ACTASCIBA 4 · 2012. 10. 23. · ACTASCIBA 4 FoJograffa de COlljUIIJO de un culJivo de Jejidos (fibrocitos del conejo). Se advierJe biCI< el fragmenJo madre, a partir del cllal se

ACTASCIBA 4

FoJograffa de COlljUIIJO de un culJivo de Jejidos (fibrocitos del conejo). Se advierJe biCI< el fragmenJo madre, a partir delcllal se desarrollall las células e1l disposición radiada y forman el velo del margen. FoJo: Dr. O. Bucher.

ACTAS 'CIBA.

EL CULTIVO DE TEJIDOS

4

Abril 1941

SUMARIO: Cronología .

El desarrollo del cultivo de tejidosPor el DR. O. BUCHER

La técnica del cultivo de tejidosPor el DR. O. BUCHER

El cultivo de tejidos como método de lainvestigación morfológica y fisiológicaPor el Dr. O. BUCHER

Comportamiento de diversos tejidos du-rante el cultivoPor el DR. O. BUCHER

El cultivo de tejidos como método bacte~riológicoPor el DR. O. BUCHER

El cultivo de células neoplásicasPor el DR. O. BUCHER

pág. 74

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102

106

La reproducción parcial o íntegra de los artículos originalesde esta revista, así como su traducción, sólo son permitidasindicando su proc~dencia.

Un nuevo diurético mercurial en la prác-tica clínicaPor el DR. VINCENZO RAO .... 111

Contribución a la sintomatología clínicay tratamiento de la infección por latenia hymenolepis nanaPor el DR. J. DIAMANTOPOULOOS 111

Notas acerca del tema 112

Il l

Cronología

fragmentos de tejidos ensangre caliente, así como

bacterias y tejidos.de investigación celular expe-

cueñta de un "Supermicroscopio" (microscopiofotografiarse los virus obtenidos en culti vos de

Dr. O. B.

1884

1897

1899

1902

19051907

1910

1911

1912

1913

1913/14

19151920

1924/25

19251926

19271931

1938

74

W. Roux "explanta" la placa medular de un pollo y observá su ulterior desarrolloen solución caliente de cloruro sódico.Experimentos de 1. Loeb para obtener el desarrollo decoágulos sanguíneos, dentro del cuerpo de un animal detambién in vitro.S. 1. Schouten en Utrecht y M. A. Barber en Kansas construyen simultánea-mente un micromanipulador.G. Haberlandt mantiene con vida durante largo tiempo células vegetales aisladas,en diversas soluci~>nes nutritivas.\'0/. Roux introduce el término de "explantación".R. G. Harrison, que es considerado generalmente como e! fundador del cultivo detejidos, observa e! desarrollo de fibras nerviosas a partir de células nervio.l.ls en unfragmento de tubo medular de un embrión de rana que ha cortado de él y ha co-locado en linfa de rana.M. T. Burrows en el Laboratorio de Harrison cultiva tejidos embrionarios de pollo.A. Carre!, en el laboratorio del Instituto Rockefeller de Nueva York, empieza susensayos de cultivo de tejidos.Primer ensayo de G. Volpino para cultivar in vitro tejidos neoplásicos; anál0gos ex-perimentos emprendieron también A. Carrel y M. T. Burrows.A. Can'el logra obtener un cultivo puro de fibroblastos que había explantado de unasiembra de corazón embrionario.A. Carre! 'hace una demostración de la técnica del cultivo de tejidos en b clínicaquirúrgica de Bier, en Berlín.H. Braus emplea por primera vez la microcinematografía para' el estudio de cul-tivos in vitro de órganos de animales de sangre fría.A. Carre! descubre la acción estimulante de desarrollo que ejerce el extracto em-brionario.A. Carrel y R. Ingebrigtsen constatan que las células de los tejidos son capaces aúnin vitro de producir anticuerpos bajo la influencia de antígenos.C. Levaditi ensaya e! cultivo de los virus de la rabia y de la poliomielitis, valiéndosedel cultivo de tejidos.Análogos ensayos son realizados por E. Steinhardt, C. Israelí y R. A. Lambert conel virus de la vacuna variolosa.H. Smyth estudia en e! cultivo las relaciones entreRhoda Erdmann funda en Berlín el Departamentorimental.F. Parker y R. N. Nye logran obtener un cultivo puro de virus de vacuna vuiolosaen el explantado testicular.Rhoda Erclmann funda el Archivo de investigación celular experimental.A. Fischer, mediante la influencia prolongada de! pentóxido de arsénico, tr:lsformafibroblastos del bazo en células sarcomatosas.I. Congreso internacional de investigación celular en Budapest.T. M. Rivers vacuna por primera vez a tres niños con virus de vacuna v.lriolosaobtenido de cultivos puros.En e! transcurso de los siguientes años e! cultivo de tejidos se utiliza cada vezmás cdmo método de investigación en numerosas ramas especiales de la Biología yde la Medicina.B. V. Borries, E. y H. Ruska dande electrones), con el cual puedentejidos.

El desarrollo del cultivo de tej idos Por el Dr. O. Bucher

Los orígenes del cultivo de tejidos co-mo método de investigación se remontanal año 1907, en el cual Ross GranvilleHarrison (nacido en 1870) llevó a caboun genial experimento en el laboratorioanatómico de la Universidad de Yale enN ew Haven. Este experimento decidió lacuestión, largamente discutida, de si lasfibras nerviosas se desarrollan como ex-pamiones de las células nerviosas o si solosecundariamente entran en relación conéstas. En un embrión de rana de una lon-gitud aproximada de 3 mm., en el quetodavía no se había manifestado diferen-ciac ión de las células nerviosas, Harrisoncortó un fragmento del tubo medular ce-rrado y colocó dicho trocito de tejido encondiciones asépticas en un cubre-objetos,sobre una gota de linfa de rana. La linfase coaguló, con lo cual quedó fi;ado es-te trocito al cubre-objetos, que Harrisonmontó, invertido sobre un porta-objetosde célula cóncava, fijándolo con parafina.Estos fragmentos de tejido· seguían vi·-viendo durante una semana y en algunoscaso~ hasta dos semanas. Observándolosminuciosamente, Harrison pudo compro-bar que las fibras nerviosas se formabanpoco a poco a expensas de las células ner-vios:1s embrionarias como expansiones deéstas.

El nuevo método de investigación queHarrison proporcionó a la Medicina ex-perimental, se funda en los experimentosembriológicos de Wilhelm Roux (1850-1,.924), Hans Driesch· (nacido en 1867)y Gustav J. Born (1851-1900). En 1884,Roux había cortado la placa medular deun pollo, colocándola después en solucióncaliente ,de sal común y observándola. Deeste modo pudo comprobar que el tubomedular se cerraba por sí solo, es decir,sin la presiQ..n del crecimiento de los teji-dos vecinos.

Como precursores inmediatos de las"explantaciones" propiamente dichas, de-

.bejLS~miderado.sJo.Lexperimentos lle-

fibras nervio.

Ross G. Harrison (nacido en 1870), cuyos experi-melitos fueron la base del cultivo de tejidos.

tificialmente, en diversas soluciones nu-tritivas, durante días y meses, observandotambién signos de crecimiento. Los en-sayos de cultivar tejidos animales, fueronpues precedidos de intentos de cultivo conplantas. Diversos autores han continuadomás ta"rde estos experimentos, pero e! cul-tivo de tejidos vegetales no podía llegar atener gran importancia.

Harrison fué e! primero que describióuna técnica de cultivo de tejidos cuyautilidad quedó convincentemente demos-trada por e! éxito de sus experimentos.En e! año 1910, M. T. Burrows empleóen el laboratorio de Harrison e! método deéste para e! cultivo de tejidos de embrio-nes de pollo. También Alexis Carre! (na-cido en 1873), en e! Instituto Rockefellerde Nueva York, reconoció en seguida laimportancia de este nuevo método de in-vestigación. Burrows y Carre! lograronpronto cultivar los más diversos tejidosde embriones, así como de animales adul-tos, pero como medio de cultivo emplea-ron plasma sanguíneo, pues les daba re-sultados todavía mejores que la linfa. Los

'76

cultivos eran sembrados en una sala deoperaciones, con la misma escrupulosaasepsia y rapidez con que se efectúa unaintervención quirúrgica, e inmediatamen-te colocados en una estufa. El examen delos cultivos vivos se hacía con un micros-copio calentado a la temperatuLl de 37 a39°C. Las células crecían, aunq ue lenta-mente, del fragmento explantado de ori-gen hacia la periferia. En 1912 descubrióCarre! que e! extracto de embriones ydiversos extractos de órganos (como, porejemplo, e! de! bazo) estimulaban pode-rosamente e! crecimiento. Si se ;lgregabaun extracto tal al plasma sangu íneo, lascélulas crecían y se dividían de un modotan rápido que en dos días aproximada-mente se duplicaba la superficie de! cul-tivo. Con este perfeccionamiento de! me-dio de cultivo se había hallado e! principioque todavía hoy rige en la técnicl de loscultivos de tejidos.

Al contrario de 10 que ocurre con casitodos los métodos de investigación, en e!cultivo de tejidos se ha registrado el he-

Alexis Carrcl (nacido en 1.173). En 1912 recibió r1premio Nobel por sus trabaios acercó de la 'utMa devasos sangníneos y la transplantaciólI de vasos .1 órganos.

cho asombroso de que, inmediatamentedespués de su aparición, su técnica haalcanzado un perfeccionamiento casi com-pleto. El mérito de haber desarrollado elmétodo de cultivo de tejidos "in vitro"corresponde en primer término a AlexisCarre!. Verdad es que en años pasados sehan publicado muchas modificaciones delmétodo, debidas a eminentes investigado-res, pero el principio fundamental delmismo no ha sido mejorado o sensible-mente modificado hasta la fecha. Las es-peranzas que hicieron concebir los expe-rimentos de Carrel, magistralmente idea-dos y llevados a cabo con un sistematismoejemplar, fueron muy grandes. Su.s en-sayos fueron muy pronto repetidos porotros muchos, que con frecuencia no do-minaban suficientemente la técnica y ca-recían de toda experiencia en la nuevamateria y, por 10 tanto, muchas veces noobtenían el esperado éxito. Decepciona-dos por ello, muchos investigadores, porlo demás capaces, dudaron al principioqu'e el cultivo de tejidos constituyera unmétodo seguro de investigación.

Toda novedad encue.ntra siempre unambiente hostil; también el cultivo detejidos fué por largo tiempo objeto deprejuicios· e incluso de una fuerte opo-sición. Ya en 1911, Carrel mismo habíahecho una demostración de su métodoen la clínica quirúrgica de A. Bier, enBerlín. En este tiempo, algunos inves-tigadores comenzaron, también en Ale-mania, a efectual: ensayos de cultivo detejidos. Un mérito especial en la propaga-ción y adelanto de estos estudios; contrajoRhoda Erdmann (1870-1935). Con te-naz perseverancia y después de muchasnegativas, logró fundar en 1920, en Ber-lín, una sección de Investigación celularexperimental, que· al principio fué agre-gada al Instituto de investigación delcáncer, de la Charité. En la literaturaespecial, que entretanto se ha enriquecidoconsiderablemente, figuran muchas y va-liosas contribuciones científicas de estainfatigable investigadora y de sus discí-pulos. En el año 1925 fundó el "Archiv

Rhoda Erdmann (1870-1931),. que contraio especialesméritos por propagar el cultivo de tejidos como métodode investigaci6n.

für experimentelle Zellforschung, beson-ders Gewebezüchtung" y también fuéRhoda Erdmann la que en 1927 convocóel primer congreso internacional de In-vestigación celular en Budapest:

En numerosos institutos de todo elmundo, el ~ultivo de tejidos constituyehoy día un método empleado frecuente-mente para la resolución de problemasmuy diversos de la Biología y de la Me-dicina, llevando el nombre de "métodode Harrison-Carrel" en honor a los des-cubridores de su fundamento.

