UNIVERSIDAD SAN PABLO CEU FACULTAD DE FARMACIA DEPARTAMENTO DE QUÍMICA SECCIÓN DE QUÍMICA ORGÁNICA Y FARMACÉUTICA ADRENOMEDULINA y PAMP Nuevas dianas terapéuticas para el diseño de agentes antiproliferativos y/o antiangiogénicos TESIS DOCTORAL VIRGINIA ROLDÓS SERRANO Madrid, 2008
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UNIVERSIDAD SAN PABLO CEU
FACULTAD DE FARMACIA
DEPARTAMENTO DE QUÍMICA
SECCIÓN DE QUÍMICA ORGÁNICA Y FARMACÉUTICA
ADRENOMEDULINA y PAMP
Nuevas dianas terapéuticas para el diseño de
agentes antiproliferativos y/o antiangiogénicos
TESIS DOCTORAL
VIRGINIA ROLDÓS SERRANO
Madrid, 2008
Dra. Dña. Beatriz de Pascual-Teresa y Dra. Dña. Ana Ramos González,
Profesoras Agregadas de Química Orgánica y Farmacéutica ambas
pertenecientes a la Facultad de Farmacia de la Universidad San Pablo CEU,
CERTIFICAN:
Que la presente Memoria, titulada ADRENOMEDULINA Y PAMP, NUEVAS
DIANAS TERAPÉUTICAS PARA EL DISEÑO DE AGENTES
ANTIPROLIFERATIVOS Y/O ANTIANGIOGÉNICOS ha sido realizada bajo su
dirección en la Sección de Química Orgánica y Farmacéutica del Departamento de
Química de la Universidad San Pablo CEU, por la licenciada en Farmacia Dña.
Virginia Roldós Serrano, y autorizan su presentación para ser calificada como
Tesis Doctoral.
Montepríncipe, 24 de Junio de 2008
Fdo. Dra. Dña. Beatriz de Pascual-Teresa Fernández
Fdo. Dra. Dña. Ana Ramos González
VºBº Directora del Departamento
Beatriz de Pascual-Teresa Fernández
AGRADECIMIENTOS
Gracias a mis directoras de tesis Dra. Beatriz de Pascual-Teresa y Dra.
Ana Ramos González. Cada una, a su modo, ha sabido enseñarme su gran
profesionalidad y trasmitirme su vasta experiencia con atenta dedicación, valiosas
enseñanzas que espero poder aplicar en el futuro con su misma pericia. Gracias
por su calidez humana, su paciencia infinita frente a mi tozudez, su comprensión y
su amistad. Gracias por su sentido del humor y sus constantes palabras de aliento
cuando parecía que los astros confabulaban en nuestra contra.
Gracias a la Dra. Sonsoles Martín Santamaría por su apoyo, consejos y
estímulo permanente, por su incondicional ayuda y su amistad.
Gracias al Dr. Miguel Julián Viñals por tantísimas horas de labor
compartida y solidaria, por sus enseñanzas, su optimismo y su amistad.
Gracias al Dr. Alfredo Martínez Ramírez por permitirme realizar una
estancia en su laboratorio del Departamento de Neuroanatomía y Biología Celular
del Instituto Cajal de Ciencias Neurobiológicas. Gracias por su apoyo permanente
y su vivo interés en nuestro trabajo. Gracias también a los Dres. José Rodrigo,
Ricardo Martínez Murillo, Patricia Fernández y Julia Serrano por su simpatía y
afectuosa acogida.
Gracias a la Dra. Sonia de Pascual-Teresa por permitirme realizar ensayos
de proliferación celular en su laboratorio del Instituto del Frío (CSIC) y por su
asesoramiento. Gracias a María Hidalgo por su desinteresada ayuda.
Gracias a los directores de la sección de Biología Vegetal y Ecología, de la
Sección de Parasitología y de la sección de Bioquímica por permitirme utilizar su
equipamiento para las pruebas biológicas.
Gracias al Dr. Antonio Pineda-Lucena del Centro de Investigación Príncipe
Felipe y sus colaboradores Dr. Rodrigo Carbajo y Dra. Anne Schott por la
realización de los experimentos de RMN.
Gracias a las Dras. Danièle Altschuh y Laurence Choulier de École
Supérieure de Biotechnologie (CNRS) por la realización de los experimentos SPR.
Gracias al Sr. Decano, Dr. Agustín Probanza Lobo, por su permanente
disposición y comprensión, por su apoyo sincero de siempre y su valiosa ayuda.
Gracias a los compañeros de departamento que me han acompañado en
estos años: Gema, Javier, Alberto, Álvaros, Marta, Amalia, Cristina, Teresa,
Mónica, Edu, Ana, Pilar, Susana y muy especialmente a mis compañeros de grupo
José María, José Juan y Mario, con quienes he compartido más estrechamente
nuestras horas de cacharreo. Gracias a Berta por su apoyo, su cariño, su simpatía
y generosidad. Gracias a Ángel por tantas horas de risas cómplices, por su
generosidad y su nobleza. Gracias a Irene por su preciosa amistad, por
perdonarme cientos de despistes y llegadas tarde, por su honestidad y su gran
corazón.
Gracias a la Universidad San Pablo CEU por la concesión de una beca
predoctoral y diversas ayudas para estancias y asistencias a congresos, así como
la utilización de sus instalaciones y medios.
Gracias a la Sociedad Española de Química Terapéutica por la concesión
del premio Ramón Madroñero.
Gracias a mi familia, especialmente a mi madre y mi hermana por apoyar sin
condiciones mis determinaciones, por estar siempre presentes y saber tender
infinitos puentes a través del océano. Gracias por su amor y entrega. Gracias por
hacerme ser mejor ser humano cada día.
Gracias a Mariano por sus palabras y sus silencios, su amor y su luz.
Gracias por compartir conmigo la infinita ilusión de nuestro hijo, nuestro sueño
mayor.
Finalmente gracias a Madrid. Nunca sospeché que podría querer otra
ciudad que no fuera mi Montevideo. Menos podía pensar en esta posibilidad
cuando no hay mar en este horizonte, están tan lejos los abrazos de los míos y el
sol de Castilla se empeña en resecar la tierra y mi piel. Por fortuna estaba
equivocada. Al principio tímidamente y después en alud, esta ciudad me mostró
seres humanos excepcionales y aunque ha habido de los otros, no hay
mezquindad capaz de empañar el brillo de esta villa.
ÍNDICE DE ABREVIATURAS
ACTH Corticotropina
AM Adrenomedulina
AMPc Adenosín monofosfato cíclico
ARNm Ácido ribonucleico mensajero
Boc terc-butoxicarbonilo
BSA Albúmina sérica bovina
CGRP Péptidos relacionados con el gen de la calcitonina
CoMFA Análisis comparativo de campos moleculares
CRLR Receptor del tipo del receptor de la calcitonina
CV Validación cruzada
DCM Diclorometano
DMF N,N-Dimetilformamida
DMSO Dimetilsulfóxido
DMSO-d6 Dimetilsulfóxido hexadeuterado
EM Espectro de masas
FEP Perturbación de energía libre
FMM Método multipolar rápido
GA Algoritmo genético
GB/SA Modelo generalizado de Born / Área superficial
GPCRs Receptores acoplados a proteínas G
GRIND Descriptores independientes de alineamiento
HTS Cribado de alto rendimiento
IBMX 3-Isobutil-1-metilxantina
IE Impacto electrónico
IR Infrarrojo
LBDD Diseño de fármacos basado en el ligando
LGA Algoritmo genético lamarkiano
LICA N-isopropil-N-ciclohexilamiduro de litio
MD Dinámica molecular
MEP Potencial electrostático molecular
MIF Campo de interacción molecular
MIP Potencial de interacción molecular
MM Mecánica molecular
MM-GBSA Mecánica molecular-área de superficie generalizada de Born
MMP-2 Metaloproteasa 2 de la matriz
MM-PBSA Mecánica molecular-Área de superficie Poisson-Boltzmann
MTT Bromuro de 3-(4,5-dimetilltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio
NCI Instituto Nacional del Cáncer
p.f. Punto de fusión
PAMP Péptido 20-N-terminal de la proadrenomedulina
PB Poisson-Boltzmann
PBC Condiciones de límite periódico
PBS Tampón fosfato salino
PC Componente principal
PCA Análisis de componentes principales
PDB Base de datos de proteínas
PKA Proteína cinasa dependiente de AMPc
PLS Mínimos cuadrados parciales
PMA Ácido fosfomolíbdico
PME Particle Mesh Ewald
QM Mecánica Cuántica
QSAR Relación estructura-actividad cuantitativa
QSAR-3D Relación estructura-actividad cuantitativa tridimensional
RAMP Proteína modificadora de la actividad del receptor
RMDS Desviación cuadrática media
RMN Resonancia magnética nuclear
SA Superficie accesible al disolvente
SAR Relación estructura actividad
SBDD Diseño de fármacos basado en la estructura
SDS Dodecilsulfato-d25 de sodio
SNC Sistema nervioso central
SPR Resonancia de plasma en superficie
TA Temperatura ambiente
TCA Ácido tricloroacético
TFE Trifluoroetanol
THF Tetrahidrofurano
TMS Tetrametilsilano
VEGF Factor de crecimiento endotelial vascular
VS Cribado Virtual
Índice
Introducción 1
Antecedentes 1. Estructura
2. Biosíntesis, liberación y metabolismo
3. Receptores
4. Funciones
5. AM y PAMP: perspectivas de su aplicación terapéutica
6. Moduladores de la acción de AM
7. Diseño de fármacos
7. 1. Diseño indirecto
7. 2. Diseño directo
7. 2. 1. Cribado virtual o virtual screening
7. 2. 2. Dinámica Molecular
5
5
9
12
15
23
27
32
33
39
44
45
Capitulo I. Diseño, síntesis y evaluación biológica de moduladores negativos de Adrenomedulina como agentes antitumorales
I. 1. Objetivos y Plan de Trabajo 61
I. 2. Discusión de Resultados I. 2. 1. Síntesis
I. 2. 2. Actividad Biológica
65
65
71
I. 3. Conclusiones 89
I. 4. Parte Experimental I. 4. 1. Materiales y Métodos
I. 4. 2. Síntesis
I. 4. 2. 1. Cloruros de 4-[carboxi(fenil)metil]-4-hidroxipiperidinio
I. 4. 2. 2. 4-hidroxi-4-(2-metoxi-1,1-dimetil-2-oxoetil)piperidin-1-carboxilato de
terc-butilo (21)
91
91
96
96
106
I. 4. 2. 3. Cloruro de 4-hidroxi-4-(2-metoxi-1,1-dimetil-2-oxoetil)piperidinio (22)
I. 4. 2. 4. Método general de la preparación de 2-(1-alquil-4-hidroxipiperidin-
4-il)-2-metilpropanoato de metilo (23-34)
I. 4. 2. 5. 2-(1-etil-4-hidroxipiperidin-4-il)-2-metilpropionato de metilo (35)
I. 4. 2. 6. 2-(1-benzoil-4-hidroxi-piperidin-4-il)-2-metilpropionato de metilo (36)
I. 4. 2. 7. 2-(4-etil-1-hidroxiciclohexil)-2-metilpropionato de metilo (38)
I. 2. 4. 8. Ácido 2-(1-etil-4-hidroxipiperidin-4-il)-2-metilpropanoico (37)
I. 2. 4. 9. Ácido 2-(4-etil-1-hidroxiciclohexil)-2-metilpropanoico (39)
I. 2. 4. 10. (1-etil-4-hidroxipiperidin-4-il)(fenil)acetato de metilo (17)
107
107
115
116
116
117
117
118
I. 4. 3. Determinación de la afinidad I. 4. 3. 1. Ensayo de competición
I. 4. 3. 2. Determinación de la afinidad por SPR
I. 4. 4. Ensayos Biológicos
I. 4. 4. 1. Análisis de la producción de AMPc
I. 4. 4. 2. Pruebas antiproliferativas
I. 4. 5. Estudios QSAR- 3D
119
119
119
120
120
122
123
Capitulo II. Cribado virtual de pequeñas moléculas con posible actividad como moduladores negativos del PAMP
II. 1. Objetivos y Plan de Trabajo 127
II. 2. Discusión de Resultados II. 2. 1. Cribado Virtual
II. 2. 2. Ensayo de competición
II. 2. 3. Determinación de la afinidad por SPR
129
129
140
142
II. 2. 4. Dinámica Molecular
II. 2. 5. Evaluación de la actividad antiangiogénica
II. 2. 6. Pruebas Antiproliferativas
II. 2. 7. Resonancia Magnética Nuclear
145
167
168
171
II. 3. Conclusiones 175
II. 4. Parte Experimental
II. 4. 1. Cribado Virtual
II. 4. 2. Ensayo de competición
II. 4. 3. Determinación de la afinidad por SPR
II. 4. 4. Dinámica Molecular
II. 4. 5. Angiogénesis: Ensayo de anillos de arcos aórticos de pollo II. 4. 6. Pruebas antiproliferativas
II. 4. 7. Resonancia Magnética Nuclear
177
177
182
183
184
186
187
188
Bibliografía 189
Introducción
Introducción
1
Introducción
La Adrenomedulina (AM) y el péptido 20-N-terminal de la
proadrenomedulina (PAMP) son dos péptidos biológicamente activos relacionados
entre sí y que desarrollan papeles muy importantes en la regulación de diversas
funciones biológicas.
La AM es un factor vital para la supervivencia de las células tumorales ya
que, además de comportarse como un factor de crecimiento, reduce la apoptosis,
su producción aumenta en situaciones de hipoxia y muestra una acusada actividad
proangiogénica en modelos ex vivo e in vivo.
El PAMP es aún más potente como factor angiogénico y su inhibición
provoca la reducción del crecimiento tumoral.
En el presente trabajo nos hemos planteado la búsqueda de pequeñas
moléculas que, a través de su unión a estos péptidos, puedan modular su
actividad. Especial interés poseen los moduladores negativos, por su potencial
utilidad como agentes antitumorales y/o antiangiogénicos.
Para este estudio se han aplicado dos estrategias diferentes de diseño de
fármacos. En el caso de la AM, al no disponer de la estructura tridimensional, se
ha llevado a cabo un diseño basado en el ligando. Por el contrario, la
disponibilidad de la estructura 3D del PAMP, ha permitido iniciar el estudio
mediante un cribado virtual para detectar moléculas que se unan al péptido.
En el capítulo I de esta memoria nos hemos centrado en la AM. En un
estudio de cribado farmacológico puesto a punto en el Instituto Nacional del
Cáncer de EEUU (NCI), se detectaron varios moduladores positivos y negativos de
AM con una interesante actividad hipotensora y antiproliferativa, respectivamente.
Introducción
2
En primer lugar se puso a punto un método de síntesis para obtener una
serie de compuestos estructuralmente relacionados con un cabeza de serie
previamente seleccionado mediante el citado cribado farmacológico llevado a cabo
en el NCI.
A continuación, se evaluó cualitativamente la afinidad por la AM de los
compuestos sintetizados mediante un estudio de competición con su anticuerpo
monoclonal. También se estudió de forma cuantitativa, con la técnica de
Resonancia de Plasma en Superficie (Surface Plasmon Resonance, SPR), la
capacidad de unión de los compuestos a la AM.
Los datos se utilizaron para establecer un modelo QSAR-3D que nos
permitió identificar ciertas características estructurales fundamentales para la
unión a la AM: la presencia de un grupo dador de enlace de hidrógeno y un anillo
aromático. Además, el modelo posee una alta capacidad predictiva y está siendo
utilizado para el diseño de nuevos moduladores más activos.
En la siguiente etapa se determinó la producción de AMPc mediante un
radioinmunoensayo, lo que nos permitió comprobar que los compuestos con un
ácido carboxílico libre se comportan como moduladores negativos de la AM.
Por lo tanto, todos los ácidos sintetizados se sometieron a ensayos de
actividad antiproliferativa en diferentes líneas celulares. El compuesto 16, que es
el que posee mayor afinidad por la AM, mostró una interesante actividad
antiproliferativa frente a la línea celular de cáncer de colon HCT116, por lo que ha
sido seleccionado para llevar a cabo ensayos in vivo en colaboración con el
Centro Integral Oncológico Clara Campal (CIOCC), Hospital de Madrid.
En el capítulo II de esta memoria, nos propusimos buscar pequeñas
moléculas capaces de modular la acción del PAMP. En primer lugar, se llevó a
cabo un cribado virtual, utilizando el programa AutoDock, de la colección de
compuestos del NCI (NCI diversity set), constituida por 1800 compuestos, junto
con 60 compuestos pertenecientes a nuestra quimioteca. Este cribado nos
permitió seleccionar los 50 compuestos con mayor afinidad de acuerdo a criterios
energéticos.
Introducción
3
A continuación se puso a punto un método para determinar
experimentalmente la afinidad de los ligandos por el PAMP, basado en la
competencia con un anticuerpo monoclonal antiPAMP. De esta forma se
seleccionaron los 20 compuestos más afines para realizar otros ensayos
biológicos y de afinidad.
Con la finalidad de profundizar en el conocimiento de las interacciones que
se establecen entre el péptido y un ligando que mostró afinidad por el PAMP
mediante SPR, se llevaron a cabo simulaciones de Dinámica Molecular (DM) del
complejo correspondiente y del péptido libre.
La simulación puso de manifiesto que las interacciones que más
contribuyen a la estabilidad del complejo son las interacciones de tipo catión-π
entre argininas del péptido y anillos aromáticos del ligando y de apilamiento
(stacking) entre anillos aromáticos de ambas especies.
Aplicando los métodos MM-PBSA (Molecular Mechanics Poisson
Boltzmann Surface Area) y MM-GBSA (Molecular Mechanics Generalized Born
Surface Area) y el módulo NMODE de AMBER, se determinó la energía teórica de
unión del complejo PAMP-USP1K (∆Gbind) y se comparó con la energía de unión
calculada para el complejo entre el PAMP y un compuesto que experimentalmente
se ha demostrado que no se une al péptido (PAMP-USP1N). Por otro lado, para el
complejo PAMP-USP1K se calculó la contribución media de la entalpía de unión
de cada uno de los residuos del péptido, confirmando la importancia de las
interacciones detectadas en la simulación de dinámica molecular.
