Abbau von Polyethylenterephthalat mit PET-Hydrolasen aus Thermobifida fusca KW3 Von der Fakultät für Maschinenbau der Technischen Universität Chemnitz Genehmigte Dissertation zu Erlangung des akademischen Grades Doktor-Ingenieur Dr.-Ing. vorgelegt von Dipl.-Ing. Susan Billig geboren am 12.01.1978 in Marienberg eingereicht am 06.09.2011 Gutachter: Prof. Dr. Wolfgang Zimmermann Prof. Dr.-Ing. habil. Bernd Platzer Dr. Vincent A. Nierstrasz Chemnitz, den 06.09.2011
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Abbau von Polyethylenterephthalat mit PET …€¦ · II Bibliographische Beschreibung Autor Billig, Susan Thema Abbau von Polyethylenterephthalat mit PET-Hydrolasen aus Thermobifida
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Abbau von Polyethylenterephthalat mit PET-Hydrolasen aus
Thermobifida fusca KW3
Von der Fakultät für Maschinenbau der Technischen Universität Chemnitz
Genehmigte
Dissertation
zu Erlangung des akademischen Grades
Doktor-Ingenieur
Dr.-Ing.
vorgelegt
von Dipl.-Ing. Susan Billig
geboren am 12.01.1978 in Marienberg
eingereicht am 06.09.2011
Gutachter:
Prof. Dr. Wolfgang Zimmermann
Prof. Dr.-Ing. habil. Bernd Platzer
Dr. Vincent A. Nierstrasz
Chemnitz, den 06.09.2011
II
Bibliographische Beschreibung
Autor Billig, Susan
Thema Abbau von Polyethylenterephthalat mit PET-Hydrolasen aus Thermobifida fusca KW3
Dissertation an der Fakultät für Maschinenbau der Technischen Universität Chemnitz, Institut für
Technische Thermodynamik, Chemnitz, 06.09.2011
Seitenzahl: 200, Anzahl der Abbildungen: 91, Anzahl der Tabellen: 37, Anzahl der Literaturzitate: 203
Referat
Der Actinomycet T. fusca KW3, isoliert aus Kompost, bildete während der Kultivierung im
Mineralsalz-Spurenelement-Vitamin-Minimalmedium nach Zusatz von PET-Fasern eine 52 kDa
Carboxylesterase (TfCa), welche effizient zyklische PET Trimere (CTR) hydrolysiert. Die TfCa besitzt
einen pI von 4,8, eine Substratspezifität gegenüber kurzkettigen p-Nitrophenyl-Estern und wird durch
Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) und Tosyl-L-Phenylalanin-Chloromethylketon (TPCK) in der
Aktivität gehemmt. Die Carboxylesterase hydrolysiert kein Cutin oder Poly-ε-caprolacton (PCL). CTR
hingegen wurden durch die TfCa mit einem Km von 0,5 mM und einer Vmax von 9,3 µmol/min/mg bei
optimalen Bedingungen (60°C, pH 6) hydrolysiert. Das aktive Zentrum der Carboxylesterase besteht
aus den Aminosäuren Ser185, Glu319 und His415, wobei das Serin in das katalytische Motiv G-E-S-A-
G eingebettet ist.
Während der Reaktion setzte die TfCa auch Hydrolyseprodukte aus PET-Fasern und -Filmen frei. Der
Nachweis der Hydrolyse erfolgte durch Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie
der Abbauprodukte und bei den PET-Filmen zusätzlich mittels Rasterelektronenmikroskopie. Dabei
zeigte die Carboxylesterase verglichen mit anderen PET-Hydrolasen eine geringere Effizienz, was
durch die Lage des aktiven Zentrums in einer Bindungstasche und der daraus folgenden schlechten
Zugänglichkeit für polymere Substrate begründet werden kann. Bei der Hydrolyse der viel kleineren
CTR war die TfCa deutlich effektiver, was auf eine höhere Spezifität gegenüber kurzkettigen PET
2.4.8 Bestimmung der Temperatur und pH-Wert Stabilität 72
2.4.9 Bestimmung der Stabilität gegenüber Inhibitoren 72
2.4.10 Bestimmung der kinetischen Konstanten für die Hydrolyse von p-NP Ester 72
2.4.11 Bestimmung der kinetische Konstanten für die Hydrolyse von CTR 73
2.4.12 Bestimmung optimaler Temperatur und pH-Wert für die Hydrolyse von CTR 73
2.4.13 N-terminale Sequenzierung 73
2.4.14 MALDI-TOF Sequenzierung 74
2.4.15 Abbaustudien 74
VII
2.4.16 Analytik der PET Abbauprodukte 75
2.4.17 Konzentrationabhängige CTR-Abbaustudien 75
2.5 Homologie-Modelling der TfCa und weitere PET-Hydrolasen 76
3 Ergebnisse und Diskussion 77
3.1 Screening nach PET-Hydrolasen aus T. fusca 77
3.1.1 Wachstum von T. fusca KW3 im Czapek-Medium 77
3.1.2 Wachstum von T. fusca KW3 im MSV-Medium 78
3.1.2.1 Esterasebildung mit verschiedenen synthetischen und natürlichen Polyestern 78
3.1.2.2 Esterasebildung mit einer Suberinpräparation 81
3.1.2.3 Esterasebildung mit PET-Fasern 83
3.1.3 Esterasebildung bei T. fusca KW3 DSM 6013, T. fusca DSM 43792 und DSM 43793 mit
PET-Fasern und Diethylterephthalat 85
3.2 Charakterisierung der PET-Hydrolasen aus T. fusca KW3 95
3.2.1 Aufreinigung 95
3.2.1.1 Aufreinigung der TfCa 95
3.2.1.2 Aufreinigung der rekombinanten PET-Hydrolasen 105
3.2.2 pI der TfCa 113
3.2.3 Molare Masse der TfCa 113
3.2.4 Temperatur- und pH-Stabilität der TfCa 114
3.2.5 Wirkung von Inhibitoren auf die TfCa 117
3.2.6 Kinetik der Hydrolyse von verschiedenen Esterasesubstraten durch die TfCa 118
3.2.7 Optimale Temperatur und optimaler pH-Wert der CTR-Hydrolyse durch die TfCa 119
3.2.8 Cutinaseaktivität der TfCa 120
3.2.9 PCL-Abbau durch die TfCa 121
3.2.10 N-terminale Sequenz der TfCa 122
3.2.11 MALDI-TOF Sequenzierung der TfCa 123
3.2.12 Homologie-Modeling der TfCa und Vergleich der Struktur mit anderen Hydrolasen 126
3.2.13 Vergleich der TfCa mit bekannten PET-Hydrolasen 128
3.3 Hydrolyse von PET Substraten durch prokaryotische und eukaryotische Hydrolasen 138
3.3.1 Partielle Hydrolyse von APET-Filmen durch die PET-Hydrolasen 140
3.3.2 Partielle Hydrolyse von PET-Fasern durch die PET-Hydrolasen 148
3.3.3 Hydrolyse von PET-Trimeren durch die PET-Hydrolasen 151
4 Zusammenfassung 165
VIII
5 Literaturverzeichnis 166
6 Publikationen 181
7 Poster und Vorträge 182
8 Lebenslauf 183
IX
Abbildungsverzeichnis Seite
Abbildung 1: Phylogenetischer Stammbaum des Lebens auf Grundlage der 16S rDNA Untersuchungen. Die Gruppe der Actinobakterien ist im linken oberen Bereich angeordnet (www.lisci.kitasato-u.ac.jp/me/images/phylogenetic.jpg). 1
Abbildung 2: T. fusca KW3 mit 1000facher Vergrößerung (links, Färbung mit Safranin) und Makroskopisches Aussehen nach Wachstum auf Czapek-Medium (rechts). 3
Abbildung 3: Schematische Darstellung der Einlagerung von Cutin in einem Blatt. Die Stärke, Struktur und Zusammen-setzung der einzelnen Schichten der Cuticula können stark variieren abhängig von Spezies, Organen und Entwicklungs-phase. Die epicuticulären Wachse (EW) bedecken die Cuticula (C) komplett, die aus Cutin und darin eingelagerten intracuticulären Wachsen besteht. Die cuticulären Schichten (CL) bestehen höchstwahrscheinlich aus Cutin und Polysacchariden der Zellwand, könnten aber vielleicht auch intracuticuläre Wachse enthalten. (PW: primäre Zellwand, Cy: Cytoplasma, V: Vakuole) (Pollard et al. 2008). 5
Abbildung 4: Schematische Darstellung der Einlagerung von Suberin in der Endodermis einer Wurzel. Abgebildet sind zwei angrenzende Zellen mit Mittellamelle (ML) und Pektinschicht zwischen ihren primären Zellwänden (PW). Die Suberinlamellen befinden (SL) sich auf der Innenseite der primären Zellwand. (SW: sekundäre Zellwand, PM: Plasmamembran, Cy: Cytoplasma, V: Vakuole) (Pollard et al. 2008). 6
Abbildung 5: Modell der möglichen Bindungsstrukturen im Biopolyester Cutin (Kolattukudy 2002). 7 Abbildung 6: Modell der hypotetischen Struktur der Suberinschicht der Kartoffel. P: phenolisches Monomer, C:
Kohlenhydrat, S: Suberin (aromatisch oder aliphatisch) (Bernards 2002). 9 Abbildung 7: Darstellung der möglichen Verbindungen der Monomere der Biopolyester Cutin und Suberin. a) Hauptsächlich
treten dabei primäre Esterbindungen auf (roter Pfeil), wodurch lange Ketten gebildet werden. Die sekundären Esterbindungen (blauer Pfeil) stellen zusätzliche Verzweigungspunkte dar. b) Anordnung der Fettsäure- und ω-Hydroxyfettsäure-Monomere unter Bildung eines Dendrimers. c) Anordnung der α,ω-Dicarbonsäure- (DCS) und Glycerin-Monomere unter Bildung einer Dendrimer Struktur, angeordnet um freie OH Gruppen um eine Bindung an einige Glycerin Monomere zu ermöglichen. d) Anordnung der DCS- und Glycerin-Monomere unter Bildung einer quervernetzten Domäne. (Pollard et al. 2008). 11
Abbildung 8: α/β Hydrolase-Faltungsmotiv der Hydrolasen ist eine „doubly wound α/β superfold“ bestehend aus 8 zentral parallel angeordneten β-Faltblättern (rot) und 6 umgebenden stabilisierenden α-Helices (blau). Im Speziellen kann die Anzahl der Elemente variieren, das allgemeine Gerüst ist aber hochkonserviert. Das aktive Zentrum bilden 3 Aminosäuren (grün), das Nucleophil befindet sich im hoch konservierten Bereich zwischen der αC-Helix und dem β5-Faltblatt, dem „nucleophilic elbow“ (Ollis et al. 1992). 13
Abbildung 9: Der katalytische Reaktionsmechanismus der Hydrolasen am Beispiel der Spaltung eines Esters in die dazugehörige Säure und Alkohol. Die Reaktion erfolgt ohne Verwendung eines Cofaktors und ist somit sehr einfach und effizient. Die Bildung des Acylenzyms ist ein schneller Reaktionsschritt, die Freisetzung der Säure und des Enzyms ist der geschwindigkeitsbestimmende Reaktionsschritt. (Holmquist 2000). 14
Abbildung 10: Übersicht über die katalysierten hydrolytischen Spaltungen der Enzymgruppen der Carboxylesterase, Triacylglycerol Hydrolasen und der Cutin Hydrolasen im wässrigen Milieu. 15
Abbildung 11: Reaktionskinetik der Carboxylesterasen (links) nach Michaelis-Menten und der sigmoide Kurvenverlauf der Reaktionskinetik der Lipasen (rechts) (Pütz 2006). 16
Abbildung 12: Struktur der offenen und geschlossenen Lipase von Burkholderia cepacia BcL. Die offene Kristallstruktur ist blau dargestellt und das geschlossene Homologie-Modell grün, die gelbe Kugel stellt ein Ca
2+-Ion dar. Die katalytische
Triade besteht aus Serin, Histidin und Asparaginsäure (Trodler et al. 2009). 20 Abbildung 13: Polykondensationsreaktion von Terephthalsäure und Ethylenglycol zu Polyethylenterephthalat. 23 Abbildung 14: Struktur eines zyklischen PET-Trimers. 24 Abbildung 15: Schematische Darstellung des Schmelzspinnverfahrens von PET-Fibrillen (links) und Darstellung einer
beheizten Schmelzspinndüse (Jahreiß 2005). 26 Abbildung 16: Anordnung der PET-Ketten vor (links) und nach (rechts) dem Verstrecken unter Ausbildung von geordneten
kristallinen Bereichen (Jahreiß 2005). 27 Abbildung 17: Darstellung der Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den durch Verstrecken entstandenen geordneten
PET-Ketten (grün). 27 Abbildung 18: Darstellung möglicher Faserquerschnitte und Oberflächen (links) und die PET-Fasern vor und nach dem
Texturieren (rechts) (Jahreiß 2005). 28 Abbildung 19: DSC-Kurve einer PET-Folie (http://web.utk.edu/~mse/Textiles/Polymer%20Crystallinity.htm). 29 Abbildung 20: Darstellung der chemischen Struktur der Polyethylenterephthalat Polymerkette, der zyklischen Trimere und
der enzymatisch freigesetzten Hydrolyseprodukte (Zimmermann und Billig 2011). 31 Abbildung 21: Darstellung der chemischen Struktur der Polytrimethylenterephthalat Polymerkette, der zyklischen Dimere
und der enzymatisch freigesetzten Hydrolyseprodukte (Zimmermann und Billig 2011). 32 Abbildung 22: Darstellung der chemischen Struktur der angewandten Polyethylenterephthalat Modellsubstrate
(Zimmermann und Billig 2011). 32 Abbildung 23: Kalibrierungskit für die pI Bestimmung, Breiter pI Bereich (pH 3-10, rechte Spur, GE Healthcare). 52 Abbildung 24: Elutionsprofil des Kalibrierungskit für die Größenausschlusschromatographie eluiert von einer XK 26/60
Säule, Superdex 200 prep grade, 320 ml SV, 50 mM Tris HCl pH7,2 150 mM NaCl, 2,5 ml/min, 280 nm und dazugehörige Kalibrierkurve (kleine Abbildung). 53
X
Abbildung 25: Wachstumskurve von T. fusca KW3 im Czapek-Medium bei 50°C und 150 rpm. 77 Abbildung 26: SDS-PAGE und Aktivitätsfärbung mit den Esterasen in den zellfreien Überständen des MSV-Mediums nach 10
tägiger Inkubation bei 50°C mit PET-Fasern (Spur 1), recyceltes PET-Granulat (Spur 2), einer PET-Oligomerpräparation (Spur 3), einer zyklischen PET-Oligomerpräparation (Spur 4), BHET (Spur 5), PBT-Fasern (Spur 6), einer Suberinpräparation (Spur 7) und einer Cutinpräparation (Spur 8). 79
Abbildung 27: Esteraseproduktion durch T. fusca KW3 mit recyceltem PET-Granulat, PET-Oligomerpräparation, zyklische PET-Oligomerpräparation, BHET, PBT und PET-Fasern über einen Zeitraum von 10 Tagen im MSV-Medium. 80
Abbildung 28: Bestimmung der Esteraseaktivitäten (◊) und der spezifischen Esteraseaktivitäten () während des Wachstums im MSV-Medium unter Zugabe von Suberin. 82