Sabido es que bajo el nombre de trans-plantación se entiende la traslación de untejido u órgano, separado completamentede sus relaciones, a otra región del orga-nismo del mismo individuo (transplanta-ción autoplástica) o en otro individuo dela misma o incluso de otra especie (trans-plantaciones homoplásticas o heteroplás-ticas). Tales experimentos se han hechoya hace mucho tiempo en la Embriologíaexperimental, y en la Cirugía han adqui-rido cada vez mayor importancia práctica.

77

Al concepto de transplantación W.Roux opuso en 1905 el de Explantación.Mientras que en la transplantación el ob-jeto (transplantado) se planta en un nue-vo ambiente de vida propia, la pieza ex-perimental en el explantado es llevada aun medio muerto, natural o artificial, pu-diéndose variar experimentalmente algu-nos factores aislados. Los objetos de losensayos de explantación son explantadostotales o parciales; en la cultura de tejidosdesempeña un papel principal la explan-tación parcial, es decir, la de tejidos ais-lados.

Hay que establecer una diferencia en-tre la investigación de tejidos supervi-vientes en soluciones protectoras (mante-nimiento de tejidos) y la cría ,de tejidos"in vitro" empleando medios con sustan-cias e.stimulantes del desarrollo (culturasde tejidos). En ciertas circunstancias pue-den también desarrollarse células de lapieza madre explantada, en solucionessimples que no contienen más que salesinorgánicas; estas células, sin embargo,viven a costa de las sustancias nutritivasy estimulantes del desarrollo contenidastodavía en el explantado. Aquí pues, nose trata de un cultivo de tejidos propia-mente dicho, sino de una supervivenciatemporalmente limitada de partes de te-jido en una solución protectora. Ahorabien, para las investigaciones científicasen tejidos vivos son apropiados solamentecultivos de tejidos y en particular los deespecies permanentes y puras.

La importancia que actualmente tieneel cultivo de tejidos como método de in-vestigación se echa de ver sobre todo con-siderando cuántos y cuán diversos pro-blemas son estudiados con ayuda de dichométodo. N os limitaremos a citar algunosde estos temas de estudio:

Gracias a la posibilidad de estudiar "invitro" células vivas, se han modificadoprofundamente las nociones acerca de lafina estructura del citoplasma y de la re-lación causal entre la función fisiológicay la morfología. Las objeciones que se hanhecho de vez en cuando al valor del cul-

tivo de tejidos para la Citología se fun-dan en falsas interpretaciones. Cierto esque el deseo de reproducir "in vitro"la estructura completa de un órgano de-terminado (desarrollo organotípico) nose ha visto cumplido hasta la fecha; encambio, las propiedades específicas de lascélulas y tejidos pueden conservarse "invitro" largo tiempo; a menudo indefi-nidamente (desarrollo histotípico). Unejemplo característico de ello son las cé-lulas hepáticas.

El conocimiento de la carioquinesis haprogresado por ello de un modo conside-rable en estos últimos años, especialmentepor la posibilidad de registrar microcine-matográficamente sus fases en los culti-vos de tejidos, valiéndose del método deabreviación del tiempo mediante toma devistas espaciadas.

La histogénesis de las más diversa~ pro-ducciones celulares como, por ejemplo, lasfibras del tejido conjuntivo, cuyo modode formación no se ha llegado a eschrecerdel todo, puede ser estudiada con ayudadel cultivo de tejidos.

La génesis de las diversas células san-guíneas constituye un problema discutidodesde hace mucho tiempo, sin que se hayalogrado, no obstante, llegar a un acuerdoentre las distintas tendencias; tambiénaquí podemos esperar que el cultivo detejidos aportará nuevos resultados quearrojen luz en este problema.

Hace ya tiempo que el cultivo de te-jidos ha sido utilizado con éxito en lasinvestigaciones inmuno-biológicas. En lainvestigación de virus ha rendido tras-cendentales servicios. Después de haberfracasado los corrientes medios muertosbacteriológicos en el cultivo del virus "invitro", este se consiguió, con ayuda delcultivo de tejidos, en la mayoría de losvirus conocidos actualmente.

y a con anterioridad se habían estudia-do. también los procesos inflamatorios va-liéndose del cultivo de tejidos, así comoel problema de los tumores, de tanta im-portancia en la patología moderna. Tam-bién aquí el cultivo de tejidos ha dado

!'I

Terapéutica con hormonas puras

PerandrenHormona testicular sintética

Tratamiento intensivo de la

Insuficiencia sexual masculina

Neurastenia sexual - Impotencia

Afecciones prostáticas - Insuficiencia endocrina

Ampollas

Productos "Ciba"

Pomada

_..1~ ............ lL-_""- ""-~ O_lSl_--,

'1

~

~

Terapéutica con hormonas puraJ

OvociclirJaHormona folicular pura

Acci6n intensa y persistente en los

Estados de insuficiencia ovárica

Ampollas Comprimidos

Lulociclin aHormona sintética del cuerpo lúteo

Tratamiento de los estados originadospor déficit endocrino del cuerpo lúteo

Amenorrea - metrorragia - pOlimeJ, )rreaDismenorrea - aborto inminenteAborto habitual - etc.

Ampollas Compr rrudos

I

resultados de importancia. En el año1910, es decir, inmediatamente despuésde h:lberse perfeccionado algo la técni-ca, A. Carrel y M. Burrows empeza-ron el cultivo "in vitro" de los tumo-res malignos. Al principio, el cultivoperm;lnente de'las células neoplásicas encultivos puros presentaba considerablesdificultades; hoy día" en cambio, existenvarias razas de tumores que se vienencultinndo desde hace más de 10 añossin que hayan perdido su malignidad. Lacancerización experimental, así como laBiología de la célula cancerosa han ob-tenido valiosos datos gracias al cultivo detejidos.

También en la Radiología constituyeun método verdaderamente ideal para el

estudio de la acción de irradiación sobrelos diversos tejidos aislados, tanto norma-les como patológicos.

No menos importante es la aplicacióndel cultivo de tejidos al estudio de pro-blemas concernientes a la Mecánica deldesarrollo, sobre todo al de la induccióny determinación. De este modo viene acontinuar los trabajos de los fundadoresde la Mecánica del, desarrollo (G. Born yW. Roux) , de los cuales se ha desarrolladoel método de cultivo de tejidos.

Si bien el cultivo de tejidos nos auto-riza a esperar importantes resultados parala Biología y la Medicina, como todo mé-todo de investigación tiene sus límites,que hay que tener en cuenta al emplearloy valorarlo.

Puede administrarse por vía gástrica ypor vía parenteral. En casos graves seconsigue un efecto casi instantáneomediante la inyección endovenosa

Contra dolores de cualquier clase

Es un analgésico y sedante exentode derivados opiáceos u otrassustancias heroicas

Es perfectamente tolerado aún porenfermos sensibles

I1-- 111

,1

11\

79

r;==:=============================--

Neuro -Trasentina(Trasentina + ácido fenilelilbarbilúrico]

Tratamiento de las Distonias vegetativas

de todos los sistemas orgánicos

ACCION:

(espasmoIílica]

sobre los nervios y la musculatura lisa

(sedaliva]

sobre el hipotálamo y la corteza cerebral

OOSIFlCACION:

3-6 veces diariamente 1 gragea

80

La técnica del cultivo de tejidos Por el Dr. O. Bucher

El medio empleado para el cultivo detejidos "in vitro" se compone principal-mente de dos partes: el aparato de sostény las sustancias estimulantes del desarrollo.

El aparato de sostén

Para las células de los tejidos es de im-portancia vital un andamiaje sólido quelas ofrezca apoyo durante el desarrollo.R. Harrison, en sus primeros experimen-tos, insistió ya acer.ca de la necesidad de

un sostén tal para el desarrollo de las cé-lulas nerviosas.

La figura especial de las células de lostejidos depende principalmente de la ar-quitectura del aparato de sostén de quedispone. E. Uhlenhuth, al estudiar lastransformacione~ morfológicas de las cé-lulas epiteliales de la rana como conse-cuencia de las variaciones de consistenciadel medio de cultivo, descubrió que lascélulas se redondean tan pronto como el

Mesa de trabajo. c,m instrumflltal

p'lTa prepararc"ltivosde tejidos.(Laboratorio decultivo de tejidosdel Institutoanatámico dela Universidadde Zurich).

8.1

figura de arriba a ¡a derecha: Tres porlú·objetos concélula cónca'va con sus correspondientes ,ubre-objetos.

Figuras de abajo: Recorte del cultivo para ," transplan-tación. A"tes de colocarlo en el nuevo medio, se bañael trocito recortado.

Figuras de la izquierda: Sobre cubre-objetos se deposi-tan, gota a gota, plasma y extracto. Colocación de untrocito de tejido del grosor d~ una cabeza ie alfiler.El borde deA porta-objetos cóncavo es untado con vase-lina. El cubre-objetos es colocado de tal manera que eltrocito de te¡ido queda bajo él.

para la preparaci6n de un(Fotografías Conta>: del Dr. O.

Orden de trabajocultivo de tejidosBucher y de P. Perk).

/

82

medio de cultivo se licúa o se elimina elaparato de sostén; en este caso ya no cre-cen más ni se reproducen, sucumbiendopoco a poco. Si se cultivan células en unlíquido utilizando solamente el cubre-objetos como sostén (Lewis) que sólo en-cuentran un apoyo en dos dimensiones,crecen en forma plana y formando unacapa; en cambio, cuando existe un sosténde tres dimensiones (como por ejemplocultivándolas en coágulo fibrinoso), cre-cen en forma de huso. Esta dependenciafundamental de la vida celular con res-pecto a la clase de aparato de sostén, hasido denominada por L. Loeb "estereotro-pismo". La modificación introducida enla técnica por M. T. Burrows y A. Ca-rrel, que en lugar de la linfa emplearonplasma sanguíneo, proporcionó un medio

.de cultivo verdaderamente ideal que porsu completa transparencia permite inclusoel examen microscópico directo de las cé-lulas vivas. Por otra parte, las células vi-ven en este medio bajo condiciones quese aproximan casi enteramente a las na-turales. Frecuentemente se ha intentadosustituir la red esponjosa de los filamen-tos de fibrina (como se encuentra en elplasma sanguíneo) por otras sustanciascompletamente indiferentes (agar-agar,gela tina, vidrio hilado, algodón, etc.), pe-ro el coágulo de fibrina sigue siendo elandamiaje ideal siempre y cuando se rea-lice el experimento en condiciones que noestorben la coagulacion del plasma. Así,por ejemplo, las células de tumores ma-lignos, a consecuencia de sus propiedadesproteolíticas, dan lugar a una licuefaccióndel medio de cultivo que dificulta prema-turamente y en grado extraordinario elcultivo de estos tejidos.