Recientemente, se ha comenzado a estudiar la interacción de nuestros
compuestos con PAMP utilizando técnicas de RMN. Esta técnica permite, no solo
confirmar la formación de los complejos, sino también obtener información
experimental sobre los residuos del péptido implicados en la unión, que podrían
confirmar los datos obtenidos en nuestro estudio teórico.
Finalmente, todos los compuestos que dieron positivo el ensayo de
competición con el anticuerpo monoclonal antiPAMP fueron evaluados en un
Introducción
4
ensayo de anillos aórticos de pollo, para determinar su actividad antiangiogénica,
pero desafortunadamente ninguno de ellos resultó activo.
Sin embargo, tres de ellos han mostrado una interesante actividad
antiproliferativa frente a la línea celular de cáncer de colon Caco-2.
Antecedentes
Antecedentes
5
La AM es un péptido biológicamente activo, que fue aislado por primera
vez en 1993 a partir de extractos de una línea celular de feocromocitoma humano,
un cáncer derivado de la médula adrenal, por un grupo de científicos japoneses
que buscaban péptidos capaces de estimular la producción de adenosín
monofosfato cíclico (AMPc) en plaquetas.1
El PAMP es una molécula peptídica multifuncional que posee varias
funciones biológicas entre las que se encuentra su papel proangiogénico que
favorece el crecimiento tumoral y su efecto inhibitorio de la secreción de
catecolaminas mediado por los receptores nicotínicos.
El papel de estos péptidos en la regulación de diferentes procesos
biológicos y, más específicamente, en enfermedades como el cáncer, los convierte
en atractivas dianas para el diseño de nuevos agentes antitumorales.
1. Estructura
La AM humana es un péptido de 52 aminoácidos con un puente disulfuro
entre los residuos 16 y 21 y con una tirosina amidada en su extremo carboxilo
terminal (Figura 1).1 El puente disulfuro genera un anillo de 6 aminoácidos, con
dos cadenas de diferente longitud que salen del mismo.
Antecedentes
6
Debido a sus características estructurales, la AM, el CGRP (calcinotin
gene-related peptide), la amilina y la calcitonina propiamente dicha están incluidos
dentro de la familia de los péptidos relacionados con el gen de la calcitonina. La
secuencia de la AM no presenta una homología alta con el CGRP (27%), sin
embargo, los péptidos AM, calcitonina, CGRP y amilina tienen características
estructurales comunes, tales como el ciclo de 6 ó 7 aminoácidos, generado por un
puente disulfuro intramolecular y la tirosina amidada en su extremo carboxilo
terminal.2, 3 Estas dos características estructurales son imprescindibles para la
actividad biológica de estos péptidos.4 Entre ellos existe un solapamiento de
acciones biológicas que puede ser debido en parte a la promiscuidad de sus
receptores.5
En el momento de iniciar este trabajo no existía ningún dato sobre la
estructura tridimensional de la AM y su resolución podría suministrar claves para la
determinación del mecanismo involucrado en la modulación de su actividad.
Los esfuerzos realizados en nuestro grupo de investigación para proponer
un modelo basado en la homología por el momento no han dado resultados
positivos, ya que no se conoce la estructura tridimensional de ninguna proteína
suficientemente homóloga.
Figura 1: Representación de la AM donde se muestra el puente disulfuro que da lugar al ciclo
entre los aminoácidos 16 y 21.
Antecedentes
7
Tampoco los modelos que obtuvimos por threading fueron de calidad
suficiente y no fue posible llegar a un consenso entre los distintos servidores
utilizados.6
En cuanto a los intentos de resolver su estructura mediante la técnica de
difracción de rayos X, no condujeron a ningún resultado positivo debido a que
sufre agregación y no fue posible conseguir cristales adecuados para su estudio.
Finalmente, y en el momento de imprimir esta tesis, ha sido posible obtener un
espectro de RMN con calidad suficiente para resolver la estructura tridimensional
de la AM. Este trabajo fue realizado por el Dr. Javier Pérez Castells (USP-CEU) y
el Dr. Jesús Jiménez Barbero del CIB (Centro de Investigaciones Biológicas).
El PAMP fue aislado por primera vez en 1993 al mismo tiempo que la AM.7
Posee una secuencia de 20 aminoácidos en la que su extremo carboxilo terminal
se encuentra amidado (PAMP-[1-20]; ARLDVASEFRKKWNKWALSR-amida).
La estructura tridimensional del PAMP y su conformación más estable fue
determinada en 2005 usando espectroscopia de RMN bidimensional de 1H y 13C y
modelado molecular.8 Evaluando las diferencias entre conformaciones obtenidas
del PAMP en dos disolventes, los autores de este trabajo determinaron que la
estructura consiste en una α-hélice desde la ARG2 hasta la ARG20 en
trifluoroetanol/agua (TFE/H2O) y desde ARG2 hasta ALA17 en dodecilsulfato-d25 de
sodio (SDS) (Figura 2). Este último se utiliza mucho en investigación estructural
puesto que, a través de la formación de micelas, genera un ambiente hidrófobo
que emula las membranas biológicas o el interior de las proteínas.9
Antecedentes
8
Figura 2: Estructura tridimensional del PAMP (Código PDB = 2FLY).
El hecho de que los residuos de 18 a 20 no adopten la conformación de α-
hélice en SDS sugiere que podrían tener un papel esencial en el reconocimiento y
unión del PAMP a su receptor. Esto coincide con los estudios de Mahata y cols.10
que demuestran la importancia de los residuos del extremo C-terminal en la
actividad fisiológica. Este grupo observó que la eliminación de la amida del
carboxilo terminal disminuye levemente la actividad y que la eliminación de los tres
aminoácidos de este extremo anulaba completamente la acción del PAMP en sus
receptores nicotínicos.
Pero no sólo el extremo C-terminal es necesario para la actividad. Belloni y
cols. determinaron que el fragmento peptídico PAMP-[12-20], no inhibe la
secreción de catecolaminas pero actúa como un antagonista débil de la actividad
del PAMP.11 El hecho de que el PAMP-[12-20] sea capaz de unirse a los
receptores nicotínicos aunque no produzca los mismos efectos que el PAMP
sugiere que los dos extremos N y C-terminal son fundamentales para la inhibición
de secreción de catecolaminas desde estos receptores.
Por otra parte, Martínez y cols.12 investigaron el potencial angiogénico del
PAMP en ensayos in vitro e in vivo. Observaron que el PAMP induce el
crecimiento de los vasos sanguíneos (respuesta dosis dependiente) y que el
fragmento peptídico PAMP-[12-20] produce una acción antagónica del PAMP,
inhibiendo su acción angiogénica. Estos resultados indican que los extremos C y
Antecedentes
9
N-terminal son fundamentales tanto para la actividad angiogénica como para su
acción inhibitoria de la secreción de catecolaminas.
2. Biosíntesis, liberación y metabolismo
Tanto la AM como el PAMP provienen del mismo gen y éste se ha
secuenciado en distintas especies (rata, cerdo, vaca, ratón y hombre).13-15
El gen humano contiene cuatro exones y tres intrones. La pérdida de los
tres intrones del ARNm recién transcrito da lugar al ARNm maduro denominado
Forma A (Figura 3). Después de la translación de la misma se produce una
prehormona de 185 aminoácidos llamada preproadrenomedulina. Ésta debe sufrir
distintas modificaciones post-transduccionales antes de producir la
proadrenomedulina y dar lugar a dos péptidos amidados: AM y PAMP (Figura 3).16
El PAMP es liberado de la proadrenomedulina por proteolisis en el primer grupo de
aminoácidos básicos (GLY42LIS43ARG44), después de lo cual tiene lugar la
amidación post-translacional del C-terminal del PAMP, en respuesta a la señal de
la GLY por la enzima monooxigenasa α-amidante de peptidilglicinas.
La AM secretada, también llamada AM inmadura, posee un aminoácido
más (GLY) y es convertida en AM madura por amidación enzimática. La enzima
amidante, monooxigenasa α-amidante de peptidilglicinas, es coexpresada con la
AM en diferentes tejidos y contiene dos dominios que catalizan dos reacciones
consecutivas: monooxigenasa hidroxilante de peptidilglicinas y lipasa α-amidante
de peptidilhidroxiglicinas.17, 18
Por otra parte, si el intrón 3 se conserva, se produce un ARNm más largo
(Forma B), que posee un codon prematuro. Este codon evita la transcripción de la
AM, dando lugar sólo a la producción de una prohormona más pequeña que solo
contiene PAMP.16
Esto explicaría que la relación PAMP/AM en las células y tejidos donde se
expresa el gen sea diferente dependiendo del tejido y la especie a la que
Antecedentes
10
pertenezca, e incluso el hecho de que solo uno de los péptidos esté presente
exclusivamente en determinados tipos de células.16
Figura 3: Representación esquemática de los pasos intermedios en la biosíntesis de la AM y el
PAMP. El gen de la AM humana tiene cuatro exones y tres intrones. El ARN maduro puede estar
presente en dos formas: A y B. La forma A se traduce en una proteína precursora, la
preproadrenomedulina, de un tamaño de 185 aminoácidos y da lugar a dos péptidos activos, la
AM y el PAMP. La forma B da lugar únicamente al PAMP.
La secreción de AM se ha estudiado en cultivos de células endoteliales,
células del músculo liso vascular y cardiomiocitos. Factores como el estrés
oxidativo, citoquinas proinflamatorias, angiotensina II, hipoxia e hiperglicemia
estimulan la producción de AM.19 En la médula adrenal, la AM es secretada junto
con las catecolaminas en respuesta a la estimulación colinérgica. A diferencia de
otros péptidos, la AM no se almacena en gránulos (excepto en las células
endocrinas pancreáticas), sino que se libera inmediatamente después de su
síntesis.
3’
Exón 1 Exón 2 Exón 3 Exón 4
Preproadrenomedulina
PAMP AM
Forma A
5’
Forma BStop
ARNm ARNm
PAMP
Pre ARNm
Antecedentes
11
En plasma, la AM se une específicamente al factor H del complemento.20
Con esta unión aumentan los efectos mediados por receptor, pero se suprimen los
efectos independientes de él, como la actividad antimicrobiana. Por otra parte, la
AM mejora la actividad del factor H, que es un inhibidor de la ruta alternativa de
activación del sistema del complemento. La AM unida al factor H no se puede
detectar en la mayoría de los ensayos que se hacen en el plasma, por lo tanto los
niveles de AM probablemente son más altos que los publicados en la mayoría de
los estudios. Pero además, los niveles altos de AM que se han detectado en
algunos estados clínicos, especialmente en el shock séptico, podrían estar
sobrestimados en estudios tempranos puesto que en esas circunstancias se
registra una disminución de la concentración de factor H en plasma.19
La AM circulante es rápidamente metabolizada con un tiempo de vida
media de aproximadamente 20 minutos. Los niveles de AM en aorta son más
bajos que en la arteria pulmonar, lo que sugiere que los pulmones podrían ser el
principal lugar de eliminación del péptido.19
Se ha observado la expresión del gen de la proadrenomedulina en la
mayoría de los órganos y tejidos, incluyendo el sistema nervioso central, glándulas
y sistema cardiovascular entre otros.21
Martínez y cols. estudiaron las secuencias de este gen a lo largo de la
evolución de diferentes especies vertebradas y observaron que mientras la
secuencia correspondiente a la AM no sufre grandes cambios, la correspondiente
al PAMP experimenta grandes variaciones.22 Entre ellas se encuentra la función
amida del C-terminal del PAMP que no está presente en peces y aves pero sí se
encuentra en todos los mamíferos estudiados. Las secuencias de este gen en
ratas, cerdos y humanos son idénticas en un 80% y los 12 residuos del extremo C-
terminal están conservados completamente en las tres especies.10
El PAMP se encuentra en plasma y orina, y en muchos tejidos humanos
como la médula adrenal, pulmones, hígado, bazo, páncreas, corazón
(especialmente en la aurícula derecha en una concentración considerable),
corteza cerebral y riñón, entre otros.23 Eto y cols. identificaron la presencia de
PAMP en diferentes tejidos humanos.23 Estos datos se recogen en la tabla 1.
Antecedentes
12
Los niveles de PAMP en plasma aumentan con varias enfermedades tales
como la hipertensión,24 insuficiencia renal crónica,25 insuficiencia cardiaca26 y
Serie 3 n % Competición n % Competición 4 1 4 18 5 16 5 4 6 20 6 10 7 7 7 6 8 25 8 5
Tabla 2: Resultados del ensayo de competición para moduladores positivos de la AM.
Antecedentes
32
En el trabajo recogido en esta memoria se plantea un estudio similar con
moduladores negativos. El interés es aún mayor porque los compuestos que de él
se deriven tienen potencial utilidad como antitumorales y/o antiangiogénicos. No
existe ningún antecedente de moléculas pequeñas que actúen como moduladores
negativos de la AM, por lo tanto este trabajo representa una aproximación
novedosa al diseño de agentes antitumorales.
7. Diseño de fármacos La estrategia actual de búsqueda de nuevos y mejores medicamentos es
un proceso complejo e interdisciplinar que suele llevar entre 10 y 12 años de
investigación y desarrollo, con un gasto de 800 millones de euros, tras lo cual tan
solo entre 5-10% de las moléculas llegan a la fase de ensayo clínico y menos aún
son comercializadas. El uso de ordenadores ha facilitado y abaratado los costes
de cada etapa de investigación y desarrollo de un nuevo medicamento. En
particular, parte de nuestro trabajo se centra en el uso de técnicas
computacionales para el diseño de nuevos ligandos o lo que se denomina diseño
asistido por ordenador.
Actualmente, existen dos estrategias principales para abordar el diseño de
fármacos por técnicas computacionales: el diseño directo o basado en la
estructura y el diseño indirecto o basado en el ligando. Se habla de diseño de
ligandos (o de fármacos) basado en la estructura (structure based drug design,
SBDD) cuando se dispone de la estructura tridimensional del receptor o diana
terapéutica. Cuando se desconoce, o no se desea tener en cuenta la estructura
del receptor que constituye la diana farmacológica, el análisis de un conjunto de
ligandos que se unan a esa diana puede suministrar información muy útil para
diseñar moléculas más afines a dicho receptor. Ésta es la metodología que se
denomina diseño indirecto o diseño de fármacos basado en el ligando (ligand
based drug design, LBDD).
Antecedentes
33
En este trabajo se han abordado las dos estrategias. Como la estructura
tridimensional de la AM no se conoce, la búsqueda de moléculas capaces de
unirse a ella se realizó mediante diseño indirecto. En el caso del PAMP, para el
que se conoce la estructura 3D, nos planteamos un diseño de fármaco basado en
la estructura.
7. 1. Diseño indirecto La manipulación de una estructura cabeza de serie para obtener diversos
compuestos análogos y la evaluación cuantitativa de la actividad biológica de
éstos puede proporcionar información muy útil incluso cuando no se encuentre
ningún análogo de mayor actividad. El análisis de los resultados obtenidos puede
llevar al establecimiento de relaciones estructura-actividad o QSAR (Quantitative
Structure-Activity Relationships).
El concepto de QSAR se basa en el hecho de que las propiedades
biológicas de un compuesto están en función de parámetros fisicoquímicos, tales
como solubilidad, lipofilia, efectos electrónicos, ionización, estereoquímica, etc.181
Con el establecimiento de relaciones estructura-actividad se logran dos
objetivos: en primer lugar, el establecimiento del grupo farmacóforo, es decir, de la
estructura mínima responsable de la acción de las moléculas consideradas, que
debe ser común a todos los compuestos que ejerzan su acción farmacológica a
través de una misma interacción molecular con el receptor. En segundo lugar, el
establecimiento de cuáles son los sustituyentes que, situados sobre dicho
farmacóforo, conducen a un compuesto con propiedades terapéuticas óptimas (no
sólo en cuanto a actividad biológica, sino que se pueden relacionar con
selectividad de acción, distribución, toxicidad, etc.), es decir, optimización del
cabeza de serie.
Cuando las relaciones QSAR hacen uso de descriptores fisicoquímicos que
dependen de la estructura tridimensional de la molécula, entonces se habla de
QSAR-3D.182 Actualmente, su uso está muy extendido, no solo para predecir
Antecedentes
34
actividades, sino también para estimar otras propiedades (toxicidad,
biodisponibilidad, etc.).
Para llevar a cabo un estudio QSAR-3D se deben calcular los descriptores
químicos tridimensionales y correlacionarlos con actividades a través de análisis
estadístico multivariante.
Para determinar los descriptores interesa describir propiedades
fisicoquímicas de una molécula que tenga que ver con su posible modo de unión.
Estas propiedades estarán relacionadas con las fuerzas de interacción molecular.
Debido a que las interacciones ligando-receptor son óptimas a una determinada
distancia r, es útil construir una malla alrededor de cada ligando y calcular en
cada punto de esa malla o grid, su potencial de interacción molecular (molecular
interaction potential, MIP) con determinados grupos químicos, llamados sondas.
En el caso de que el cálculo del MIP considere una sonda protón y dicho cálculo
considere la función de onda de la molécula, entonces, se habla de potencial
electrostático molecular (molecular electrostatic potential, MEP). A la distribución
de valores de MIP alrededor de una molécula se le denomina campo de
interacción molecular (molecular interaction field, MIF). Existe una gran variedad
de descriptores para simular diferentes átomos o grupos funcionales. Por
ejemplo, existen desde descriptores para simular oxígenos carbonílicos a otros
que simulan grupos carboxílicos alifáticos. Se han desarrollado otros descriptores
denominados descriptores independientes de alineamiento (GRid INdependent
Descriptors, GRIND)183 que permiten obtener modelos QSAR-3D sin necesidad
de superponer los compuestos.