Abbildung 29: SDS-PAGE der zellfreien Überstände nach Inkubation mit Suberin im MSV-Medium, links Coomassie-gefärbtes Gel; rechts Gel mit Aktivitätsfärbung mit Fast Red. Spur 1, 7: Roti
®-Mark SDS Proteinstandard; Spur 2:
Nullwert; Spur 3, 8: zellfreier Überstand nach 2 Tagen Kultivierung; Spur 4: zellfreier Überstand nach 4 Tagen Kultivierung; Spur 5: zellfreier Überstand nach 7 Tagen Kultivierung; Spur 6: zellfreier Überstand nach 10 Tagen Kultivierung. 82
Abbildung 30: Biotrockenmasseproduktion () und Esteraseaktivität (◊) von T. fusca KW3 im MSV-Medium. 83 Abbildung 31: Graphische Darstellung der Esteraseaktivität (◊) und der spezifischen Esteraseaktivität () gebildet während
der 10-tägigen Kultivierung im MSV-Medium mit PET-Fasern. 84 Abbildung 32: SDS-PAGE der zellfreien Überstände nach Inkubation mit PET-Fasern im MSV-Medium, links Coomassie-
gefärbtes Gel; rechts Gel mit Aktivitätsfärbung mit Fast Red. Spur 1 und 7: Roti®-Mark SDS Proteinstandard; Spur 2:
Nullwert; Spur 3: zellfreier Überstand nach 2 Tagen Kultivierung; Spur 4: zellfreier Überstand nach 4 Tagen Kultivierung; Spur 5: zellfreier Überstand nach 8 Tagen Kultivierung; Spur 6, 8: zellfreier Überstand nach 10 Tagen Kultivierung. 84
Abbildung 33: SDS-PAGE der Rohenzymlösungen nach Kultivierung mit unbehandelten PET-Fasern bzw. DET im MSV-Medium, Gel gefärbt mit Coomassie- und mit Aktivitätsfärbung. Spur 1, 8: Low Molecular Weight Längenstandard; Spur 2: T. fusca DSM 43792 mit PET-Fasern kultiviert; Spur 3: T. fusca DSM 43792 mit DET kultiviert; Spur 4: T. fusca DSM 43793 mit PET-Fasern kultiviert; Spur 5: T. fusca DSM 43793 mit DET kultiviert; Spur 6: T. fusca KW3 DSM 6013 mit PET-Fasern kultiviert; Spur 7: T. fusca KW3 DSM 6013 mit DET kultiviert. 86
Abbildung 34: Esteraseproduktion durch T. fusca KW3 mit DET (◊) und PET-Fasern () über einen Zeitraum von 13 Tagen im MSV-Medium. 87
Abbildung 35: Elutionsprofil der Enzymlösung während des zweiten Aufreinigungsschritts (Phenylsepharose, Säulenvolumen 25 ml, Puffer A: 20 mM Phosphatpuffer pH 8, Puffer B: 30% Isopropanol in 20 mM Phosphatpuffer pH 8). Dargestellt sind das Proteinprofil (grau), die Esteraseaktivität (schwarz) und der Gradient der Elution (gestrichelt). 96
Abbildung 36: Elutionsprofil der Enzymlösung während des dritten Aufreinigungsschritts (DEAE-Sepharose, Säulenvolumen 54 ml, Puffer A: 20 mM Phosphatpuffer pH 8, Puffer B: 1 M NaCl in 20 mM Phosphatpuffer pH 8). Dargestellt sind das Proteinprofil (grau), die Esteraseaktivität (schwarz) und der Gradient der Elution (gestrichelt). 96
Abbildung 37: Elutionsprofil der Enzymlösung während des vierten Aufreinigungsschritts (Octyl-Sepharose, Säulenvolumen 1 ml, Puffer A: 20 mM Phosphatpuffer pH 8, Puffer B: 30% Isopropanol in 20 mM Phosphatpuffer pH 8). Dargestellt sind das Proteinprofil (grau), die Esteraseaktivität (schwarz) und der Gradient der Elution (gestrichelt). 97
Abbildung 38: Elutionsprofil der Enzymlösung während des fünften Aufreinigungsschritts (Sephadex 200, Säulenvolumen 110 ml, Puffer: 0,15 M NaCl in 20 mM Tris/HCl pH 8). Dargestellt sind das Proteinprofil (grau) und die Esteraseaktivität (schwarz). 97
Abbildung 39: SDS-PAGE der Aufreinigung der TfCa aus T. fusca KW3. Spur 1: Enzymlösung nach der Dialyse; Spur 2: Enzymlösung nach der HIC 1; Spur 3: Enzymlösung nach der AIEX; Spur 4: Enzymlösung nach der HIC 2; Spur 5: Enzymlösung nach der SEC; Spur 6: Low Molecular Weight Längenstandard (Billig et al. 2010). 98
Abbildung 40: Elutionsprofil der TfCa während des ersten Aufreinigungsschritts (HisTrap, Säulenvolumen 10 ml, Puffer A: 50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl; pH 8,0, Puffer B: 50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 250mM Imidazol, pH 8). Dargestellt sind das Proteinprofil (grau), die p-NPB Aktivität (schwarz) und der Gradient der Elution (gestrichelt). 106
Abbildung 41: Elutionsprofil der TfCa während des zweiten Aufreinigungsschritts (Sephadex 200 prep grade, Säulenvolumen 320 ml, Puffer: 0,15 M NaCl, 20 mM Phosphatpuffer pH 8). Dargestellt sind das Proteinprofil (grau), die p-NPB Aktivität (schwarz). 106
Abbildung 42: Elutionsprofil der TfCut2 während des ersten Aufreinigungsschritts (HisTrap, Säulenvolumen 10 ml, Puffer A: 50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl; pH 8,0, Puffer B: 50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 250 mM Imidazol, pH 8). Dargestellt sind das Proteinprofil (grau), die p-NPB Aktivität (schwarz) und der Gradient der Elution (gestrichelt). 107
Abbildung 43: Elutionsprofil der TfCut2 während des zweiten Aufreinigungsschritts (Sephadex 200 prep grade, Säulenvolumen 320 ml, Puffer: 0,15 M NaCl, 20 mM Phosphatpuffer pH 8). Dargestellt sind das Proteinprofil (grau), die p-NPB Aktivität (schwarz). 107
Abbildung 44: SDS-PAGE der Aufreinigung der rekombinant produzierten TfCa in E. coli (A) und der rekombinant produzierten TfCut2 in E. coli (B). Spur M: Low Molecular Weight Längenstandard; Spur 1, 4: Rohenzymlösung nach Zellaufschluss; Spur 2, 5: Enzymlösung nach Ni-Affinitätschromatographie; Spur 3, 6: Enzymlösung nach SEC. 108
Abbildung 45: PhastGel der Bestimmung des isoelektrischen Punktes der TfCa. (linkes Gel PhastGel IEF 3-9, rechtes Gel PhastGel IEF 4-6,5) Spur 1: 26,7 ng TfCa; Spur 2: 66,7 ng TfCa; Spur 3: 133 ng TfCa; Spur 4: 26,7 ng TfCa; Spur 5: 53,4 ng TfCa; Spur 6: Kalibrierungskit für die pI Bestimmung, Breiter pI Bereich (pH 3-10, GE Healthcare). 113
Abbildung 46: Laufstrecken der Proteine des Roti®-Mark SDS Proteinstandards (Fa. Carl Roth GmbH) aufgetragen gegen den
Logarithmus ihres Molekulargewichtes. 114
XI
Abbildung 47: Esteraseaktivitäten der TfCa über einen Zeitraum von 7 Tagen bei Inkubation in unterschiedlichen pH-Werten von 4 bis 11 bestimmt mit p-NPB als Substrat. 115
Abbildung 48: Esteraseaktivitäten der TfCa nach 24 Stunden Inkubation in verschiedenen pH-Werten von 3 bis 11 bestimmt mit p-NPB als Substrat. 115
Abbildung 49: Esteraseaktivitäten der TfCa über einen Zeitraum von 7 Tagen bei Inkubation bei 40°C, 50°C und 55°C bestimmt mit p-NPB als Substrat (Billig et al. 2010). 116
Abbildung 50: Esteraseaktivitäten der TfCa nach 24 Stunden Inkubation bei 30°C, 40°C, 50°C und 55°C bestimmt mit p-NPB als Substrat. 116
Abbildung 51: Lineweaver-Burk Darstellung für die enzymkatalysierte Hydrolyse der CTR durch die TfCa. Mit Hilfe der doppeltreziproken graphischen Darstellung konnten die Geschwindigkeitskonstanten Vmax und Km bestimmt werden. 119
Abbildung 52: pH und Temperaturoptimum der TfCa beim Abbau von zyklischen PET-Trimeren, bestimmt per RP HPLC (Billig et al. 2010). 119
Abbildung 53: Gaschromatographische Analyse des Blindwerts (ohne Enzym) der Cutinhydrolyse. 120 Abbildung 54: Gaschromatographische Analyse des Ansatzes mit 1 U TfCa der Cutinhydrolyse. 120 Abbildung 55: Gaschromatographische Analyse des Ansatzes mit 2 U TfCa der Cutinhydrolyse. 121 Abbildung 56: Gaschromatographische Analyse des Ansatzes mit 4 U TfCa der Cutinhydrolyse. 121 Abbildung 57: PCL-Agarplatten nach 24 stündiger Inkubation mit TfCa (linkes Photo), mit dem Kulturüberstand des Suberin-
MSV-Mediums (mittleres Photo) und mit Kulturüberstand des Cutin-MSV-Mediums (rechtes Photo). 122 Abbildung 58: Lokalisation des Tfu_2427 Gens im Genom von T. fusca YX (Quelle: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). 122 Abbildung 59: Proteinsequenz von Tfu_2427 aus T. fusca YX, die Aminosäuren des aktiven Zentrums und das GXSXG Motiv
sind gelb markiert. Die ersten 10 Aminosäuren am N-Terminus, anhand derer die Identifikation erfolgte, sind unterstrichen (Billig et al. 2010). 123
Abbildung 60: Proteinsequenz der TfCa aus T. fusca KW3, die Aminosäuren des aktiven Zentrums und das GXSXG Motiv sind gelb markiert, die identifizierten Unterschiede zu Tfu_2427 aus T. fusca YX sind rot markiert (Billig et al. 2010). 124
Abbildung 61: Alignment der Carboxylesterase TfCa aus T. fusca KW3 (tfu), der Carboxylesterase Arth_3983 aus Arthrobacter FB24 (art), der Carboxylesterase SCO6127 aus Streptomyces coelicolor (sco), der putativen Carboxylesterase FRAAL0556 aus Frankia alni (fal) und der putativen p-Nitrobenzylesterase SACE_2933 aus Saccharopolyspora erythraea (sen) (Billig et al. 2010). 125
Abbildung 62: Tertiärstruktur der Carboxylesterase TfCa aus T. fusca KW3. Rot sind die α-Helices gekennzeichnet und gelb die β-Faltblattstrukturen. Die grünen Bereiche sind Sequenzen ohne eine spezielle Sekundärstruktur. Die drei blau gekennzeichneten Aminosäuren sind die katalytische Triade (Billig et al. 2010). 126
Abbildung 63: Ausschnitt aus der Tertiärstruktur der Carboxylesterase TfCa aus T. fusca KW3. Rot sind die α-Helices gekennzeichnet und gelb die β-Faltblattstrukturen. Die grünen Bereiche sind Sequenzen ohne eine spezielle Sekundärstruktur. Die drei blau gekennzeichneten Aminosäuren sind die katalytische Triade. 126
Abbildung 64: Homologie-Modelle der Carboxylesterase TfCa aus T. fusca KW3 (a) verglichen mit verschiedenen PET-Cutinasen. Die Strukturen der Cutinasen aus H. insolens (b), F. solani sp. pisi (c), der Cutinasen Tfu_0882 (d) und Tfu_0883 (e) aus T. fusca KW3 und der Cutinase aus P. mendocina (f) sind dargestellt (Billig et al. 2010). 127
Abbildung 65: SDS-PAGE der für die Abbauuntersuchungen eingesetzten Hydrolasen, linkes Gel mit Aktivitätsfärbung, rechtes Gel Aktivitäts- und Coomassie-Färbung. Spur 1: Carboxylesterase TfCa aus T. fusca KW3; Spur 2: rekombinante Cutinase 1 von T. fusca WSH03-11 (Chen et al. 2010, Chen J et al. 2008); Spur 3: rekombinante Cutinase 2 von T. fusca WSH03-11 (Chen et al. 2010, Chen J et al. 2008); Spur 4: rekombinante Cutinase von F. solani pisi (Chen et al. 2010); Spur 5: Cutinase aus Fusarium solani sp. pisi (Vertommen et al. 2005); Spur 6: Cutinase von Novozymes. Zum Vergleich die Kulturüberstände verschiedener MSV-Medien, Spur 7: Cutin-induzierte Hydrolase aus T. fusca KW3; Spur 8: Suberin-induzierte Hydrolase aus T. fusca KW3; St
1: Spectra™ Multicolor Broad Range Protein Ladder (Fermentas); St
2:
PageRulerTM
Plus Prestained Protein Ladder (Fermentas). 138 Abbildung 66: PCL Abbautest der für die Abbauuntersuchungen eingesetzten Hydrolasen (obere Reihe: Carboxylesterase
TfCa aus T. fusca KW3 (links), rekombinante Cutinase 1 von T. fusca WSH03-11 (Mitte, Chen et al. 2010, Chen J et al. 2008), rekombinante Cutinase 2 von T. fusca WSH03-11 (rechts, Chen et al. 2010, Chen J et al. 2008); mittlere Reihe: rekombinante Cutinase von F. solani pisi (links, Chen et al 2010), Cutinase aus F. solani sp. pisi (Mitte, Vertommen et al. 2005), Cutinase von Novozymes (rechts); untere Reihe : rekombinant produzierten Hydrolasen aus T. fusca KW3: Carboxylesterase TfCa (links), Cutinase TfCut1 (Mitte), Cutinase TfCut2 (rechts). 139
Abbildung 67: Detektierte Hydrolyseprodukte nach Inkubation des APET-Films mit TfCa aus T. fusca KW3. 140 Abbildung 68: Detektierte Hydrolyseprodukte nach Inkubation des APET-Films mit der Cutinase 2 aus T. fusca WSH03-11
von Chen et al. 2010 und Chen J et al. 2008. 140 Abbildung 69: Detektierte Hydrolyseprodukte nach Inkubation des APET-Films mit der Cutinase aus F. solani pisi von
Vertommen et al. 2005. 141 Abbildung 70: Detektierte Hydrolyseprodukte nach Inkubation des APET-Films mit der Cutinase aus F. solani pisi von Chen
et al. 2010. 141 Abbildung 71: Detektierte Hydrolyseprodukte nach Inkubation des APET-Films mit der Cutinasepräparation von
Abbildung 75: Detektierte Hydrolyseprodukte nach Inkubation der PET-Fasern mit TfCa aus T. fusca KW3. 148 Abbildung 76: Detektierte Hydrolyseprodukte nach Inkubation der PET-Fasern mit der Cutinase 2 aus T. fusca WSH03-11
von Chen et al. 2010, Chen J et al. 2008. 148 Abbildung 77: Detektierte Hydrolyseprodukte nach Inkubation der PET-Fasern mit der Cutinase aus F. solani pisi von
Vertommen et al. 2005. 149 Abbildung 78: Detektierte Hydrolyseprodukte nach Inkubation der PET-Fasern mit der Cutinase aus F. solani pisi von Chen
et al. 2010. 149 Abbildung 79: Detektierte Hydrolyseprodukte nach Inkubation der PET-Fasern mit der Cutinasepräparation von Novozymes.