Las sustancias estimulantes del desarrollo

Para mantener durante largo tie~po ensupervivencia las células de los tejidos, nobasta el plasma coagulado como medio decultivo. J;:l suero ~olo, empleado a la con-centración natural, puede incluso ejerceruna influencia inhibitoria sobre el des-arrollo .de las células. Las sustancias que

estimulan ante todo la reproducción delos fibroblastos, no se encuentran en elplasma sanguíneo, sino en las células.. En1912, A. Carrel demostró que diversosextractos tisulares (de embriones, de ba-zo, etc.), exaltaban fuertemente la in-tensidad del desarrollo. Sería de gran in-terés práctico poder aislar y emplear elagente activante del extracto embrionarioque es sumamente delicado, pues pierdeparte de su actividad por la filtración através de una bujía de Berkefeld y porel calentamiento a 56" Y es destruído a los70°C.; dicho agente podría utilizarse paraacelerar la curación de heridas, fracturasóseas, etc. Ya desde el principio de la eradel cultivo de tejidos, A. Carrel constatóen el transcurso de sus experimentos acer-ca de la curación de heridas, que las he-ridas abiertas cicatrizan más rápidamentecuando se extiende sobre ellas una papillade tejido embrionario. La naturaleza deeste principio activante todavía no es co-nocida. Es probable que la conservaciónde la potencia estimulante de desarrollo

Estufa de cultivo. E" el cajón que aparece medio abier-to, se ven fres filas de porta-objetos con cultivos encubre-objeto. (Laboratorio de cUltivo de tejidos delInstituto anatómico de la Universidad de Zurich).

83

se halle ligada a sistemas coloidales, locual explicaría también su extrema labi-lidad. Probable es también que por lomenos una parte de las cualidades delextracto embrionario sean debidas a la ac-tivación de fermentos proteolíticos (L.B:iker y A. Carrel).

M. T. Burrows yA. Carrel fueron losprimeros que lograron cultivar tejidos in-definidamente "in vitro", con ayuda deplasma sanguíneo adicionado de extractode tejido. El fragmento de tejido teníaque ser de cuando en cuando escindido delantiguo medio de cultivo, para librarle delos productos del metabolismo, y lavadoen solución de Ringer, después de lo cualvolvían a plantarse en un medio nuevo.

La preparación del plasma

Como dadores de sangre para la obten-ción de plasma se utilizan sobre todo losmamíferos (rata, ratón, conejillo de In-dias, conejo, gallina y hombre) y como

animales de sangre fría la rana. La coa-gulación de la sangre es evitada emplean-do jeringas, tubitos de ensayo, etc., reves-tidos de parafina. Un gran progreso eneste sentido lo constituyó la introducciónde la heparina, que impide la coagulaciónespontánea; al adicionar extractos de teji-dos que contienen tromboquinasa, el plas-ma con heparina se coagula, sin embargo,lo mismo que el plasma ordinario. A lasdiluciones empleadas, no ha podido com-probarse influencia alguna de la heparinasobre los cultivos. La sangre extraída parala obtención de plasma es refrigerada in-mediatamente con hielo, centrifugada yguardada en un armario frigorífico, per-maneciendo líquida así durante semanasy aún meses.

La obtención de extractos de tejidos

Lo mismo que la sangre, también losórganos utilizados para obtener extractosde tejidos (bazo, timo, etc.), así como

84

Micrrnnanipulado,según ¡amey Péterfi,con el '/lalpueden efectuarsetambiéninterVe1J,·joneJmicro-quirúrgicasen las célulasen los cultivosde tejidos.Sobre Ulla platinainferior vanfijadas a derechae izquierdados soPorttlpara operaciones.

Dos tijlOs de frascos de cultivo de Carrel.

los embriones empleados para prepararextracto embrionario, son extraídos delorgan ismo con todas las precauciones deasepsiJ. Después de ello son divididos enpequeñísimos trocitos, valiéndose de ins-trumentos esterilizados y en algunos ca-sos triturados en un mortero de porce-lana, después de lo cual se añade unacantidad igual de solución de Tyrode ytodo ello se coloca durante algún tiempoen el ter,móstato. Luego se centrifuga ,yel extracto es tomado con una pipeta. Ta-les extractos de tejidos, después de secados,pueden conservarse estériles durante díaso sem;mas sin perder su actividad. El ex-tracto embrionario conserva su actividadmenos tiempo que el extracto de tejidospreparado únicamente' con órganos.

La siembra de cultivos en cubre-objetos

Lo mismo que en las' intervencionesquirúrgicas, también en el cultivo de te-jidos el trabajo en condiciones asépticases un;¡ de las más importantes condicio-nes del éxito. Todos los instrumentos uti-lizados para un ensayo de cultivo de te-jidos (escalpelos, tijeras, pinzas, etc.), asícomo los objetos de cristal (platillos, pi-petas, porta-objetos, cubre-objetos, etc.)y soitlciones (de Ringer, Tyrode, etc.)deben ser cuidadosamente esterilizados.

El tejido que se desea cultivar es ex-traído del animal en condiciones estérilesy sumergido en solución de Ringer. Parapreparar cultivos en cubre-objetos se co-locan trocitos de tejido del grosor de unacabeza de alfiler con una gota de extracto

sobre un cubre-objetos, se mezcla y almismo tiempo el medio de cultivo (quese coagula en seguida) se extiende al-go. El cubre-objeto se invierte y se fijacon un poco de vaselina sobre un porta-objetos provisto de concavidad. Cuandose trata de cultivos de tejidos de animalesde sangre caliente se colocarán inmediata-,,mente en la estufa. La temperatura en eltermóstato se acomodará al calor del cuer-po del animal, del cual procede el' tejidoy deberá oscilar entre 3r y 3g0c. Paracultivar tejidos de animales de sangre fríacomo, por ejemplo, la rana, no se necesitaestufa. Por lo común, los cultivos se trans-plantarán cada f ó 4 días. Con este ob-jeto se cortarán los trocitos de tejido me-diante 4 cortes hechos con un bisturíafilado de cataratas" separándolos así dela zona de crecimiento; el trocito en cues-tión se dividirá en caso necesario en 2 ó 3fragmentos iguales, se bañará brevementeen solución de Ringer para privarle delos productos del metabolismo que se hanacumulado y a continuación se implan-tarán en otro nuevo medio en la formaarriba descrita. Para evitar en lo posiblela infección bacteriana por el aire, con-vendrá trabajar bajo una placa de cristal.Con este método es posible cultivar ili-mitadamente los tejidos "in vitro". Sólolos cultivos que han de servir para reali-zar el experimento, deberán permanecercontinuamente en el termóstato; los de-

Platina de microscopio calentable (estudio cultivos vivos).

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más, después de haber permanecido undía en la estufa, pueden conservarse tam-bién a la temperatura de la habitación.Así, las células de tejido conjuntivo, de-jadas a la temperatura de la habitación yen la oscuridad, siguen viviendo un mesaproximadamente y después de este tiem-po pueden seguir siendo cultivadas.

Los cultivos en frascos

Persiguiendo el objeto de mantener te-jidos en crecimiento ininterrumpido du-rante un tiempo prolongado, A. Carrelha ideado otro método más con el cualno se perjudican los cultivos por la trans-plantación, pero, no obstante, se les pro-porcionan las necesarias sustancias nutri-tivas y de desarrollo y se eliminan losproductos del metabolismo. Es el llamadométodo del frasco, el cual se. funda en elsiguiente principio: El medio de cultivoestá formado por una parte sólida y otralíquida. La parte líquida puede ser reno-vada tan a menudo como es necesario.Como recipientes se usan frascos apIana-dos y redondos provistos de uno o de dosembocaduras laterales. Teniendo en cuen-ta el peligro de infección bacteriana, hayque observar con este método precaucio-nes especiales. Primeramente se introdu-cirá el plasma sanguíneo y se extenderásobre el fondo del frasco; antes de quese coagule, se introducirá el fragmento detejido. Una vez coagulado el plasma san-guíneo se verterá sobre él el medio lí-quido de cultivo (extracto y solución deTyrode), cerrando después la boca delfrasco. Según la clase de tejido, el mediolíquido se renovará cada 2- 5 días. Coneste método puede conservarse vivienteun cultivo de epitelio o de tejido con-juntivo durante tres semanas aproxima-damente, sin necesidad de transplantación.

Con el fin de poder aportar continua¡_mente una solución nl.ltritiva al trocitode músculo, M. T. Burrows, B. Romeis y'otros investigadores han construído apa-ratos complicados que permiten observarcon toda exactitud el objeto e incluso fo-tografiarlo (J. de Haan).

86

Para poder juzgar acerca del crecimien-to del explantado, A. Carrel y A. H. Ebe-ling han ideado un método de mensura-ción que se funda en dibujar los contor-nos del cultivo en diversos tiempos conayuda de un aparato de proyección y ha-cer después el cálculo planimétrico. R.Meier ha expuesto un método que permitedesprender los cultivos del plasma sin es-tropearlos en lo más mínimo y pesarlos.El método de la medición planimétricade la superficie ocupada por el cultivo,aun cuando es muy usado, no ofrece exac-titud, pues un aumento de la su perficieno quiere decir forzosamente que sea de-bido :t una reproducción de las células,sino que en ciertas circunstancias puedenproducirse por células que han emigradodel trozo matriz (véase la reproducciónde un cultivo de bazo, pág. 97). El mé-todo más exacto para averiguar la inten-sidad de crecimiento de un cultivo "invitro", es la determinación de su coefi-ciente mitósico, es decir, de la proporciónentre el número de las células que se ha-

Aparato para toma de vistas cinematográficas espaciadas.(Instituto anatámico de la Universidad de Zurích).

llan en estado de carioquinesis y las cé-lulas en fase de reposo.

La obtención de cultivos puros

Las investigaciones biológicas deben serllendas a cabo en objetos experimenta-les bien definidos; para ello se necesitan,pues, cultivos puros de células. Esto fuéprimeramente reconocido por Carrel, queen el año 1911 consiguió ya un cultivopuro de fibroblastos de un trocito de te-jido cardíaco embrionario.

Para lograr cultivos puros es conve-niente extraer del cuerpo del animal unaespecie determinada de células puras, porejemplo cartilaginosas (método anatómi-co electivo) o bien se deja ahogar ciertasespecies celulares menos resistentes porotras más resistentes (método fisiológicoelectivo). Este último método presentacierta analogía con algunos métodos bac-teriológicos electivos, por ejemplo, el delcultivo de bacilos de Eberth en bilis queinhiben el crecimiento de otras bacterias.En un cultivo mixto de elementos con-juntivos y epiteliales, estos últimos crecenpeor que los fibrocitos, de tal manera que,por lo menos en ciertas condiciones, seorigina poco a poco un cultivo puro defibrocitos. Sobre este principio se fundatambién el método clásico de Carrel paraobtener cultivos puros de fibroblastos depollo. El célebre cultivo celular del Ins-tituto Rockefeller, que hasta la fecha vie-ne cultivándose desde hace más de 25años, se obtuvo de un trocito de corazónde un embrión de pollo de 7 días. Elmétodo de Carrel consiste en explantarun pequeño fragmento de corazón em-brionario y cultivarlo dos a tres semanas;con ello los mioblastos sucumben y quedaun cultivo puro de fibroblastos.