Una vez calculados los MIFs de una serie de moléculas, podemos
construir una matriz que correlacione cada valor de actividad con los valores del
MIF. Esta matriz tendrá tantas filas como moléculas (n) y tantas columnas como
puntos tenga el MIF, más el valor de actividad (x+1). La resolución de este
sistema se obtiene con la aplicación de métodos de análisis multivariante: análisis
de componentes principales (principal components analysis, PCA) y mínimos
cuadrados parciales (partial least square, PLS).
Antecedentes
35
El análisis de componentes principales (PCA) es un método de reducción
de variables. Normalmente, en estudios QSAR-3D, la matriz contiene menos de
100 objetos (que son los ligandos) y varios miles de variables x. Mirando
directamente estos números, nadie podría descubrir patrones, tendencias, pautas,
clusters (agrupamientos o conglomerados), etc. en los objetos. El PCA es una
técnica extremadamente útil para resumir toda la información contenida en la
matriz-X y ponerla en una forma inteligible.
En el análisis de componentes principales, las p variables originales (x)
son reemplazadas por un número menor de m nuevas variables (t) llamadas
componentes principales, de forma que la pérdida de información sea mínima. Ello
se consigue expresando cada nueva variable ti como un vector combinación lineal
de las p variables originales.
t1 = c11χ1 + c12χ2 + … + c1pχp
t2 = c21χ1 + c22χ2 + … + c2pχp
tm = cm1χ1 + cm2χ2 + … + cmpχp
Los componentes principales deben ser ortogonales, es decir, no estar
correlacionados entre sí. Cada nueva variable ti acumula, de forma decreciente
(desde 1 hasta m) el máximo de información original. En teoría se pueden obtener
tantos componentes principales como variables originales, si bien con un número
reducido m << p se retiene una cantidad suficiente de la información (varianza) de
las variables originales.
La información no contenida en las variables pi queda como varianza-X no
explicada, en una matriz residual (E), la cual tiene exactamente la misma
dimensionalidad que la matriz-X original.
Al reducir un espacio de cientos o miles de descriptores, que pueden
contener información redundante, a unas pocas variables (de 2 a 5, normalmente,
y totalmente independientes entre sí), la técnica del PCA permite disponer de las
descripciones multivariantes de una forma intuitiva, manejable y sobre todo
Antecedentes
36
interpretable.184 La distribución que adoptan los objetos (moléculas) en el espacio
de descriptores y su agrupamiento en conglomerados (clusters), se puede
visualizar a través de la representación gráfica de la matriz de puntuación (T)
(scoring). También se puede determinar cómo contribuyen las variables originales
a esta distribución, estudiando la relación entre variables originales y componentes
principales a través de la representación gráfica de la matriz de loadings (P’).
Una variante del PCA aplicada a los estudios de regresión es el método de
mínimos cuadrados parciales (PLS). Mientras que el PCA trabaja únicamente con
variables X, el análisis PLS es una técnica de regresión cuya finalidad consiste en
explicar una o más variables dependientes (Y) en términos de variables X.
Y = f(X) + E
Es posible crear múltiples modelos que satisfagan la ecuación. Entre ellos
el mejor es aquel que permita el cálculo de la variable y que corresponda
correctamente con el valor experimental, incluso para moléculas no incluidas en el
set de construcción del modelo. Estos son los modelo predictivos y pueden ser
utilizados para realizar estimaciones de confianza de los valores Y para nuevas
moléculas, antes de ser sintetizadas.
Los mejores modelos PLS que se puedan obtener están sujetos a la
misma limitación que cualquier otro modelo de regresión, es decir, un modelo de
regresión nunca puede ser mejor que la serie de datos a partir del cual se ha
obtenido. No es posible, por tanto, obtener información sobre áreas en las que no
haya suficiente variabilidad.
Una vez que ha finalizado este proceso es necesario hacer una validación
interna del modelo quimiométrico generado. Para ello, el método más empleado
es la validación cruzada (cross-validation, CV), que permite eliminar el riesgo de
correlaciones casuales. Funciona construyendo modelos reducidos (modelos para
los cuales se han excluido algunos objetos) y que se utilizan para predecir las
variables Y (normalmente actividad) de los objetos excluidos. Entonces, la Y
predicha se compara con la Y experimental, calculándose, entre otros índices, el
Antecedentes
37
q2 (coeficiente de correlación predictivo), que nos indica la calidad predictiva del
modelo.
⎥⎥⎦
⎤
⎢⎢⎣
⎡
−
−−=
∑∑
2
22
)(`)(
1YYYY
q
A veces será necesario ajustar ligeramente el alineamiento del compuesto
o compuestos peor predichos y repetir los pasos anteriores hasta que se
encuentre un alineamiento mutuo que produzca un modelo QSAR-3D con alto
valor predictivo (alto valor de q2).
Es importante darse cuenta de que las variables Y, como cualquier otra
variable experimental, contienen errores. Los modelos tratarán de ajustar la Y
tanto como sea posible y, si se intenta mejorar demasiado el ajuste (fitting), el
modelo explicará también el ruido. Este fenómeno, denominado “sobreajuste”
(overfitting), es muy peligroso porque los modelos sobreajustados parecen muy
buenos modelos, pero no son capaces de predecir los valores de Y de objetos no
incluidos en el conjunto de entrenamiento.185
La capacidad de predicción de un modelo se atribuye a la existencia de
una relación verdadera entre los valores de las propiedades X (normalmente las
energías de los campos de interacción) y los valores de la propiedad Y
(normalmente la actividad de un fármaco). Incluso si los modelos QSAR-3D no son
capaces de explicar completamente los valores de la actividad, son muy valiosos
para identificar las áreas alrededor de las moléculas que más contribuyen a la
actividad. Estas regiones pueden ser consideradas como regiones importantes en
la interacción ligando-receptor, y pueden proporcionar pistas sobre cómo
interaccionan y por tanto ayudar al diseño de nuevos compuestos.
El análisis QSAR-3D tiene tres dificultades principales que superar. En
primer lugar, la identificación de las conformaciones bioactivas de los compuestos
flexibles que forman el conjunto de entrenamiento (training set). La conformación
bioactiva no se corresponde necesariamente con la estructura obtenida del
Antecedentes
38
análisis de la estructura cristalina o con la conformación en solución obtenida por
RMN. En la interpretación más sencilla, sobre todo para la actividad in vitro, la
conformación activa de un ligando se supone que es aquella que corresponde a la
conformación unida al receptor. En segundo lugar, la especificación de los criterios
para comparar las moléculas a la hora de construir un modelo QSAR-3D, lo que se
denomina alineamiento o superposición molecular. Por último, cada molécula del
conjunto de entrenamiento debe ser particionada respecto a las interacciones
intermoleculares (con el receptor). Es decir, se puede esperar que diferentes
partes de cada molécula tengan diferentes tipos de interacción con sitios de un
receptor común y/o en un medio común. Esta forma particionada de la molécula se
denomina farmacóforo de interacción.
Los métodos QSAR-3D más utilizados son el método CoMFA
(Comparative Molecular Field Análisis)186 y el método GRID/GOLPE.187 La
principal diferencia entre estos métodos es el tipo de descriptores que usan: el
método CoMFA calcula dos tipos de campos de interacción molecular: estérico (un
potencial de Lennard Jones 12-6) y electrostático (potencial culómbico); el método
GRID/GOLPE permite calcular un campo para cada sonda química implementada
en el programa GRID,188 que utiliza aproximaciones de la mecánica molecular.
Antecedentes
39
7. 2. Diseño directo
La investigación sobre fármacos que se realiza en la actualidad, a diferencia
de la llevada a cabo hasta hace dos o tres décadas, tiene su punto de mira en los
receptores moleculares. El avance en muchas disciplinas ha hecho posible la
identificación de numerosas macromoléculas diana: fundamentalmente ácidos
nucleicos y proteínas. Entre los avances más importantes realizados en el campo
de la biología molecular se encuentra la posibilidad de producir cantidades
suficientes de proteínas purificadas o del aislamiento desde su fuente natural.
Esto, añadido al avance en las técnicas de determinación estructural, hace que
puedan ser utilizadas como dianas para el diseño de fármacos. Los modelos de
receptores generados por ordenador (métodos teóricos) también nos pueden
servir para el diseño directo, aunque estos modelos deben ser de buena calidad.
El análisis detallado de los complejos ligando-receptor muestra que los
ligandos suelen adaptarse a la forma del sitio de unión, haciendo uso extenso de
su contribución hidrofóbica para la unión e interaccionando mediante enlaces de
hidrógeno. Todas estas observaciones han conducido a un enriquecimiento del
conocimiento del modo de unión desde el punto de vista fisicoquímico.
Los sistemas biológicos se rigen por la asociación no covalente, pero
altamente específica de moléculas. La acción de las hormonas, el reconocimiento
de antígenos por el sistema inmune o el control de la transcripción de ADN son
claros ejemplos.
Debido a que los ligandos que utilizamos como fármacos son moléculas
orgánicas pequeñas y que éstos tienen modos de interacción con sus receptores
muy específicos, el conocimiento del proceso de reconocimiento molecular es de
vital importancia para poder abordar el diseño de nuevos fármacos. El empleo de
técnicas computacionales que nos permitan, no sólo reproducir los procesos de
reconocimiento molecular, sino entenderlos y estudiarlos para, posteriormente,
predecir el comportamiento de determinados ligandos en el seno de los sitios
activos de distintas proteínas, ha permitido un avance muy significativo en el
Antecedentes
40
campo del diseño molecular basado en la estructura, que en general representa
uno de los mayores retos de la química farmacéutica actual.
El diseño basado en la estructura se basa en el análisis de la
complementariedad de los ligandos con una macromolécula en términos de forma,
volumen y otras propiedades fisicoquímicas. El éxito de este análisis puede
proporcionar información sobre nuevas entidades químicas que sean capaces de
interaccionar con distintos receptores terapéuticos o nuevos usos para ligandos ya
conocidos para otros receptores. La primera consecuencia de un diseño basado
en la estructura asistido por ordenador es la reducción drástica del número y de la
magnitud de las pruebas biológicas. En su lugar sólo es necesario probar aquellos
compuestos más prometedores.
El Protein Data Bank (PDB)189 es una base de datos de estructura 3D de
proteínas y ácidos nucleicos que es de dominio público y puede ser usada
libremente (figura 7).
85,1
14,3
0,40,2
Rayos-X RMN Microscopía Electrónica Otros
Figura 7: Aproximadamente el 85% de las estructuras disponibles en el PDB han sido
determinadas por cristalografía de rayos X, 14% por RMN, alrededor del 0.4% por
microscopía electrónica y sólo el 0.2% se determinaron con otros métodos.
Estos datos son enviados por científicos de todo el mundo. Los métodos
experimentales principales de resolución de la estructura de macromoléculas y de
complejos ligando-receptor son la cristalografía de rayos X y RMN. Otros métodos
Antecedentes
41
experimentales menos utilizados incluyen la microscopía electrónica, la difracción
electrónica, la transferencia de fluorescencia y la tomografía electrónica.
Además, cuando no se dispone de la estructura experimental de la
macromolécula problema, aún se pueden utilizar métodos directos de diseño de
fármacos acudiendo a técnicas de modelado molecular. Con éstas se pretende
obtener un modelo teórico de la estructura de la macromolécula, que si bien en
ningún caso será una representación exacta, nos puede permitir explorar las
zonas de interés con una cierta confianza.190 Las técnicas de modelado de
proteínas abarcan: Métodos ab initio, de reconocimiento de plegamiento (fold
recognition)191 y modelado por homología, entre otros.
Dependiendo del tipo de información experimental de que se disponga, la
predicción del modo de unión de un nuevo ligando a su receptor se puede abordar
de diferentes maneras. Es posible que la estructura del receptor objeto de estudio
haya sido resuelta formando complejos con más de un ligando, lo que sería la
situación ideal para el estudio del modo de unión. En ese caso es posible procesar
la información sobre el modo de unión de cada uno de los compuestos para
alinear nuevos ligandos y así conocer su posición de acoplamiento en la proteína.
En los casos en los que únicamente se dispone de uno de estos complejos
resueltos, la información puede ser suficiente para conocer el sitio de unión de
nuevos ligandos. Si se dispone de datos experimentales suplementarios, como
pueden ser estudios de mutagénesis dirigida, es posible un acoplamiento manual
del ligando, con la ayuda de programas de modelado molecular.
Si otros datos experimentales adicionales no están disponibles, es posible
utilizar métodos automáticos para explorar los posibles modos de unión de nuevos
ligandos al receptor problema. Estos son los programas de docking (anglicismo
que se podría traducir por acoplamiento), los cuales realizan una exploración
exhaustiva de posiciones relativas ligando-receptor, evaluando las interacciones
intermoleculares en cada posición explorada. Como resultado de esta exploración
se obtiene una colección de posibles posiciones de acoplamiento ligando-proteína,
que el programa ordena según la puntuación que su función de evaluación le ha
dado a cada solución (scoring). Estos dos pasos consecutivos (exploración y
Antecedentes
42
evaluación) se han resuelto de muy diversas formas en los programas de docking
disponibles.
El programa AutoDock192 es un conjunto de herramientas de docking o
acoplamiento automático. Realmente consiste en dos programas principales:
AutoDock, que lleva a cabo el acoplamiento del ligando en un conjunto de mallas
tridimensionales o grids que describen la macromolécula y AutoGrid, que pre-
calcula dichos grids.
AutoDock hace uso de una técnica de simulación tipo Monte Carlo para
explorar el espacio conformacional y de un sistema de evaluación rápida de la
energía, usando potenciales de afinidad molecular basados en mallas
tridimensionales. Esto permite realizar con eficacia el estudio de un problema de
acoplar un sustrato flexible en el sitio de unión de un receptor rígido. De este
modo, partiendo de la especificación de la estructura tridimensional del receptor,
de la información acerca de la libertad de rotación de los enlaces del ligando y de
una conformación arbitraria de partida, el procedimiento permite realizar un
acoplamiento que puede considerarse altamente efectivo.
La malla tridimensional o grid consiste en un enrejado tridimensional de
puntos regularmente espaciados, envolviendo, completa o parcialmente, a la
macromolécula objeto de estudio (figura 8). Ésta puede ser una proteína, una
enzima, un anticuerpo, el ADN, el ARN, o incluso un polímero o un cristal iónico.
Normalmente, el espaciado de los puntos de la malla varía desde 0,2 Å a 1,0 Å.
Cada punto dentro del mapa de grid almacena la energía potencial experimentada
por un átomo “sonda” o grupo funcional, situado en el interior de cada celda de la
rejilla. Esta energía potencial se debe a la interacción con todos los demás átomos
de la macromolécula. A partir de estos supuestos se debe especificar un nivel de
número de puntos de enrejado en cada dimensión, nx, ny y nz. La energía de la
sonda en cada punto del enrejado se determina mediante el conjunto de
parámetros necesarios para este particular tipo de átomo y la suma de todos los
átomos de la macromolécula, dentro de un radio de no enlace y de todas las
interacciones recíprocas existentes.
Antecedentes
43
Figura 8: representación de una malla tridimensional o grid, los vértices de esta malla
están representados en color verde y está constituida por un conjunto de puntos (puntos
de grid) que se encuentran a una distancia regular los unos de los otros (espaciado o
grid spacing) (color violeta). En cada uno de estos puntos se coloca un átomo-sonda
(probe atom) (color azul).
Los mapas de grid se necesitan para aquellos tipos de átomos presentes en
el ligando que está siendo acoplado. Por ejemplo, si el ligando acoplado es un
hidrocarburo, entonces sólo se requieren mapas de grid de carbono e hidrógeno.
En la práctica, sin embargo, los hidrógenos no polares no se tienen en cuenta de
forma explícita, de tal modo que sólo sería necesario el mapa de enrejado del
carbono, para los átomos de carbono unidos entre sí. Esto ahorra tiempo de
cálculo y espacio en disco.
Las últimas versiones de AutoDock utilizan algoritmos genéticos que han
permitido afrontar, por un lado, el funcionamiento correcto con un sistema que
tenga más de ocho enlaces con libertad de rotación y, por otro, estimar si el
ligando se une con una constante de afinidad milimolar, micromolar o nanomolar.
La versión 3.0 de AutoDock192 ofrece varios algoritmos de búsqueda para
explorar un problema de docking dado: Monte Carlo Simulated Annealing (SA),
Algoritmo Genético (GA) y un algoritmo híbrido entre algoritmo genético y
búsqueda local, conocido como Algoritmo Genético Lamarckiano (LGA). En
general, el método LGA proporciona mejores resultados en la búsqueda de la
energía más baja del sistema. Además, AutoDock incluye un campo de fuerzas de
Antecedentes
44
energía libre de enlace evaluado empíricamente, que permite la predicción de
energías libres de enlace y, en consecuencia, de constantes de asociación para
los ligandos acoplados.
7. 2. 1. Cribado virtual o virtual screening
El descubrimiento de compuestos activos para una diana terapéutica
representa un paso limitante en el proceso de descubrimiento de fármacos. Los
avances en la automatización y el desarrollo de los métodos bioanalíticos han
permitido la aplicación de técnicas HTS, que implica poder realizar ensayos
farmacológicos a millones de compuestos. Un ejemplo que ilustra claramente la
importancia de esta metodología es el hallazgo de oxadiazoles para el tratamiento
de la esquistosomiasis, recientemente publicado en Nature.193
A pesar de que el número de compuestos que pueden ser evaluados
mediante HTS es muy elevado, este número es muy pequeño en comparación con
el astronómico número de estructuras moleculares que podrían tener interés
biológico. Conforme el coste computacional ha disminuido, los investigadores han
dirigido sus esfuerzos a desarrollar métodos computacionales que realicen
cribados virtuales (virtual screenings o cribados in silico) de los compuestos con
potencial interés farmacológico.
