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CAPTULO II 31
CAPTULO II Sistema gentico mitocondrial humano
Manuel J. Lpez Prez y Julio Montoya
Departamento de Bioqumica y Biologa Molecular y Celular,
Universidad de Zaragoza. Miguel Servet 177. 50013 Zaragoza., Espaa.
[email protected]
RESUMEN
Las mitocondrias son los orgnulos subcelulares encargados de la
produccin de energa en forma de ATP. Contienen su propio sistema
gentico con ADN mitocondrial que codifica un nmero
pequeo de polipptidos que forman parte de la cadena respiratoria
junto con protenas mitocondriales codificadas en el ncleo. Para la
biognesis de la mitocondria se requiere la
expresin coordinada de los dos sistemas genticos, el nuclear y
el mitocondrial. Los genes estn dispuestos en el ADN mitocondrial
de manera muy compacta con los tARNs intercalados entre los
genes de los rARNs y los codificantes de protenas. Esta
organizacin gnica se ve tambin reflejada en su modo de expresin y
en las caractersticas singulares de los ARNs. Las dos cadenas
del ADN mitocondrial se transcriben completamente en forma de
tres molculas policistrnicas que se procesan posteriormente por
enzimas especficos que cortan en los extremos 5' y 3' de los
tARNs
para originar los rARNs, mARNs y tARNs maduros. La mitocondria
posee asimismo su propia maquinaria para la sntesis de las protenas
codificadas en su genoma. El ADN mitocondrial difiere
del nuclear en una serie de caractersticas. En especial, el
genoma mitocondrial se hereda exclusivamente de la madre que lo
transmite a todos sus hijos. Este ADN tiene tendencia a mutar y
a fijar estas mutaciones en variantes genticas poblacionales por
lo que se est utilizando para estudiar la filogenia y estructura de
poblaciones.
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32 CAPTULO II
INTRODUCCIN
Las mitocondrias son orgnulos subcelulares con doble membrana
que se encuentran prcticamente en todas las clulas eucariotas y
cuya funcin principal es la de llevar a cabo el metabolismo
oxidativo con la consiguiente produccin de energa en forma de ATP.
En este proceso, conocido como fosforilacin oxidativa (sistema
OXPHOS), participan una serie de complejos enzimticos (complejos I
al V) que proporcionan la mayor parte del ATP celular. Adems, estos
orgnulos participan tambin en la biosntesis de otros componentes
celulares: pirimidinas, aminocidos, fosfolpidos, nucletidos, cido
flico, hemo, urea y una gran variedad de metabolitos (1).
La caracterstica mas singular de las mitocondrias es la de
poseer un sistema gentico propio con toda la maquinaria necesaria
para su expresin, es decir, para la sntesis de ADN, ARN y de todas
las protenas que codifica. Este segundo sistema gentico celular, a
pesar de contener un nmero muy pequeo de genes, es indispensable
para la vida celular porque codifica 13 protenas integrantes de los
complejos respiratorios mitocondriales. Sin embargo, las
mitocondrias no son autnomas ya que tanto la formacin del orgnulo
como la expresin de su genoma dependen de un gran nmero de protenas
codificadas en el ncleo, que son sintetizadas en los ribosomas
citoplsmicos e importadas a la mitocondria. La biognesis de las
mitocondrias representa pues un caso nico en la clula ya que su
formacin est bajo el control de los dos sistemas gentico celulares:
el nuclear y el mitocondrial.
La existencia de un sistema gentico en el citoplasma empez a
intuirse a finales de los aos 40 al descubrirse unos mutantes de
levadura con deficiencias en las funciones respiratorias que eran
debidas a un factor citoplsmico, no nuclear, y que era hereditario
(2). El ADN mitocondrial se descubri en los aos 60 (3), y desde
entonces se ha ido obteniendo una imagen muy detallada de su
estructura as como de su relacin con determinadas patologas. Se
conoce la secuencia nucleotdica completa de muchas especies de
animales vertebrados e invertebrados, aunque el sistema gentico
mejor estudiado es el humano.
El sistema gentico mitocondrial presenta una serie de caracteres
particulares como son la utilizacin de un cdigo gentico propio con
algunas desviaciones con respecto al universal, la existencia de
una alta velocidad de mutacin, su transmisin por herencia materna,
no-mendeliana, y la organizacin y expresin de sus genes (4-9).