La Micrurgia

En las células de los cultivos de teji-dos pueden efectuarse operaciones micros-cópicas. Sin embargo, tales intervencio-nes micrúrgicas exigen no solamente unapráctica extraordinaria, sino también apa-ratOs complicados y costosos. En el año

1899 fué construído por primera vez unmicromanipulador simultáneamente porM. A. Barber en Kansas y S. L. Schoutenen Utrecht. A R. Chambers y T. Péterfisobre todo se debe un considerable per-feccionamiento de este instrumental.

El exam-en microscópico de loscultivos de tejidos

Los cultivos d.e tejidos pueden exami-narse muy bien al microscopio en estadovivo y sin teñir por medio de grandesaumentos. Para evitar que los cultivos seenfríen durante el examen, se usa un mi-croscopio con platina calentable. Si sequieren estudiar los detalles de un culti-vo, se fija y tiñe en total. Para el teñidono todos los métodos-corrientes son igual-mente apropiados, pues el teñido del coá-gulo del plasma, en el cual se encuentranlas células, debe ser atenuado en compa-ración con el de las células mismas. Cuan-do interesa reconocer finas estructuras ce-lulares y extracelulares, se incluirá el te-jido cultivado en parafina o celoidina yse harán de él cortes de la misma maneraque cuando se hace preparados histoló-gicos. Mencionaremos además que con loscultivos de tejidos pueden llevarse a ca-bo también experimentos de teñidos envivo, por ejemplo con el rojo neutral.

La Microfoto- y la MicrocinematografíaLa fotografía de células teñidas o cé-

lulas vivas sin teñir no presenta hoy díadificultades especiales. Para ello es conve-niente utilizar aquellas partes de cultivoen las que las células han crecido en el velomarginal, formando una sola capa. La Mi-crocinematografía tropieza con· ciertas di-ficultades técnicas. Así, por ejemplo, hayque evitar el enfriamiento del cultivo y elresultado obtenido depende también en-tre otras cosas de una iluminación con-veniente, de la elección de un filtro apro-piado, etc. La Microcinematografía fuéusada por primera vez por H .. Braus( 1911) para estudiar los preparados deórganos de animales de sangre fría culti-vados "in vitro". La importancia de estemoderno medio auxiliar para la investi-

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9 10 11 12 15 16 1~

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Curva mitósica normal obtenida por valoració" cuantitativa de 1tn film COIl toma de vistas espaciadas (.¡ exposi-ciones por minuto) durante 9 horas y media. Se trataba d" un ensayo con arsénico 1: 5 millone.. Cultivo de fibro-citos. La curva q1te resulta al 1tnir los puntos de iniciació" de las mitosis registradas, nos da por su trayecturia máso menos decreciente la medida de la actividad milósica del cultivo en cuestión. Las pequeñas oscilaciones rítmicasse originan por el hecho de q1te las segmClltaciones celulares aparecen en los diversos territorios de n¡{tivo engolpes de producció'l periódica q1te sólo en S11 totalidad dan por resultado el crecimier;to aproximadamente C(m-ti"1to de todo el cultivo. Las pequeñas rayas verticales q1te aparecen de tiempo en tiempo aproximadamente enla mitad de cada segmentación celular, indican el mo-mento de la estrang1tlación celular (véase figs. pág. 93).La duración media del proceso de la mitosis es de 38-43 minutos. (Experimento filmado por el pro O. lIucher).

gación de 'los procesos vitales en los teji-dos es evidente, pues permite registrar yreconocer, en todos los detalles alteracio-nes morfológicas y fenómenos de movi-miento. Los procesos vitales que transcu-rren lentamente como, por ejemplo, lasegmentación celular, pueden ser proyec-tados en un corto tiempo con ayuda dela toma de vistas espaciadas. Como quieraque la proyección puede repetirse en cual-quier momento, es posible apreciar ciertosdetalles que se escapan a la primera ob-servación. La posibilidad de proyectar lapelícula en sentido contrario, facilita en

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ciertos casos el estudio de ciertos fenóme-nos y relaciones, sobre todo en el estudiode las mitosis. Aquí, la Microcinemato-grafía ha creado un nuevo método por lavaloración cuantitativa de las pelícu las, elcual ha sido perfeccionado en estos últi-mos años sobre todo por W. von Móllen-dorH. Con este método se ha logrado ad-quirir valiosos conocimientos en la diná-mica de diversos trastornos mitósicos pro-vocados experimentalmente (por ejem-plo, tras la radiación por rayos ultravio-letas o consecutivos a la acción de hidro-carburos carcinóginos, arsénico, etc.).

Por el Dr. O. Bucher

El cultivo de tejidos como método de la investigación

morfológica y fisiológica

Las características de un cultivo de tejidos

En un cultivo de tejidos se distingueentre el fragmento explantado del animalo transplantado del pase anterior (el frag- .mento matriz) y el velo marginal quecrece a su alrededor (véase grabado de lacubierta). El fragmento marginal es unpreparado que no puede ser bien estudia-do microscópicamente en su totalidad,porque se compone de varias capas. Porel hecho de componerse de varios estra-tos, está mal nutrido y por ello se obser-van procesos regresivos poco después deempezar el cultivo. A la media hbra de laexplantación comienzan ya 'a emigrar cé-lulas del fragmento matriz central haciala perifería (véase grabado del cultivo debazo en la pág. 97) Y a reproducirse.Al cabo de 24-36 horas el fragmento ma-triz se halla rodeado por 10 general deun velo marginal más o menos ancho.El aumento de la superficie del trozo ex-plantado hasta duplicarse, tiene lugar enuna, 48 horas en un cultivo de fibrocitosy en 72 horas en un cultivo de epiteliodel iris.

La intensidad de crecimiento de un cul-tivo de tejidos depende de numerosos fac-tores, como son la clase del extracto, latem peratura elegida, el pH, la presiónosmótica, etc., así como también entreotras cosas del tamaño del explantado. Sieste es demasiado grande, el crecimientoes mínimo o no se llega a registrar elcrecimiento de las células. A la inversa,es necesario transplantar juntamente unnúmero suficiente de células para quetenga lugar la proliferación y segmenta-cÍón de las mismas (A. Fischer). Es im-posible realizar "in vitro" un cultivo detejidos con una sola célula normal. Así,pues, no podemos obtener un cultivo pu-ro de fibroblastos con un solo fibroblas-to de la manera como obtenemos colonias

bacterianas con una sola bacteria. Desdeestos puntos de vista, la célula no puedeser considerada como la última unidad ca-paz de vida. Según A. Fischer, las cé-lulas neoplásicas se COmportan de un mo-do distinto bajo este concepto.

Después de cierto tiempo, que varíasegún el tejido y el medio de cultivo, apa-recen en todos los cultivos fenómenos dedegeneración que terminan por la muer-te cuando se abandona el cultivo a sí mis-IJlO. La causa de este fenómeno no es fácilde analizar; los factores que desempeñanaquí un papel decisivo son la falta desustancias nutritivas, sales y oxígeno, laacumulación de productos del metabolis-mo y las alteraciones en la concentraciónde los iones de hidrógeno. Puede evitarsela muerte de un cultivo excindiéndolo detiempo en tiempo del plasma antiguo, ba-ñándolo y transplantándolo a un nuevomedio, con lo cual los productos metabó-licos nocivos son eliminados y se aportaa las células nuevas sustancias nutritivas(véase pág. 85). En la estimulación delcrecimiento del tejido es de importanciatambién el hecho de que al recortar elexplantado se producen en su contornoheridas incisas que se reproducen a cadatransplantación.

A continuación esbozaremos algunas delas cuestiones referentes a la investigaciónmorfológica.

La formación de las estructuras fibrosasy sustancias duras en el cultivo de tejidos

Entre el crecimiento y la diferenciaciónexiste "in vitro" cierta relación recípro-ca; el empeoramiento de las condicionesde desarrollo conduce a una formaciónmayor de productos de diferenciación.Desde los estudios de A. Fischer y R. C.Parker se ha concedido a estos problemasuna atención creciente. Estos autores re-

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J

. .

Velo marginalde un cultivoteiiido defibrocitos,examinado confuerte aumento.También puedenreconocersealguna, célulasen l1Jitosis.Foto:Dr. O. Bucher.

tardaban la proliferación celular supri-miendo el extracto embrionario (estimu-lante del crecimiento) en el medio delcultivo. Para conseguir una diferenciaciónlo más acentuada posible, W. von M61-lendorff transplantó repetidas veces cul-tivos sin la división generalmente prac-ticada del fragmento matriz. Con elloconsiguió en los fragmentos matrices desus cultivos de fibrocitos, una diferen-ciación de las fibras colágenas y argi-rófilas, así como de las cortezas duras.A. Paravicini pudo demostrar que los fi-brocitos cultivados de diversos órganoscomo intestino, bazo, hígado, etc., soncapaces de la misma diferenciación quelos fibrocitos del tejido subcutáneo. Lasfibras así originadas muestran una dispo-sición en trayectorias determinadas (W.von M6llendorff); aquí dominan las es-tructuras en capas concéntricas, pero jun-to a ellas también se encuentran fibrasverticales y meridionales que vienen acorresponder a la disposición de los cas-cos de cebolla. En los fragmentos matri-ces viejos se presentan en las zonas mar-ginales capas más o menos gruesas quepueden calcificarse y que en comparacióncon los tejidos vienen a constituir a modode un hueso joven de groseras fibras. T o-das estas construcciones son determinadaspor los estados de tensión en el proto-

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plasma y su robustez es (según los ensa-yos de O. Düggeli) proporcional a lafuerza de las tensiones de tracción.

La influencia de las tensiones de tracciónsobre el crecimiento del tejido "in vitro"

También en la morfología del cuer-po humano, el criterio funcional encontrócada vez mayor aceptación en los últimos

Corte horizolltal a trallés del fragmento matriz de uncultivo de intestmo embrionario de conejo. Se- aprecianclaramente los trozos corticales di,puesto, concéntrica-mwte. Según A. Paravicini. 1934.