Los métodos de cribado virtual deben desarrollarse basándose en un
algoritmo lo suficientemente rápido como para evaluar millones de compuestos
potenciales, pero manteniendo la suficiente precisión como para identificar
satisfactoriamente un subconjunto de compuestos entre los cuales se espera que
haya algún cabeza de serie. De acuerdo con estos requisitos, los métodos de
cribado basados en la estructura utilizan una representación muy simplificada de
las propiedades del receptor: un enrejado (grid) y una función de puntuación
empírica o semiempírica para estimar la fuerza de unión. La función de puntuación
(scoring function) puede variar mucho de unos programas a otros y es difícil
establecer la efectividad real de cada una de ellas.
Antecedentes
45
Para el cribado virtual se pueden utilizar bases de datos de compuestos
(quimiotecas) de dominio público, entre las que se encuentran la base de datos
ACD (Available Chemicals Directory)194, ZINC195, NCI (base de datos del NCI)196,
CSD (Cambridge Structural Database)197 y por supuesto quimiotecas disponibles
previo pago o colecciones privadas de compuestos.
Como el coste de realizar cribados virtuales es mucho menor y más rápido
que los métodos de HTS, pueden proporcionar la clave para limitar el número de
compuestos que hay que evaluar mediante HTS aumentando la eficacia del
proceso de descubrimiento de moléculas con interés farmacológico.
7. 2. 2. Dinámica Molecular
La dinámica molecular constituye una de las principales herramientas en el
estudio de la estructura, dinámica y termodinámica de macromoléculas biológicas.
Prueba de ello son los numerosos artículos científicos publicados hasta el año
2007 que hacen referencia a esta técnica (más de 60.000, algunos de ellos citados
más de 2.000 veces). Esta herramienta computacional calcula el comportamiento
de un sistema molecular a lo largo del tiempo. En este tiempo, es posible que
sucedan desde vibraciones de enlace o cambios conformacionales hasta
movimientos alostéricos, dependiendo del tiempo de integración que se utilice. En
todo caso, la dinámica molecular proporciona cambios en las posiciones de los
átomos de una manera dinámica.
La dinámica molecular se basa en la segunda ley de Newton del
movimiento. Integrando las ecuaciones de movimiento para cada átomo, se puede
obtener la trayectoria que viene definida por las posiciones, las velocidades y las
aceleraciones de los átomos a lo largo del tiempo de simulación.
La dinámica molecular es por tanto un método determinista, lo cual significa
que, una vez conocidas las posiciones y las velocidades de los átomos, es posible
predecir el estado del sistema en cada momento del futuro o del pasado. Las
Antecedentes
46
posiciones iniciales pueden ser obtenidas de la resolución de estructuras mediante
métodos experimentales, como se vio anteriormente.
Al conjunto de estados accesibles a una molécula se le denomina espacio
de fase. Se trata de un espacio 6N-dimensional, ya que el estado de un sistema
de N átomos queda definido al especificar las 3N coordenadas atómicas y los 3N
momentos.
Según la ecuación de la segunda ley de Newton:
iii amF =
donde Fi es la fuerza ejercida sobre el átomo i, y mi y ai son la masa y la
aceleración de ese átomo.
La fuerza sobre un átomo puede ser calculada a partir del cambio en la
energía potencial entre la posición actual y una posición cercana. Esto se conoce
como el gradiente de energía potencial U:
UF ii −∇=
Las energías potenciales pueden ser calculadas mediante el empleo de
métodos de mecánica molecular (MM) o mediante mecánica cuántica (QM). La
MM sólo se puede aplicar en aquellos casos en los que no se produzcan cambios
drásticos en la estructura electrónica, como puede ser la ruptura de un enlace. La
QM, sin embargo, sí puede ser utilizada en esas circunstancias.
Es posible predecir la posición de cada átomo a lo largo del tiempo
mediante el conocimiento de la fuerza y de la masa de cada uno de los átomos.
Para ello es necesario realizar la evaluación de las variables en intervalos muy
pequeños de tiempo (del orden de femtosegundos). El resultado de unir todos
estos pequeños intervalos de tiempo se llama trayectoria. En la práctica, las
trayectorias no se obtienen directamente de la ecuación de movimiento ya que
carece de solución analítica. En primer lugar se calculan las aceleraciones
mediante la resolución de la siguiente ecuación:
Antecedentes
47
2
2
dtrdm
drdU i
ii
=−
en el caso más sencillo donde la aceleración es constante:
dtdva i
i =
a partir de la integración de la ecuación, se calculan las velocidades:
0vtav ii +=
y así
dtdrv i
i =
las posiciones se pueden obtener de la integración de la ecuación anterior:
0rtvr ii +=
Combinando esta ecuación con la expresión de velocidad, se obtiene la
siguiente ecuación que relaciona la posición r a un tiempo t en función de la
aceleración a, la posición inicial r0 y la velocidad inicial v0:
002 rtvatr ++=
Por lo tanto, para calcular la trayectoria de un sistema molecular sólo se
necesitan las posiciones iniciales de los átomos, la distribución inicial de las
velocidades y la aceleración que se determina mediante el gradiente de la función
de energía potencial. Estos datos se obtienen de diferentes formas:
- La topología inicial del sistema se obtiene a partir de datos experimentales o
modelos teóricos.
- La distribución inicial de velocidades se suele obtener al azar mediante la
aplicación de una distribución de Maxwell-Boltzmann a la temperatura del
estudio.
- La energía cinética (K) se define en términos de momento de los átomos (p)
Antecedentes
48
∑=N
i
i
mppK
1
2
21)(
- La energía total del sistema (Hamiltoniano) es la suma de la energía
potencial y la cinética,
)()(),( rUpKprH +=
Se pueden calcular propiedades termodinámicas a partir de una simulación
de dinámica molecular. El valor instantáneo de temperatura se relaciona con la
energía cinética por medio del momento de los átomos según la siguiente
ecuación:
)3(221
2
NTkm
pK BN
i
i == ∑=
donde N es el número de átomos del sistema. Para un sistema aislado, el
momento de traslación total y el momento angular total están conservados y se les
puede asignar un valor cero mediante la elección de velocidades iniciales
apropiadas.
La energía potencial es función de la posición de todos los átomos (3N) del
sistema. Debido a la complejidad de este sistema, no existe una solución analítica
a la ecuación de movimiento y debe ser resuelta numéricamente.
Entre los algoritmos que resuelven numéricamente la ecuación de
movimiento se encuentran el de Verlet,198 leap-frog,199 un derivado de Verlet
conocido como Velocity-Verlet200 y el algoritmo de Beeman.201
Antecedentes
49
7. 2. 2. 1 Condiciones especiales de la dinámica molecular202
Utilización de restricciones
Los movimientos experimentados por una molécula flexible se pueden
distinguir por su frecuencia. Así, podemos hablar de movimientos que tienen lugar
con muy alta frecuencia, como las vibraciones de enlace y de movimientos que
tienen lugar con baja frecuencia, como pueden ser los cambios conformacionales
importantes. Como se ha descrito anteriormente, la evaluación de la posición de
los átomos no se realiza de forma continua, sino que se realiza a determinados
intervalos de tiempo.
Estos intervalos de tiempo pueden ser mayores o menores y no existe un
intervalo ideal ya que depende bastante del tipo de información que deseemos
obtener. Si el intervalo de tiempo es muy pequeño, la trayectoria no recogerá
información de la mayoría del espacio multidimensional aunque nos proporcionará
gran información sobre las vibraciones de enlace. Si el intervalo de tiempo es muy
grande, existe la posibilidad de que surjan errores al integrar el algoritmo, ya que
durante el tiempo entre una integración y la siguiente podrían haberse producido
movimientos de los átomos que violen la ecuación de movimiento, lo que se
reflejaría en un error matemático que detendría la simulación. Normalmente, en el
caso de los sistemas moleculares, se suele escoger como tiempo de integración la
décima parte del tiempo que tarda en realizarse el movimiento más rápido. El
movimiento más frecuente es el del alejamiento-acercamiento del enlace,
especialmente aquél que implica un hidrógeno cuyo período de vibración es de 10
fs, por lo que se suele escoger un intervalo de tiempo de 1 fs.
El coste computacional es mayor cuanto menor sea el intervalo de tiempo
de integración. En el caso de que no sea crucial el conocimiento de los
movimientos de vibración de los enlaces, es posible constreñir éstos a un valor de
equilibrio sin afectar al resto de grados de libertad del sistema, lo cual permite
Antecedentes
50
aumentar el intervalo de tiempo de integración y por tanto reducir el coste
computacional.
Una constricción o restricción es un requerimiento que el sistema debe
cumplir. Es posible constreñir enlaces, ángulos, etc., de tal manera que se fuerza
al sistema a adoptar los valores específicos de esa constricción a lo largo de la
simulación.
Se han desarrollado algoritmos que permiten constreñir movimientos, lo
cual aumenta la velocidad de la simulación. El más conocido es SHAKE,203 que se
aplica al final de cada paso y que se encarga de poner todos los enlaces en sus
respectivos valores de equilibrio permitiendo utilizar intervalos de tiempo de
integración superiores (en torno a 2 fs). SHAKE puede ser utilizado para constreñir
distancias de enlace, ángulos de enlace y diedros, aunque esto puede llevar a
disminuir los posibles cambios conformacionales.
Control de la presión y de la temperatura
Las dinámicas moleculares a temperatura constante introducen un término
λ para ajustar las velocidades y mantener el sistema a la temperatura deseada. El
sistema está acoplado a un baño externo que es el encargado de mantener
constante la temperatura, proporcionando calor o extrayendo calor del sistema.204
21
1)(
1 ⎥⎦
⎤⎢⎣
⎡⎟⎟⎠
⎞⎜⎜⎝
⎛−+=
tTTt o
τδλ
Los métodos para ajustar la presión a un valor constante funcionan de
manera similar. En este caso se acopla un baño de presión que es análogo al
baño de temperatura y se escala el volumen de la caja de simulación por el factor
λ, que en este caso corresponderá a:
))((1 0PtPt
p
−−=τδλ
Antecedentes
51
Condiciones de límite periódico (Periodic Boundary Conditions, PBC)
Las condiciones de límite periódico surgen como solución al problema de
las fuerzas que experimentan los átomos alojados en los extremos terminales de
la caja de simulación (normalmente una caja de disolvente), ya que estos átomos,
al estar en el límite de la caja, no experimentan las mismas fuerzas que el resto de
los átomos que sí están rodeados de otros átomos en todas las direcciones.
Las condiciones de límite periódico hacen que un sistema se comporte
como si estuviera replicado N veces en el espacio en idénticas celdas formando
una red periódica, en la que cada una de estas celdas es un sistema periódico
simple. Las coordenadas de las partículas que se encuentran en las celdas
replicadas se relacionan directamente con las partículas de la celda original
mediante simple translación. Las fuerzas que experimentan las partículas de la
celda original son calculadas con las partículas de esa misma celda y lo mismo
pasa con las celdas imagen. Si una partícula sale de una celda durante la
simulación se reemplaza por una partícula de una imagen que entra en la celda
por el lado opuesto.
El empleo de las condiciones de límite periódico proporciona una manera
efectiva y rápida de solucionar el problema de los extremos de la caja de
simulación, aunque entran en juego nuevos problemas, como el cálculo de las
fuerzas de largo alcance, que pueden traspasar el límite de la caja y hacer
necesario tener en cuenta las celdas replicadas. Las fuerzas de largo alcance sólo
pueden ser correctamente calculadas mediante la suma de las réplicas del
sistema original. Sin embargo, esto supone un esfuerzo computacional muy
importante por lo que se han desarrollado algunos métodos para poder resolver
este problema, como el del sumatorio de Ewald205 o el fast multipole method
(FMM).206
Antecedentes
52
Distancia de corte (Cut-off)
La cantidad de información que se debe procesar en el cálculo de una
trayectoria de dinámica molecular puede llegar a ser abrumadora. Por ello se
utilizan distancias de corte (cut-off) que permiten reducir el espacio de cálculo
definiendo la distancia máxima a la cual se tienen en cuenta las interacciones
entre átomos. Más allá de esta distancia, las interacciones se desprecian. Esta
aproximación es particularmente interesante en cuanto al cálculo de las
interacciones no enlazantes se refiere, ya que están consideradas como la parte
más costosa desde el punto de vista computacional.
La utilización de un cut-off para las interacciones no enlazantes está
generalmente aceptado para las interacciones de tipo van der Waals, ya que éstas
tienden rápidamente a cero a medida que la distancia entre átomos es mayor. Sin
embargo, en el caso de las interacciones iónicas de átomos cargados, la
dependencia respecto de la distancia es mucho menor que en el caso anterior, por
lo que el empleo de la distancia de corte no es completamente correcto.
El método de Particle Mesh Ewald (PME)205, 207 corrige este problema
relacionado con las interacciones electrostáticas. PME transforma el cálculo de
sumatoria de todas las interacciones electrostáticas posibles en otros dos términos
de convergencia mucho más rápida:
0EEeEeE recdirele ++=
donde Eedir se refiere al espacio directo, Eerec se refiere al espacio recíproco y E0 es
una constante.
Cuando se utiliza este método, las interacciones de rango corto o de
espacio directo son calculadas mediante un potencial culómbico modificado,
mientras que el resto de las interacciones o de espacio recíproco son calculadas a
través del sumatorio de vectores. En el cálculo del espacio directo se utilizan
distribuciones gaussianas para representar las cargas originales, que hacen
converger el término más rápidamente que en su forma original. Dichas
Antecedentes
53
distribuciones son posteriormente contrarrestadas mediante distribuciones
gaussianas de carga inversa en el cálculo del espacio recíproco. En el método
PME se optimiza el cálculo del espacio recíproco a través de la transformación
mediante interpolación de las cargas puntuales a mallas tridimensionales. Dichas
mallas son posteriormente tratadas mediante transformadas de Fourier, las cuales
reducen notablemente el coste computacional.
Tratamiento del disolvente. El agua como disolvente
El agua influye profundamente en la mayor parte de los fenómenos
bioquímicos y la unión de los ligandos a sus receptores no es una excepción. El
disolvente acuoso juega un papel clave en la determinación de la preferencia
conformacional de los ligandos y sus receptores, a la vez que modula las fuerzas
de unión que experimentan entre sí. El efecto hidrofóbico que gobierna muchas de
las interacciones fármaco-receptor es una consecuencia directa de interacciones
desfavorables de solutos no polares en medio acuoso, por este motivo es esencial
tener en cuenta los efectos de solvatación para poder predecir cuantitativamente
las afinidades de unión.
Se han desarrollado numerosos métodos para modelar los efectos del
disolvente, tanto para pequeñas moléculas como para macromoléculas, utilizando
desde modelos de solvente continuo, pasando por la inclusión de moléculas de
disolvente hasta la utilización de métodos híbridos.208, 209 Estas técnicas han sido
desarrolladas tanto para estudios de mecánica molecular como para mecánica
cuántica.
La energía de solvatación se define como la diferencia entre el coste
energético necesario para crear una cavidad en el disolvente y la energía que se
libera debido a las interacciones atractivas de dispersión y electrostáticas que se
producen entre el disolvente y el soluto. Las fuerzas electrostáticas se refuerzan
debido a la polarización tanto en el soluto como en el disolvente. La entropía
también juega un papel importante en cuanto a que el disolvente alrededor del
Antecedentes
54
soluto puede estar más ordenado que si se trata el disolvente en bruto. El
disolvente también reduce la interacción intramolecular de las cargas del soluto y
por lo tanto, puede alterar la preferencia conformacional del soluto.
Debido al coste computacional, las simulaciones con solvente explícito se
llevan a cabo normalmente empleando métodos de mecánica molecular. Los
efectos de la polarización debidos al disolvente se pueden mimetizar mediante el
uso de modelos de solvatación continuos por inclusión de un campo de reacción.
Estos modelos se utilizan tanto en MM como en QM. Los métodos híbridos
consisten en que la primera esfera de solvatación está modelada mediante
moléculas de disolvente explícito, mientras que el resto del disolvente se trata
como modelo continuo. Los métodos que mimetizan adecuadamente la
polarización del soluto pueden ser estudiados únicamente mediante QM.
Disolvente explícito
La inclusión de solvente de forma explícita, de manera que se trata a nivel
atómico, es una de las formas más exactas, pero también más costosas
computacionalmente. En la mayor parte de los casos, se tratan en condiciones
periódicas de contorno (PBC): la molécula de soluto se sitúa en el centro de la
celda y el espacio vacío en ella se rellena con moléculas de solvente. En este
caso, AMBER210 realiza el tratamiento de las interacciones de largo alcance con el
método de sumas de Ewald.
Otra forma de solvatar explícitamente consiste en rodear la molécula con
una capa (cap) de moléculas de solvente y sin tratamiento de condiciones
periódicas de contorno. En este caso, el número de moléculas de agua requeridas
es menor que en PBC, por lo que resulta más asequible computacionalmente que
la solvatación explícita periódica. Para prevenir la evaporación de las aguas en el
límite solvente-vacío, se aplican stochastic boundary conditions mediante la
restricción de un potencial harmónico.
Antecedentes
55
En la versión de AMBER 8210 se ha implementado un modelo alternativo
de solvatación para el tratamiento de esta capa de aguas respecto a versiones
anteriores de AMBER. Así, se incluye una corrección para el campo de reacción
de las aguas que están situadas tras la capa (cap), calculado mediante el método
de diferencias finitas de Poisson-Boltzmann. No se trata de un modelo de
solvatación implícito, como los que se presentan posteriormente, ya que no trata la
generalidad del sistema mediante este modelo.
Las regiones interiores al radio de la capa de aguas (soluto + solvente
explícito) se detallan a nivel atómico y el resto se trata como un medio continuo.
Se destaca que en versiones anteriores de AMBER, se permitía la inclusión de
una cap de aguas que solvatase parcialmente el sistema (normalmente la región
activa). En AMBER 8,210 la esfera de aguas ha de englobar a todo el soluto ya que
modela como un continuo todo aquello más allá del radio de la capa.