Asimismo, desde que en 1988 se describi por primera vez mutaciones
en el ADN mitocondrial que podan causar enfermedades degenerativas
humanas con deficiencias en la produccin de ATP (10-
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CAPTULO II 33
12), el estudio de la bioenergtica y gentica mitocondrial ha
adquirido nuevas dimensiones (13-15).
SISTEMA GENTICO MITOCONDRIAL HUMANO
Estructura y organizacin del ADN mitocondrial humano
Las clulas humanas contienen de 1.000 a 10.000 copias de ADN
mitocondrial dependiendo de los tejidos; las plaquetas tienen unas
cuatro y los oocitos unas 10.000. El ADN mitocondrial humano es una
molcula duplohelicoidal circular cerrada que consta de 16.569 pares
de bases (pb) cuya secuencia se conoce en su totalidad (16,17).
Este ADN codifica 37 genes que corresponden a dos ARN ribosmicos
(rARN) componentes de los ribosomas mitocondriales (rARNs 12S y
16S), 22 ARNs de transferencia (tARNs), y 13 polipptidos
componentes de los complejos respiratorios de la membrana interna
mitocondrial (sistema OXPHOS). De estos polipptidos, siete forman
parte del complejo I (subunidades ND1, ND2, ND3, ND4, ND4L, ND5 y
ND6) ; uno corresponde al apocitocromo b del complejo III; tres
subunidades, COI; COII y COIII al complejo IV; y dos son las
subunidades 6 y 8 de la ATPasa (complejo V) (18-20). El resto de
las subunidades polipeptdicas de estos complejos estn codificadas
por el ADN nuclear.
Una de las caractersticas mas sorprendentes del ADN mitocondrial
es que presenta una organizacin gentica extremadamente compacta.
Como se puede observar en la Figura 1 donde se muestra el mapa
gentico y de transcripcin del ADN mitocondrial humano, ste se
encuentra prcticamente saturado por genes. La cadena pesada (H) del
ADN codifica los 2 rARNs, 14 tARNs y 12 polipptidos, mientras que
la cadena ligera (L) contiene solamente informacin para 8 tARNs y
un polipptido (ND6). La nica zona del ADN que no codifica ningn gen
es un pequeo fragmento que corresponde al 7% del ADN, localizado
alrededor del origen de replicacin de una de las cadenas y que
incluye el bucle de desplazamiento (bucle D). Todos estos genes
carecen de intrones. Los genes, en la cadena pesada, se disponen
uno a continuacin del otro, sin tramos no codificantes intermedios
(16). Adems, la mayor parte de genes codificantes de protenas
carecen de un codon de terminacin. Estos presentan una T o TA
despus del ltimo codon con sentido y preceden al extremo 5' del gen
adyacente. El codon de terminacin UAA del mARN se
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34 CAPTULO II
forma postranscripcionalmente por poliadenilacin del extremo 3'
como veremos mas adelante.
Otra de las peculiaridades de la organizacin gentica del ADN
mitocondrial es la distribucin de los genes de los tARNs a lo largo
de la secuencia del ADN. En la cadena pesada, estos separan casi
con absoluta regularidad los genes de los rARNs y los codificantes
de protenas. Esta disposicin tendr consecuencias muy importantes
para el procesamiento del ARN(16).
Replicacin del ADN mitocondrial
El mecanismo exacto de replicacin de ADN mitocondrial en
animales es una materia controvertida desde hace unos aos. Durante
dcadas se consideraba que la replicacin suceda por un modelo de
desplazamiento de las cadenas con dos orgenes de replicacin, una
para la cadena pesada y otra para la ligera. Ms recientemente en lo
ltimos aos se ha propuesto un modelo alternativo con un solo origen
de replicacin, a su vez con dos variantes que lo explican; una
conocida como replicacin acoplada y otra conocida como RITOLS, que
luego explicaremos.