· Este e,quema muestra cómo se hallan repartidas laslíneas de tensión más importantes en el fragmentomatriz de un cultivo de tejidos. En la mitad de izquier-da se bailan señaladas solamente las lineas de tensión;m la mitad derecha se indica que en el fragmento",atriz se forman también sustancias duras, en lascuales se reflejan estructuralme'nte las trayectorias.Según \V. von Mollendorff. 1932.

dos decenios. Sabido es que la estructurade ciertos tejidos como, por ejemplo, delóseo y de ciertos órganos, se adapta espe-cialmente a su trabajo mecánico, es decir,que su crecimiento y su diferenciaciónobedecen a ciertos principios arquitectó-nicos. En cambio, el crecimiento en elculti vo de tejidos tiene lugar por 10 ge-neral menos ordenadamente. Anterior-mente hemos llamado ya la atención acer-ca de las líneas de tensión que en sentidoradial aparecen por 10 común en las gotasde plasma de los cultivos en cubre-objeto(crecimiento radial de los fibrocitos, de-terminada trayectoria de los productos dediferenciación en el fragmento matriz).La influencia ejercida sobre la direccióny la intensidad del crecimiento puede es-tudilrse excelentemente "in vitro" bajociertas pruebas de tensión exactamentedefinidas (P. Weiss, O. Düggeli). Cuan-do se hace un cultivo de fibrocitos en un

Este dibujo esquemático de un cultivo "en dado" indicaCómo se halla dispuesto el fragmento matriz en el medioplasm,itico. Las flechas indican las direcciones princi-pales de crecimimto. Según O. Düggeli. 1937.

medio de plasma que ha hecho coagular,en marcos triangulares o cuadrangularesde vidrio o en marco cúbico de tres di-mensiones, se pone de manifiesto' que lascélulas no crecen ya a partir del fragmen-to matriz en dirección raoial regular, sinoqu~ son desviadas en sentido de las líneasprincipales de tensión. Mientras que enlas zonas de más escasa tensión forman lascélulas una especie de maneja más o me-nos irregular, las que se éncuentran en laszonas de tensión adoptan posición para-lela y alargada. Estas células crecen tam-bién con mucha mayor rapidez, propor-cionalmente al estado de tensión que do-mina en estos puntos. Las condiciones fí-sicas, según estos estudios, no solamenteinfluyen sobre la estructura de tejido pro-porcionalmente a la carga mecánica, sinoque también estimula la formación deproductos de diferenciación. '

La mitosis en el cultivo de tejidos

En los cultivos de tejidos, p. ej. de fibro-citos, el curso y mecanismo de la mitosispuede ser objeto de un estudio exacto es-pecialmente con ayuda de la Microcinema-tografía (W. von Mol1endorff, 1937/38).Aquí se distinguen las siguientes fases:

En la primera fase (profase) la célulase redondea y a menudo éxperimentatambién un aumento de volumen porimbibición de líquidos. En el citoplasmase originan dos compartimentos de visco-

Fotografía en vivo de la superficie superior en uncultivo "en dado", después de 9 días de desarrollo.Según O. Düggeli. 1937.

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Fibrillas impregnadas con nitrato de plata en 1In c1tltivode fibrocitos. Fotografía Lcica del Dr. O. B1tcher.

sidad distinta, el espacio de segmentacióny el espacio para el plasma co'r-cical quele rodea, el cual se halla menos fluidifi-cado. También en el núcleo celular seobservan modificaciones' características:La membrana nuclear desaparece y unproceso de detersión conduce a la for-mación de los cromosomas que muestranfuerte refringencia.

Al principio de la segunda fase (meta-fase) se ve una célula esférica, cuyos po-los celulares se prolongan en largos y te-naces filamentos de plasma. El citoplasmase ha diferenciado en un plasma corticaly un plasma de segmentación o mixoplas-ma. En este espacio central de segmen-tación se encuentran los cromosomas enla primera parte de la metafase, animadosde un movimiento irregular de velocidadcreciente. En el segundo período los mo-vimientos cromosomiales se ordenan enuna dirección polar, haciéndose visible laplaca ecuatorial. En la metafase los cro-mosomas se excinden en sentido de su lon-gitud. Cuando se ha formado el huso enel espacio de división, se ha alcanzado elfin de la metafase. :1;:1 huso es bastanteconsistente y puede ser empujado en elmedio que le rodea con ayuda de la agujadel micromanipulador. En las películascinematográficas se advierten a veces mo-vimien~os en l~ superfi

FOI lila de trabajo de un fibrocito. Foto: Dr. O. Bucher.

Micosis: (Fotografias Leica del Dr. O. Bucher).

Figltras de abajo: Profase. En el ",¡cleo celular se hacC1lviSIbles los cromosomas.

Mdafase tardía. La placa ecuatorial vista de lado.

Figuras a la derecha: Anafase. Las dos mitades de loscrumOsomas se desplazan en dirección al polo.

Telofase. Acaba de producirse la estrangulación delcu,.,.po celular.

Telofase '" uu momento posterior al de la foto auterior.

Fa'e de reconstrucción. Las células hijas se desplegan.El núcleo y el citoplasma alcanzan por último suesl rlle/ura de trabajo.

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De izquierda' a derecha: Mitosis tripolar. Según O. Bucher. 1939. Picnosis nuclear de nna metafase tardía COn husobien visible y cromosomas dislocados. De~pués 'de actuar durante 9 horas una solución de colchicina (l: lOmillo-nes). Según O. Bucher, 1939. - Primer estadio de la telofase. Las estrellas hijas se hallan unidas entre sí I'or unhaz de finos filamentos cromosomáticos; estrangulación ;,¡cipiente del cuerpo celular. Después de actuar durante9 horas una solución de tripaflav;"a al 1:S00'OOO. Según O. Bucher. 1939.

El curso de las mitosis depende tam-bién de la temperatura. Entre 25° y 45°C.transcurren con bastante normalidad. A28° la mitosis (en cultivos de 'embrión depollo) es de doble duración que a 38°.(R. A. Lambert y F. M. Hanes). Tem-peraturas más altas (por encima de 46°)perjudican las células, por lo menos lasque se hallan en estado de mitosis, siendoeste daño irreversible. Muy pocas célulassobreviven a temperaturas de 48°-50°. Larefrigeración excesiva (por bajo de 24°)produce la interrupción de las mitOSIS,pero calentándolas a 39° pueden conti-nuar normalmente en ciertas circunstan-cias. Así, pues, las células pueden sopor-tar considerables oscilaciones de tempera-tura. Sin embargo, el aceleramiento o elretardo de la mitosis en general no tienelugar con arreglo a las reglas de la reac-ción química de van t'Hoff, pues el tiem-po en que transcurre no aumenta conregularidad, sino tantp más cuanto másse aleja el medio de la temperatura ópti-ma (L. Bucciante).

Mediante investigaciones hechas con to-ma de vistas espaciadas acerca de la in-fluencia de sales .que producen imbibicióny detersión sobre el curso de la mitosisen cultivo de tejidos" han podido estu-diarse también detenida~ente las altera-CIOnes de la viscosidad que se presentan

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durante la mitosis de los fibrocitos (W.von Mollendorff).

Los trastornos de los procesos mitósicospueden ser determinados por una modi-ficación directa del plasma celular como,por ejemplo, por determinadas sales enconcentraciones no fisiológicas o por sus-tancias de fuerte actividad supetfici:ll,asícomo también por el daño sufrido por elregulador mismo (producido por ejemplopor arsénico, colchicina, etc.). Si las in-fluencias alterantes son más fuertes queel poder de regulación de la célula, la mi-tosis, aún en caso de verificarse, seLÍ pa-tológica. Así, por ejemplo, la separaciónde las dos mitades de los cromosomas pue-de ser incompleta, teniendo lugar a pesarde ello la estrangulación del cuerpo celu-lar, y viceversa puede faltar la segmenta-ción del plasma, aun habiéndose real izadocompletamente la división del núcleo, delo cual resultan células binucleares. Entrelos trastornos' mitósicos más frecuen tes secuenta la dislocación de los cromosomas.En cultivos normales pueden observarsede vez en cuando mitosis tripolares.

Las nuevas investigaciones de W. vonMollendorff he.chas en fibrocitos de co-nejos (1939) permitieron la interesanteobservación de que las hormonas sexuales(testosteron, estrona) pueden producir"in vitro" trastornos mitósicos análogos

a los que se observan por lo general bajola influencia de hidrocarburos canceríge-nos o en tumores malignos. Estos trastor-nos, caracterizados ante todo por placasecuatoriales con cromosomas dislocados,pueden ser producidos por diversas in-fluencias; sin embargo, se observan yaempleando las hormonas sexuales y loshidrocarburos cancerígenos a concentra-ciones que todavía no inhiben la intensi-dad de desarrollo de los cultivos. Esta se-mejanza de acción sobre los cultivos de te-jidos depende quizá de un posible paren-tesco químico entre las hormonas sexualesy dichos hidrocarburos. Por de pronto hayque abstenerse de sentar conclusiones de-finitivas aceptadas por algunos autoresacerca de la relación entre hormonas se-xuales y desanrollo neoplásico, rebatidas .por otra parte por autores como F. Sauer-bruch y E. Knake, A. Butenandt y G.Domagk. (W. von Mollendorff).

Del 11Ieta'bolismo en cultivos de tejidos

El número de investigaciones realizadasacerca del metabolismo de los cultivos detejidos, es hasta la fecha relativamentereducido, quizá a causa de sus grandesdificultades técnicas. Ahora bien, el per-feccionamiento ulterior de los métodosmicroanalíticos promete todavía impor-tantes resultados de tales investigaciones.

. Los tejidos normalmente explantadosnecesitan ante todo oxígeno para su des-arrollo. O. Warburg fué el primero quellevó a cabo ensayos de respiración entejidos explantados. R. Meier modificó elmétodo de Warburg para la medición deloxígeno en los cultivos en desarrollo. Alcontrario de lo que ocurre con las célulasnormales, las células sarcomatosas necesi-tan cantidades relativamente reducidas deoxígeno cuando existe abundante glucosa.Aun en un medio exento de oxígeno, eldesarrollo del tejido sarcomatoso no essensiblemente peor, pudiendo éste seguirsiendo cultivado después de 48 horas enlas condiciones corrientes.

El azúcar en los cultivos de tejidos nosolarnente puede ser oxidado, sino tam-

bién desdoblado formándose ácido lácti-co (R. Meier, F. Demuth). Los cultivosde tejidos normales producen bastantemenos ácido láctico que los cultivos detejidos neoplásicos. Según l'as investigacio-nes de A. Krontowski y J. A. Bronsteinhechas en tejidos normales de rápido cre-cimiento, en dos días se consumió el 80por ciento del azúcar existente en el me-dio, es decir, la mitád' del propio peso enseco. Con el método de Hagedorn-Jensen,-los autores constataron que a los 4- 5 díasno se encontraba ya azúcar en el mediode cultivo. En el cultivo de tejido neo-plásico todo el azúcar ha desaparecido yaa los 2-3 días. En la célula tumoral, auncuando se halle suficiente cantidad deoxígeno, la glicolisis anaerobi:¡. desempeñaun importante papel. También las célulasembrionarias glicolizan en los medios decultivo provistos de azúcar, pero sólocuando no hay suficiente cantidad deoxígeno, pues en otro caso cubren su gas-to de energía por procesos de oxidación.

Los aminoácidos actúan tóxicamentesobre el medio del cultivo cuando se ha-llan a concentraciones elevadas (M. T.Burrows, A. Carrel y A. H. Ebeling).Las sustancias asimilables nitrogenadas sonprobablemente los primeros productos dedesintegración de la molécula de protei-na. La acción estimulante' del crecimientoque caracteriza al extracto embrionario,es probable que se deba sobre todo a susfacultades proteolíticas. A. Carrel susten-tó ya la opinión de que en el extractoembrionario, además de las sustancias nu-tritivas, desempeñan también un papel lashormonas. En 1913 Carrel comunicó laacción estimuladora de desarrollo propiade la hormona tiroidea, que ha sido confir-mado desde entonces por diversos autores.