Disolvente implícito
La descripción exacta del entorno acuoso puede resultar
computacionalmente cara: la solvatación explícita de una proteína de tamaño
medio requiere miles de moléculas de agua.
Actualmente, la alternativa de reemplazar estas aguas discretas por un
sistema “virtual” de aguas está cobrando gran popularidad. Consiste en modelar
un medio infinito continuo con las propiedades dieléctricas e hidrofóbicas del agua.
Esto es lo que hacen los modelos de solvente implícito, basados en la teoría
clásica de Poisson-Boltzmann (PB). En ellos, el soluto se detalla a nivel atómico,
mientras que las moléculas de solvente y posibles electrolitos se tratan como un
continuo sin estructura, caracterizado por una constante dieléctrica del solvente
(εs). En el interior de la cavidad del soluto, la constante dieléctrica toma valores
característicos de proteínas (εint=2-8) o 1.
Aparte del coste computacional más reducido, estos modelos implícitos
presentan una serie de ventajas frente a la representación explícita del agua,
Antecedentes
56
como evitar el equilibrado del sistema (temperatura y presión); el soluto puede
explorar más rápidamente el espacio de fases debido a la ausencia de viscosidad
asociada a los modelos explícitos; se modela la solvatación en un volumen infinito,
evitándose artefactos del sistema periódico y se facilita la estimación de energías
de estructuras solvatadas. Sin embargo, se pierde también la posibilidad de
analizar interacciones estructurales soluto-solvente, como la formación de enlaces
de hidrógeno.
7. 2. 2. 2. Cálculo de la afinidad de unión Molecular Mechanics-Generalized Born Surface Area (MM-GBSA) Molecular Mechanics-Poisson Boltzman Surface Area (MM-PBSA)
MM-PBSA y MM-GBSA son métodos para evaluar energías libres de unión
o para calcular energías libres absolutas de moléculas en solución.
Las energías son evaluadas de acuerdo a una estrategia desarrollada por
Srinivassan, Kollman y Massova.211, 212 Están basadas en mecánica estadística y
contiene los distintos términos fisicoquímicos que intervienen en el proceso de
unión de un ligando a una proteína, fenómeno esquematizado en la Figura 9.
+
Figura 9: Esquema de unión de un ligando y proteína, con el desordenamiento de
aguas que produce el efecto hidrofóbico.
Inicialmente, la proteína y el ligando se hayan solvatados por moléculas de
agua. Tras la unión, las interacciones intermoleculares no enlazantes (suponiendo
que no hay unión covalente), estabilizan el complejo. El cambio entrópico asociado
al proceso es debido a la reducción de libertad conformacional del ligando (supone
∆G
Antecedentes
57
una reducción de entropía) y por el denominado efecto hidrofóbico producido por
el desordenamiento de las moléculas de agua, inicialmente ordenadas en torno al
ligando y receptor, contribuyendo positivamente al cambio entrópico.
Termodinámicamente, corresponde a la siguiente ecuación donde las
interacciones intermoleculares establecen la variación entálpica.
∆Gbind = GC – (GR + GL)
donde C, R y L son complejo, receptor y ligando.
El objetivo fundamental del método MM-PBSA/GBSA es calcular la
diferencia de energía entre dos estados:
R (aq) + L (aq) C (aq)
R (vac) + L (vac) C (vac)
∆GRsolv ∆GL
solv ∆GCsolv
∆Gbind,vac
∆Gbind,solv
El método combina mecánica molecular, el modelo Poisson-Bolzmann
para las interacciones electrostáticas en el caso de PBSA y la ecuación
generalizada de Born en GBSA, cálculos de área de la superficie accesible al
disolvente y análisis de modo normal para la entropía. La energía libre de unión es
expresada como:
∆Gbind, solv = ∆Gunión, vacío + ∆GC solv – (∆GL
solv + ∆GR solv)
donde ∆Gbind, solv es la energía libre de unión, ∆Gbind, vacío es la energía libre de
asociación entre proteína y ligando en fase gaseosa y ∆GC solv, ∆GL
solv y ∆GR solv
Antecedentes
58
corresponden a las energías libres de solvatación de complejo, ligando y receptor,
respectivamente. Además:
∆Gbind, vacío = ∆GMM - T∆S
donde ∆GMM es la diferencia de energías de enlace, ángulo, ángulo diedro,
electrostática y de van der Waals entre productos (complejo) y reactivos (ligando y
receptor) calculadas con el campo de fuerzas de AMBER. La energía libre de
solvatación está compuesta por dos términos, uno electrostático y otro no polar:
∆GMM = ∆GvdW + ∆Gelec + ∆GINT
∆G solv = ∆Gsolv pol + ∆G np
El término electrostático supone la contribución más importante, debido a
la fuerza de las interacciones soluto-solvente. Este término no sólo incluye estas
interacciones, sino también el trabajo necesario para generar el campo de
reacción del solvente inducido por la distribución de cargas del soluto. ∆Gsolv pol
equivale a la mitad de la energía de interacción soluto-solvente. Esta contribución
electrostática se evalúa a partir de modelos continuos del solvente: bien a partir de
la resolución de la ecuación de Poisson-Boltzmann mediante el método de
diferencias finitas (el método se denomina MM-PBSA)213 o mediante un modelo
Generalizado de Born (MM-GBSA).214 En teoría, los resultados obtenidos por MM-
GBSA ó MM-PBSA son similares, aunque el modelo generalizado de Born es más
rápido.
El término de interacciones no-polares es proporcional al área de la
superficie accesible al disolvente (solvent accesible surface area, SA),215 que
describe el área sobre la cual se produce contacto ligando–proteína, según la
ecuación:
∆Gsolv np = γSASA + β
Antecedentes
59
donde la tensión superficial γ y el término independiente β se fijaron en 0.005 kcal
mol –1 Å-2 y 0.00 kcal mol-1 respectivamente para el cálculo con PB y 0.0072 kcal
mol–1 Å-2 y 0.00 kcal mol-1 respectivamente para el cálculo con GB. La superficie
accesible se determina a partir de la posición del centro de una sonda esférica
(que representa una molécula de solvente, de radio 1.4 Å) que rueda sobre la
superficie de van der Waals de la proteína. Incrementando el valor de los radios de
van der Waals por el radio de la sonda, se obtienen los radios denominados
expandidos (expanded atom radii).
Capítulo I Diseño, síntesis y evaluación biológica de moduladores negativos de Adrenomedulina como agentes antitumorales
I. 1. Objetivos y Plan de Trabajo
Objetivos y Plan de Trabajo
61
I. 1. Objetivos y Plan de Trabajo
Desde el descubrimiento inicial de la AM por Kitamura y cols.1 se han
publicado un gran número de trabajos describiendo su mecanismo de acción y su
gran potencial como diana terapéutica. Los datos de que se dispone hasta el
momento parecen indicar que el control de los niveles de AM con moduladores
negativos podría tener importantes efectos en el tratamiento de diversas
enfermedades.
De especial interés para nosotros es su relación con el cáncer. Se ha
demostrado que la AM estimula el crecimiento celular, es un agente angiogénico
(estimula la vascularización en tejidos tumorales) y un inhibidor de la apoptosis.
El objetivo de este trabajo es la búsqueda de compuestos de bajo peso
molecular, capaces de ejercer un control negativo sobre los niveles de AM y que,
como consecuencia, puedan presentar actividad antiangiogénica y/o antitumoral.
El estudio es totalmente original y novedoso, ya que hasta el momento los únicos
compuestos no peptídicos con conocida afinidad por la AM y capaces de regular
sus funciones son los detectados en el cribado realizado en el NCI, que
constituyen el punto de partida de la investigación que se lleva a cabo en nuestro
grupo de trabajo en esta área.
De entre los diez compuestos que han demostrado interaccionar con la
AM actuando como moduladores negativos (figura 5), para este trabajo hemos
Objetivos y Plan de Trabajo
62
elegido el ácido 1, como cabeza de serie para llevar a cabo la síntesis y
evaluación biológica de una serie de moduladores negativos de la AM. Ello nos
permitirá establecer la relación estructura actividad de este tipo de compuestos y
proponer nuevas estructuras con mayor afinidad y actividad biológica.
Concretamente, nos hemos propuesto la síntesis y evaluación biológica de
dos series de compuestos. Una de ellas consiste en derivados de piperazinas de
tipo A donde R es un grupo etilo o bencilo. La otra serie de compuestos
relacionados son las piperazinas de tipo B, donde se ha eliminado el centro
estereogénico y se ha aumentado la variedad estructural del radical R (figura 10).
HO
N
OCH3
O
RN
HOOH
OAr
R
Tipo A Tipo B
H
+Cl-N
HOOH
OPh
1
H
+Cl-
Figura 10: Compuesto 1 y estructuras químicas de los derivados de
piperazinas de tipo A y B
I. 1. 1. Síntesis
En primer lugar nos planteamos poner a punto rutas de síntesis que
permitieran acceder a los derivados propuestos, utilizando métodos
convencionales. Una vez optimizados los procedimientos, se pretende diseñar
quimiotecas de tamaño pequeño utilizando técnicas combinatorias de síntesis en
paralelo. Con ello se pretendía obtener de forma rápida compuestos con una gran
variedad estructural y establecer la relación estructura-actividad para cada una de
las series.
Objetivos y Plan de Trabajo
63
I. 1. 2. Ensayo de competición
La determinación de la actividad biológica se ha estructurado en varias
etapas. En primer lugar, la evaluación de la habilidad de los compuestos
sintetizados para competir por la unión a la AM con su anticuerpo monoclonal. El
ensayo de competición con su anticuerpo ha sido desarrollado por miembros de
nuestro grupo de investigación179 y permite evaluar simultáneamente y de forma
sencilla un gran número de compuestos, entre ellos las colecciones de
compuestos que se obtengan utilizando técnicas de síntesis combinatoria.
I. 1. 3. Resonancia de Plasma en Superficie y QSAR-3D
Otro de los objetivos de este trabajo es el estudio de la capacidad de los
compuestos para unirse a la AM utilizando la técnica de Resonancia de Plasma en
Superficie (SPR) y con los datos obtenidos llevar a cabo un estudio QSAR-3D.
I. 1. 4. Producción de segundos mensajeros
Con el fin de comprobar que los compuestos sintetizados se comportan
como moduladores negativos de AM, nos hemos propuesto determinar la
producción de segundos mensajeros, mediante un radioinmunoensayo que
permite detectar los niveles intracelulares de AMPc. Cuando la AM se une a su
receptor se produce una elevación de los niveles de AMPc intracelulares, el cual
actúa como segundo mensajero. Para asegurar que los nuevos compuestos son
moduladores negativos de la acción de la AM, se expone la línea celular Rat2 (que
contiene los receptores específicos de la AM) a una mezcla formada por 100 nM
de AM (como agonista) más uno de los compuestos. La disminución de los niveles
de AMPc se analiza mediante un radioinmunoensayo comercial.179
Objetivos y Plan de Trabajo
64
I. 1. 5. Ensayos de proliferación celular
Finalmente nos proponemos evaluar la actividad antiproliferativa en
células tumorales de los compuestos que, con las técnicas anteriores, se muestren
como potenciales moduladores negativos. Las células tumorales serán
suministradas por el grupo de investigación del Dr. Alfredo Martínez (Consejo
Superior de Investigaciones Científicas, Instituto Cajal) y se mantendrán en cultivo
en su laboratorio. Para evaluar la capacidad antiproliferativa de los compuestos,
las células se sembrarán en placas de 96 pocillos y se expondrán a los
compuestos. Al final del experimento el número de células se evaluará mediante
las técnicas de MTT o tiñéndolas con sulforrodamina. Por otra parte, el grupo de
investigación del Dr. Manuel Hidalgo del Centro Integral Oncológico Clara Campal
(CIOCC), Hospital de Madrid, se hará cargo de evaluar la actividad antiproliferativa
en otras líneas celulares.
I. 2. Discusión de Resultados
65
I. 2. Discusión de Resultados
I. 2. 1. Síntesis
En este apartado se describe síntesis de una serie de compuestos
derivados del compuesto 1. Como ya se mencionó anteriormente, este compuesto
constituye el cabeza de serie elegido para, mediante modificaciones estructurales,
conseguir pequeñas quimiotecas de una variedad estructural tal que permitan
establecer relaciones estructura-actividad.
La síntesis de los derivados de piperazina de tipo A se recoge en el
esquema 1. En esta serie se ha sustituido el anillo bencénico por otros sistemas
con grupos atrayentes y donadores de electrones en distintas posiciones.
Asimismo se ha sustituido el anillo bencénico por tiofeno y naftaleno.
N
HOOH
OPh
1
H
+Cl-
66
También, aprovechando la disponibilidad de otra piperidona comercial, se
han preparado análogos de los compuestos anteriores con piperidonas N-bencil
sustituidas. Para la síntesis de todos estos compuestos se ha utilizado el método
descrito por Blicke y Zinnes216 para la síntesis de 1, en la que se hace reaccionar
el ácido fenilacético con N-etil-4-piperidona o N-bencil-4-piperidona en presencia
de iPrMgCl como base.
ArOH
O N
O
RCl
-NR
HOAr
COOH
H+
(a)
1- 24
+
1: Ar = Ph; R = CH3CH22: Ar = Ph; R = PhCH23: Ar = p-Br-Ph; R = CH3CH24: Ar = m-CH3-Ph; R = CH3CH25: Ar = m-HO-Ph; R = CH3CH26: Ar = m-Br-Ph; R = CH3CH27: Ar = p-Br-Ph; R = PhCH28: Ar = m-Br-Ph; R = PhCH2
9: Ar = p-CH3-Ph; R = CH3CH210: Ar = p-CH3-Ph; R = PhCH211: Ar = m-CH3-Ph; R = PhCH212: Ar = m-HO-Ph; R = PhCH213: Ar = 2-tienil; R' = CH3CH214: Ar = 2-tienil; R' = PhCH215: Ar = 1-naftil; R' = CH3CH216: Ar = 1-naftil; R' = PhCH2
Esquema 1. Reactivos (a) iPrMgCl, tolueno
La reacción se completó con rendimientos moderados para todos los
derivados propuestos. Sin embargo, la dificultad del procedimiento se centró en la
purificación de los productos obtenidos, ya que se trata de sales muy polares que
no fue posible someter a cromatografía en columna sobre gel de sílice o alúmina.
La purificación se basó en efectuar extracciones sucesivas en caliente con
nitrometano, a fin de separar las impurezas insolubles de los productos solubles
en este disolvente en caliente. Este método fue adecuado para aislar los
67
compuestos 1-5 y 13-16 con una pureza suficiente para obtener microanálisis
correctos.
En otros casos (compuestos 6-12) resultó útil tratar la sal inicialmente
formada con óxido de propileno en etanol a reflujo para liberar el grupo amino y
volver a formar el hidrocloruro tratando el residuo con HCl/AcOEt.217 Sin embargo,
aunque el procedimiento conduce a compuestos aparentemente puros por RMN 1H y 13C, en algunos casos no se obtienen con suficiente pureza como para
conseguir microanálisis correctos. También se intentaron, sin éxito, otros métodos
de purificación como recristalización, resinas de intercambio iónico y cromatografía
en columna.
Para solucionar este problema se intentó poner a punto un método que
permitiese obtener los ácidos puros por hidrólisis de los ésteres correspondientes.
Éstos deberían ser fáciles de obtener en una reacción de Reformatsky a partir del
α-bromo éster y la piperidona correspondientes. Sin embargo, al llevar a cabo la
reacción de Reformatsky partiendo de bromofenilacetato de metilo y N-etil-4-
piperidona no se obtuvo el α-hidroxiéster 17, sino que se recuperaron los
compuestos de partida inalterados.
N
HOOCH3
O
17
NR
HOOCH3
O
18 : R=COCH319 : R=Boc
NBoc
HOAr
COOH
20
Una alternativa a la reacción de Reformatsky consiste en la formación del
enolato del éster con una base fuerte218 (LICA suele ser la base de elección en
68
estos casos), y posterior adición de la cetona. De esta forma se consiguió obtener
el éster (17) con un 12% de rendimiento.
Desafortunadamente, cuando la reacción se intentó extender a otros
ésteres arilsustituídos o a la N-acetil-4-piperidona (para la síntesis de 18) o N-Boc-
4-piperidona (para la síntesis de 19), no se consiguió aislar los productos
deseados, por lo que esta vía no fue útil para ampliar la sustitución de nuestros
sistemas en estas posiciones.
La N-Boc-4-piperidona es un compuesto comercial y su utilización en este
tipo de reacciones tiene la ventaja de que, por eliminación posterior del grupo terc-
butoxicarbonilo, seguido de alquilación o acilación de la amina formada, se podría
acceder a una gran variedad de compuestos diferentemente sustituidos en el
átomo de nitrógeno. Puesto que la reacción con LICA no tuvo éxito, se intentó
obtener el ácido 20 por reacción del ácido fenilacético con N-Boc-4-piperidona en
las condiciones habituales. Sin embargo tampoco en este caso la reacción tuvo
éxito.
Para la síntesis de los derivados de tipo B decidimos partir de isobutirato
de metilo, para el cual están descritas varias reacciones de condensación con
distintas cicloalcanonas en presencia de LICA y que transcurren con rendimientos
excelentes.218
El isobutirato de metilo se hizo reaccionar con N-Boc-4-piperidona y la
reacción transcurrió con un alto rendimiento (87%) obteniéndose el N-Boc-
derivado 21 (esquema 2). En este caso se trata de un compuesto neutro fácil de
aislar y purificar. La posterior desprotección del grupo amino se realizó
burbujeando HCl (g) a través de una solución en AcOEt enfriada a 0 ºC. Esta
reacción transcurrió con un 75% de rendimiento y resultó mucho más eficaz que la
desprotección con ácido trifluoroacético (33%) que se había ensayado
previamente. El cloruro de 4-hidroxi-4-(2-metoxi-1,1-dimetil-2-oxoetil)piperidinio
(22) obtenido es un intermedio clave para la obtención de una serie de ésteres con
una amplia variedad de sustituyentes en el átomo de N. Así, el compuesto 22 pudo
alquilarse de manera sencilla y con buenos rendimientos utilizando el bromuro de
69
alquilo correspondiente y K2CO3, en periodos que van desde las 6 a 24 horas
(esquema 2).
