºC según el método seguido, durante 5 días o mayor tiempo.

Bacterias:

Microorganismos CrecimientoAspergillus niger BuenoCandidaalbicans BuenoSacharomycescerevisiae Bueno

AGAR EXTRACTO DE ARROZ

Modo de acción:

El medio de cultivo contiene extracto de arroz como única base nutritiva. La falta de nutrientes junto con lascondiciones de cultivo pobres en oxígeno (bajo un cubreobjetos!) crea un ambiente, que induce la formaciónde formas morfológicas específicas (clamidosporas y pseudomicelios en particular) en algunas levaduras.

Composición (g/litro)Extracto de arroz, concentrado 0,7; agar-agar 14,3.

Preparación y conservaciónAgar Extracto de arroz (20 placas de 18 ml cada una)Utilizable hasta la fecha de caducidad cuando se conserva entre: +12 y +15ºC.Las placas son claras y de color blanco con matices blanco amarillentos.

Empleo e interpretaciónUtilizar un asa de siembra de platino para obtener una pequeña cantidad de material a partir de un cultivopreliminar que contenga colonias sospechosas de contener Candida y extender en fina capa sobrela superficie del Agar Extracto de arroz en 3-4 líneas en zig-zag.

Cubrir la superficie sembrada con cubreobjetosestériles. Si el material está abundantemente infectado con Candida, puede extenderse directamentesobre Agar Extracto de arroz. Los frotis vaginales obtenidos mediante hisopos pueden extendersedirectamente sobre la superficie del medio de cultivo (TAUBERT y SMITH 1960).Incubación hasta 4 días a 28ºC aerobia.Deben evitarse temperaturas elevadas ya que las clamidosporas pueden no formarse.Evaluar el cultivo por examinación directa en microscopio a través del cubreobjetos.

Deben efectuarse ulteriores exámenes para confirmar los resultados obtenidos.

AGAR MALTOSA

Se emplea para el aislamiento y recuento de mohos y levaduras. También se puede emplear para pruebas de esterilidad en relación a la presencia de estos microorganismos.

Fundamento:En medio ácido, el extracto de malta que es rico en glúci-dos, es capaz de aportar todos los nutrientes necesarios para el desarrollo de mohos y levaduras. Por el carácter ácido del medio, se inhibe el crecimiento de la mayor parte de los gérmenes contaminantes.

Fórmula (por litro) del AgarEx t rac to de Ma l t a . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12 ,75gDex t r i na . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 , 75gG l i ce r i na . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 , 35gPep tona de Ge la t i na . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0 , 78g  Aga r . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15 ,0gpH final: 4 ,6 ±0 ,2

Esterilizar en autoclave a 121ºC durante 15 min. No esterilizar por períodos más prolongados, ni sobrecalentar ya que el medio puede ablandarse. Este medio se utiliza principalmente para el aislamiento de mohos y levaduras.

CONDICIONES ADECUADAS DE HUMEDAD

Un nivel mínimo de humedad, tanto en el medio como en la atmósfera, es imprescindible para un buen desarrollo de las células vegetativas microbianas en los cultivos. Hay que prever el mantenimiento de estas condiciones mínimas en las estufas de cultivo a 35-37°C proporcionando una fuente adecuada de agua que mantengan la humedad necesaria para el crecimiento de los cultivos y evitar así que se deseque el medio.

PRESENCIA (O AUSENCIA) DE OXÍGENO Y OTROS GASES

Gran cantidad de bacterias pueden crecer en una atmósfera con tensión de oxígeno normal (aerobios estrictos). Algunas pueden obtener el oxígeno directamente de varios sustratos (anaerobios facultativos). Pero los microorganismos anaerobios estrictos sólo se desarrollarán adecuadamente en una atmósfera sin oxgeno ambiental. En un punto intermedio, los microorganismos microaerófilos crecen mejor en condiciones atmosféricas parcialmente anaerbias (tensión de oxígeno muy reducida), mientras los anaerobios facultativos tienen un metabolismo capaz de adaptarse a cualquiera de las citadas condiciones.