También se ha comprobado en algunostejidos la presencia de vitaminas, habién-dose estudiado sus efectos sobre los tejidos "in vitro". A pesar de las numerosí-simas investigaciones biológicas acerca dehormonas y vitaminas, las practicadas encultivos de tejidos no han sido llevadas acabo hasta la fecha con gran frecuencia.

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Comportamiento de diversos tejidos durante el cultivo

Por el Dr. O. Bucher

Fibrocitos

Como quiera que los fibrocitos puedencultivarse con relativa facilidad, son uti-lizados las más de las veces para expe-rimentos de cultivo de tejidos. En losfibrocitos es típico el crecimiento forman-do una red más o menos tupida; sus cé-lulas fusiformes y dispuestas radialmenteen -el cultivo, están anastomosadas entresí por expansiones protoplasmáticas (véa-se figura de abajo). Las células de doscolonias vecinas de fibrocitos parecen

Tres fibrocitos de '''' cultivo de tejido subcutáneo deconejo. Aumento de 115 O diámelros. Dibujo del Dr.O. Bucber.

Fotografía el' fondo oscuro de fibrocitos. Los plintosque aparecen iluminados son pequeñas gotas de grasa.La fina red en el citoplasma está constituíd" por ¡.las-tosomas. Fotografía del Prof. Dr. W. van MOllendorff.

atraerse, pues se advierte la tendenci.l aunirse de ambos cultivos. La velocidadde crecimiento de los fibrocitos es algomayor que la de las células epiteliales bajolas mismas condiciones. Por lo general,los fibrocitos en su fuerte crecimiento nomuestran fagocitismo, pero en cambiopueden hacerse más macrófagos despuésde ciertas lesiones experimentales como,por ejemplo, después de una ligera y pro-longada irritación mediante azul trípano.Los macrófagos, sin embargo, según lasinvestigaciones de M. y W. von Mollen-dorff, deben ser considerados solamentecomo un estadio funcional especial de losfibrocitos, pudiendo extenderse y vol vera ser fibrocitos nuevamente. Mientras queestos últimos se encuentran unidos en tresí por sus expansiones protoplasmáticas,los macrófagos presentan movimientosamiboides y emigran hacia la periferia.En los films cinematográficos llaman laatención sobre todo por su membrana on-dulante. La figura de la página 97 re-presenta un macrófago que contiene gran

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Macrú fago de un cultivo de fibrocitos de conejo tratadocon azul trípano; al transplantarlo fueron agregados aeste c"ltiva eritrocitos de rana. La célula cO,ntiene eri-trocitos fagocitados en todas las fases de digestión.Según W. van Mollendorff, 1932.

número de eritrocitos fagocitados de ranaen dlstintos estadios de digestión, los cua-les habían sido agregados al cultivo alhacer la transplantación.

T ejido nervioso

Los primeros intentos de cultivar teji-do nervioso fueron realizados por R. G.Harrison (1907) (vé~se pág. 75). Sonlos primeros ensayos que se hicieron encultivos de tejidos. Experimentos poste-riores de M. T. Burrows y T. Ingebrigt-sen confirman que es posible obtener "invitre>" una neoformación de fibras ner-viosas. Al crecer, éstas se deslizan a lolargo del armazón de fibrina. Puede apre-ciarse por hora una progresión de 15 - 56 !-l(Ha rrison) y hasta 90!-l (Burrows). La

Fotografía Ctl vida de un cultivo de bazo de erizo, tresdías después de la explantación. Alrededor del frag-11I~nto matriz (arriba y a la derecha) se observa unborde espeso de células libres emigr~das. Preparado yfoto del Dr. W. Bargmann.

fibra nerVIOsa más larga observada "invitro" medía 631!-l (Harrison) y segúnBurrows 1-2 mm. El crecimiento óptimosé observa en los cilindros ejes de célulasde embriones jóvenes; 'las células post-embrionarias manifiestan una formaciónde fibras nerviosas bastante más lenta yproporcionalmente menos frecuente. Se,-gún Ingebrigtsen, la fibra nerviosa sepa-

, rada de la célula 'a que pertenece, dege-nera "in vitro" de la misma manera que"in vivo" (degeneración de W aller). G.Levi ha podido demostrar la presencia deneurofibrillas tanto en las fibras nervio- 1sas, como también en las células nerviosasen los cultivos. Al cultivo de tejido ner-vioso se debe importantes conocimientosacerca de la histología y de la histogé-nesis del sistema nervioso.

Célúlas esplénicas

De todos los órganos el bazo es segu-ramente el que se cultiva con más fre-cuencia (véase fig. de abajo). Ya en elaño 1910, Carrel y Burrows hicieron losprimeros cultivos de bazo. En un cultivode células esplénicas que han resistido va-rios pases, puede observarse fundamen-talmente los siguientes e importantes pro-cesos: La emigración de las células librescomienza inmediatamente y a ella sigueuna proliferación de las células reticularesdel estroma que están caracterizadas porsu forma fusiforme análoga a la de losfibrocitos. Después de 5-6 pases son lasque dominan el cuadro, mientras que enlos primeros pases se hallan en mayor pro-porción las células libres. Después de 8 pa-ses aproximadamente del primitivo tejidodel bazo se origina un cultivo típico deltejido conjuntivo, el cual puede seguirsiendo cultivado a voluntad. Entre lascélulas libres emigradas,se encuentran lin-focitos, granulocitos, monocitos y eritro-citos.

Además del tejido de bazo pueden cul-tivarse también "in vitro" los tejidos deotros órganos como, por ejemplo, del te-jido hepático (véase fig. pág. 100). La

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Médula ósea dI!' conejo en el cultivo, 68Yz horas des-pués de la explantación. Velo marginal formado por lascélulas libres !!'migradas. Aumooto mediano.

estructura arquitectónica del hígado (cre-cimiento organotípico) se pierde en elcultivo, pero en cambio pueden conser-varse muy bien ciertos caracteres citoló-gicos como, por ejemplo, la abundantepresencia de plastosomas.

Médula ósea y sangre

La. médula ósea fué cultivada por va-rios autores, entre otros A. Carrel y M.T. Burrows (1910), N. C. Foot (1912/13), A. Maximow (1916) y Rh. Erd-mann (1917). En el explantado se en-cuentran eritrocitos, granulocitos neutró-filos y eosinófilos, mie1ocitos, linfocitospequeños y grandes, así como células detejido conjuntivo y adiposas.

Los eritrocitos y los eritroblastos de-generan my pronto, así como también,

EPiteolio pancreático explantado dI!' un feto de conejo,fotografiado en vida y sin teñir. Preparado y foto delDr. W. Bargmann.

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Parte del preparado reproducido a la izquierda, aulltenta-do. Aquí se ven mie/ocitos, granulocitos y lill[oeitos.Preparado del Dr. G. Tondury. Fotos del Dr. O. BI,cher.

más tarde, los granulocitos. Los mielo-citos pueden dividirse por mitosis (A.Maximow) y actuar como fagocitos. Rh.Erdmann no observó crecimiento ulte-rior de los pequeños linfocitos que, se-gún Foot, pueden transformarse en gran-des linfocitos mononucleares, mielocitosy granulocitos. Según un nuevo trabajoacerca del cultivo de médula ósea de co-nejos (H. Rasmussen 1933). los mie-loblastos se conservan largo tiempo enel cultivo, reproduciéndose y pudiendollegar a transformarse en células mieloi-cas adultas. Los mieloblastos neoformadosproceden quizá de la reproducción de cé-lulas reticulares indiferentes de la médulaósea.

En el cultivo ulterior aparecen nuevascélulas basófilas con núcleo vesicular y alcabo de 14 días sólo se encuentran célu-

Cultivo de epitelio tiroideo. Desarrollo en forma demembrana, a la derecha debajo el frag1nl!'1lto matriz.Prep. Prof. W. v. Mollendorff. Foto: Dr. O. nucher.

Membrana epitelial en un cultivo de la sustancia medular renal de un feto de conejo. Trama epitelial t/pica,tupida, con células apretadas. Observación a gran aumellto. Preparado y foto del Dr. W. Bargmann.

las e'migrantes mesenquimatosas, célulasfijas de tejido conjuntivo y células adi-posas modificadas análogas a los fibroci-tos. En los ensayos de Maximow se obser-vó también que la mayoría de las célulasgranuladas sucumben al cabo de 5 díasaproximadamente, sin haber manifestadodiferenciación alguna; no obstante, di-cho autor pudo constatar la presencia detodos los grados de transición desde lospequeños linfocitos hasta las células fago-citarias que denominó poliblastos.

Los ensayos hechos para cultivar "invitro" la médula ósea; así como las célu-las sanguíneas, tienen extraordinaria im-portancia para la Hematología, pues con-tribuyen a la solución de uno de los másdiscutidos problemas de la Medicina, asaber: la histogénesis de las células san-guíneas. Como es sabido, en este proble-ma se enfrentan dos tendencias: La l1a-mada unitaria y la dualista.

Según la noción unitaria, defendidatanto por anatómicos (Maximow, von

Méil1endorff, Weidenreich y otros) comopor clínicos (Pappenheim, Grawitz, Fe-rrata, etc.), todas las células s~nguíneasse derivan de una célula primordial me-senquimatosa y omnipotente (hemocito-blasto). Por el contrario, la doctrina dua-lista (Ehrlich, Naegeli, Schridde, etc.)acepta para la hematogénesis post-embrio-naria dos células originarias con dos dis-tintas potencias de desarrol1o; según el1a,de los mioblastos de la serie mieloica, cu-yos eslabones finales .son los eritrocitos ylos diversos granulocitos granulados, asícomo de los linfoblastos, se. forman loslinfocitos. Otra opinión, que ha encon-trado pocos partidarios, es la doctrina tria-lista (Schilling y otros), según la cual losmonocitos se derivan no del tejido mie-loico, sino del retículo endoteliaI.

Durante meses enteros Carrel y A. H.Ebeling cultivaron leucocitos de pol1o enplasma y extracto embrionario, observan-do algunas veces una transformación enformas análogas a los fibrocitos; resulta-

Cultivo de epitelio hepático explantado de un embriónde pollo de 8 dias. Crecimiento en forma de membrana;plastosomas c/ara11letlte visibles. Según G. Levi. 1934.

dos parecidos fueron obtenidos tambiénpor A. Fischer. A. D. Timofejewsky encolaboración con P. Aworow (1914) YS. W. Benewolenskaja (192 5, 1927) cul-tivó sangre leucémica y sangre normal.Estos autores no solamente constataronuna transformación de los mieloblastos deNaegeli (hemocitoblastos de Ferrata) enpoliblastos, fibroblastos y células gigan-tes, sino también en diversos granulo-citos granulados; también se comprobóla formación de cierto número de eritro-blastos. Esto indica que existen ciertascélulas sanguíneas movibles que puedendiferenciarse de modo distinto aJ corres-pondiente a la especie celular en cuestión.