Modelo de desplazamiento de las cadenas
En este modelo, la sntesis del ADN mitocondrial es
unidireccional, asimtrica (21) y requiere dos orgenes de replicacin
diferentes, uno para la cadena pesada (OH), que se
localiza en la regin del bucle de desplazamiento (bucle-D), y
otro para la cadena ligera
(OL), situado entre los genes de los tARNCys y tARNAsn a dos
tercios de la longitud total
del genoma respecto a OH (22) (Figura 1). La regin del blucle-D
carece de secuencias
codificantes, se extiende entre los genes de los tARNs prolina y
fenilalanina (1122 pb), y contiene, adems del origen de replicacin,
los promotores de la transcripcin de las dos cadenas y las
secuencias de regulacin (23). La replicacin comienza con la sntesis
de un pequeo ARN iniciador, formado por procesamiento de un ARN
transcrito a partir del promotor de la cadena ligera, que se
prolonga por la accin de la ADN polimerasa gamma especfica de la
mitocondria. La transicin de sntesis de ARN a sntesis de ADN se
produce previa accin de una endorribonucleasa especfica que corta
el ARN precursor originando el extremo 3' del ARN iniciador que
acta como sustrato para su extensin por la ADN polimerasa. La
replicacin comienza con la sntesis de un segmento corto de cadena H
(ADN 7S de 680 nt) (24), que permanece unido al ADN molde,
desplazando la cadena H y formando una triple hlice (bucle-D).
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CAPTULO II 35
La elongacin de la cadena H hija lo hace de forma unidireccional
a lo largo de la cadena L, al tiempo que desplaza la cadena H
parental. La replicacin de la cadena L requiere la accin de una
primasa especfica y solo comienza cuando el desplazamiento de la
cadena H ha dejado la zona del origen de replicacin OL como cadena
sencilla. La
sntesis de la cadena ligera hija termina despus que la de la
cadena pesada (22,25,26)).
Modelo acoplado y RITOLS.
Estos modelos se deben al trabajo del grupo Holt mediante
estudios con electroforesis bidireccional en agarosa. En ellos se
observaba la presencia de intermediarios de replicacin de doble
cadena procedente de un nico punto de replicacin conocido como OriZ
diferente en posicin al OH y OL del modelo anterior. La replicacin
era bidireccional (27-31).
Ms adelante se comprob la existencia de ribonucletidos en los
dplex intermediarios explicndose la existencia de stos por la
existencia de fragmentos de Okazaki en la replicacin del ADN
mitocondrial dando lugar al modelo RITOLS (incorporacin de
ribonucletidos a lo largo de la cadena retrasada). En este modelo a
partir del mismo punto de replicacin existe una replicacin
unidireccional con una cadena conductora y otra retrasada.
Nucleoides
La replicacin del ADN mitocondrial est producida por varios
factores de transcripcin y de replicacin codificados en el ncleo.
stos junto con molculas de ADN se empaquetan en lo que se conoce
como nucleoide que tiene unos 70 nm de dimetro. En estos nucleoides
hay alrededor de treinta protenas diferentes muy conservadas entre
especies. Existe un modelo estructural propuesto para los
nucleoides en el que un ncleo central estara compuesto por protenas
que participan en la sntesis de cidos nuclicos mientras que las
protenas de ensamblaje estaran en la periferia. Hay un debate sobre
el nmero de molculas de ADN que participan en un nucleoide,
manejndose cifras que van desde 2 hasta 15 molculas de ADN por
estructura (32,33).
Transcripcin del ADN mitocondrial y procesamiento del ARN
Las particularidades que presenta la estructura gentica y
organizacin del mtADN se reflejan tambin en su modo de expresin.
Las dos cadenas del ADN se transcriben completa y simtricamente
(Figura 1). Los productos de transcripcin del ADN
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36 CAPTULO II
mitocondrial humano que han sido aislados incluyen los 2 rARNs
(rARN 12S y 16S), un ARN precursor de los mismos, 22 tARNs y 18
ARNs poliadenilados en el extremo 3' (poli(A)-ARNs), la mayora de
los cuales corresponden a los ARN mensajeros (mARNs) (34,35). La
mayor parte de los ARNs maduros corresponden a un nico gen.
Solamente dos de ellos, los mARNs de los genes para las subunidades
6 y 8 de la ATP sintasa y ND4 y 4L, contienen dos genes cada uno
con el marco de lectura solapado. Los tres poli(A)-ARNs mayores
(ARNs 1, 2 y 3), el menor (ARN 18) y 8 tARNs son productos de
transcripcin de la cadena ligera del ADN mitocondrial mientras que
el resto de los ARNs lo son de la cadena pesada (Figura 1).