El compuesto dibencilado 34 se obtuvo aplicando el mismo procedimiento
a partir de 22 y bromuro de bencilo, pero utilizando 2 equivalentes del haluro y
empleando un tiempo de reacción mucho mayor que para la formación de 24.
OCH3
O
NBoc
HOOCH3
O
NH2
HOOCH3
O
+
NR
HOOCH3
O
Cl-
(c)
21 22
(a)
(d)
23-33
23: R = CH2=CH-CH224: R = PhCH225: R = p-NO2PhCH226: R = (CH2)2CHCH227: R = p-Cl PhCH228: R = p-CF3PhCH229: R = HOCH2CH230: R = (CH3CH2)2NCH2CH231: R = p-CH3OPhCH232: R = CH3OCH2CH2
50.52, H 8.58, Cl 14.91, N 5.89, O 20.19; encontrado: C 50.06, H 8.39, N 5.95.
I. 4. 2. 4. Método general de la preparación de 2-(1-alquil-4-hidroxipiperidin-4-il)-2-metilpropanoato de metilo (23-34) A una solución de cloruro de 4-hidroxi-4-(2-metoxi-1,1-dimetil-2-oxoetil)piperidinio
(22) (1 equivalente) en DMF (2 mL aprox.) a temperatura ambiente se añade
K2CO3 (2 equivalentes) y a continuación el haluro de alquilo correspondiente (1
equivalente). La mezcla de reacción se agita a TA hasta que completa la reacción
(de 4 a 24 h). Se adiciona agua (10 mL) y la mezcla se extrae con AcOEt (3x15
mL). Los extractos orgánicos combinados se lavan con solución saturada de NaCl
y se secan sobre Na2SO4 anhidro. La solución se filtra y se evapora a vacío. Se
obtiene un residuo que se purifica por cromatografía en gel de sílice.
N
HO
O
O
HHCl
Parte Experimental
108
Síntesis de 2-(1-alil-4-hidroxipiperidin-4-il)-2-metilpropionato de metilo (23)
A partir de 22 (0.10 g, 0.4 mmol) en DMF (2 mL), K2CO3 (0.14 g,
0.8 mmol) y bromuro de alilo (0.043 mL, 0.4 mmol), y después de
una cromatografía en columna del crudo con AcOEt como
eluyente, se obtuvo el compuesto 23 (0.042 g, 41 %) como un
Se adsorbe AM en placas de PVC de 96 pocillos (adsorción pasiva)
incubando 50 µL de AM (100 µg/µL) en cada pocillo durante 1 h.
Después de descartar la solución sobrenadante, se añaden 200 µL de
suero de albúmina bovina 1% (BSA) en tampón fosfato (PBS). Después de 1 h la
solución sobrenadante se vuelve a aspirar y se añaden 50 µL de una solución 1µM
de los compuestos a analizar.
Después de 1 h se añaden 50 µL de anticuerpo marcado con peroxidasa
(2.4 µg/mL) y la solución se deja reaccionar durante 1 h más. Tras lavar con BSA
1% en PBS, se estimula la actividad de la peroxidasa usando hidrocloruro de o-
feniletilendiamina como sustrato. El producto de reacción se cuantifica en un lector
de placas (Spectra Rainbow; Tecan, Raleigh, NC) a 450 nm. Cada placa contiene
varios controles internos, incluyendo pocillos sin AM para evaluar las uniones no
específicas; pocillos donde no se agrega ningún compuesto para obtener de ellos
el máximo registro de color; y pocillos donde se adiciona anticuerpo sin marcar
como control positivo de inhibición. Cada compuesto se ensaya por duplicado en
la misma placa. Los resultados son aceptados cuando son reproducibles en tres
placas independientes. La variación intraensayo fue del 6% y la variación
interensayo fue del 13%. La sensibilidad del ensayo se determinó con el
anticuerpo frío y fue 12 nM con un rango dinámico de 12 nM a 54 nM.
I. 4. 3. 2. Determinación de la afinidad por SPR
Usando un equipo Biacore T100 (GE Heathcare Biacore, Uppsala, Suecia)
se llevó a cabo un análisis de interacción molecular en tiempo real. Todos los
experimentos se llevaron a cabo a 25 ºC. En la célula de flujo 2 (Fc 2) de un chip
sensor sCM5 se inmovilizaron 1800 unidades de resonancia (RU) de AM usando
Parte Experimental
120
el método de acoplamiento de amina de acuerdo con las especificaciones del
fabricante (BIAapplications Handbook). Fc 1 fue tratada igual que Fc 2 pero sin la
inyección de AM y se utilizó como referencia. Los estudios se llevaron a cabo con
un flujo de 30 L/min con HBS-DMSO (10 mM HEPES, pH 7.4, 150 mM NaCl, 3.4
mM EDTA, 5% DMSO) como tampón. Las muestras de los compuestos en
concentraciones de entre 10 y 200 µM en HBS-DMSO se inyectaron durante 1
min sobre las superficies de referencia y la de la AM, seguido de una post-
inyección durante 2 min. La regeneración se llevó a cabo con dos inyecciones de
30 s de NaCl 0.5 M, seguidas de 2 min. de estabilización. Típicamente, los 10
primeros ciclos consistieron en inyecciones de HBS-DMSO para asegurar que la
superficie se encontraba totalmente equilibrada. También se inyectó HBS-DMSO
antes de cada nuevo compuesto. Los datos del biosensor fueron analizados
usando el software Biacore T100 Evaluation versión 1.1.1 (GE Healthcare). Como
el DMSO a menudo genera cambios en el índice de refracción mayores a las
señales esperadas de los compuestos, los datos fueron corregidos teniendo en
cuenta las posibles diferencias en el índice de refracción generadas por el DMSO
entre las células de flujo.229
I. 4. 4. Ensayos biológicos I. 4. 4. 1. Análisis de la producción de AMPc
Este ensayo se realizó siguiendo protocolos anteriormente publicados.20
Se prepara una placa de 24 pocillos con células confluentes añadiendo 500 µL de
una suspensión de células Rat2 en medio R10 (1x105 células por pocillo) y
dejando incubar una noche. A continuación se lava dos veces con TIS. El medio
TIS consiste en medio RPMI 1640 (Invitrogen) al que se añaden 10 µg/mL de
transferrina, 10 µg/mL de insulina y una concentración 50 nM de selenito sódico.
La transferrina transporta hierro al interior de la célula. La insulina actúa como
factor de crecimiento, evitando que las células entren en apoptosis. El selenito
sódico, por su parte, actúa como antioxidante.
Parte Experimental
121
Se añaden luego 250 µL de TIS con 1% BSA, 1 mg/mL de bacitracina y
100 µM de IBMX. Se incuban las células durante 15 min. a 37 ºC en esta solución.
A continuación, se añaden los compuestos que se desea analizar a una
concentración tal que la concentración final sea 100 nM. Como control positivo se
utiliza forskolina (50 µM) que es un potente activador de proteínas G. Se deja
actuar a los compuestos durante 5 minutos a 37 ºC y a continuación se detiene la
reacción colocando la placa en hielo. Se añaden 250 µL de etanol absoluto frío,
que extrae completamente los contenidos celulares. Las células pegadas al fondo
se homogenizan raspando con la punta de una pipeta y la suspensión se transfiere
a tubos. Las muestras se congelan a –80 ºC hasta que se realice el
radioinmunoensayo.
Radioinmunoensayo para AMPc
El radioinmunoensayo para el AMPc se realiza siguiendo el protocolo del
kit RPA 509 de Biotrack (Amersham Pharmacia, Piscataway, NJ).20
En primer lugar se equilibran todas las muestras y productos del kit a
temperatura ambiente. Después se rotulan tubos de polipropileno con 25 fmol, 50
fmol, 100 fmol, 200 fmol, 400 fmol, 800 fmol y 1600 fmol, y se agregan 500 µL de
buffer (kit) en todos los tubos. En el tubo 1600 fmol se agregan 500 µL de estándar
(32 pmol/mL) y se agita vigorosamente. A partir de esta solución se preparan las
siguientes diluyendo a la mitad sucesivamente con los tubos restantes. Alícuotas
de 100 µL de cada dilución proporcionarán siete niveles de AMPc estándar
diferentes entre 25 y 1600 fmol.
Por otra parte, se rotulan tubos de polipropileno por duplicado para
cuentas totales (TC), tubos de cero estándar (B0), estándares (7-20) y muestras
(21-68). Se agregan 100 µL de tampón en los tubos de cero estándar, 100 µL de
estándar en los tubos 7-20, y 100 µL de cada muestra a ensayar en los tubos
correspondientes.
Parte Experimental
122
Inmediatamente se adicionan 100 µL de antisuero a todos los tubos excepto los
correspondientes a TC. Todos los tubos se agitan vigorosamente en un vortex, se
cubren con un film de plástico y se incuban 3 horas entre 2-8 ºC.
Se agita la botella conteniendo el anticuerpo secundario Amerlex-M hasta
obtener una suspensión homogénea y se adicionan 500 µL a cada tubo excepto a
los TC. Se agita con vortex y se incuba 10 minutos a temperatura ambiente.
Después se separa la fracción unida al anticuerpo por centrifugación (10
minutos, a 1500 rpm) y se extrae el sobrenadante. Por último se mide la
radioactividad presente en cada sedimento. Después de restar el valor de unión no
específica, se construye la curva de calibrado y se interpolan en ella las medidas
de las muestras problema.
I. 4. 4. 2. Pruebas antiproliferativas
En el caso de las líneas celulares T47D, CT2A, A549 y H1299, en una
placa de 96 pocillos se siembran células de la línea elegida (1x104 células por
pocillo) en 50 µL de RPMI 1640 sin suero. Las placas se mantienen en un
incubador húmedo a 37 ºC. Un día después de la siembra se añaden los
compuestos y 5 días después se realizan las medidas. Para el revelado con la
solución comercial, CellTiter 96® AQueous One Soluction Cell Proliferation Assay, se
añaden 20 µL a cada pocillo de la placa. Inmediatamente se incuba la placa entre
1-4 h a 37 ºC en una atmósfera de 5% de CO2. Finalmente, se registra la
absorbancia a 492 nm.
Para las líneas celulares PANC-1, L36PL, HCT-116 y HT29, se
siembran en una placa de 96 pocillos 5 x 103 células por pocillo. Las placas se
mantienen en un incubador húmedo a 37 ºC. Un día después de la siembra se
añaden los compuestos en concentración creciente y también el control 5-
fluorouracilo (5-FU) para HCT116 y HT29, y gemcitabina para PANC-1 y
L36PL, en presencia de suero fetal bovino 0.5%. Después de 96 horas, se
agregan en cada pocillo, 0.02 mL de una solución de bromuro de 3-(4,5-
Parte Experimental
123
dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio (5 mg/mL en PBS; Sigma) y las placas se
incuban 3 h a 37 ºC. A continuación el medio se reemplaza por 0.1 mL de
DMSO por pocillo. Se agitan las placas y se mide la absorbancia a 570 nm
usando un lector de placas multipocillo (Modelo 550, Bio-Rad, Inc., Hercules,
CA). Cada experimento se realiza por triplicado para cada concentración y se
lleva a cabo por lo menos tres veces.
I. 4. 5. Estudios QSAR- 3D
La estructura 3D de los compuestos se construyó con el grupo carboxílico
protonado, es decir, en su forma neutra y el sustituyente voluminoso en el C4 de la
piperidina se colocó en posición ecuatorial.
Para todos los compuestos se consideró la misma configuración absoluta
del centro estereogénico. La geometría se optimizó a nivel AM1 usando los
programas ChemDraw Ultra 10.0 y Gaussian98.230
Los datos de SPR (tablas 3, 4 y 5) se usaron como variables y.
Las conformaciones obtenidas se analizaron utilizando la metodología
GRIND con el programa Almond 3.3.0.
Se eligieron las sondas DRY, O y N1 para representar las funciones
potencialmente importantes del sitio de unión. La sonda TIP fue también incluida
para considerar la forma de la molécula.
El espaciado de malla se fijó en 0.5 Å (smooth window = 0.8 unidades de
grid). El número de nodos filtrados se situó en 100, con un 50% de peso relativo
de los campos. Almond produjo diez grupos de variables: cuatro
autocorrelogramas y seis correlogramas cruzados. La línea base se eliminó para
hacer el escalado. La validación cruzada se realizó bien usando el método leave-
one-out (LOO) o por asignación de compuestos al azar en cinco grupos,
realizando la validación cruzada en estos grupos y luego repitiendo todo el poceso
20 veces. No se encontraron diferencias importantes entre ambos métodos de
validación.
Parte Experimental
124
Todas las operaciones se llevaron a cabo en un PC Intel Pentium 4
usando el sistema operativo Linux RedHat 9.
Capítulo II Cribado virtual de pequeñas moléculas con posible actividad como moduladores negativos del PAMP
II. 1. Objetivos y Plan de Trabajo
Objetivos y Plan de Trabajo
127
II. 1. Objetivos y Plan de Trabajo
De todas las acciones biológicas del PAMP nos ha interesado
particularmente su capacidad para actuar como un potente factor angiogénico. El
presente trabajo plantea la búsqueda de pequeñas moléculas que, a través de la
unión con el PAMP, puedan actuar como moduladores negativos de su acción, y
como consecuencia, puedan presentar interés como agentes antiangiogénicos.
Para ello nos planteamos llevar a cabo un cribado virtual basado en la
estructura del PAMP y utilizando la quimioteca de compuestos conocida como NCI
Diversity Set.231 Mediante el uso de este cribado virtual se pueden seleccionar
aquellos compuestos que tengan mayor afinidad por el PAMP, para someterlos en
una segunda etapa a ensayos de afinidad que confirmen experimentalmente la
predicción teórica.
Del mismo modo se pretende analizar una pequeña colección de
compuestos sintetizados en nuestro laboratorio, que proceden de otros trabajos
realizados en nuestro grupo de investigación.180, 232
Una vez ordenados los compuestos de acuerdo a su energía de unión al
péptido, se pretende profundizar en las interacciones ligando-péptido predichas
por el programa para los compuestos con energía de unión más favorable.
En una segunda etapa, es necesario poner a punto un método para
determinar experimentalmente la afinidad de los ligandos al PAMP, basado en la
competencia con un anticuerpo monoclonal del PAMP, que nos permita evaluar los
Objetivos y Plan de Trabajo
128
compuestos seleccionados y confirmar de manera preliminar las predicciones del
estudio de docking.
Los compuestos que muestren afinidad por el PAMP, se seleccionarán
para una evaluación cuantitativa con la técnica de SPR.
También se probará la actividad como agentes antiangiogénicos de los
compuestos seleccionados, mediante el ensayo de anillos de arcos aórticos de
embrión de pollo,118 así como su capacidad antiproliferativa en una línea celular de
cáncer de colon, Caco-2.
Las interacciones entre algunas de las pequeñas moléculas seleccionadas
y el PAMP se analizarán más profundamente mediante estudios de dinámica
molecular y cálculos teóricos de energías.
II. 2. Discusión de Resultados
Discusión de Resultados
129
II. 2. Discusión de resultados II. 2. 1. Cribado Virtual En los últimos años el cribado virtual (Virtual Screening: VS) se ha
transformado en una herramienta de gran utilidad para el descubrimiento de nuevos
fármacos. El VS supone un complemento del HTS y un criterio para la racionalización
de la síntesis. Los posibles hits determinados por HTS son reales pero, por sí solos,
no contribuyen a ampliar el conocimiento del modo de interacción con su diana
farmacológica. Sin embargo, el VS proporciona hits potenciales que aportan
información acerca del modo de interacción ligando-receptor. Además, esta técnica
es relativamente barata (ahorra la adquisición de reactivos y robotización), rápida y
permite considerar un número de compuestos in silico mucho mayor al que se
accede experimentalmente.
En este trabajo se ha seleccionado la colección de moléculas del NCI
conocida como NCI Diversity Set, ya que se trata de una base de datos de libre
acceso, preparada para AutoDock y nuestro grupo posee experiencia en la utilización
de la misma.233
Para iniciar la búsqueda de pequeñas moléculas capaces de unirse al
PAMP, en primer lugar se preparó la estructura del péptido con el formato y
características adecuadas para su utilización con el programa AutoDock. Se refinó la
lista del NCI, eliminando los compuestos de la denominada “problem list” que
contiene algunos archivos cuya calidad no está comprobada. También se eliminaron
aquellos que poseen átomos diferentes de C, H, N, O, S, P, F, Cl, Br, I. Del mismo
Discusión de Resultados
130
modo se construyeron los archivos correspondientes a los compuestos de nuestra
quimioteca.
A continuación se realizó el docking de forma automática para un total de
2436 estructuras, 1836 pertenecientes al NCI Diversity Set y 600 confórmeros
correspondientes a 60 compuestos pertenecientes a nuestra colección particular. Existen antecedentes que demuestran que la región activa del péptido se
encuentra en el extremo carboxilo terminal.12 Por este motivo, la compañía
Evogenix (Sydney, Australia), dentro de su proyecto de desarrollar un anticuerpo
monoclonal humanizado contra PAMP utilizable en clínica, desarrolló un
anticuerpo monoclonal αPAMP específicamente para este epítopo del péptido.234
Este anticuerpo es el que posteriormente se utilizó para los ensayos de afinidad.
Por lo tanto, en nuestro estudio de cribado virtual enfocamos el docking
solamente a esta región del péptido, tal y como se muestra en la figura 17.
Figura 17: Estructura 3D del PAMP y localización y dimensiones de la caja construida
para la realización del docking.