HUMEDAD

Un nivel mínimo de humedad, tanto en el medio como en la atmósfera, es imprescindible para un buen desarrollo de las células vegetativas microbianas en los cultivos. Hay que prever el mantenimiento de estas condiciones mínimas en las estufas de cultivo a 35-37° proporcionando una fuente adecuada de agua que mantenga la humedad necesaria para el crecimiento de los cultivos y evitar así que se deseque el medio.

LUZ AMBIENTAL

La mayoría de los microorganismos crecen mucho mejor en la oscuridad que en presencia de luz solar. Hay excepciones evidentes como sería el caso de los microorganismos fotosintéticos.

pH

La concentración de iones hidrógeno es muy importante para el crecimiento de los microorganismos de los microorganismos. La mayoría de ellos se desarrollan mejor en medios con un pH neutro, aunque los hay que requieren medios más o menos ácidos. No se debe olvidar que la presencia de ácidos o bases en cantidades que no impiden el crecimiento bacteriano pueden sin embargo inhibirlo o incluso alterar sus procesos metabólicos normales.

TEMPERATURA

Los microorganismos mesófilos crecen de forma óptima a temperaturas entre 15 y 43°C. Otros como los psicrófilos crecen a 0°C y los termófilos a 80°C o incluso a temperaturas superiores (hipertemófilos). En líneas generales, los patógenos humanos crecen en rangos de temperatura mucho más cortos, alrededor de 37°C, y los saprofitos tienen rangos más amplios.

SIEMBRA E INACULACIÓN

La siembra consiste en disponer las bacterias que queremos estudiar en un medio de cultivo de una forma adecuada. La siembra puede ser: Para aislamiento, para poder llevar a término el estudio de un microorganismo es condición necesaria aislarle del resto de microorganismos acompañantes.

Otras técnicas, son pruebas que no permiten aislamiento, en este caso se pueden utilizar tanto medios sólidos como líquidos.

SIEMBRA EN TUBO EN MEDIO LÍQUIDO

Se puede realizar atendiendo al instrumento con que siembre, bien asa de siembra, pipeta o hisópo.

Asa de siembra, los tubos, del que se va a sembrar y el que contiene el medio, se toman con la mano izquierda, colocando las bocas a la misma altura. Con la mano derecha se toma el asa de siembra, se esteriliza en la llama en posición vertical hasta que se ponga incandescente. Se destapa los tubos, tomando se esterilizan las bocas de los tubos pasándolos por la llama, se introduce el asa en el material y se introduce en el medio de cultivo hasta el borde del líquido. Por último se esteriliza el asa y el tubo se agita para una buena homogenización del inóculo.

Tubo, se puede utilizar cualquier pipeta, pero generalmente se utiliza la pipeta PASTEUR, se utiliza la técnica expuesta anteriormente, pero esta vez el inóculo el líquido.

Hisopo, el hisopo o torunda debe de ser estéril y viene protegido dentro de un tubo de plástico.

SIEMBRA EN TUBO EN MEDIO SÓLIDO

Atendiendo al tipo de medio sólido, nos podemos encontrar que sean en tubo, placa PETRI.

Tubo

El agar tiene que estar en posición inclinada, dejando una lengüeta en la parte superior y en la parte inferior una parte más ancha. Se puede realizar dos técnicas, por estría y picadura, en ambos casos nos dice las características bioquímicas de la bacteria a estudiar (fermentación de azúcares, movilidad, reducción de metales, etc.)

Placa petri

Se realiza en agar, se emplea para aislamiento de bacterias y para la realización de antibiogramas. En este último caso, previamente se tiene que realizar una dilución de la muestra (con la bacteria totalmente aislada) y se siembra con el hisopo en el medio en el cual se va a realizar el antibiograma, generalmente Mueller-Hinton, aunque atendiendo al tipo de bacterias podemos emplear agar sangre (hemólisis) y agar chocolate (factores X y V).

BILBIOGRAFÍA:

www.educa.madrid.org/web/ies.../TEORIA_EM_alumnos.pdf

biblioteca.usac.edu.gt/tesis/05/05_8921.pdf

http://www.britanialab.com