150 Abbildung 80: Detektierte Hydrolyseprodukte nach Inkubation der zyklischen PET-Trimeren mit TfCa aus T. fusca KW3. 152 Abbildung 81: Detektierte Hydrolyseprodukte nach Inkubation der zyklischen PET-Trimeren mit der Cutinase 1 aus T. fusca
WSH03-11 von Chen et al. 2010, Chen J et al. 2008. 152 Abbildung 82: Detektierte Hydrolyseprodukte nach Inkubation der zyklischen PET-Trimeren mit der Cutinase 2 aus T. fusca
WSH03-11 von Chen et al. 2010, Chen J et al. 2008. 153 Abbildung 83: Detektierte Hydrolyseprodukte nach Inkubation der zyklischen PET-Trimeren mit rekombinanter TfCut1. 153 Abbildung 84: Detektierte Hydrolyseprodukte nach Inkubation der zyklischen PET-Trimeren mit rekombinanter TfCut2. 154 Abbildung 85: Detektierte Hydrolyseprodukte nach Inkubation der zyklischen PET-Trimeren mit der Cutinase aus
F. solani pisi von Vertommen et al. 2005. 154 Abbildung 86: Detektierte Hydrolyseprodukte nach Inkubation der zyklischen PET-Trimeren mit der Cutinase aus
F. solani pisi von Chen et al. 2010. 155 Abbildung 87: Detektierte Hydrolyseprodukte nach Inkubation der zyklischen PET-Trimeren mit der Cutinase-Präparation
von Novozymes. 155 Abbildung 88: Effekt der rTfCa Konzentration auf die Hydrolyse von PET-Trimeren (Reaktionszeit 4 Stunden). 159 Abbildung 89: Effekt der rTfCut2 Konzentration auf die Hydrolyse von PET-Trimeren (Reaktionszeit 4 Stunden). 160 Abbildung 90: Effekt der Reaktionszeit auf die Hydrolyse von PET-Trimeren mit rTfCa. 161 Abbildung 91: Effekt der Reaktionszeit auf die Hydrolyse von PET-Trimeren mit rTfCut2. 161
Tabellenverzeichnis
Tabelle 1: Vertreter der Actinomyceten-Gruppe (Madigan et al. 2009). 2 Tabelle 2: Hauptmonomere des Cutins: C16: Hexadecansäure, 16-Hydroxyhexadecansäure, Dihydroxyhexadecansäure; 5 C18: Octadeca-9-ensäure, 18-Hydroxyoctadeca-9-ensäure, 18-Hydroxy-cis-9,10-epoxyoctadecansäure, 9,10,18-
Trihydroxyoctadecansäure. (*Δ12 ungesättigte Analoga können auftreten; y = 8,7,6,oder 5; x+y = 13) (Kolattukudy 2002). 5
Tabelle 4: Gegenüberstellung der prozentualen Anteile der typischen Cutin- und Suberin-Monomere. (Pollard et al. 2008). 10
Tabelle 5: Übersicht lipolytische Enzyme I, Esterasen (Gruppe II-VIII) mit ausgewählten Beispielen (Hausmann und Jaeger 2010). 18
Tabelle 6: Übersicht lipolytische Enzyme II, Lipasen (Grup. I.1-I.8) mit ausgewählten Beispielen (Hausmann und Jaeger 2010). 21
Tabelle 7: PET Biofunktionalisierung und analysierte Effekte (Zimmermann und Billig 2011). 33 Tabelle 8: Vergleich der PET-Hydrolasen von F. solani (Carvalho et al. 1998, Carvalho et al. 1999, Ronkvist et al. 2009),
T. insolens (Sandal et al. 1996, Ronkvist et al. 2009), P. mendocina (Bott et al. 2003, Ronkvist et al. 2009) und T. fusca (Kleeberg et al. 2005, Chen S et al. 2008). 39
Tabelle 9: Das Kalibrierungskit für die Größenausschlusschromatographie. 52 Tabelle 10: Zusammensetzung des Trenn- und Sammelgels. 70 Tabelle 11: Zeitlicher Ablauf der Silberfärbung. 71 Tabelle 12: Esteraseproduktion durch T. fusca KW3 im MSV-Medium mit verschiedenen Additiven über einen Zeitraum von
10 Tagen. 80 Tabelle 13: Bildung von PET-Hydrolasen bei Bakterien. 93 Tabelle 14: Bildung von PET-Hydrolasen bei Pilzen. 94 Tabelle 15: Aufreinigungstabelle der TfCa aus T. fusca KW3 (Billig et al. 2010). 98 Tabelle 16: Aufreinigungstabelle der TfH aus T. fusca DSM 43793 (Kleeberg et al. 2005). 99
XIII
Tabelle 17: Aufreinigungstabelle der Cutin-induzierten p-NPB Hydrolase aus T. fusca (Chen S et al. 2008). 100 Tabelle 18: Aufreinigungstabelle der Cutinase aus P. mendocina ATCC 55613 (Sebastian et al. 1988). 100 Tabelle 19: Aufreinigungstabelle der Cutinasen und p-NPP Hydrolase aus F. solani f. pisi (Purdy und Kolattukudy 1975a). 102 Tabelle 20: Aufreinigungstabelle der extrazellulären Cutinasen (Lin und Kolattukudy 1980a). 103 Tabelle 21: Aufreinigungstabelle der PET-Hydrolase aus P. citrinum (Liebminger et al. 2007). 104 Tabelle 22: Aufreinigungstabelle der rekombinanten TfCa. 108 Tabelle 23: Aufreinigungstabelle der rekombinanten TfCut2. 108 Tabelle 24: Aufreinigungstabelle der rekombinanten periplasmatischen (pp-rTfH) und zytoplasmatischen (zp-rTfH) TfH
(Dresler et al. 2006). 109 Tabelle 25: Expression der rekombinanten TfH in E. coli und B. megaterium (Yang et al. 2007). 109 Tabelle 26: Übersicht zur Affinitätsaufreinigung der His6-Tag rTfH produziert durch B. megaterium WH323-pYYBm9
gewachsen in einer LB-Batch Kultivierung und Hochzelldichten-Kultivierung (HZDK) mit A5 Medium. I:ohne Vorhbehandlung; II: 50°C für 10 min; III: 18 Stunden Dialyse bei 4°C (Yang et al. 2007). 110
Tabelle 27: Übersicht über die verbleibenden Esteraseaktivitäten nach der Inkubation der TfCa mit verschiedenen Inhibitoren. 117
Tabelle 28: Kinetische Parameter der Hydrolyse von p-NP-Estern und PET-Trimeren durch die TfCa aus T. fusca KW3. 118 Tabelle 29: Identifizierte N-terminale Sequenz der TfCa aus T. fusca KW3. 122 Tabelle 30: Vergleich der Eigenschaften der TfCa mit Cutinasen aus T. fusca. 128 Tabelle 31: Vergleich der PET-Hydrolasen aus F. solani FsC (Carvalho et al. 1998, Carvalho et al. 1999, Ronkvist et al. 2009),
T. insolens HiC (Sandal et al. 1996, Ronkvist et al. 2009), P. mendocina PmC (Bott et al. 2003, Ronkvist et al. 2009), T. fusca TfH/Cutinase 2 (Kleeberg et al. 2005, Chen S et al. 2008, Chen J et al. 2008) und TfCa (Zimmermann und Billig 2011). 133
Tabelle 32: Kinetische Parameter Km und Vmax bestimmt für verschiedene p-NP Ester für die Hydrolasen TfCa, TfH 1/2 (Chen et al. 2010), PmC
a (Sebastian et al. 1988), PmC
b (Gray et al. 1995), FsC (Purdy und Kolattukudy 1973), FsC 1, FsC 2 und
FsE (Purdy und Kolattukudy 1975b). Die geringsten Km Werte je Enzym sind hervorgehoben, ebenso die höchsten Vmax Werte. 137
Tabelle 33: Vergleich der freigesetzten Abbauprodukte der PET-Hydrolasen mit APET-Film. 142 Tabelle 34: Vergleich der freigesetzten Abbauprodukte der PET-Hydrolasen mit PET-Fasern. 150 Tabelle 35: Vergleich der freigesetzten Abbauprodukte der PET-Hydrolasen mit PET-Trimeren. 156 Tabelle 36: Vergleich der Abbauprodukte der PET Hydrolasen mit den drei PET Substraten. Die beiden Hauptprodukte des
Enzyms sind blau unterlegt. 158 Tabelle 37: Proteinkonzentration der eingesetzten Enzyme und die dazugehörigen p-NPB-Aktivitäten in den Ansätzen des
Abbauversuchs. 159
XIV
Einheiten
% Prozent
°C Grad Celsius
µg Mikrogramm
µm Mikrometer
bp Basenpaar
cm Zentimeter
cm2 Quadratzentimeter
d Tag
g/L Gramm / Liter
g/ml Gramm / Milliliter
kDa Kilodalton
LU/ml Lipase Units / Milliliter
m/min Meter / Minute
mg Milligramm
mg/ml Milligramm / Milliliter
mm Millimeter
mM Millimolar
nm Nanometer
S Svendberg
U/ml Units / Milliliter
Abkürzungen
Abkürzungen, die dem allgemeinen deutschen Sprachgebrauch entsprechen, werden nicht
aufgeführt.
2D-Elektrophorese 2-Dimensionale Elektrophorese
3PET Bis(Benzoyloxyethyl)terephthalat
AFM Atomkraftmikroskopie
AIEX Anionenaustauschchromatographie
APET amorphes Polyethylenterephthalat
AS Aminosäure
BEB Ethylenglycol-dibenzylester
XV
BETEB Bis(Benzoyloxyethyl)terephthalat
BHET Bis(2-Hydroxyethylterephthalat)
BHPT Bis(3-Hydroxypropylterephthalat)
BTA Copolyester aus 1,4-Butanediol, Dimethylterephthalat und
F Phe Phenylalanin N Asn Asparagin W Trp Trytophan
G Gly Glycin P Pro Prolin Y Tyr Tyrosin
H His Histidin Q Gln Glutamin
1 Einführung
1 Einführung
1.1 Actinomyceten
1.1.1 Klassifizierung
Actinomyceten sind filamentöse, Sporen bildende gram (+) Bodenbakterien. Die Angehörigen dieser
Gruppe weisen einen hohen GC-Gehalt von 63-78% auf. Actinomyceten gehören zur Klasse der
Actinobakterien, zu denen auch die Corynebakterien, Arthrobacter, Brevibakterien,
Propionibakterien, Eubakterien, Bifidobakterien, Acetobakterien und Thermoanaerobacter zählen.