ARG20
62 Å
37 Å
45 Å ARG20
62 Å
37 Å
45 Å62 Å
37 Å
62 Å62 Å
37 Å
45 Å45 Å
Discusión de Resultados
131
Los resultados se ordenaron según la energía de unión al PAMP predicha
en el estudio de docking y, a continuación, se seleccionaron los 50 compuestos
que mostraron las energías de interacción más favorables para su posterior
evaluación en el ensayo de competición.
En la tabla 6 se muestran las estructuras químicas de los 50 compuestos
seleccionados junto con los valores de energía de unión obtenidos y los
aminoácidos que intervienen en las interacciones detectadas.
Se analizaron los complejos péptido-ligando uno a uno, a través de una
inspección visual (SYBYL 7.3), localizando los aminoácidos que podrían estar
implicados en la unión, según criterios de distancia (4 Å). Esta distancia es lo
suficientemente amplia para incluir interacciones de van der Waals, enlaces de
hidrógeno, interacciones hidrofóbicas, etc.
Los primeros 14 compuestos presentan estructuras relacionadas y
pertenecen a nuestra quimioteca (código USP). Todas ellas se encuentran en un
rango de energía entre -14.17 y -11.56 kcal mol-1, que corresponde a una
diferencia de 2.61, valor cercano al que corresponde a la desviación estándar de
AutoDock (2.1 kcal mol-1)192 y por lo tanto se puede considerar que todas ellas
poseen una afinidad similar desde el punto de vista teórico.
Discusión de Resultados
132
Tabla 6: Compuestos identificados mediante el cribado virtual del PAMP.
Tabla 6: Compuestos identificados mediante el cribado virtual del PAMP.
Discusión de Resultados
139
En la figura 18 se muestra la frecuencia de interacción con aminoácidos en
los complejos PAMP-ligando de los 50 compuestos seleccionados.
Como se puede observar, los aminoácidos TRP13, ASN14, TRP16, ALA17 y
ARG20 están a menos de 4 Å de distancia del ligando en más del 80% de los
complejos predichos por AutoDock. Las moléculas que presentaron mejor energía
de interacción se unen precisamente a esta región del péptido y se observa que,
con mucha frecuencia, los anillos aromáticos presentes en los ligandos se apilan
con los anillos indólicos, predominantemente con el del TRP16. Sin embargo, estas
observaciones son incompletas debido a la rigidez del modelo utilizado. Para
estudiar con más profundidad las interacciones péptido-ligando se han propuesto
estudios de dinámica molecular para algunos de los ligandos mencionados.
Figura 18: Frecuencia de interacción con aminoácidos en los complejos PAMP-ligando
8
30
13
49
41
7
49 49
1
32
48
0
10
20
30
40
50
60
PHE9
ARG
10
LYS1
1
LYS1
2
TRP1
3
ASN
14
LYS1
5
TRP1
6
ALA1
7
LEU
18
SER
19
ARG
20
Discusión de Resultados
140
II. 2. 2. Ensayo de competición
Para poder llevar a cabo los ensayos biológicos, así como los estudios de
afinidad, se solicitaron al NCI los compuestos de la quimioteca seleccionados.
El ensayo de competencia con el anticuerpo monoclonal αPAMP se puso
a punto en nuestro laboratorio. Aunque el ensayo es similar al descrito para la AM,
fue necesario marcar el anticuerpo y determinar las condiciones de trabajo
idóneas, tales como las concentraciones de los anticuerpos, el tipo de placa a
utilizar y los tiempos de medida.
Los 50 compuestos seleccionados se sometieron al ensayo de
competición a una concentración 1 µM. Los registros de absorbancia (%A) para
cada uno de los compuestos ensayados se muestran en la figura 19 y en la tabla
6.
Como se puede observar, más de la mitad de los compuestos son
capaces de disminuir los registros de absorbancia confirmando experimentalmente
las predicciones de AutoDock.
Para posteriores ensayos se seleccionaron los 20 compuestos que
disminuyen la absorbancia más de un 10%. En la tabla 6 el código de estos
compuestos está indicado de color azul.
0
90
USP
1KU
SP3L
USP
1LU
SP3N
USP
2MU
SP1J
USP
2JU
SP2L
USP
2KU
SP3M
USP
2NU
SP3J
USP
1NU
SP1M
3718
8437
1876
3718
7833
5461
1615
2664
516
0391
6411
134
3227
3720
4660
0067
4948
765
9162
3722
9412
8437
4238
411
6654
8787
742
258
1134
9128
2027
1167
0210
6221
2392
226
273
2117
3623
217
6013
6429
9589
1726
1436
1814
5645
232
7705
6325
3627
0718
1267
10 Ac
Compuestos (1uM)
% A
Figura 19: Resultados del ensayo de competición. Registros de absorbancia a 450 nm (%A); los compuestos con código USP pertenecen a nuestra
quimioteca; los que sólo poseen código numérico pertenecen a la colección del NCI. Ac representa el anticuerpo sin marcar (control positivo de inhibición).
Discusión y Resultados
142
II. 2. 3. Determinación de la afinidad por SPR
Como se ha mencionado en el capítulo I de esta memoria, la SPR constituye
una técnica validada para la detección de interacciones ligando-receptor e incluso en
algunos casos permite cuantificar dicha interacción.
Por este motivo los 20 compuestos seleccionados mediante el ensayo de
competición fueron sometidos a experimentos de SPR en colaboración con la Dra.
Danièle Altschuh, del Laboratorio de Biotecnología de Interacciones Moleculares,
Escuela Superior de Biotecnología de Estrasburgo (Francia).
De los 20 compuestos seleccionados, tres de ellos (USP3M, 343227 y
113491) no fueron evaluados debido a que no se solubilizaron al 100% en DMSO.
Por otro lado, los compuestos 64111, 42258, 211736, 299589 y 327705 dieron respuestas superiores a la respuesta máxima calculada (Rmáx), lo que hace
suponer que existe agregación.
Entre los compuestos que pudieron ser evaluados, tres de ellos dieron una
respuesta positiva inequívoca (USP1K, USP3J y 49487). Los sensorgramas
correspondientes a los compuestos USP1K y 49487 se muestran en la figura 20.
Discusión y Resultados
143
Figura 20: Sensorgramas SPR, correspondientes a inyecciones de 60 s para los
compuestos USP1K (a) y 49487 (b) a diferentes concentraciones (0, 50, 100 y 200 µM).
Los compuestos 56452, USP1L, 116702 y 172614 dieron resultados
positivos, sin embargo, la respuesta no es dosis-depediente y la fiabilidad del
experimento es menor que en los casos anteriores. Un ejemplo se muestra en la
figura 21(a).
Los compuestos USP2M, USP1N, USP3N, 23217, 87877 y 601364 en este
experimento dieron resultados negativos (ejemplo en la figura 21 (b)).
-10
-5
0
5
10
15
-50 -30 -10 10 30 50 70 90 110 130 150T im e s
RU B la nk S u btra cted S en sorgram s
UR 15
10
5
0
-5
-10
-50 -30 -10 10 30 50 70 90 110 130 150 Tiempo (s)
a
-10
-5
0
5
10
15
-50 -30 -10 10 30 50 70 90 110 130 150T im e s
RU B la nk S u btra cted S en sorgram s
UR 15
10
5
0
-5
-10
-50 -30 -10 10 30 50 70 90 110 130 150 Tiempo (s)
a
-30
-20
-10
0
10
20
30
40
50
60
-100 -50 0 50 100 150 200
Tim e s
RU
Res
pons
e
Blank Subtracted Sensorgrams
-100 -50 0 50 100 150 200Tiempo (s)
UR
60
50
40
30
20
10
0
-10
-20
-30
b
-30
-20
-10
0
10
20
30
40
50
60
-100 -50 0 50 100 150 200
Tim e s
RU
Res
pons
e
Blank Subtracted Sensorgrams
-100 -50 0 50 100 150 200Tiempo (s)
UR
60
50
40
30
20
10
0
-10
-20
-30-30
-20
-10
0
10
20
30
40
50
60
-100 -50 0 50 100 150 200
Tim e s
RU
Res
pons
e
Blank Subtracted Sensorgrams
-100 -50 0 50 100 150 200Tiempo (s)
UR
60
50
40
30
20
10
0
-10
-20
-30-30
-20
-10
0
10
20
30
40
50
60
-100 -50 0 50 100 150 200
Tim e s
RU
Res
pons
e
Blank Subtracted Sensorgrams
-100 -50 0 50 100 150 200Tiempo (s)
-30
-20
-10
0
10
20
30
40
50
60
-100 -50 0 50 100 150 200
Tim e s
RU
Res
pons
e
Blank Subtracted Sensorgrams
-100 -50 0 50 100 150 200Tiempo (s)
UR
60
50
40
30
20
10
0
-10
-20
-30
b
Discusión y Resultados
144
Figura 21: Sensorgramas SPR, correspondientes a inyecciones de 60 s para los
compuestos 56452 (a) y USP1N (b) a diferentes concentraciones (0, 50, 100 y 200 µM).
Estos resultados ponen de manifiesto que el protocolo utilizado en este
trabajo, que se basa en un cribado virtual seguido de un ensayo de competición
rápido y sencillo, permite detectar compuestos que se unen al PAMP.
a
-20
-15
-10
-5
0
5
10
15
20
-100 -50 0 50 100 150 200
Tim e s
RU
Res
pons
e
Blank Subtracted Sensorgrams
-100 -50 0 50 100 150 200Tiempo (s)
UR
20
15
10
5
0
-5
-10
-15
-20
a
-20
-15
-10
-5
0
5
10
15
20
-100 -50 0 50 100 150 200
Tim e s
RU
Res
pons
e
Blank Subtracted Sensorgrams
-100 -50 0 50 100 150 200Tiempo (s)
UR
20
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-100 -50 0 50 100 150 200Tiempo (s)
Discusión y Resultados
145
II. 2. 4. Dinámica Molecular (DM) Los datos descritos anteriormente ponen de manifiesto que, compuestos
como USP1K y USP1N, que poseen estructuras muy similares y sólo se
diferencian en la longitud de la cadena metilénica, se comportan de forma muy
diferente en su interacción con PAMP.
Por un lado, en los experimentos de docking, los complejos poseen
energías muy similares (USP1K: -14.17 kcal mol-1 y USP1N: -11.85 kcal mol-1) y,
como se ha mencionado anteriormente, están próximos al margen de desviación
estándar del método. Sin embargo, tanto en el ensayo de competición como en
SPR, únicamente el compuesto USP1K mostró afinidad por el péptido, mientras
que el compuesto USP1N no presenta afinidad por el PAMP, como se muestra en
la figura 21.
Con la finalidad de profundizar en el modo de unión del compuesto USP1K a nivel atómico y considerar la flexibilidad tanto del ligando como del receptor, se
llevaron a cabo simulaciones de dinámica molecular, tanto para el péptido libre
como para el complejo entre el PAMP y el compuesto USP1K. Por otro lado, y con
el fin de obtener datos termodinámicos comparables, se aplicó el mismo protocolo
para el complejo PAMP-USP1N.
Como punto de partida para las simulaciones de DM se utilizó la primera
de las conformaciones depositadas de la estructura del péptido (código PDB =
2fly)8 y el complejo obtenido a partir de los estudios de docking. Tanto los dos
complejos como el péptido libre fueron neutralizados con cinco iones Cl- y
minimizados en vacío.
A continuación, con el módulo xleap de AMBER, se construyó una caja de
agua y, una vez inmersos en ella, los complejos se volvieron a minimizar. Los
parámetros para los compuestos USP1K y USP1N se derivaron por analogía de
trabajos previos realizados con compuestos de la misma serie.6 Se aplicaron
condiciones de límite periódico y las interacciones electrostáticas fueron tratadas
con el método Particle Mesh Ewald (PME)205, 207 con un espaciado de malla de 1
Discusión y Resultados
146
Å. La distancia de corte (cut off) para las interacciones entre los átomos fue de 8
Å. El algoritmo SHAKE203 fue aplicado a todos los enlaces con hidrógenos con un
intervalo de integración de 1.0 fs.
Tanto los complejos como el péptido libre se sometieron a un proceso de
equilibrado en varias etapas, que se detallan en la parte experimental y finalmente
a la dinámica de producción durante 9 ns a 300 K. Las simulaciones de dinámica molecular proporcionan coordenadas
respecto al tiempo, permitiendo un análisis detallado de la evolución
conformacional del sistema. La representación de la desviación cuadrática media
(RMSD) de las estructuras respecto a la inicial en función del tiempo da
información acerca de la estabilidad del complejo dinámico. Valores elevados de
RMSD indican un alto grado de desviación respecto de la estructura original. Este
valor fue monitorizado para los átomos principales del esqueleto de la proteína
(Cα, C, N) a lo largo del tiempo de simulación. En la figura 22 se recogen los
valores de RMSD para el complejo PAMP-USP1K y el péptido libre.
T∆S -22.43 (2.28) -23.38 (3.09) Tabla 7: Energías promedio en kcal mol-1 con su correspondiente desviación estándar
entre paréntesis. ∆Gelec, energía electrostática calculada con el campo de fuerzas;
∆GvdW, energía de van der Waals calculada con el campo de fuerzas; ∆GINT, energía
interna (enlace, ángulos y diedro); ∆GMM, energía total en fase gaseosa; ∆Gsolv np, contribución no polar a la energía libre de solvatación; ∆Gsolv pol, contribución polar a la
energía libre de solvatación; ∆Gsolv, energía libre de solvatación; ∆Hbind, contribución
entálpica a la energía libre de unión y T∆S, contribución entrópica a la energía libre de
unión.
Si bien la pérdida de entropía es similar para ambos complejos, es
evidente que la magnitud relativa de su contribución a la energía total de unión
(∆Gbind) es diferente. En el caso del complejo PAMP-USP1N la contribución
entrópica desfavorable se ve reforzada por la entálpica, lo que conduce a un
resultado que indica una asociación desfavorable (∆GbindPB = 258.06 kcal mol-1 y
∆GbindGB = 249.69 kcal mol-1). Sin embargo, en el caso del complejo PAMP-
USP1K, la contribución entálpica favorable y el cambio de entropía desfavorable
se oponen. Según el método de cálculo aplicado en el cálculo de la entalpía,
∆Gbind es igual a 5.8 kcal mol-1 (PB) ó -3.36 kcal mol-1 (GB).
Discusión y Resultados
163
Aunque no es correcto pretender que los valores de las energías halladas
coincidan con valores determinados experimentalmente, a pesar de la diferencia
registrada entre los métodos y considerando los errores, sí se puede concluir que
la tendencia que indican las energías de binding se correlaciona con los hechos
experimentales.
Además de la energía total del sistema, los cálculos computacionales nos
permiten descomponer las energías libres en contribuciones individuales y
determinar cuál es la aportación que hacen los distintos residuos o constituyentes
del complejo a la energía final de unión. Nos interesó particularmente la
interacción catión-π que se establece entre los grupos guanidinios de las ARG 2 y
20 y los anillos aromáticos del compuesto USP1K.
En la tabla 8 se muestran los resultados de las energías medias, a lo largo
de toda la simulación, para las interacciones entre los guanidinios de las argininas
y los sistemas aromáticos de USP1K.
De acuerdo con estos resultados, estas interacciones realizan una
contribución entálpica a la energía libre de unión total favorable en todos los
casos. Es interesante destacar en este sentido, que ninguna de las interacciones
de los anillos aromáticos TL1 y MT1 con ARG2, realiza un aporte a la energía total
más favorable que la otra, lo cual concuerda con la alternancia de los anillos a lo
largo de la simulación. En cambio, sí puede decirse que la contribución de la
interacción de MT2 con ARG20 a la estabilidad del complejo es mucho más
Total -3.22 Tabla 9: Descomposición de la contribución entálpica a la energía libre de unión (∆Hbind)
de la interacción entre el aminoácido ARG20 y el ligando USP1K.
Esta nueva descomposición puso de manifiesto que en la interacción entre
la ARG20 y el ligando, la contribución fundamental se debe al enlace por puente de
hidrógeno, seguida de una interacción hidrofóbica con la cadena alifática y
finalmente por la interacción de tipo catión-π con el anillo aromático MT2.
En resumen, del estudio de dinámica molecular, se puede concluir que los
datos teóricos corroboran los datos experimentales y aportan información
estructural y energética interesante que puede ser utilizada para el diseño racional
de otros compuestos con mayor afinidad por el péptido.
Así, teniendo en cuenta que una de las interacciones más importante es la
establecida entre ARG20 y el anillo de triazol (TR2) junto con el anillo MT2, la
introducción de sustituyentes dadores de electrones en el anillo MT2 podría
contribuir a una estabilización del complejo.
También se ha observado que la longitud de la cadena alifática debe
mantenerse puesto que una distancia mayor impide que se establezcan las
interacciones anteriormente mencionadas.
Por otra parte, los experimentos SPR han puesto de manifiesto que el
compuesto USP3J también es capaz de unirse al PAMP. Es de suponer que esta
estructura interaccione con el péptido de manera similar a como lo hace USP1K.
Discusión y Resultados
167
Sin embargo, todas estas suposiciones deberán ser confirmadas cuando se
finalicen los experimentos de RMN que se mencionan más adelante.
II. 2. 5. Evaluación de la actividad antiangiogénica
El objetivo final de este trabajo es el diseño de compuestos con actividad
antiangiogénica a través de la modulación negativa de la actividad del PAMP.
Como ya se describió en la introducción de esta memoria, el PAMP ha
mostrado ser un potente agente antiangiogénico que supera incluso la actividad
del VEGF en modelos animales.12
Por ello, todos los compuestos que mostraron afinidad en el ensayo de
competición, se seleccionaron para evaluar su actividad antiangiogénica en el
ensayo de anillos aórticos de embrión de pollo. Este trabajo se llevó a cabo en el
Instituto Cajal (CSIC) y estuvo a cargo del Dr. Alfredo Martínez.