En los cultivos' de tejido linfoide enplasma, los linfocitos emigran rápidamen-te·, se hacen algo alargados, pudiendo pre-sentar durante algún tiempo procesos mi-tósicos, pero no experimentan diferen-

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ciaclOn ulterior, sino qJ.le sucumben enbreve plazo. Ahora bien, si el medio decultivo contiene todavía extracto de mé-dula ósea, los pequeños linfocitos cer-canos al explantado y aún los que seencuentran en éste, muestran diversosprocesos de diferenciación (Ma"ximow);en' parte se transforman en células delplasma y en parte en grandes linfocitosque se dividen por mitosis y que pueden'volver a diferenciarse en distintas formas'incluso hasta en mielocitos típicos. De lascélulas reticulares embrionarias puedentambién originarse linfocitos o hemocito-biastos y transformarse aún ulteriormenteen mielocitos. Las observaciones de Ma-ximow acerca de la diferenciación de mie-locitos a partir de los linfocitos son con-firmadas por algunos autores como, porejemplo, por Rh. Erdmann, mientras queson rechazadas por otros (Lewis) sobretodo porque en gran parte se encuentranen cortes fijados y teñidos del cultivo ypor ello no se han demostrado, pues, todoslos procesos en las células vivas. •

El problema de la génesis de las célulassanguíneas no se halla aclarado hasta eldía. A pesar de las objeciones de diversosinvestigadores, como M. R. Lewis y W. H.Lewis, hay que confesar que los estudiosde Maximow y otros (como, p. ej., Foot)hablan en favor de la doctrina sanguí neaunitaria. Así, pues, habría que aceptarcomo primitiva célula común, de la cualse derivarían todas las células sanguíneas,una célula libre "linfoide", el hemocito-blasto, que junto a sus potencias hema-topoyéticas presenta también otras hj~tocitarias y fibroblásticas. Los métodos clá-sicos de la histología normal no puedenaportar la solución de estos problemas,pero no parece descartado que se lleguea establecer más este tema con la ayudaexperimental del cultivo de tejidos.

Células epiteliales

El cultivo de células epiteliales trope-zaba al principio con considerables difi-cultades. En el año 1922, A. Fischer con-

sigUlo por primera vez obtener cultivospuros de células epiteliales del iris de polloembrionario. En los epitelios, las propie-dades citológicas son menos característi-cas que la disposición celular. No obstan-te, las células epiteliales de ciertos órga-nos embrionarios pueden conservar suscaracteres específicos; así, por ejemplo,las células hepáticas, su forma poliédricay la acumulación típica de plastosomas(véase fig. pág. 100); las células epite-liales del iris siguen formando su pigmen-to aún después de s"r cultivadas largotiempo "in vitro" y A. Fischer llegó in-cluso a comprobar la queratinización des-pués de un cultivo de varios años cuandola intensidad de crecimiento del cultivo sehabía rebajado, por ejemplo, por falta desustancias nutritivas o de oxígeno; noobstante, en las células epiteliales cultiva-das no llega a desarrollarse una determi-nada arquitectura orgánica. Un carácter

Culth'" mixto de tejido. epitelial y conjulltivo, I!'II elCltal sr aprecia claramente las diversas clases de creci-miento, Según A. Fischer. 1930.

típico del tejido epitelial es el crecimien-to en formaciones uvulares sólidas o enmembranas. Las células se encuentranapretadas unas junto a otras como laspiedras de un adoquinado y si al parecerse hallan separadas por una pequeña grie-ta comunican entre' sí, como lo ha de-mostrado una detenida observación, me-'diante finos puentes protoplasmáticos.También se observan mitosis, las cuales,fundamentalmente no se diferencian delas de los fibrocitos. La consistencia delmedio del cultivo influye extraordinaria-mente sobre la morfología de las célulasepiteliales. Además, en los cultivos purosde células epiteliales hay que cuidar sobretodo de que el cultivo no se impurifiquepor fibrocitos que pudieran aparecer enel extracto, pues los fibrocitos creceríanexuberantemente a expensas de las célu-las epiteliales. La capacidad de resistencia

, de las células epiteliales no es tan grandecomo la de los fibrocitos; el epitelio crecesiempre allí donde encuentra la menorresistencia. "In vitro" no tiene lugar unadiferenciación final de las células epite-liales.

Tejido tiroideo

A. Carrel y M. T. Burrows empren-dieron en 1910 los primeros cultivos detejido ti;oideo. A. H. Ebeling, F. Demuthy otros cultivaron durante largo tiempopreparados puros de epitelio de la glándulatiroides. Durante el cultivo se pierde laarquitectura característica del órga'no, elfolículo y las células-epiteliales crecen enforma de tubos atípicos o membranas(véase fig. pág. 98). La formación co-loidea parece ser que no se ha demostrado"in vitro':. Si a un cultivo de fibrocitosse agregan fragmentos de un cultivo deepitelio tiroideo (A. H. Ebeling), el cre-cimiento de los fibrocitos es al pareceractivado de la misma manera que si seagregaran extractos de tiroides. Los epite-lios tiroideos parecen conservar, pues, suspropiedades fisiológicas en el cultivo.

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El cultivo de tejidos como método bacteriológico Por el Dr. O. Bucher

El cultivo de tejidos permite estudiaren el microscopio las relaciones redpro-cas entre bacterias y células vivas bajodeterminadas condiciones naturales y ex-perimentales. Mayor importancia tienetodavía el hecho de que con ayuda delcultivo de tejidos se ensaya con éxitocultivar aquellos agentes patógenos, cuyocultivo con los métodos bacteriológicoscorrientes no había sido logrado. En lainvestigación de los virus los métodos decultivo de tejidos han permitido posibi-lidades de estudio completamente nuevas.

Bacilos tuberculosos

Las investigaciones con bacilos tuber-culosos en cultivos de tejidos han sidorealizadas con gran frecuencia y desdediversos puntos de vista. A continuaciónesbozaremos aquí sólo algunas de ellasque se relacionan con el problema de lahistogénesis del tubérculo.

Para poder estudiar las diversas fasesdel proceso tuberculoso "in vitro", A.Maximow cultivó nódulos linfáticos me-sentéricos, epiplón y tejido conjuntivolaxo de conejos adultos; a estos cultivosse agregó bacilos tuberculosos humanos.(Recordaremos aquí que las células de lostejidos de conejo son mucho menos sen-sibles que las células humanas a los ba-cilos tuberculosos del tipo humano). Enlos ensayos de esta clase se ha demostradoque los bacilos tuberculosos se desarrollanbien en estos medios de cultivo. Las cé-lulas del retículo de los explantados sereproducen y aumentan de volumen engran escala bajo la influencia de los ba-cilos tuberculosos; en ellas se adviertengrandes cantidades de bacilos fagocita-dos que progresivamente degeneran en elplasma celular. A veces, las células re-ticulares, después de haber tomado tran-sitoriamente el.carácter de poliblastos ami-boideos, se transforman en células epite-loideas típicas. Mediante acumulación detales células pueden 'originarse en los cul-

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Cultillo de leucocitos con bacilos tuberC1t1o'os. SegúnTimofejewsky y Benewolenskaja. 1926.

tivos formaciones análogas al tubérculo,y por fusión de ellas se forman célulasgigantes. A. Maximow, mediante estosensayos acerca del papel de los leucocitosde la sangre en la formación del tubércu-lo, observó que también pueden origi-narse .células epiteloides a partir de loslinfocitos y monocitos. Análoga opiniónsustentan también M. Lewis y W. Lewis;estos autores describen la transición de lascélulas sanguíneas mononucleares en ma-crófagos, células epiteloides y cél Lilas gi-gantes, así, pues, estas tres clases no seríanotra cosa que diversos estadios de evolu-ción de la misma especie celular. TambiénA. D. Timofejewsky y S. W. Benewolens-kaja apoyan la teoría del origen hema-tógeno de las células epiteloides; cuandoagregaban bacilos tuberculosos a cultivosde leucocitos, observaban la aparición deformaciones tuberculoideas que se des-arrollan de los leucocitos no granulados.Las células granuladas sucumben, mien-

tras que las no granuladas, que son másresistentes, destruyen los bacilos en elcultivo. De aquí puede deducirse quetambién desempeñan un importante pa-pel en la lucha del macro-organismo con-tr:l la infección tuberculosa.

Acerca de la génesis de las células gi-gantes de Langhans se ha entablado unaviva discusión, sin que se haya llegado aun acuerdo hasta el día. Según las ob-servaciones hechas en cultivos, las célulasgigantes de Langhans se originan proba-blemente por fusión de las células mono-nucleares o de las células epiteloides queproceden de aquellas. Las mitosis y lasegmentación celular consiguiente parecendesempeñar aquí un papel muy secun-dario.

Si bien la histogénesis del tubérculo nose ha llegado a esclarecer todavía del todo,el cultivo de tejidos nos ha aproximadomucho a la solución del problema.

ItI vestigación de virus

Gracias a las investigaciones de Iwa-llowsky (1892) sobre el agente patógenode la enfermedad de mosaico del taba-co y a los trabajos de L6ffler y Frosch(1898) sobre la glosopeda, se conoce des-de hace 45 años una clase especial deagentes patógenos invisibles y filtrabIesque son denominados virus (véase ActasCiba, NQ 1,1936, pág. 34). Posterior-mente, la investigación de los virus hahecho enormes progresos. Así, por ejem-plo, se ha llevado a cabo investigacionesacerca de las dimensiones de diversas es-pecies de virus, sus propiedades físico-químicas, la naturaleza de las llamadasinclusiones celulares y la posibilidad defotografiar los virus con la luz ultravio-leta o recientemente con ayuda del mi-croscopio de electrones, etc. Uno de losmás grandes adelantos en la investigaciónde los virus es el perfeccionamiento demétodos para cultivarlos ilimitadamenteen cultivos puros. Durante tres deceniosaproximadamente todos los ensayos de es-ta clase fracasaron, pero después pudodemostrar la investigación celular expe-

Virus de vacunavariolosa deun preparadoexaminado con elmicroscopio deelectrones.Aparece algoborrosa aconsecuencia dehaber sidotratado el viruscon glicerina.Aumento 10.200diámetros. SegúnB. von Borris,E. Ruska yH. Ruska, 1938.

rimental que las especies' de virus cono-cidos hasta la fecha solamente podían sercultivadas en presencia de células vivas,pero no en los medios nutritivos muertosusados corrientemente en Bacteriología.Esto viene a ser confirmado por el hechode que los agentes productores de las en-fermedades por virus pueden seguir. sien-do cultivados en pases en animales y quela mayoría de los virus presenta una de-terminada afinidad para ciertos órganos otejidos (cerebro, médula, córnea, piel,etc.). En los medios desprovistos de célu-las, los virus no se reproducen, así comotampoco en aquellos que contienen frag-mentos muertos de tejido. Entre el vi-rus y la célula existen íntimas relacionesque también se manifiestan morfológica-mente en los diversos productos de reac-·ción (corpúsculos de Guarneri, etc.).