Die Actinomyceten werden aufgrund ihrer Eigenschaften in 8 Gruppen unterteilt (Tabelle 1).
Abbildung 1: Phylogenetischer Stammbaum des Lebens auf Grundlage der 16S rDNA Untersuchungen. Die Gruppe der Actinobakterien ist im linken oberen Bereich angeordnet (www.lisci.kitasato-u.ac.jp/me/images/phylogenetic.jpg).
Die Kolonien von T. fusca sind farblos, das gebildete Luftmycel hingegen weiß und scharf umgrenzt.
Die Lufthyphen sind geradlinig oder gewunden, einfach oder verzweigt und bilden einzelne
akropetale Luftsporen. T. fusca ist nicht säurefest, eurythermal thermophil und fakultativ anaerob
3 Einführung
(Hensen 1957). Das Temperaturoptimum für das Wachstum liegt bei 45-50°C und der optimale pH
von 7,5 bis 11. T. fusca ist Katalase stark positiv, Oxidase negativ, die Säureproduktion aus D-Glucose
ist schwach positiv und die Nitratreduktion negativ. Der Mikroorganismus kann Casein, Gelatine,
Kreatin und Elastin proteolytisch hydrolysieren. Es erfolgt ebenfalls eine Hydrolyse von Stärke, Agar,
Pektin, Cellulose, Xylan, Arbutin und Aesculin, hingegen keine von Chitin, Xanthin, Hypoxanthin,
Guanin und Tyrosin. T. fusca kann die Kohlenhydrate D-Galaktose und Laktose verwerten, D-Ribose
und D-Xylose hingegen nicht (McCarthy et al. 1984).
Phylogenetische Untersuchungen auf Grundlage der 16S rRNA zeigten keine enge
verwandtschaftliche Verbindung zu den anderen Gruppen des Actionmyceten-Klusters (Embley et al.
1994).
Abbildung 2: T. fusca KW3 mit 1000facher Vergrößerung (links, Färbung mit Safranin) und Makroskopisches Aussehen nach Wachstum auf Czapek-Medium (rechts).
Aufgrund der vielfältigen hydrolytischen Aktivität von T. fusca wurden in der Vergangenheit bereits
verschiedenste Untersuchungen zur Identifikation und Aufreinigung von hydrolytischen Enzymen
durchgeführt. Dabei erfolgte unter anderem eine Charakterisierung der Polygalakturonat-Lyase (EC
4.2.2.2) (Stutzenberger 1987), des Xylan-abbauenden Systems (Endoxylanase, α-
Arabinofuranosidase, β-Xylosidase) (Bachmann et al. 1991), einer Maltotriose produzierende α-
Amylase (Busch et al. 1997), einer Acetylxylanesterase (Yang et al. 2008) und von Cutinasen
(Kleeberg et al. 2005, Cheng et al. 2008).
Durch die lückenlose Sequenzierung der genomischen DNA von T. fusca (Lykidis et al. 2007) können
nun mit Hilfe von molekularbiologischen Methoden weitere interessante Proteine identifiziert und
charakterisiert werden. Die Proteom- und Transkriptom-Analyse der extrazellulären Proteine und des
mRNA Levels mittels 2D-Elektrophorese und LC-MS/MS erfolgte ebenfalls für einen T. fusca Stamm
nach Wachstum auf Cellubiose- und Glucose-haltigem Medium (Chen et al. 2007).
4 Einführung
T. fusca KW3 (DSM 6013) wurde aus Kompost isoliert und es erfolgten bereits Studien zur
thermophilen Xylanase-Produktion mit diesem Stamm (Röthlisberger et al. 1992, Casimir-Schenkel
1992). Das Neuisolat unterscheidet sich durch eine Resistenz gegenüber Kristallviolett, einer oberen
Wachstumsgrenze bei 60°C und einer Alkalitoleranz bis pH 11.
Ein besonderes Interesse bei der Suche nach technisch anwendbaren Enzymen gilt dem Abbau der
Biopolymere Cutin und Suberin, von Pflanzen gebildete natürliche Polyester aus aliphatischen und
aromatischen Regionen. Cutin ist ein Bestandteil der Cuticula, welche die Barriere zwischen der
Pflanze und ihrer Umwelt bildet. Die Cuticula verhindert das Austrocknen der Pflanze, reguliert den
Gasaustausch und schützt vor mechanischen und Strahlungsschäden ebenso wie vor
Pflanzenfressern und pathogenen mikrobiellen Attacken. Suberin hingegen, befindlich unter
Anderem in Korkzellen und im Periderm (äußere Barriere der Rinde und der unterirdischen
Pflanzenteile wie Wurzeln und Knollen), dient als Diffusionsbarriere (Nawrath 2002, Kolattukudy
2002).
T. fusca produziert ebenfalls diese interessanten hydrolytischen Enzyme, auf deren Aktivität und
Bedeutung in den folgenden Kapiteln näher eingegangen wird (Fett et al. 1999, Kleeberg et al. 2005,
Cheng et al. 2008).
1.2 Biopolyester Cutin und Suberin
1.2.1 Bestandteile des Cutins
Die Bezeichnung Cutin wurde von Cutose abgeleitet, was die ursprüngliche Bezeichnung für eine
Gewebsschicht der Epidermis von Blättern war, welche eine Resistenz gegenüber starken Säuren
vorwies. Cutin wurde sowohl in den Blättern von Land-, als auch von Wasserpflanzen gefunden, aber
ebenfalls in Stengeln, Blattstielen, Blütenteilen, Früchten, einige Samenschalen und im Inneren von
Zitronen. Die Stärke der Cutinschicht variiert je nach Spezies und Pflanzenteil. In den Blättern von
höheren Pflanzen beträgt die Dicke der Cutinschicht zwischen 0,5 und 14 µm mit < 20 bis 600 µg
Cutin pro cm2 Oberfläche. In manchen Früchten mit hochentwickelter Cuticula beträgt der
Cutingehalt bis zu 1,5 mg pro cm2. Bei niederen Pflanzen ist die Cutinschicht sehr dünn (~0,1 µm)
(Kolattukudy 2002).
5 Einführung
Abbildung 3: Schematische Darstellung der Einlagerung von Cutin in einem Blatt. Die Stärke, Struktur und Zusammen-setzung der einzelnen Schichten der Cuticula können stark variieren abhängig von Spezies, Organen und Entwicklungs-phase. Die epicuticulären Wachse (EW) bedecken die Cuticula (C) komplett, die aus Cutin und darin eingelagerten intracuticulären Wachsen besteht. Die cuticulären Schichten (CL) bestehen höchstwahrscheinlich aus Cutin und Polysacchariden der Zellwand, könnten aber vielleicht auch intracuticuläre Wachse enthalten. (PW: primäre Zellwand, Cy: Cytoplasma, V: Vakuole) (Pollard et al. 2008).
Typische Monomere des Cutins sind C16 und C18 Fettsäuren, welche auch ein- oder mehrfach
hydroxyliert, ungesättigt oder epoxyliert sein können (Kolattukudy 2002).
Trihydroxyoctadecansäure. (*Δ12 ungesättigte Analoga können auftreten; y = 8,7,6,oder 5; x+y = 13) (Kolattukudy 2002).
C16-Familie C18-Familie *
COOH
OH COOH
COOHOH
OH
x
y
COOH
OH COOH
COOHOOH
OH COOH
OH
OH
1.2.2 Bestandteile des Suberins
Suberin ist abgleitet von dem lateinischen Wort suber, was Kork bedeutet. Der Begriff Suberin wurde
bereits vor 200 Jahren von Michel Eugène Chevreul (1786-1889) verwendet, um den im Kork
enthaltenen wasserunlöslichen Bestandteil zu beschreiben. Dieses mehrteilige Material besteht aus
verschiedenen polymeren Domänen, die kovalent an die hoch komplexe Zellwand gebunden sind.
6 Einführung
Abbildung 4: Schematische Darstellung der Einlagerung von Suberin in der Endodermis einer Wurzel. Abgebildet sind zwei angrenzende Zellen mit Mittellamelle (ML) und Pektinschicht zwischen ihren primären Zellwänden (PW). Die Suberinlamellen befinden (SL) sich auf der Innenseite der primären Zellwand. (SW: sekundäre Zellwand, PM: Plasmamembran, Cy: Cytoplasma, V: Vakuole) (Pollard et al. 2008).
Tabelle 3: Struktur der Monomere Suberins: Aliphatische Monomere: 1-Alkanole; Alkansäuren; ω-Hydroxyalkansäuren; α,ω-Dialkansäuren; 9(10),ω-Dihydroxyalkansäure; 9,10-Dihydroxyalkansäure; 9,10,18-Trihydroxyalkansäure; 9,10-
0-10% Ferulasäure, geringere Mengen von Cumarsäure, Sinapinsäure und Kaffeesäure
Bei ersten Untersuchungen zur Aufklärung der Bindungen in Suberinpolymeren wurden lineare
Dimere der ω-Hydroxy-Fettsäuren verestert mit α,ω-Dicarbonsäuren und quervernetzt mit ω-
Hydroxy-Fettsäuren nachgewiesen. Glycerin konnte in verschiedenen Bindungsstrukturen detektiert
werden: verestert mit ω-Hydroxy-Fettsäuren oder α,ω-Dicarbonsäuren, verestert in beiden
Positionen mit α,ω-Dicarbonsäuren oder als Verbinder zwischen zwei α,ω-Dicarbonsäuren. Ebenfalls
11 Einführung
identifiziert wurde ein trimerer Diester des Glycerins verbunden mit einer ω-Hydroxy-Fettsäure und
Ferulasäure. Damit wurde nachgewiesen, dass die Ferulasäure kovalent an die aliphatische Suberin-
Domäne gebunden ist.
Schlussfolgerungen der Studien sind, dass Suberin langkettige α,ω-Dicarbonsäuren, an beiden Enden
mit Glycerin verestert, als Hauptbestandteil des Polymers enthält. Vom Glycerin aus sind 2- und 3-
dimensionale Esterbindungen zu α,ω-Dicarbonsäuren und ω-Hydroxy-Fettsäuren ausgebildet. Am
Rand des Glycerin-basierenden Polymers ist die Ferulasäure an die aliphatische Domäne als
polyaromatische Domäne gebunden und diese ist wiederum gebunden an die
Zellwandkohlenhydrate (Franke et al. 2007).
Mit 2-dimensionalen Kugel-Stab-Modellen werden mögliche Monomerverbindungen lokaler
Polyesterdomänenstrukturen dargestellt (Abbildung 7 b-d). Nur mittig stehende Hydroxyl-Gruppen
wurden in die Betrachtung einbezogen und andere mittelständige funktionelle Gruppen wurden
nicht berücksichtigt, ebenso wie mögliche Nicht-Ester-Verbindungen und Veresterungen mit den
Zellwänden. Es ist bisher nicht bekannt, ob solche klar definierten Domänen aus Hydroxyfettsäure-,
α,ω-Dicarbonsäure- und Glycerin-Monomeren gebildet werden oder ob die Strukturen vermischt
vorliegen (Pollard et al. 2008).
Abbildung 7: Darstellung der möglichen Verbindungen der Monomere der Biopolyester Cutin und Suberin. a) Hauptsächlich treten dabei primäre Esterbindungen auf (roter Pfeil), wodurch lange Ketten gebildet werden. Die sekundären Esterbindungen (blauer Pfeil) stellen zusätzliche Verzweigungspunkte dar. b) Anordnung der Fettsäure- und ω-Hydroxyfettsäure-Monomere unter Bildung eines Dendrimers. c) Anordnung der α,ω-Dicarbonsäure- (DCS) und Glycerin-Monomere unter Bildung einer Dendrimer Struktur, angeordnet um freie OH Gruppen um eine Bindung an einige Glycerin Monomere zu ermöglichen. d) Anordnung der DCS- und Glycerin-Monomere unter Bildung einer quervernetzten Domäne. (Pollard et al. 2008).
d)
c)
a)
b)
Fettsäure
ω-Hydroxyfettsäure
Substituierte ω-Hydroxyfettsäure
Dicarboxylsäure
-OH
Glycerin
-COOH
Ester
12 Einführung
In den letzten Jahren wurden ebenfalls Studien zur synthetischen Herstellung von Cutin durchgeführt
und die erhaltenen Polymere mit dem natürlichen Biopolyester verglichen. Die gebildeten Strukturen
der Hauptkomponenten stimmten sehr gut überein (Benίtez et al. 2004). Mittlerweile werden auch
die Enzyme des Cutin und Suberin Biosyntheseweges als interessante Biokatalysatoren für die
Produktion von Chemikalien und Polymeren studiert (Li et al. 2009).