El anlisis estructural de los ARNs mitocondriales ha mostrado
unas caractersticas muy particulares. As, los rARNs se caracterizan
por estar metilados, aunque el grado de metilacin es mas bajo que
el de los rARNs citoplsmicos, y por estar oligoadenilados en su
extremo 3' con 1 a 10 adeninas no codificadas en el ADN (36,37).
Los tARNs tienen un tamao que varia entre 59 y 75 nt son, por
tanto, mas pequeos en general que sus homlogos del citoplasma o de
procariotas. La estructura de los tARNs mitocondriales presenta
numerosas desviaciones con respecto al modelo considerado como
invariable de los sistemas no mitocondriales. As, la mayora de los
tARNs carecen de los nucletidos constantes y el tamao del bucle
"DHU" varia considerablemente llegando incluso a
desaparecer en el tARNSerAGY (38,39). La nica regin que ha
conservado las
caractersticas generales de los tARNs, aparte del extremo -CCA,
no codificada en el ADN,
es la regin del anticodn. Con la excepcin del tARNSerAGY, todos
los tARNs
mitocondriales pueden plegarse en la caracterstica hoja de
trbol. Los tARNs mitocondriales juegan adems un papel muy
importante en el procesamiento de los precursores de ARN.
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CAPTULO II 37
Figura 1.- Mapa gentico y de transcripcin del ADN mitocondrial
humano
Los dos crculos interiores representan las dos cadenas del ADN
mitocondrial con los genes que codifican: rARNs (rARNs 12 S y 16
S), tARNs, indicados con la abreviatura del aminocido que les
corresponde, y secuencias codificadoras de protenas (ND:
subunidades de NADH deshidrogenas; cyt b: apocitocromo b; CO:
subunidades citocromo C oxidasa). La posicin de los ARNs est
indicada en los crculos exteriores con barras negras (transcritos
de la cadena pesada) y con barras abiertas (transcritos de la
cadena ligera). H1,
H2 y L indican los lugares de iniciacin de la transcripcin de la
cadena pesada y ligera,
respectivamente. OH y OL simbolizan el origen de replicacin de
la cadena pesada y ligera.
Las flechas exteriores indican la direccin de la transcripcin de
la cadena pesada y ligera respectivamente. Las flechas al lado de
OH y de OL muestran la direccin de sntesis de la
cadena pesada y ligera.
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38 CAPTULO II
El ADN mitocondrial humano contiene 13 genes que codifican
polipptidos con un tamao que vara de 70 a 610 aminocidos. En las
mitocondrias de clulas HeLa se han aislado e identificado, entre
los poli(A)-ARNs, 10 mARNs que corresponden a los 12 polipptidos
codificados en la cadena pesada (dos de ellos contienen 2 marcos de
lectura solapados). Estos mARNs contienen exclusivamente la
secuencia del patrn de traduccin y una cola de unos 55 adenosinas
en el extremo 3'. Los mARNs mitocondriales humanos comienzan
directamente por el codon de iniciacin AUG, AUA o AUU o tienen muy
pocos nucletidos (1 a 3) delante de los mismos. Carecen por tanto
de uno de los caracteres tpicos de los mARN de otros sistemas, como
es la presencia de un tramo no codificante en el extremo 5' (40).
Tampoco contienen la estructura "cap" en el extremo 5' (41).
Asimismo, el extremo 3' de la mayor parte de los mARNs carecen de
una regin no codificante y finalizan con un codon de terminacin
incompleto U o UA (42). La poliadenilacin juega un papel muy
importante y, en particular, la adicin postranscripcional de la
cola de poli(A) genera en la mayor parte de los casos el codon de
terminacin UAA. No existe ninguna secuencia en comn cerca del
extremo 3' que pueda actuar como seal de la poliadenilacin, como
sucede en los mARN nucleares.
Figura 2.- Nucleoide de ADNmt.