C. Levaditi fué el primero que utilizóel cultivo de tejidos para la investigaciónde los virus. Ya en 1913 comunicó susensayos de cultivo del virus de la polio-mielitis con ganglios espinales de monos,que padecían esta enfermedad. El viruspudo ser cultivado mediante varios pasesen tejidos, conservando sus propiedadespatológicas; verdad es que con ello toda-vía no se había logrado un cultivo en elverdadero sentido de la palabra. Casi almismo tiempo que Levaditi, E. Steinhardt,C. Israeli y R. A. Lambert (1913-14)publicaron mancomunadamente sus ensa-yos de cultivo del virus de vacuna va-riolosa juntamente con fragmentos de te-jido corneaI. Estos ensayos fueron repe-

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tidos por diversos autores. En 1925 F.Parker y R. N. Nye lograron el cultivopuro del virus de vacuna variolosa enexplantados de testículo que eran trans-plantados cada 5-7 días. En este ensayo,que duró 13 2 días, al 11Q pase se pu-do comprobar ya una cantidad de virus51.000 veces mayor de la que existía enel material de partida. Ahora bien, lascantidades de virus que se obtienen conel cultivo en cubre-objeto, son demasiadoreducidas para su aprovechamiento prác-tico. No obstante, mediante los trabajosde A. Carrel y-T. M. Ri:vers entre otros,

-ha llegado a ser posible obtener virus devacuna con ayuda de un método modi-ficado en cantidades tales que bastaronpara la vacunación. En -este método seutilizaron cultivos de tejidos de embrio-nes de pollo en frascos de Carrel; poste-riormente ha sido todavía más simplifi-cado -y perfeccionado. Por lo demás, losvirus pueden asimismo bien cultivarse nosólo "in vitro", sino también "in ovo"sobre la corioalantoides del huevo de ga-llina fecundado.. .

En 1931, R. M. Rivers emprendió conéxito el ensayo de vacunar tres niños convacuna de virus varioloso obtenido "invitro", después de haber vacunado previa-mente con éxito conejos y monos. Des-pués de ello no podía existir, pues, dudaalguna de que con los cultivos puros de

-virus de vacuna variolosa se podía obtenerun material absolutamente exento de bac-terias y apto para vacunas preventivas.El uso general de tales cultivos de virusde vacuna para las vacunaciones antiva-riolosas preventivas en el hombre, todavíano se ha introducido del todo, pues lospases en conejos necesarios para obtenerun material de cultivo exento de bacte-rias (linfa variolosa de terneras), parecenproducir en las citadas especies, según ob-servaciones de diversos autores, una ten-dencia a hemorragias, necrosis, etc. des-pués de la vacunación. _

Entre las especies de virus más impor-tantes cultivados hasta hoy día se encuen-tran la viruela, glosopeda, poliomielitis,

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Microscopio de electrones (supermkroscopio) SiemellS.

encefalitis y herpes. La magnitud del vi-rus de vacuna es aproximadamente de0,15 I-A. Y la del virus de la poliomielitis0,011-A..

Los virus no solamente pueden culti-varse, sino también fotografiarse con elmicroscopio de electrones, lo cual repre-senta otro progreso en la investigación delos virus que hoy día constituye uno delos ramos de investigación más impor-tantes de la Medicina.

Fenómenos inmuno-biológicos

Carrel, cuyo nombre siempre hay quecitar al tratar estas cuestiones, e Inge-brigtsen demostraron ya en el año 1912,que las células de los tejidos poseen tam-bién "in vitro" la facultad de produciranticuerpos bajo la acción de antígenos.En sus ensayos cultivaron médula óseay ganglios linfáticos de conejillos de In-dias en plasma de este mismo animal.Como antígeno se agregó sangre de cabray después de ello fueron colocados loscultivos durante 5 días en la estuh. Acontinuación, el extracto de los cultivos,juntamente con una suspensión de eritro-citos de cabra, fué examinado en cuanto

a sus propiedades hemolíticas. El extractode los cultivos tratados previamente consangre de cabra hemolizaba los glóbulosrojos sanguíneos, propiedad que no pre-sentaba el extracto de los cultivos testi-gos. El extracto hemolizante perdía suspropiedades hemolíticas cuando se calen-taba durante 3O minutos a 56°C.

Además de la producción de hemoli-sinas, pudo también demostrarse en loscultivos de tejidos por experimentos apro-piados la producción de aglutininas (enel tejido esplénico agregando bacilos tí-ficos) , precipitinas, bacteriolosinas y anti-toxinas. Tampoco puede descartarse laposibilidad de que se llegue a analizar laanafilaxia con ayuda del método de cul-tivo de tejidos, si bien hasta la fecha sehan hecho muy pocos ensayos en esteterreno. Lo mismo puede decirse de lascitotoxinas, acerca de 10 cual ya en el año1911 realizaron trabajos R. A. Lamberty F. M. Hanes.

C. Levaditi y S. Mutermilch estudiaron. la acción de la toxina y de la antitoxinadiftéricas ~obre fragmentos de tejido "invitro". Para ello se introdujo un frag-mento de corazón en antitoxina diftéricadurante 5-60 minutos, después de 10 cualfué lavado y por último se agregó toxinadiftérica. Con ello se puso de manifiestoque Jos cultivos previamente tratados deeste modo presentan una marcada resis-tencia contra la acción de la toxina; éstaes neutralizada por la antitoxina fijadaa las células, a las cuales confiere ciertainmllnidad pasiva. También "in vitro"tiene lugar una fijación análoga de la an-

titoxina a las células como demostró otroexperimento: Pocos días después de inyec-tar intramuscularmente 1 cm: de sueroantidiftérico, se extrajo el corazón delanimal y se cortó en pequeños fragmen-tos; después de lavados en solución de~inger fueron sometidos a la acción de latoxina diftérica y por último puestos acultivar en plasma. También estos tejidosresultaron ser resistentes a la toxina.

Actualmente predomina la creencia deque la inmunidad de los virus es esen-cialmente de naturaleza humoral; conello, sin embargo, no se dice nada acercadel origen de los cuerpos inmunizantes.Si en el macro-organismo circulan los an-ticuerpos, los virus libres que se introdu-cen en él serán neutralizados; ahora bien,si éstos han penetrado ya en las células,podrán reproducirse en ellas sin ser ata-cados por los anticuerpos. Esto concuer-da con las experiencias prácticas de laSeroterapia, por ejemplo en la parálisisespinal infantil. Mientras que la aplica-ción temprana de suero poliomielítico dereconvalecientes antes de que fuera de-masiado elevado el número de agentes quehabían atacado las células, dió resultadosmuy satisfactorios, la enfermedad. no su-fría ya influencia sensible por los anti-cuerpos en un estadio más tardío, en elcual los virus se han fijado ya a las cé-lulas y se han presentado las parálisis. Lomismo que en la investigación de la po-liomielitis, el cultivo de tejidos ha con-tribuído también a resultados de granimportancia práctica en·otros problemasde los virus.

El q~J9f actúa. comoanü!oJaco Vanúcatarra!

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El cultivo de células neoplásicas Por el Dr. O. Bucher

De todos los problemas en que se em-plea el cultivo de tejidos como métodode investigación, el más importante es elde las neoplasias. A pesar de que el cul-tivo de células neoplásicas presentaba di-ficultades técnicas mucho mayores que elde los tejidos normales, Carrel y Burrowslograron ya en el año 1910 (es decir,cuando se inició el cultivo de tejidos) cul-tivar diversos tejidos malignos, entre ellosun carcinoma humano de la mama y unsarcoma del peroné. Las células del carci-noma y del sarcoma son poco exigentesen cuanto a las condiciones de vida, comotambién más resistentes que' los tejidosnormales a las manipulaciones técnicas.No obstante, su cultivo tropieza con ladificultad de que fluidifican el medioplasmático; después de perder el armazónnecesario para su vida (véase pág. 81)se redondean y perecen. Evitar esta flui-dificación del medio, cuyo grado depen-de tanto de la especie del plasma comotambién de la naturaleza de las célulasneoplásicas, fué desde un principio el pro-blema principal del cultivo de célulasneoplásicas. No nos ocuparemos aquí dela técnica de dicho cultivo, la cual hasido especialmente perfeccionada por A.Carrel, A. Fischer y Rhoda Erdmann.

Algunas horas después de la explan-tación, se observa en todos los tejidoscarcinomatosas y sarcomatosos, sean dehombre o de ammal, una emigración decélulas amiboideas del explantado. A con-secuencia de ello, el tejido explantado desarcoma, por ejemplo, ofrece en las pri-meras horas la apariencia de tejido delbazo. Todas las células neoplásicas mallg-nas poseen facultades fagocitarias. El cre-cimiento en los cultivos de carcinomastiene lugar por lo general en formacionescerradas epiteliales (membranas o úvu-las), y en los cultivos de sarcoma acos-tumbra a ser más difuso adoptando aveces la forma de una red de célulasfusiformes o asteriformes.

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Al contrario de lo que ocurre en lostejidos normales, las investigaciones deA. Fischer demuestran que de una solacélula neoplásica maligna puede de$arro-lIarse todo un cultivo. Este hecho, su po-niendo que se confirme, tendría funda-mental importancia para la aparición demetástasis "in vivo". Si se corta un pe-queño fragmento de un cultivo de fibro-citos con un bisturí que haya estado encontacto anteriormente con un cultivo desarcoma, y se coloca dicho fragmento enun medio apropiado, las células sarcoma-tosas después de pocos pases, ahogan eldesarrollo de losfibrocitos y por últimose obtiene un nuevo cultivo de sarcoma.Las células sarcomatosas pueden inclusosintetizar su protoplasma a partir de te-jido muerto y de componentes del suero.Ad~más, lo mismo que las células carci-nomatosas, poseen propiedades fuertemen-te proteolíticas y glicolíticas. Estas cua-lidades no son, sin embargo, específicasde las células neoplásicas malignas, puesno se encuentran en todas las especies ypor otra parte pueden presentarse t:1m-bién en células normales; la diferenciaentre células normales y neoplásicas ma-lignas es probablemente más bien cuanti-tativa que cualitativa.

Lo mismo que en los tejidos normales,también tratándose de los tejidos tumo-rales fueron los mesenquimatosos los pri-meros que se cultivaron. Durante muchotiempo no fué posible obtener cultivosdurables de tejido carcinomatoso. En loscultivos, que sólo vivían corto tiempo,no se podían hacer más que observacionesmorfológicas. El tipo de crecimiento delas células del carcinoma, quizá prescin-diendo de una mayor independencia delas células aisladas, no se diferencia esen-cialmente del de las células epiteliales nor-males. Sin embargo, mientras que estasúltimas son ahogadas con seguridad en sudesarrollo por pocos fibrocitos que se en-cuentren, las células carcinomatosas bajo

CarcinOJ'lade rató"Hin vi/rn" ,fotograf ladoen vida. Eltejido t IImoralque ha ( reeidoa expema, delfragmentomatriz, IItuestraun tipo decrecimientoepitelial. SegúnA. Fi,eh,·r. 1930.

condiciones apropiadas, 10 hacen con todotejido normal. Si en un cultivo (por ejem-plo dc carcinoma del ratón de Ehrlich)se introducen trocitos de músculo de ra-tón, cuya vitalidad se ha destruído pre-viamente por congelación, se infiltranmuy intensamente de células malignas.A. Fischer ha utilizado esta propiedadde l~s células neoplásicas para evitar lafluidificación de los medios de cultivo.Las células carcinomatosas presentan por10 general un tama