1.3 Hydrolasen
1.3.1 Struktur und katalytischer Mechanismus
Die Enzymklasse der Hydrolasen ist eine große Gruppe an strukturell ähnlichen Enzymen mit
verschiedensten katalytischen Funktionen. Diese Enzyme katalysieren unter Einbau eines
Wassermoleküls die reversible Spaltung von Biomolekülen (Hydrolyse), aber auch unter Abspaltung
eines Wassermoleküls die Synthese dieser Strukturen. Die Gemeinsamkeit dieser Klasse ist die α/β
Hydrolase Faltungsstruktur, die aus 8 meist parallel angeordneten β-Faltblättern (β1-β8) und auf
beiden Seiten umgebende stabilisierende α-Helices (αA-αF) aufgebaut ist. Eine gewisse Variabilität in
der Anzahl der Strukturen ist bei den verschiedenen hydrolytischen Enzymen identifiziert worden,
allerdings ist die zentrale Anordnung und Form des aktiven Zentrums als definierte Bindungstasche
bei allen Enzymen gleich. Diese dreidimensionale Struktur der Hydrolasen bildet das Gerüst für die
enzymatische Funktion und Substratspezifität der Enzyme. Die hydrolytischen Katalysatoren sind ein
Beispiel für die divergierende Evolution von Enzymen, die aus einer Struktur durch den Austausch
von Aminosäuren oder durch die Insertion/Deletion von Schleifen über einen zeitlichen Abstand
entstehen und unterschiedliche katalytische Aufgaben erfüllen. Die Enzyme besitzen dadurch zwar
geringe Sequenzhomologien aber eine vergleichbare Raumstruktur und eine identische Anordnung
am katalytischen Zentrum. Die Aminosäuren des aktiven Zentrums sind ein Histidin, eine Säure
(Asparaginsäure oder Glutaminsäure) und ein Nucleophil (Serin, Asparagin oder Cystein) in einer
konservierten Region, welche sich über Wasserstoffbrückenbindungen untereinander stabilisieren
(Abbildung 8) (Ollis et al. 1992).
13 Einführung
Abbildung 8: α/β Hydrolase-Faltungsmotiv der Hydrolasen ist eine „doubly wound α/β superfold“ bestehend aus 8 zentral parallel angeordneten β-Faltblättern (rot) und 6 umgebenden stabilisierenden α-Helices (blau). Im Speziellen kann die Anzahl der Elemente variieren, das allgemeine Gerüst ist aber hochkonserviert. Das aktive Zentrum bilden 3 Aminosäuren (grün), das Nucleophil befindet sich im hoch konservierten Bereich zwischen der αC-Helix und dem β5-Faltblatt, dem „nucleophilic elbow“ (Ollis et al. 1992).
Die katalytische Hydrolyse am aktiven Zentrum erfolgt in mehreren Schritten. Im Grundzustand
stabilisieren sich die Aminosäuren der katalytischen Triade untereinander durch Wasserstoff-
Brückenbindungen (Abbildung 9). Bei Anwesenheit eines Esters im katalytischen Zentrum greift das
Nucleophil, in diesem Fall das Serin, den Ester unter Ausbildung eines tetraedrischen
Zwischenprodukts nucleophil an. Das frei werdende Proton des Nucleophils übernimmt der
Imidazolring des Histidin und dieser wird unterstützt durch das Carboxylatanion der Säure, in diesem
Fall der Asparaginsäure. Das gebildete, negativ geladene Intermediat wird durch mehrere
Aminosäure-Reste, welche sich in der Region des aktiven Zentrums befinden, stabilisiert. Diese
Struktur wird als Oxyanionen-Loch bezeichnet. Im nächsten Schritt erfolgt die Abspaltung des
Alkohols und die Bildung eines Enzym-Substrat Komplexes, dem Acylenzym. Durch den Eintritt eines
Wassermoleküls in das aktive Zentrum und dessen nucleophilen Angriff am Acylenzym bildet sich
wiederum ein tetraetrisches Intermediat, welches durch Wasserstoff-Brückenbindungen im
Oxyanionen-Loch stabilisiert wird. Durch die Abspaltung der Säure und ihrer Freigabe erfolgt die
Rückführung des aktiven Zentrums in seinen Ausgangszustand und steht somit direkt für die Bindung
eines weiteren Esters bereit.
NH2
β8
β7
β6
β5
β4
β3
β2
β1
αA
αB
αC
αD
αE
αF
His
Säure
Nuc
COOH
14 Einführung
Abbildung 9: Der katalytische Reaktionsmechanismus der Hydrolasen am Beispiel der Spaltung eines Esters in die dazugehörige Säure und Alkohol. Die Reaktion erfolgt ohne Verwendung eines Cofaktors und ist somit sehr einfach und effizient. Die Bildung des Acylenzyms ist ein schneller Reaktionsschritt, die Freisetzung der Säure und des Enzyms ist der geschwindigkeitsbestimmende Reaktionsschritt. (Holmquist 2000).
Eine weitere Besonderheit der Hydrolasen ist das hochkonservierte Pentapeptid G-X-S-X-G, in das das
katalytische Serin eingebettet ist. Bei den beiden flankierenden Aminosäuren handelt es sich um
Glycin, für X können verschiedene Aminosäuren stehen.
Die Enzymklasse der Hydrolasen beinhaltet unter Anderem die Carboxylesterasen (EC 3.1.1.1,
Esterase), die Triacylglycerol Lipasen (EC 3.1.1.3, Lipase) und die Cutin Hydrolasen (EC 3.1.1.74,
Cutinase). Sie hydrolysieren alle Ester-Verbindungen, variieren aber bezüglich ihres
Substratspektrums. Die Carboxylesterase, auch unspezifische Esterase, spaltet unter Einbau eine
Wassermoleküls Carboxylester in seine Bestandteile Alkohol und Carboxylsäure. Die Lipasen finden
Anwendung bei dem hydrolytischen Abbau von Fetten (Triacylglyceride) in Glycerol und Fettsäuren.
Die Cutinasen zeichnen sich durch die Besonderheit der katalytischen Spaltung des Biopolymers
Cutin in dessen Monomere (u.a. Fettsäuren, Hydroxyfettsäuren, aliphatische Alkohole, aromatische
Säuren) aus. Alle dargestellten Reaktionen laufen im wässrigen Milieu ab.
Säure O
O
NHN
His Ser
OH
Säure O
OH
NNH
His Ser
O
N
H
O
N
H
O
RO
O
R´
Säure O
OH
NNH
His Ser
O
N
H
O
N
H
O
R
O
R´ O
Säure O
OH
NNH
His Ser
O
O
R
N
H
O
N
H
O
Säure O
OH
NNH
His Ser
O
N
H
O
N
H
O
R
O
H O
RO
O
R´
ROH
O
Freies Enzym
R´OH
OH2
tetrahedraler Übergangszustand I
tetrahedraler Übergangszustand II
Acyl-Enzym-Komplex
15 Einführung
Abbildung 10: Übersicht über die katalysierten hydrolytischen Spaltungen der Enzymgruppen der Carboxylesterase, Triacylglycerol Hydrolasen und der Cutin Hydrolasen im wässrigen Milieu.
Die Carboxylesterase zeichnet sich durch die Hydrolyse von kurz- und mittelkettigen, wasserlöslichen
Estern aus und ihre Reaktionskinetik kann durch die Michaelis-Menten-Gleichung beschrieben
werden (Abbildung 11). Im Gegensatz dazu hydrolysieren die Lipasen bevorzugt langkettige
Triglyceride, welche meist wasserunlöslich sind. Die Reaktionskinetik der Lipasen zeichnet sich durch
einen sigmoiden Verlauf aus, da diese Enzyme eine „Grenzflächenaktivierung“ aufweisen
(Abbildung 11). Das bedeutet, dass bei geringen Substratkonzentrationen die Lipase inaktiv bleibt
bzw. nur geringe Aktivitäten detektiert werden. Sobald aber die Substratkonzentration die
spezifische Konzentration (kritische micellare Konzentration) erreicht, ab der eine Agglomeration des
Substrats erfolgt, bildet sich eine Grenzfläche zwischen den hydrophoben Substratmicellen und der
hydrophilen Wasserphase mit der Lipase aus. Ab dieser Substratmenge steigt die hydrolytische
Aktivität der Lipasen rapide an.
OR2
O
R1 OH
O
R1
O
O
O
O
O
O
R3
R2
R1 OH
OH
OH+ H2O
+ R1COOH
+ R2COOH
+ R3COOH
+ H2O + R2OH
+ (H2O)n
COOH
OH COOH
COOHOH
OH
x
y
COOH
OH COOH
COOHOOH
OH COOH
OH
OH
Carboxylesterase
Triacylglycerol Hydrolase
Cutin Hydrolase
n
16 Einführung
Abbildung 11: Reaktionskinetik der Carboxylesterasen (links) nach Michaelis-Menten und der sigmoide Kurvenverlauf der Reaktionskinetik der Lipasen (rechts) (Pütz 2006).
Der Grund für dieses Verhalten lässt sich anhand der Struktur der Lipasen erklären. Das aktive
Zentrum des Enzyms wird durch eine bewegliche Proteinschlaufe, eine α-Helix, abgedeckt. Dieser
Deckel (engl.: lid) ist der Grund für die geringen Enzymaktivitäten unterhalb der kritischen mizellaren
Konzentration. Sobald diese Proteinschlaufe mit der Grenzfläche der Substratmizelle in Berührung
kommt, erfolgt eine Konformationsänderung und der Deckel gibt das aktive Zentrum frei (Abbildung
12). Gleichzeitig wird dadurch die hydrophobe Oberfläche, die das aktive Zentrum umgibt, frei
zugänglich und unterstützt die Interaktion zwischen dem Enzym und dem hydrophoben Substrat.
In neueren Studien wurden weitere Lipasen identifiziert und biochemisch charakterisiert, die keine
Grenzflächenaktivierung zeigten. Die Lipase LipA aus B. subtilis besitzt zum Beispiel keinen Deckel
und die Lipase aus P. aeruginosa LipA besitzt zwar einen Deckel, zeigt allerdings keine
Grenzflächenaktivierung. Somit ist die Anwesenheit oder Abwesenheit des Deckels kein struktureller
Hinweis zur Unterscheidung zwischen den Carboxylesterasen und Lipasen (Hausmann und Jaeger
2010).
1.3.2 Carboxylesterasen
Die Carboxylesterasen werden aufgrund ihrer primären Struktur und der biochemischen
Eigenschaften in 7 Gruppen (II-VIII) unterteilt (Hausmann und Jaeger 2010). Die meisten Esterasen
gehören zu der α/β-Hydrolase-Faltung Superfamilie. Ausnahmen enthält die Gruppe VIII, die
Esterasen mit einem β-Lactamase Faltungsmotiv beinhaltet. Im Jahre 2009 waren 696 bakterielle
Esterasen in der Enzymdatenbank BRENDA (Schomburg et al. 2004) enthalten und viele von ihnen
zeigen keine signifikante Übereinstimmung mit einer der bisher bekannten Esterasefamilien. Einige
Vertreter der einzelnen Gruppen sowie einige ihrer Merkmale sind in Tabelle 5 gegenübergestellt.
17 Einführung
Bakterielle Esterasen können im Cytoplasma (Droege et al. 2005), im Periplasma (Weadge et al.
2005) oder in der Membran vorhanden sein (von Tigerstrom und Stelmaschuk 1989, Wilhelm et al.
1999) oder sekretiert werden (von Tigerstrom und Stelmaschuk 1989, Xiang et al. 2006). Eine
spezifische Funktion der Esterase ist bisher nicht bekannt, sie sind unter normalen Standard-
Laborbedingungen nicht überlebenswichtig für die Bakterien (Berger et al. 1998). Sie sind involviert
in Prozessen, die eine C-Quelle zugänglich machen, wie die pathogene Infektion, der
Pflanzenzellwandabbau oder die Entgiftung (Khalameyzer et al. 1999). Es kommt zum Beispiel zur
Esteraseproduktion beim probiotischen Lactobacillus reuteri bei Anwesenheit von Gallensaft und es
wird vermutet, dass die Esterase bei der Erkennung von Zellmembranen beteiligt ist (Wall et al. 2007,
Whitehead et al. 2008). Andere Esterasen werden durch die Anwesenheit von Wasserstoffperoxid
gebildet und helfen dem Bakterium bei der Bewältigung von oxidativem Stress (Baatout et al. 2006).
Esterasen sind ebenfalls eingebunden in die Regulation der Kommunikation und Interaktion zwischen
den Spezies, sie bauen Signalmoleküle ab (Shinohara et al. 2007, Khalameyzer et al. 1999) oder
hydrolysieren Triacylglyceride als Ausgangsstoffe für die Antibiotika-Synthese (Olukoshi und Packter
1994).
Esterasen sind aufgrund ihrer Fähigkeit, Esterbindungen zwischen der Hydroxyzimtsäure und Zuckern
zu hydrolysieren, wichtige Enzyme beim Pflanzenzellwandabbau durch Clostridium und Lactobacillus
(Fonaghy et al. 2000, Prates et al. 2001, Wang et al. 2004, Garcia-Conesa et al. 1999). Die einzige
identifizierte Esterase im humanpathogenen Helicobacter pylori (Ruiz et al. 2007) ist direkt beteiligt
an der Bildung von Magen- und Zwölffingerdarmgeschwüren und Magenkrebs (Kuster et al. 2006)
durch den Abbau der Fette des Magenschleims (Slomiany et al. 1989). Das oft in Krankenhäusern
übertragene pathogene Corynebacterium jeikeium besitzt keine eigene Fettsäure-Synthase und
spaltet deshalb mit einer Cholesterin-Esterase das Cholesterin im Blut und an extrazellulären
Matrixproteinen (Hansmeier et al. 2007, Tauch et al. 2005). Es ist Verursacher von Blutvergiftungen
und Herzinnenhautentzündungen. Die LipF aus dem pathogenen Mycobacterium tuberculosis,
gehörend zur Gruppe IV der Esterasen, ist ebenfalls ein wichtiger Faktor bei der Infektion des
Menschen durch das Bakterium. Als Autotransporter ist die Esterase EstA aus
Pseudomonas aeruginosa ebenfalls an der Infektion beteiligt (Camacho et al. 1999, Zhang et al.
2005).
18 Einführung
Tabelle 5: Übersicht lipolytische Enzyme I, Esterasen (Gruppe II-VIII) mit ausgewählten Beispielen (Hausmann und Jaeger 2010).