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CAPTULO II 39
La sntesis de ARN se inicia en tres lugares diferentes, uno en
la cadena ligera (L) y dos en la cadena pesada (H1 y H2), situados
cerca del origen de replicacin, dando lugar a
dando lugar a tres molculas policistrnicas largas que se
procesan posteriormente por cortes endonucleolticos precisos
delante y detrs de los tARNs, dando lugar a los rARNs, tARNs y
mARNs maduros (23,34,40,42). De acuerdo con este modelo que se
denomina de "puntuacin por el tARN", las secuencias de los tARNs
situadas entre los genes de los rARNs y mARNs, actan como seales de
reconocimiento para los enzimas de procesamiento al adquirir la
configuracin en hoja de trbol en las cadenas nacientes de ARN. Para
la transcripcin del mtADN se requiere una ARN polimerasa (43) y dos
factores de iniciacin de la transcripcin (mtTFA y mtTFB)
(44-46).
La cadena pesada se transcribe mediante dos unidades de
transcripcin solapadas en la regin de los rARNs (34). La primera de
ellas, que se transcribe muy frecuentemente, comienza en el lugar
de iniciacin H1, situado unos 19 nt por delante del gen para el
tARNPhe, termina en el extremo 3' del gen para el rARN 16S y es
responsable de la sntesis
de los rARNs 12S y 16S, del tARNPhe y del tARNVal. Un factor de
terminacin mTERF acta unindose en una secuencia inmediatamente
posterior al gen del rARN 16S, situada
en el gen del tARNLeu (47-50). El segundo proceso de
transcripcin, mucho menos frecuente que el anterior, comienza en el
punto de iniciacin H2, cerca del extremo 5' del
gen rARN 12S, se extiende ms all del extremo 3' del gen rARN 16S
y produce un ARN policistrnico que corresponde a casi la totalidad
de la cadena pesada. Los mARNs de 12 pptidos y 12 tARNs se originan
por procesamiento de este ARN policistrnico. Este modelo de
transcripcin muestra asimismo un mecanismo por el cual se puede
producir una regulacin en la transcripcin diferencial de los rARNs
y de los mARNs (34).
La cadena ligera se transcribe mediante una nica unidad de
transcripcin que empieza en el lugar de iniciacin L, cerca del
extremo 5 del ARN 7S (poli(A)-ARN 18), dando lugar a 8 tARNs y al
nico mARN (ND6) codificado en esa cadena. El inicio de la sntesis
de ADN depende tambin de la actividad de esta unidad de
transcripcin, como se ha mencionado anteriormente.
Traduccin del ADN mitocondrial
Los mARN mitocondriales traducen su mensaje en un sistema de
traduccin propio de la mitocondria con ribosomas especficos. Los
componentes de los ribosomas mitocondriales estn codificados por
los dos sistemas genticos de la clula. As, mientras que los rARNs
estn codificados en el ADN mitocondrial, las protenas ribosmicas
lo
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40 CAPTULO II
estn en el genoma nuclear. El coeficiente de sedimentacin de los
ribosomas mitocondriales es de 55S, con subunidades de 28S y 39S,
que contienen 33 y 52 protenas respectivamente (51,52). Se conocen
factores de iniciacin, elongacin y de terminacin de la sntesis de
protenas.
El cdigo gentico utilizado por la mitocondria para traducir sus
genes presenta algunas diferencias muy significativas con respecto
al cdigo universal. As, el codon UGA codifica triptfano en lugar de
ser uno de los codones de terminacin. Asimismo, la mitocondria
humana, adems de AUG, utiliza AUA y AUU como codones de iniciacin,
mientras que AGA y AGG, codones de arginina en el cdigo universal,
son seales de terminacin. Reciente mente se ha propuesto que los
codones AGA y AGG no actan directamente como codones de terminacin
sino que producen un movimiento del ribosoma de un nucletido hacia
atrs encontrndose entonces con un codon de terminacin caracterstico
del cdigo universal (53).
Otra de las caractersticas particulares del sistema gentico
mitocondrial es su inusual reconocimiento de codones, que permite
la lectura del cdigo gentico con solo los 22 tARNs codificados en
el mtADN. Cada una de las 8 familias del cdigo con 4 codones para
un aminocido son ledas por un solo tARN, mientras en las otras 6
familias se siguen utilizando 2 tARNs para leer los codones de cada
familia (54,55). De esta forma 24 tARNs son suficientes para
traducir el cdigo gentico mitocondrial.