Desafortunadamente ninguno de ellos mostró actividad antiangiogénica
apreciable.
Una posible explicación, es que al unirse al PAMP se comporten como
moduladores positivos de su actividad, es decir que tengan un efecto
proangiogénico. Debido a que el ensayo anterior no es capaz de detectar
compuestos proangiogénicos, aquellos compuestos que se comporten como
moduladores positivos del PAMP no pueden ser identificados con este
experimento. Para explorar esta posibilidad, se proyecta realizar un ensayo de
angiogénesis in vivo, el ensayo in vivo dirigido de angiogénesis (directed in vivo
angiogenesis assay, DIVAA),12, 118 con el fin de establecer de qué manera modulan
la acción del PAMP compuestos como USP1K, USP3J y 49487.
En caso de actuar como moduladores positivos podrían tener diferentes
aplicaciones farmacológicas como potenciales vasodilatadores ó por su acción
proangiogénica. Por ejemplo, en cirugía plástica se han realizado distintos
experimentos con el VEGF, con el fin de mejorar la perfusión tisular.243, 244
Discusión y Resultados
168
Por otra parte, la hipoxia e isquemia crónicas estimulan la expresión de
importantes mediadores de la angiogénesis, por lo que actualmente, están en
evaluación en ensayos clínicos nuevas estrategias terapéuticas que involucran la
estimulación de la angiogénesis en el tejido isquémico.245, 246
II. 2. 6. Pruebas antiproliferativas
Como parte de la evaluación biológica de los compuestos también se
realizó el ensayo de proliferación en la línea celular de cáncer de colon Caco-2.
Con este ensayo se pretende evaluar si los compuestos con afinidad por el PAMP
también son capaces de alterar la proliferación celular inhibiendo su crecimiento.
Aunque la capacidad antiangiogénica y antiproliferativa son
independientes, el hecho de que compuestos potencialmente antiangiogénicos
sean capaces también de inhibir el crecimiento celular resulta muy interesante,
puesto que esta complementariedad de funciones aumenta sus posibilidades
como candidatos a fármacos antitumorales.
El ensayo consistió en la incubación de un número determinado de células
por pocillo junto con el compuesto de prueba a dos concentraciones (10 µM y 100
µM). Se sometieron a la prueba los 26 compuestos que presentaron un registro de
absorbancia inferior al 95% en el ensayo de competición con el anticuerpo
monoclonal.
En este ensayo se obtuvieron resultados interesantes para los siguientes
compuestos: 42258, 299589 y USP1K, tal y como se muestra en la figura 36. Para
estos tres compuestos se determinaron los IC50 y se obtuvieron los siguientes
valores: 26.3 µM, 85.5 µM y 101.7 µM para USP1K, 42258 y 299589
respectivamente.
Como se ha mencionado anteriormente, el compuesto USP1K es capaz
de unirse al PAMP. Sin embargo, para 42258 y 299589 los experimentos de SPR
no permitieron sacar conclusiones ya que se produce agregación.
Discusión y Resultados
169
Por este motivo, hemos recurrido a la RMN para evaluar la capacidad de
unión, técnica que además nos permite estudiar las interacciones existentes entre
el ligando y el péptido.
0
20
40
60
80
100
120
140
Contro
lUSP1K
USP1LUSP3NUSP2M
USP3M
USP3J
6411
134
3227
4948
7
8787
7
4225
811
3491
1167
0221
1736
2321
760
1364
2995
8917
2614
5645
232
7705
% d
e pr
olife
raci
ón
Figura 36: Porcentaje de crecimiento celular respecto del control (células no tratadas), en la línea de cáncer de colon Caco-2 a las concentraciones de
10 (azul) y 100µM (naranja).
Discusión y Resultados
171
II. 2. 7. Resonancia Magnética Nuclear
En la actualidad, una de las metodologías más empleadas para la
determinación de la estructura tridimensional de macromoléculas en disolución se
basa en la combinación de medidas de RMN y cálculos teóricos de mecánica y
dinámica molecular. Además, mediante esta estrategia no sólo se puede obtener
información estructural, sino también información dinámica, que no pueden aportar
fácilmente otras técnicas.
Para su estudio por RMN, inicialmente se seleccionaron los compuestos
USP1K, USP1N y 42258. De acuerdo con los experimentos de SPR, el compuesto
USP1K es capaz de unirse al PAMP, mientras que el compuesto USP1N no se
une. Por otro lado el compuesto 42258 ha sido seleccionado porque presenta una
interesante actividad antiproliferativa, aunque por SPR no se han obtenido
resultados concluyentes sobre su posible interacción con el PAMP.
Las pruebas fueron realizadas por el Dr. Antonio Pineda en el Centro de
Investigación Príncipe Felipe. Se llevaron a cabo principalmente experimentos
heteronucleares 2D HSQC 15N.
En primer lugar el PAMP marcado con 15N fue expresado con citocromo
b5 en Escherichia coli. El nivel de expresión fue aproximadamente de 10 mg/L de
proteína soluble por cultivo celular. A continuación, el péptido se purificó por
columna de intercambio iónico.
Las figuras 37 y 38 muestran la superposición de tres espectros: en color
negro el espectro del PAMP a 300 K en presencia de un 36% de TFE; en magenta
el espectro obtenido al añadir únicamente DMSO; y en rojo el que se obtiene al
añadir DMSO y los compuestos USP1K (figura 37) y 42258 (figura 38). En ambos
casos se puede observar que existen diferencias entre el desplazamiento
producido por los compuestos y el que se produce en presencia únicamente de
DMSO. Esta diferencia es mayor para el compuesto 42258, pero en ambos casos
los resultados permiten afirmar que existe interacción con el PAMP.
Discusión y Resultados
172
Cuando los experimentos se llevaron a cabo con el compuesto USP1N no
se observaron diferencias entre los espectros obtenidos, confirmándose el hecho
de que este compuesto no es capaz de formar un complejo estable con PAMP.
Estos resultados son especialmente interesantes, pues además de
confirmar tanto las predicciones teóricas, como corroborar los resultados de los
experimentos SPR, una vez que se resuelvan los espectros, dispondremos de
información concreta del modo de unión de los ligandos al PAMP, facilitando el
proceso de diseño de nuevos ligandos.
Este estudio se está ampliando al resto de los compuestos seleccionados,
especialmente para aquellos en los que mediante SPR no fue posible obtener
resultados concluyentes.
Discusión y Resultados
173
Figura 37: Espectro HSQC 15N de PAMP a 300 K con 36% de TFE (negro). Espectro HSQC 15N
de PAMP a 300 K con 36% de TFE y 24 µL de DMSO (magenta). Espectro HSQC 15N de PAMP-
USP1K (DMSO) a 300K con 36% de TFE (rojo).
Discusión y Resultados
174
Figura 38: Espectro HSQC 15N de PAMP a 300 K con 36% de TFE (negro). Espectro
HSQC 15N de PAMP a 300 K con 36% de TFE y 24 µL de DMSO (magenta). Espectro
HSQC 15N de PAMP- 42258 (DMSO) a 300K con 36% de TFE (rojo).
II. 3. Conclusiones
Conclusiones
175
II. 3. Conclusiones
Se ha llevado a cabo un cribado virtual de la colección de compuestos del
NCI (NCI Diversity Set) junto con una colección de 60 compuestos de nuestra
quimioteca (en un total de 600 conformaciones distintas).
Se ha puesto a punto un ensayo de competición con el anticuerpo
monoclonal del PAMP. Este ensayo nos ha permitido seleccionar 20 compuestos
de un total de 50, capaces de competir con el anticuerpo monoclonal en su unión
al PAMP, que por lo tanto podrían actuar como moduladores de su acción. De
acuerdo con este procedimiento, el 40% de las predicciones de AutoDock podrían
considerarse correctas.
Las medidas de afinidad determinadas inicialmente para los compuestos
de nuestra quimioteca con la técnica SPR, mostraron que los compuestos USP1K,
USP3J y 49487 son capaces de unirse al péptido.
Mientras que el compuesto USP1K es capaz de unirse al PAMP, el
compuesto de estructura similar USP1N no lo es. Por este motivo, los complejos
péptido-ligando de estos compuestos se sometieron a simulaciones de dinámica
molecular. Un análisis detallado de la simulación del complejo PAMP-USP1K nos
permitió poner de manifiesto algunas interacciones interesantes. Se trata de
interacciones catión-π, interacciones de apilamiento, enlaces por puente de
Conclusiones
176
hidrógeno e interacciones hidrofóbicas que estabilizan la estructura del complejo
formado.
Para los dos complejos objeto de estudio se realizaron cálculos de energía
utilizando los métodos MM/PBSA y MM/GBSA. Se determinaron las energías
teóricas de unión de los complejos, además de las contribuciones energéticas por
residuo, corroborándose por estos métodos los datos experimentales obtenidos.
Por otro lado, se llevaron a cabo pruebas antiproliferativas de los 20
compuestos seleccionados, en la línea celular Caco-2 de cáncer de colon. Aunque
la capacidad antiangiogénica y antiproliferativa son independientes, el hecho de
que compuestos potencialmente antiangiogénicos sean capaces también de inhibir
el crecimiento celular resulta muy interesante, puesto que esta complementariedad
de funciones aumenta sus posibilidades como candidatos a antitumorales. Se
observaron resultados interesantes para los compuestos USP1K, 42258 y 299589.
Hasta ahora, 14 de estos compuestos han sido evaluados como agentes
antiangiogénicos mediante el ensayo de anillos de arcos aórticos de pollo y
desafortunadamente ninguno de los compuestos ha resultado ser antiangiogénico.
Por último, a través de experimentos HSQC 15N, se estudió la interacción
entre dos compuestos y el PAMP. En este estudio, se pudo confirmar ambos
compuestos (42258 y USP1K) se unen al péptido formando complejos estables.
De acuerdo con las pruebas realizadas hasta el momento, se puede
concluir que estos dos compuestos, cuya capacidad para unirse al PAMP ha sido
demostrada experimentalmente con técnicas SPR y HSQC 15N y poseen
interesantes propiedades antiproliferativas, son muy buenos candidatos como
potenciales moduladores de la acción del péptido.
II. 4. Parte Experimental
Parte Experimental
177
II. 4. Parte Experimental II. 4. 1. Cribado Virtual II. 4. 1. 1. Preparación del péptido
Para este estudio se cuenta con una única estructura disponible
determinada usando espectroscopia de RMN bidimensional de 1H y 13C cuyo
código PDB es 2fly.8 De las veinte conformaciones depositadas en esta estructura
se seleccionó la primera por no haber diferencias significativas entre ellas.
En primer lugar, se eliminaron los hidrógenos no polares y se asignaron
cargas tipo Kollman UNI a todos los átomos utilizando SYBYL 7.3.
La malla 3D se centró en el residuo TRP16, aminoácido central de la región
elegida, en una caja de dimensiones 45 x 37 x 62 Å y 0.375 Å de espaciado para
los siguientes átomos: C, A (C aromático), N, S, H, F, Cl, Br, I, P y e
(electroestático) usando el programa AutoGrid v.3.
II. 4. 1. 2. NCI Diversity set
El NCI Diversity set es un conjunto reducido de 1990 compuestos
seleccionados de la base de datos 3D original del NCI y preparados para su
utilización con programas de docking en concreto para AutoDock. Se trata de una
lista de compuestos representativa de la diversidad química de una colección
mayor perteneciente al Programa de Desarrollo Terapéutico del Instituto Nacional
Parte Experimental
178
del Cáncer en Estados Unidos. En el esquema 4 se muestra el proceso de
selección que utiliza el NCI para los compuestos que pertenecerán al NCI Diversity
Set.
De los aproximadamente 140.000 compuestos que constituyen la
quimioteca del NCI, se seleccionan 71.756 compuestos que son aquellos de los
que se dispone de más de 1 g. A continuación se realiza la selección mediante el
programa Chem X, que define tres puntos farmacofóricos basados en aceptores ó
dadores de enlace de H, cargas positivas y negativas, sistemas aromáticos,
grupos hidrófobos, ácidos, bases e intervalos de distancia para crear un conjunto
finito de farmacóforos.
Esquema 4: Metodología que utiliza el NCI para seleccionar los integrantes del NCI
Diversity Set
Este proceso genera alrededor de 1.000.000 de farmacóforos para todas
las conformaciones aceptables de cada estructura. Finalmente el NCI Diversity Set
~140.000 compuestos
>1.0 g disponible
71.756 compuestos
3 puntos farmacofóricos(Chem X)
1990 compuestos
NCI Diversity Set
Parte Experimental
179
se construye por comparación de todos los farmacóforos para cada conformación
aceptable, incluyendo la estructura en el conjunto si posee cinco o más
farmacóforos nuevos y adicionalmente, cinco o menos enlaces rotables. Como el
proceso de selección depende del orden, las estructuras para este procedimiento
se consideran al azar.
Este protocolo conduce a 1990 compuestos de los que se construye un
archivo en el formato adecuado (pdbq), accesible en la red para su utilización
directa con el programa AutoDock.247 Esto implica agregar los hidrógenos polares,
asignar tipos de átomos, cargas puntuales tipo Gasteiger y los ángulos diedros
rotables.
Para nuestro estudio, de los 1990 compuestos, se eliminaron aquellos que
poseen en su estructura elementos distintos de C, N, S, H, F, Cl, Br, I y P para
simplificar la parametrización. Tampoco se incluyeron los pertenecientes a la
denominada “problem list” por el NCI, puesto que se conoce que dan problemas
con el programa AutoDock. El número total de compuestos pertenecientes al NCI
diversity set utilizados en este trabajo fue de 1836.
II. 4. 1. 3. Compuestos de nuestra colección
En este trabajo también se estudiaron una serie de compuestos
perteneciente a nuestra colección particular.
Los compuestos que poseen más de cinco enlaces rotables fueron
sometidos inicialmente a una búsqueda conformacional exhaustiva. Para ello se
construyeron las estructuras mediante el programa Macromodel248 y
posteriormente fueron sometidas a un refinamiento de la energía utilizando
mecánica molecular y el campo de fuerzas de AMBER.249
Después del refinamiento inicial, las estructuras se sometieron a una
búsqueda conformacional utilizando el programa Batchmin y el método Monte
Carlo,250 en el que los ángulos de la geometría inicial son relacionados y
modificados al azar. Una vez generada la nueva estructura, el propio método la
Parte Experimental
180
minimiza utilizando el campo de fuerzas seleccionado (en este caso AMBER) y
analiza el valor de su energía, de forma que si este valor es superior a la energía
del confórmero anterior en más de 50 kj (valor elegido) la estructura es rechazada,
si la energía es inferior a este margen, la nueva geometría es aceptada y
almacenada.
El programa continúa buscando hasta un máximo de 100 conformaciones
(valor seleccionado); las coloca en orden de menor a mayor energía y finaliza.
Todos los demás ligandos fueron inicialmente refinados mediante el
programa MOPAC.251
En los casos en que los compuestos contenían grupos ácidos o básicos se
determinó el estado de ionización a pH fisiológico haciendo uso del programa
Marvin.252
La asignación de cargas para todos los compuestos y confórmeros se
realizó mediante el programa SYBYL 7.3 y cargas tipo Gasteiger-Marsili.
Este procedimiento dio lugar a 600 confórmeros correspondientes a 60
estructuras diferentes. Estos 600 confórmeros fueron sometidos al mismo
procedimiento de cribado virtual que los 1836 pertenecientes al NCI Diversity Set.
II. 4. 1. 4. Cribado virtual
Para la realización del cribado virtual se utilizó la versión 3.0.5 del
programa AutoDock.192 La tabla 10 resume los parámetros utilizados para la
realización del docking de los distintos ligandos, para los que se buscaron en cada
caso 100 posibles soluciones. Este procedimiento consumió aproximadamente
media hora en un PC Xeon con sistema operativo Linux para cada una de las
moléculas objeto de estudio, excepto para las que pertenecían a nuestra
quimioteca, cuya exploración consumió aproximadamente cinco horas por
confórmero, debido a la elevada flexibilidad de los compuestos (ver tabla 6).
Parte Experimental
181
PARÁMETROS VALORES
Parámetros Algoritmo Genético (GA) y Algoritmo Genético Lamarckiano (LGA)
ga_pop_size Nº de individuos en la población 100
ga_num_evals Nº máximo de evaluaciones de energía 250000
ga_num_generations Nº del máximo de generaciones 27000
ga_elitism Nº individuos máximo que sobrevive a la siguiente
generación 1
ga_mutation_rate Porcentaje de mutación 0.02
ga_crossover_rate Porcentaje de entrecruzamiento 0.80
ga_window_size Nº de generaciones por escoger al peor individuo 10
ga_cauchy_alpha Distribución de Cauchy 0
ga_cauchy_beta Varianza de distribución de Cauchy 1
Parámetros Búsqueda local
sw_max_its Nº de iteraciones búsqueda local 300
sw_max_succ Nº de éxitos consecutivos antes del rho cambiante 4
sw_max_fail Nº de fracasos consecutivos antes del rho cambiante 4
sw_rho Tamaño de espacio de la búsqueda local para probar 1.0
sw_lb_rho Límite más bajo en rho 0.01
ls_search_freq Probabilidad de realizar búsqueda local en un individuo 0.06
Tabla 10: Parámetros utilizados en el estudio de docking
El programa busca hasta un máximo de 100 soluciones (valor
seleccionado), las coloca en orden de menor a mayor energía y finaliza. Para este
estudió se decidió seleccionar los primeros 50 complejos PAMP-ligando de
mínima energía. Estos complejos se analizaron visualmente mediante la utilización
del programa SYBYL 7.3.
Parte Experimental
182
II. 4. 2. Ensayo de competición
El anticuerpo monoclonal αPAMP fue producido por la compañía Evogenix
(Sydney, Australia).
El anticuerpo fue marcado con peroxidasa y purificado en nuestro
laboratorio utilizando los kits EZ-Link Plus Activated Peroxidase y Freezyme