Gruppe Herkunft der Esterase (Proteinnr.) Merkmale
II
(GDSL)
Aeromonas hydrophila (P10480)
Pseudomonas aeruginosa
(O33407)
Bacillus cereus (Q81AY4)
Xanthomonas vesicatoria
(Q7X4K7)
Enthält die GDSL/SGNH-Esterasen, besitzen kein
GXSXG-Motiv am aktiven Zentrum, dafür ein GDS(L)-
Tetrapeptid im N-terminalen Bereich; Esterasen
enthalten fünf konservierte Sequenzbereiche, GDS(L)
mit Ser Block I, Gly in Block II, Asp in Block III und His in
Block V
III Streptomyces exfoliatus (Q56008)
Kineococcus radiotolerans
(A6WEQ4)
Clavibacter michiganensis
(B0RCM8, B0RFW0)
Thermobifida fusca (Q47RJ6,
Q47RJ7)
Extrazelluläre Enzyme, molekulare Masse von 32-35
kDa, besitzen Ähnlichkeit mit dem menschlichen
Blutblättchen-Aktivierungsfaktor Acetylhydrolase
(PAF-AH)
In dieser Gruppe sind Lipasen (definitionsgemäß) ohne
Deckel enthalten z.B. Tfu_0882 und Tfu_0883 aus T.
fusca
IV
(HSL)
Alicyclobacillus acidocaldarius
(Q7SIG1)
Burkholderia sp. 383 (u.a.
Q39FH4)
Pseudomonas sp. B11-1 (O52270)
Bacillus subtilis (O68884)
Ähnlich zur Gruppe der Hormonsensitiven
Säugetierlipasen, besitzen 3 konservierte
Sequenzblöcke, Bock II und III mit den katalytischen
AS, Block I mit HGGG Consensus-Sequenz, bevorzugen
kurzkettige Substrate und zeigen Esterase-
Enzymkinetik, besitzen am aktiven Zentrum eine „cap“
Ser in Bock II, Asp und His in Block III, Esterase-Kinetik,
kurzkettige Substrate bevorzugt
VI Spirulina platensis (Q53415)
Anabaena variabilis (Q3M6G8)
Shewanella amazonensis (A1S771)
Rhodoferax ferrireducens
(Q21XU9)
Kleine Enzyme mit 23-26 kDa, bisher nur eine mit 31,6
kDa, 40% Sequenzähnlichkeit zu eukaryotischen
Lysophospholipasen, 3 konservierte Sequenzblöcke
analog zu Gruppe IV und V, bevorzugt kurzkettige
Substrate
19 Einführung
Fortführung Tabelle 5
Gruppe Herkunft der Esterase (Proteinnr.) Merkmale
VII Arthrobacter oxydans (Q01470)
Streptomyces coelicolor (Q9Z545)
Burkholderia sp. 383 (Q398P3)
Bacillus pumilus (Q66M67)
Molekulare Masse von ca. 55 kDa, hohe Ähnlichkeit zu
Acetylcholinesterase und Darm/Leber
Carboxylesterase, 4 konservierte Sequenzblöcke,
hydrolysieren kurzkettige p-NP Ester und Triglyceride,
aber auch biotechnologisch interessante Substrate
VIII Arthrobacter aurescens (A1RB78)
Saccharopolyspora erythraea
(A4F8E6)
Pseudomonas gingeri (B0M0H4)
Streptomyces anulatus (O87861)
Unterscheiden sich in der Struktur deutlich von den
anderen Gruppen, zeigen Ähnlichkeiten zu β-
Lactamasen und DD-Peptidasen, Größe ca. 42 kDa,
Multimerbildung kann auftreten, hohe
Lösungsmitteltoleranz, katalytisch aktives Serin
befindet sich in SXXK Motiv, Ser und Lys im N-
terminalen Block und Tyr bilden aktives Zentrum,
zusätzlich wurde eine GXSXG Sequenz am C-Terminus
identifiziert
1.3.3 Lipasen
Überraschenderweise ist die genaue Funktion der Lipase bei Bakterien noch nicht bekannt, da ihre
Produktion einer komplexen Regulation unterliegt und sie somit wahrscheinlich nicht nur für die
Hydrolyse von Fetten als Energiequelle verantwortlich sind (Hausmann und Jaeger 2010). Die Art der
Regulation lässt die Schlussfolgerung zu, dass die Lipasen auch als Virulenzfaktoren auftreten
(Degrassi et al. 2008, Devescovi et al 2007, Heurlier et al. 2004, Lewenza et al. 1999, Ulrich et al.
2004) oder ähnlich den Xylan-Esterasen durch die Hydrolyse von Xylan die Schutzbarriere der
Wirtszelle zerstören (Khalameyzer et al. 1999).
Der die Atemwege infizierende, opportunistisch pathogene Pseudomonas aeruginosa produziert eine
Lipase, welche zusammen mit der Phospholipase C Substanzen abbaut, die zur Reduktion der
Oberflächenspannung an den Lungenbläschenmembranen und somit zur Unterstützung der Atmung
wichtig sind (Beatty et al. 2005, Schmidt et al. 2007). Isolierte Stämme von P. aeruginosa und
Salmonella zeigten untypische Zusammensetzungen der Lipid A Schicht, was sie für die mikrobiellen
Abwehrmechanismen des Menschen nicht erkennbar machten und es somit zu häufigeren
Erkrankungen kam (Ernst et al. 1999, Guo et al. 1998, Tanamoto und Azumi 2000). Die normale Lipid
20 Einführung
A Schicht besteht aus Capron-, Laurin-, Myristin-, Palmitin- und Stearinsäuren, bei den Isolaten wurde
allerdings eine Palmitinsäure-Konzentration von bis zu 33% gefunden (Ernst et al. 1999).
Ebenso können freie Fettsäuren die normalen Abläufe, wie die Hinderung der Lymphozyten-
Proliferation und die Chemotaxis von neutrophilen Granulozyten, im menschlichen Organismus
stören (Buttke 1984, Buttke und Cuchens 1984, Hawley und Gordon 1976, Jaeger et al. 1991,
Nordstrom et al. 1991, Pourbohloul et al. 1985).
Die Anwesenheit einer Lipase bei Propionibacterium acnes unterstützt die Ansiedlung des
Organismus in den Talgdrüsenfollikeln der Haut. Durch die Hydrolyse von Glyceriden aus dem Serum
werden Fettsäuren freigesetzt, die die Ansiedlung des Bakteriums unterstützen (Burkhart und
Burkhart 2003, Gribbon et al. 1993).
Eine weitere wichtige Funktion der Lipasen ist der Abbau von lipolytischen Substraten zur
Verstoffwechselung. P. aeruginosa YS-7 kann mit Ölgemischen mit einem Wassergehalt von nur 1%
zum Wachsen gebracht werden (Shabtai et al. 1991). Microthrix parvicella kann Lipide und
Fettsäuren in hohen Konzentrationen in Abwässern abbauen, sowohl aerob als auch anaerob
(Nielsen et al. 2002).
Die Produktion von Lipasen kann durch die Anwesenheit von Alkanen angeregt werden, allerdings ist
der Abbau dieser Substrate noch nicht vollständig aufgeklärt. Selbst wenn die Lipase durch die Alkane
induziert wurde, kann sie nicht immer ohne weitere enzymatische Mithilfe die Alkane abbauen
(Breuil et al. 1978). Nur sehr wenige Stämme können diese Energiequelle verwerten, Hefestämme
noch eher als Bakterienstämme (Margesin et al. 2003).
Abbildung 12: Struktur der offenen und geschlossenen Lipase von Burkholderia cepacia BcL. Die offene Kristallstruktur ist blau dargestellt und das geschlossene Homologie-Modell grün, die gelbe Kugel stellt ein Ca
2+-Ion dar. Die katalytische
Triade besteht aus Serin, Histidin und Asparaginsäure (Trodler et al. 2009).
21 Einführung
Tabelle 6: Übersicht lipolytische Enzyme II, Lipasen (Grup. I.1-I.8) mit ausgewählten Beispielen (Hausmann und Jaeger 2010).
Gruppe Herkunft der Esterase (Proteinnr.) Merkmale
I.1 Pseudomonas mendocina
(Q8RKT7)
Rhodoferax ferrireducens
(Q21T36)
Vibrio cholerae (u.a. P15493)
Chromobacterium violaceum
(Q7NUI4)
Starke Ähnlichkeit zu P. aeruginosa Lipase, molekulare
Masse 30-32 kDa, Typ II Sekretionsweg, werden ATP-
abhängig ins Periplasma transportiert, in die aktive
Konformation umgefaltet und in den extrazellulären
Raum sekretiert, einige benötigen Faltungsproteine, 2
Asp binden ein Ca2+-Ion, das für die katalytisch aktive
Struktur benötigt wird, katalytisches His
I.2 Burkholderia glumae (Q05489)
Pseudomonas KWI-56 (P25275)
Burkholderia cepacia (u.a. P22088)
Pseudomonas luteola (O68551)
Starke Ähnlichkeit zu B. glumae Lipase, eine etwas
größere molekulare Masse als I.1 aufgrund 2 zusätzlicher
β-Faltblätter, Typ II Sekretionsweg, werden ATP-abhängig
ins Periplasma transportiert, in die aktive Konformation
umgefaltet und in den extrazellulären Raum sekretiert,
einige benötigen Faltungsproteine, 2 Asp binden ein Ca2+-
Ion, das für die katalytisch aktive Struktur benötigt wird,
katalytisches His
I.3 Pseudomonas fluorescens PfO1
(Q3KCS9)
Pseudomonas sp. 7323 (Q2KTB3)
Serratia marcescens (u.a. Q09KJ5)
Uncultered bacterium (A7J993)
Molekulare Masse 50-65 kDa, Typ I Sekretionsweg, Ca2+-
Ion enthalten für katalytische Funktion, näher verwandt
mit eukaryotischen Enzymen als mit bakteriellen, das C-
terminale Sekretionssignal mit Glycin-reichen Wieder-
holungen (GGXGXDX(U)X)n kann an das Ca2+-Ion binden,
welches als Chaperon bei hohen Kalzium-
Konzentrationen agiert
I.4 Bacillus subtilis (P37957)
Bacillus sp. NK13 (B0LW76)
Bacillus megaterium (Q8RJP5)
Bacillus clausii (Q5WDN0)
Molekulare Masse 20 kDa, kleinste Lipasen, häufig aus
maximale Enzymaktivität bei pH 10,0-11,5, Lipase ist
Kalzium-unabhängig und enthält kein Cystein, weisen
eine kompakte minimale Hydrolasefaltung auf ohne
Deckel und Ca2+-Ionen
I.5 Geobacillus zalihae (Q842J9)
Bacillus sp. L2 (Q51413)
Geobacillus sp. SF1 (Q1L776)
Bacillus stearothermophilus
(u.a. A0MTM1)
Bacillus Lipasen zeigen nur 15% Ähnlichkeit mit Gruppe
I.4, pH Optimum variiert (7,5-9,5), Molekulargewichte ca.
46 kDa, wahrscheinlich aufgrund von Insertionen, die
eine Zink-Bindungsstelle enthalten, weisen deshalb
höhere thermale Stabilität auf
22 Einführung
Fortführung Tabelle 6
Gruppe Herkunft der Esterase (Proteinnr.) Merkmale
I.6 Staphylococcus hyicus (P04635)
Staphylococcus xylosus (Q2TPV1)
Staphylococcus warneri (Q5DWE2)
Staphylococcus aureus (u.a.
P10335)
Ca. 75 kDa großes Präproprotein mit ca. 200 AS am N-
terminalen Ende für die effiziente Translokation und
mit möglicher Funktion als intramolekulare Chaperone,
aktives Enzym ca. 46 kDa groß mit breiter
Substratspezifität, pH Stabilität von pH 4 bis 9, einige
Lipasen zeigen Aktivitätssteigerung mit Ca2+-Ionen und
Hemmung durch EDTA, können Polymere bilden,
können als Virulenzfaktoren agieren
I.7 Streptomyces cinnamoneus
(O33969)
Propionibacterium acnes
(u.a. Q59644)
Corynebacterium glutamicum
(u.a. Q8NU60)
Zeigen Ähnlichkeit zu Lipasen der Gruppe I.2 in der
Region von AS 50-150, Lipase S. cinnamoneus 29,2 kDa
und P. acnes 36,4 kDa, Lipase aus P. acnes besitzt
weites Substratspektrum Triacylglyceride und p-NP
Ester C2-C16
I.8 Pseudoalteromonas haloplanktis
(Q3IF07)
Hahella chejuensis (Q2SGZ8)
Colwellia psychrerythraea
(Q48AN1)
Pseudoalteromonas tunicata
(A4CF12)
Neue Gruppe, identifiziert und charakterisiert anhand
Lip1 aus P. haloplanktis, 51 kDa, gebunden an äußere
Bakterienmembran, höhere Aktivität mit langkettigen
Estern, Sequenz zeigt keine nähere Übereinstimmung
mit anderen lipolytischen Enzymen, eher zu marinen
psychrophilen Stämmen, kein Deckel, keine Ca2+-Ionen
Bindungsstelle, neues Motiv LGG(F/L/Y)STG mit Ser
anstatt GXSXG
1.3.4 Cutinasen
Cutinasen sind die einzigen Enzyme, die das Biopolyester Cutin und das Modellsubstrat Poly-ε-
caprolacton abbauen können. Sie zeigen einige Eigenschaften von Lipasen (Hydrolyse unlöslicher
Substrate) und Esterasen (Hydrolyse von löslichen Substraten). Diese Enzyme werden hauptsächlich
von pflanzenpathogenen Pilzen gebildet, es sind aber auch bereits einige Bakterien mit
Cutinaseaktivität identifiziert worden. Sie sind die kleinsten Hydrolasen in der α/β-Hydrolase Familie
(Dutta et al. 2009). Die Enzymklasse der Cutinasen ist eine bisher noch umstrittene Gruppe bei den
Hydrolasen. Es gibt einige bekannte und charakterisierte Cutinasen, z.B. die Cutinase aus
23 Einführung
Fusarium solani, Thermomyces insolens, Pseudomonas mendocina, Aspergillus oryzae und
Thermobifida fusca. Bei der Einteilung der lipolytischen Enzyme wurden die Cutinasen nicht als
selbstständige Gruppe deklariert, sondern es erfolgte z. B. aufgrund der Sequenz die Zuordnung der
Cutinasen aus T. fusca zur Gruppe III der Esterasen (Hausmann und Jaeger 2010). Bei einem
Sequenzalignment zeigten diese Cutinasen Ähnlichkeiten zu Triacylglycerol Lipasen aus
Streptomyces albus G und Streptomyces sp. M1 (Kleeberg et al. 2005). Es sollten weitere
Untersuchungen erfolgen, um die Zuordnung der Cutinasen bei den lipolytischen Enzymen noch
genauer zu versehen.