GENETICA MITOCONDRIAL
El sistema gentico mitocondrial presenta unas caractersticas
genticas que lo diferencial del nuclear (7).
Herencia materna. El ADN mitocondrial se hereda con un patrn
vertical, no mendeliano,
transmitido exclusivamente por va materna. La madre trasmite el
genoma mitocondrial a todos sus hijos; por tanto, solamente las
hijas lo trasmitirn a todos los miembros de la siguiente generacin
y as sucesivamente.
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CAPTULO II 41
El ADN mitocondrial es poliploide y durante la divisin celular
las mitocondrias se distribuyen al azar entre las clulas hijas
(segregacin mittica). Todas las clulas de un individuo normal
tienen el mismo ADN mitocondrial, es decir son homoplsmicas. Sin
embargo, en la clula pueden aparecer molculas de ADN mitocondrial
mutadas que pueden afectar a todas las molculas (homoplasmia para
la mutacin) o que pueden coexistir con el ADN normal
(heteroplasmia). Con la divisin celular el fenotipo de una lnea
celular determinada puede variar dando lugar a tres posibles
genotipos diferentes: homoplsmico para el ADN mitocondrial normal,
heteroplsmico y homoplsmico para el ADN mutado. El fenotipo de una
clula con heteroplasmia depender del porcentaje de ADN daado que
exista en la clula, es decir del grado de heteroplasmia. Si nmero
de molculas de ADN mutadas es pequeo se producir una complementacin
de la funcin
Figura 3.- Modelos de replicacin
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42 CAPTULO II
con las molculas de ADN normal y no se manifestar el defecto
gentico. Sin embargo, al aumentar el porcentaje de ADN mutado se
har patente un fenotipo patognico. Es decir, el fenotipo se
manifiesta de acuerdo con un efecto umbral. Si la produccin de ATP
llega a estar por debajo de los mnimos de energa necesarios para el
funcionamiento de los tejidos debido a la presencia de mitocondrias
defectuosas se produce la aparicin de la patogenicidad.
Otra de las caractersticas particulares de la gentica
mitocondrial es que tiene una gran tendencia a mutar siendo la tasa
sustitucin de nucletidos unas 10 veces superior a la del ADN
nuclear (56). Como consecuencia de esto, hay una gran variacin de
secuencias entre especies e incluso entre individuos de una misma
especie. Se puede calcular que dos individuos tienen al menos unos
50-70 nt de diferencia en su secuencia. Adems de estas diferencias,
en un individuo determinado se esta produciendo continuamente, a lo
largo de la vida, una heterogeneidad en el mtADN como consecuencia
de las mutaciones que se estn originando en sus clulas somticas.
Por tanto, es posible que una acumulacin de este dao mitocondrial
sea la causa de la disminucin en la capacidad respiratoria de los
tejidos que tiene lugar en el envejecimiento (57).
La gran variacin existente en la secuencia del mtADN de
diferentes individuos se est utilizando hoy en da para estudios
acerca de la filogenia y estructura de las poblaciones. Los datos
disponibles son coherentes con los siguientes puntos (58,59): 1)
Las mutaciones se van acumulando de un modo secuencial en la
radiacin de de las diferentes lineas maternas; 2) La variacin del
mtADN correlaciona con el origen tico y la distribucin geogrfica de
los individuos; 3) Existe un nico rbol mitocondrial humano, cuyas
ramas se dividen en los diferentes continentes, indicando que el
origen del homo sapiens es nico; 4) La variacin actual es mayor en
frica, seguida de Asia, Europa y finalmente Amrica. Ello implica
que el homo sapiens se origin en frica (hace unos 300.000 aos de
acuerdo con el ritmo de evolucin y asumiendo un "reloj molecular"),
luego emigr a Asia y Europa y finalmente lleg (recientemente, hace
unos 30.000 aos) a Amrica. El origen africano de la rama actual de
la especie humana se ha visto confirmado recientemente mediante
estudios de locus altamente polimrficos del cromosoma Y.
AGRADECIMIENTOS
Este trabajo ha sido subvencionado por ISCIII FIS PI
10/00662.
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CAPTULO II 43
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