1.4 Polyethylenterephthalat
Synthetische Polymere und die daraus hergestellten Produkte sind aus unserem heutigen Leben nicht
mehr wegzudenken. Auch in der Textilindustrie haben die künstlichen Fasern eine große Bedeutung.
Speziell Polyesterfasern erlangten in den letzten Jahrzehnten immer mehr Einfluss. Die Produktion
dieser Fasern ist in den vergangenen 50 Jahren konstant angestiegen. Im Jahr 2007 waren bereits
76% aller synthetischen Fasern Polyesterfasern. Bei einer jährlichen Produktion von 30,7 Millionen
Tonnen waren davon 12,4 Millionen Tonnen Stapelfasern und 18,3 Millionen Tonnen Filamentgarn
(Saurer Management AG 2008). Für 2011 wird eine weltweite Produktion von 36 Millionen Tonnen
prognostiziert (Chemical Market Associates Inc. 2010). Die PET-Fasern werden weit verbreitet
genutzt, sowohl einzeln als auch in Mischungen mit anderen Fasern. Einige ihrer vielen Vorteile, die
sie für die Textilindustrie so unverzichtbar machen, sind ihre starke Reißfestigkeit, ihre Beständigkeit
und die Widerstandsfähigkeit gegenüber einer Vielzahl von Chemikalien. Doch besitzen
Polyesterfasern auch einige ungünstige Eigenschaften, wie zum Beispiel ihre starke Hydrophobie,
eine daraus resultierende geringe Wasseradsorption und sie neigen zum Pilling.
Polyethylenterephthalatfasern (PET), die bedeutendsten Polyesterfasern, werden durch
Polykondensation aus Terephthalsäure und Ethylenglycol hergestellt (Abbildung 13).
Abbildung 13: Polykondensationsreaktion von Terephthalsäure und Ethylenglycol zu Polyethylenterephthalat.
COOH
COOH
Terephthalsäure
+
OH
OH
Ethylenglycol
C
O
OR
C
O
O
R
PET
n
24 Einführung
Doch dabei entstehen ebenfalls einige unerwünschte Nebenprodukte, die die negativen
Eigenschaften der Polyesterfasern noch verstärken. Dabei handelt es sich um lineare und zyklische
Oligomere der Ausgangsstoffe. Besonders die Anreicherung von zyklischen Trimeren (Cyclo-tris-
Ethylenterephthalat, CTR), welche extrem wasserunlöslich sind, hat die Bildung von Agglomeraten
auf den Fasern und eine daraus resultierende Störung bei der Weiterverarbeitung (u.a. beim Färben)
zur Folge. Ebenfalls zeigen diese zyklischen Trimere eine Tendenz, sich an metallischen Oberflächen
anzulagern und haben somit auch negative Auswirkungen auf die Färbe- und
Veredelungsmaschinerie. Bisher angewandte Methoden zur Entfernung der zyklischen Trimere, wie
zum Beispiel der Abbau unter hohen Temperaturen, mit NaOH und mittels kationischer Tenside,
haben ebenfalls sehr viele negative Auswirkungen auf die Fasern und die Maschinen. Zum Einen
vermindert die aggressive Behandlung die Qualität der Polyesterfasern und zum anderen wird ein
hoher Gewichtsverlust beobachtet. Weiterhin kommt es neben dem hohen Energieeinsatz durch die
Anwendung der Chemikalien zu einer Anhäufung umweltschädigender Abfälle und zu Störungen an
den Maschinen (Valk et al. 1970; Senner 1973; Hempel 1979; Grosse et al. 1994; Höhn 2003).
Abbildung 14: Struktur eines zyklischen PET-Trimers.
1.4.1 Konventionelle PET-Faserbehandlung
Die bei der Polykondensation entstehenden niedermolekularen Nebenprodukte sind vielfältig und
können sowohl zyklische als auch lineare Verbindungen mit einem Polymerisationsgrad von 2 bis 10
Einheiten sein, wobei nicht alle die weitere Bearbeitung der Textilfaser im gleichen Maße
beeinflussen. Die wichtigsten Problemverursacher sind die zyklischen Trimere und im geringen
Ausmaß die Tetramere, Pentamere und Hexamere (Valk et al. 1970, Senner 1973, Hempel 1979,
Grosse et al. 1994, Höhn 2003). Zyklische und lineare Oligomere mit höheren Polymerisationsgraden
entstehen nur in kleinen Mengen. In Abhängigkeit vom Faserherstellungsprozess beträgt die Menge
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O O
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O
Zyklischer PET-Trimer
25 Einführung
an an der Faser lokalisierten Oligomer zwischen 1 bis 3% des Fasergewichtes. Während des Prozesses
der Hochtemperatur-Färbung erfolgt ein Austritt von bis zu 70% der PET-Oligomer aus der Faser.
Durch weitere Färbe- und Abkühlungsprozesse bilden sich Oligomerablagerungen auf den
Färbemaschinen, welche mit jeder Färbung zunehmen. Die überwiegende Menge der als
Ablagerungen vorliegenden Oligomere (ca. 50-80%) bilden eine grobdisperse Aufschwemmung, die
von den PET-Produkten mittels Filtration abgetrennt werden kann. Diese so gewonnenen Oligomere
werden auch als Oberflächenoligomere bezeichnet und bestehen zu 97 bis 99% aus zyklischen
Trimeren. Sie verursachen eine Vielzahl von negativen Beeinträchtigungen bei der
Weiterverarbeitung der PET-Ware, eine Verringerung der Qualität des Produktes als auch technische
Probleme, wie unter anderem eine Leistungsverringerung der Maschinen, einen höheren
Energieverbrauch und längere Stillstandzeiten. Um diese Probleme auf ein Minimum zu reduzieren,
wurden in der Vergangenheit bereits einige Verfahren entwickelt (Dugal et al. 1973, Kusch 1974,
Baker 1974, Werkes 1975, Keller et al. 1981, Yang und Li 2000, Höhn 2003).
alkalische Vorbehandlung bei hohen Temperaturen
Die Nachteile dabei sind erhöhte Kosten durch den zeit- und energieaufwendigen
Arbeitsschritt, ein Einsatz von umweltschädlichen Chemikalien ebenso wie eine Beschädigung
der Textilfasern.
Vorbehandlung zur PET-Oligomerentfernung mit chlorierten (Methylenchlorid,
Perchlorethylen) oder chlorfreiem Lösungsmittel (Dioxan)
Dies bietet sich aus umwelttoxikologischen und sicherheitstechnischen Gründen nicht als
Alternative an.
Einsatz von Dispergatoren (Tenside) zur Verhinderung der Ablagerung von austretenden
Oligomer
Diese Methode führt zu einem höheren Gehalt an organischen Verbindungen im Abwasser.
alkalisches Färben
Positiv ist dabei eine gleichzeitige Verseifung der Oligomere, diese Methode eignet sich aber
nicht für alle Textilfärbungen.
Nachwäsche als Lösemittelwäsche mit Tetrachlorethen oder Dispergatorwäsche
Auch dieses Verfahren führt zu einem höheren Gehalt an organischen Verbindungen in den
Abwässern.
Nachreinigung als alkalische Verseifung mit Tetraalkylammoniumverbindungen als
Katalysator
Auch hier treffen die bereits oben genannten Nachteile zu.
26 Einführung
Diese Verfahren und auch alle nach dem Oligomermobilisierenden Färbeprozess angewandten und
beschriebenen Methoden gegen die PET-Oligomerdeposition weisen ähnliche wirtschaftliche,
technische und ökologische Nachteile, wie ein hoher zusätzlicher Energieeinsatz, die Verwendung
von produkt-, umwelt- und personenschädigenden Chemikalien und besonders deren Entsorgung,
auf.
Sowohl aus diesen Gründen, aber auch aufgrund des drastischen Gewichtsverlusts der PET-Fasern
und der Verschlechterung ihrer Qualität während der Bearbeitung (Zeronian und Collins 1989, Shukla
et al. 1997), wurde in den letzten Jahren zunehmend nach einem biotechnologischen Prozess zur
Oligomerbearbeitung und -entfernung geforscht, um die traditionellen Faserverarbeitungs-
methoden mit ihren Nachteilen zu ersetzen (Gübitz und Cavaco-Paulo 2001).
1.4.2 Charakterisierung von PET
Bei der PET-Herstellung erfolgen anschließend verschiedenste Modifikationsschritte, welche sich auf
die Eigenschaften des PET-Textiles oder Films auswirken. Während des Schmelzspinnverfahrens
(Abbildung 14) wird die Spinnmasse geschmolzen und anschließend durch eine beheizte Spinndüse
mit einer Geschwindigkeit von 4000 m/min gepresst. Diese Spinndüsen weisen eine Größe zwischen
1-10 cm auf und bestehen aus bis zu 60000 Spinndüsenlöchern mit einem Durchmesser zwischen
0,05 und 1 mm (Abbildung 15). Durch die anschließende Luftkühlung erstarren die Fibrillen und es
erfolgt das Verstrecken, was eine Neuanordnung der PET-Ketten in der Fibrille zur Folge hat.
Abbildung 15: Schematische Darstellung des Schmelzspinnverfahrens von PET-Fibrillen (links) und Darstellung einer
beheizten Schmelzspinndüse (Jahreiß 2005).
27 Einführung
Das Verstrecken erfolgt entweder unter sehr hohen Geschwindigkeiten beim Abziehen von der
Schmelzspinndüse oder indem das gesponnene Filament vor dem Aufrollen über mehrere
verschieden große Rollen geführt wird. Beim Verstrecken werden die zuvor wirr durcheinander
liegenden PET-Ketten in Faserrichtung und auch zueinander ausgerichtet (Abbildung 16). Dadurch
bilden sich auch Wechselwirkungen zwischen den Ketten aus, wie die Wasserstoffbrückenbindungen
(Abbildung 17), und es entstehen teilkristalline Bereiche, welche die Festigkeit der Fasern deutlich
erhöhen. Diese Bindungen sind zu diesem Zeitpunkt noch nicht stabil und würden beim Waschen
zerstört werden, deshalb erfolgt anschließend eine Hitzefixierung.
Abbildung 16: Anordnung der PET-Ketten vor (links) und nach (rechts) dem Verstrecken unter Ausbildung von geordneten kristallinen Bereichen (Jahreiß 2005).
Abbildung 17: Darstellung der Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den durch Verstrecken entstandenen geordneten PET-Ketten (grün).
Verstrecken
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H
HH
28 Einführung
Die Eigenschaften von PET-Fasern, wie Glanz, Transparenz, Farbeindruck (dunkler/heller),
Schmutzsichtbarkeit, Griff (weicher/härter), eine Volumenerhöhung und Wärmeisolierung, werden
ebenfalls durch ihren Faserquerschnitt bzw. der Faseroberfläche beeinflusst (Abbildung 18). Eine
weitere Modifikation zur Optimierung der Volumenzunahme, der elastischen Dehnung, besserer
Wärmeisolierung (durch Lufteinschlüsse), des flauschigen Griffs und zur besseren
Feuchtigkeitsaufnahme für die Herstellung von elastischen Bekleidungswaren ist die Texturierung.
Dabei werden die zuvor glatten Synthesefasern mechanisch gekräuselt und somit liegen nun
Faserschlingen zwischen der Haut und dem Kleidungsstück, was zur Verbesserung der
Trageeigenschaften führt (Abbildung 18). Weiterhin hat die Modifikation eine höheren
Feuchtigkeitsaufnahme und einen erhöhten Lufteinschluss zur Folge, hingegen wird Glanz und Pilling
vermindert (Jahreiß 2005).
Abbildung 18: Darstellung möglicher Faserquerschnitte und Oberflächen (links) und die PET-Fasern vor und nach dem Texturieren (rechts) (Jahreiß 2005).
Die Textilveredelung, ein Hauptgebiet der Textilchemie, umfasst sämtliche Arbeitsprozesse, die die
äußeren Eigenschaften der Textilien verschönern, wie Färben, Bleichen, Bedrucken, sowie
Maßnahmen, die ihren Gebrauchswert steigern (Pflegeleichtausrüstung, Knitterfestmachen), sowie
Imprägnierung und Silikonisieren (weicher und geschmeidiger, durch Minimierung der Reibung der
Fasern untereinander). Diese Maßnahmen werden im unversponnenen Zustand der Textilfaser („in
der Flocke“) durchgeführt. Dazu zählt ebenfalls das Finish oder auch Ausrüstung genannt, die letzte
Bearbeitung von Textilien. Es dient zur Verschönerung, Hervorhebung oder Unterdrückung
bestimmter Eigenschaften. Dazu zählen unter anderem Waschen, Bleichen, Färben, Bedrucken,
Prägen, Imprägnieren und Hydrophobieren (d.h. wasserabweisend machen, z.B. durch
Aluminiumsalze oder Paraffinprodukte), knitterfest machen, Mattieren (z.B. durch Einschlüsse von
Titandioxid in die Faser), antimikrobiell machen (durch Zusätze von z.B. Bisphenolen oder
29 Einführung
Hexachlorophen; wodurch es zu weniger Hautpilzen und Körpergeruch kommt) und
schwerentflammbar machen (z.B. durch Borax oder Titankomplexe) (Jahreiß 2005).
PET besteht aus kristallinen und amorphen Bereichen und weist somit sowohl eine
Glasübergangstemperatur (für die amorphen Bereiche) als auch eine Schmelztemperatur (für die
kristallinen Bereiche) auf. Die Glasübergangstemperatur (Tg) ist die Temperatur, bei der ganz oder
teilweise amorphe Polymere vom glasigen oder hartelastischen, spröden Zustand in den
gummielastischen, flexiblen Zustand übergehen. Tg wird daher auch "Erweichungstemperatur"
genannt und ist für jeden Kunststoff spezifisch (Abbildung 19). Da Wärme nichts anderes als
kinetische Energie ist, bewegen sich unterhalb der Glasübergangstemperatur die Molekülketten
kaum. Bei der Erwärmung des Kunststoffes bewegen sie sich immer mehr, halten aber noch
zusammen, bis schließlich mit dem Erreichen der Glasübergangstemperatur sich längere Abschnitte
der Molekülketten frei bewegen können. Die bei Temperaturen oberhalb der
Glasumwandlungstemperatur (ca. 80°C) beweglichen Molekülketten kristallisieren bei ca. 160°C aus
(Abbildung 19, Kristallisationspeak), bevor bei ca. 255°C der endotherm ablaufende Schmelzvorgang
beginnt (Abbildung 19, Schmelzpeak).
PET kann mit Hilfe der Differentialrasterkalorimetrie (DSC) bezüglich der
Glasumwandlungstemperatur, dem Schmelzverhalten, der Kristallinität und des
Kristallisationsverhaltens charakterisiert werden (Abbildung 19). Dabei erfolgt mit der Probe eine
lineare Erhitzung und anhand der Enthalpieänderungen bezüglich einer Referenz kann ein wie in
Abbildung 19 dargestelltes Diagramm erstellt werden. Durch die Integration des Schmelzpeaks kann
die Kristallinität der vorliegenden PET Probe berechnet werden.
Abbildung 19: DSC-Kurve einer PET-Folie (http://web.utk.edu/~mse/Textiles/Polymer%20Crystallinity.htm).
Die Glasübergangstemperatur hängt im Wesentlichen von der Struktur der Polymere ab. Die
Flexibilität der Hauptkette ist einer der wichtigsten Faktoren. Ein Kunststoff hat eine niedrige
Glasübergangstemperatur, wenn sich die Molekülketten bei geringen Temperaturen schon von sich
aus gut bewegen können. Das bedeutet, dass Polymere, die aus aliphatischen Bausteinen aufgebaut
sind, eine geringere Glasübergangstemperatur besitzen als Polymere, welche aus aromatischen
Monomeren, wie der Terephthalsäure, zusammengesetzt sind. Bei PET handelt es sich um ein
Polymer, das sowohl aliphatische als auch aromatische Bestandteile besitzt und eine
Glasübergangstemperatur von ca. 80°C.
1.4.3 Biofunktionalisierung von PET
In den letzten Jahrzehnten erfolgten verschiedenste Studien über die Biofunktionalisierung von
Polyethylenterephthalat, eine Übersicht darüber gibt Zimmermann und Billig (2011). Zunächst wurde
noch angenommen, dass aromatische Polyester, also auch PET, resistent gegenüber einem
hydrolytischen Abbau sind (Kint und Munoz-Guerra 1999, Müller et al. 2001). Ferner erfolgten
Veröffentlichungen von verschiedenen Autoren, die keine enzymatischen Effekte auf den PET-Fasern
nachweisen konnten (Tokiwa und Suzuki 1977, Levefre et al. 1999). Weitere Untersuchungen
hingegen dokumentieren die Möglichkeit der biokatalytischen Modifikation der PET-Fasern.
Veränderungen in den physikalischen Eigenschaften wie Reißfestigkeit, Viskosität und
Dehnungsverhalten von PET-Film und Fasern wurde nach der Inkubation mit einer Enzym-
Präparation aus Cladosporium cladosporioides festgestellt (Sato 1983). Ferner wurde von Oda et al.
(1999) beschrieben, dass die Inkubation mit Arthrobacter und Trichosporon Spezies ebenfalls
Modifikationen der PET-Fasern zur Folge hat. Ebenfalls konnte eine Verbesserung der
Wasserbenetzbarkeit und der Absorptionseigenschaften sowie eine Verbesserung der Anfärbbarkeit
von PET-Textilien und Fasern nach einer enzymatischen Hydrolyse mit bakteriellen Cutinasen aus
Pseudomonas mendocina (Hsieh und Cram 1998, Hsieh et al. 2003, Bott et al. 2003, Kellis et al. 2001,
Yoon et al. 2002, Dyson et al. 2005), aus Thermobifida fusca (Alisch et al. 2004, Alisch-Mark et al.
2006, Heumann et al. 2006, Feuerhack et al. 2008, Eberl et al. 2008, Eberl et al. 2009, Brueckner
et al. 2008) und mit eukaryotischen Cutinasen aus Fusarium solani (O´Neill und Cavaco-Paulo 2004,
Silva et al. 2005, Alisch-Mark et al. 2006, Heumann et al. 2006, Araujo et al. 2007, O´Neill et al. 2007,
Nimchua et al. 2007, Nimchua et al. 2008) und Thermomyces insolens (Abo et al. 2004, Svendsen
et al. 2005, McCloskey und Jump 2005, Liu et al. 2008) nachgewiesen werden (Tabelle 7). Die Enzyme
bewirken dabei durch die partielle Hydrolyse von Esterbindungen und die dadurch entstehenden
Hydroxyl- und Carboxylgruppen eine Zunahme der hydrophilen Eigenschaften auf der Oberfläche der
PET-Fasern. Mit Hilfe einer solchen Behandlung erhält man bei Polyestertextilien verbesserte
31 Einführung
Eigenschaften, wie zum Beispiel größere Bindung von kationischen Farbstoffen, einen Depilling
Effekt, die Entfernung von Polyesterschlichte und eine bessere Entfernbarkeit von Ölflecken. In
weiteren Untersuchungen wurden Textilien und Fasern mit eukaryotischen Lipasen aus
Aspergillus sp. (Fischer-Colbrie et al. 2004, Heumann et al. 2006, Wang et al. 2008), aus
Thermomyces lanuginosus (Almansa et al. 2008, Brueckner et al. 2008, Eberl et al. 2008, Eberl et al.
2009), aus Candida antarctica (Anderson et al. 1999, Khoddami et al. 2001, Lee und Song 2010, Kim
und Song 2006), mit der bakteriellen Lipase aus Burkholderia cepacia (Heumann et al. 2006, Kim und
Song 2006) und einer tierischen Lipase (Kim und Song 2006, Kim und Song 2008, Hsieh und Cram
1998) behandelt und dabei eine Erhöhung der Hydrophilie erzielt. Weiterhin konnte eine
Verbesserung der Eigenschaften der PET-Fasern durch die Inkubation mit Esterasen und Proteasen
bewiesen werden (Kontkanen et al. 2006, Zhang et al. 2004, Zhang et al. 2006, Liebminger et al.
2007, Kim und Song 2010).
Abbildung 20: Darstellung der chemischen Struktur der Polyethylenterephthalat Polymerkette, der zyklischen Trimere und der enzymatisch freigesetzten Hydrolyseprodukte (Zimmermann und Billig 2011).
Neben den PET-Textilien wurden in den letzten Jahren auch Studien zur Modifikation und zum
Bioabbau von PET-Folien, welche unter anderem in der Verpackungsindustrie Anwendung finden,
durchgeführt. Dabei erfolgte mit den bereits benannten Cutinasen aus F. solani (Vertommen et al.
2005, Ronkvist et al. 2009), P. mendocina (Ronkvist et al. 2009), T. fusca (Müller et al. 2005, Eberl
et al. 2008, Eberl et al. 2009) und T. insolens (Abo et al. 2004, Ronkvist et al. 2009) die partielle
Hydrolyse der Folien unter verschiedenen Bedingungen (Tabelle 5). Ebenfalls waren die Lipase aus
T. lanuginosus (Almansa et al. 2008, Brueckner et al. 2008, Eberl et al. 2008, Eberl et al. 2009) und die
Esterase aus C. cladosporioides (Sato 1983) in der Lage, den PET-Film zu modifizieren. Diese
hydrophilen PET-Filme werden ferner für medizinische Anwendung genutzt.
32 Einführung
Abbildung 21: Darstellung der chemischen Struktur der Polytrimethylenterephthalat Polymerkette, der zyklischen Dimere und der enzymatisch freigesetzten Hydrolyseprodukte (Zimmermann und Billig 2011).
Der direkte Abbau von zyklischen PET-Trimeren erfolgte bereits mit den Cutinasen aus T. fusca (Chen
et al. 2010) und T. insolens (Andersen et al. 1999, Riegels et al. 2001, Hooker et al. 2003, Abo et al.
2004, Jump und McCloskey 2004, Svendsen et al. 2005, Figueroa et al. 2006). Für Screening-Studien,
die Optimierung der Hydrolysebedingungen und kinetische Studien wurden in den letzten Jahren
ebenfalls diverse kurzkettige Modellsubstrate eingesetzt (Abbildung 20-22) (Andersen et al. 1999,
Kellis et al. 2001, Riegels et al. 2001, Hooker et al. 2003, Jump et al. 2004, Abo et al. 2004, Zhang
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Michels et al. 2006, Pütz 2006, Zhang et al. 2006, Liebminger et al. 2007, Eberl et al. 2008, Wang
et al. 2008, Eberl et al. 2009, Chen et al. 2010).
Nach der Behandlung der PET-Textilien oder -Filme kommen verschiedenste analytische Methoden
zur Charakterisierung der modifizierten Oberfläche zur Anwendung. Dabei wird zwischen der
direkten und der indirekten Oberflächenanalytik unterschieden.
Abbildung 22: Darstellung der chemischen Struktur der angewandten Polyethylenterephthalat Modellsubstrate (Zimmermann und Billig 2011).
33 Einführung
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36 Einführung
Zur direkten Oberflächenanalytik zählen unter anderem XPS (Röntgenphotoelektronen-
spektroskopie), bekannt auch als ESCA (Elektronenspektroskopie für chemische Analyse), FTIR
(Fourier-Transformations-Infrarotspektrometrie), SEM (Rasterelektronenmikroskopie) bzw. ESEM
(Umgebungsrasterelektronenmikroskopie) und AFM (Atomkraftmikroskopie). Während der XPS
Analyse wird die elementare Zusammensetzung der PET Oberfläche in einem Bereich von 10 nm
detektiert und die spezifischen funktionellen Gruppen nachgewiesen. Enzymatische Modifikationen
durch Hydrolasen wurden bereits mehrfach bestätigt (Vertommen et al. 2005, Feuerhack et al. 2008,
Brueckner et al. 2008, Eberl et al. 2009), allerdings ist eine vorherige Reinigung der PET-Filme
notwendig, um verfälschende Proteinverunreinigungen zunächst zu entfernen (Vertommen et al.
2005, Feuerhack et al. 2008). Mit der FTIR Analyse werden ebenfalls chemische Veränderungen auf
der PET-Oberfläche nachgewiesen. Mit Hilfe infraroter Strahlung werden die Moleküle in ein
energetisch höheres Niveau versetzt und die bei der Rückkehr in den nicht angeregten Zustand
freiwerdende Strahlung wird analysiert und gibt Rückschlüsse über die Zusammensetzung der Probe
(Goddard und Hotchkiss 2007). Änderungen in der chemischen Struktur von PET-Filmen nach einer
enzymatischen Behandlung wurden mittels FTIR bereits von Donelli et al. 2009 nachgewiesen. Das
SEM nutzt einen Elektronenstrahl, um die Oberfläche abzutasten und somit ein dreidimensionales
Abbild zu erschaffen. Damit können Veränderungen wie Ablagerungen oder Löcher nachgewiesen
werden. Fasermodifikationen wurden bereits bestätigt durch eine Schweineleber Esterase (Zhang
et al. 2004, Zhang et al. 2006), Lipasen von C. antarctica und aus Schweineleber (Lee und Song 2010,
Kim und Song 2006) und Cutinasen aus P. mendocina und T. insolens (Kellis et al. 2001, Yoon et al.
2004). Die Cutinase aus T. insolens bildete während der Enzymbehandlung von PET-Filmen viele
Löcher und somit eine rauere Oberfläche (Ronkvist et al. 2009). Nach der Inkubation von PTT-
(Polytrimethylenterephthalat) Fasern mit der Cutinase aus T. fusca zeigte sich hingegen keine
Oberflächenveränderung per ESEM (Eberl et al. 2008, Brueckner et al. 2008). Die Abtastung der
Oberfläche beim AFM erfolgt mit einer dünnen Nadel, welche einen Laserstrahl aussendet. Der von
der Oberfläche reflektierte Laserstrahl wird von einem Photodetektor aufgenommen und in eine
Oberflächenaufnahme umgewandelt. Bisher wurde per AFM die Oberflächenveränderung von PET-
Fasern nach der Behandlung mit der Cutinase aus T. fusca nachgewiesen (Feuerhack et al. 2008).
Bei der indirekten Oberflächenanalyse wird die Modifikation mit Hilfe weiterer Agenzien detektiert.
Die gesteigerte Hydrophilie der Textilien wird mittels Kontaktwinkelmessung, Steighöhen-
bestimmung, Tropfentest, Flüssigkeitsaufnahmekapazität, Feuchtigkeitsaufnahme und Färbetests mit
anschließender Farbintensitätsmessung nachgewiesen. Für diese Analysemethoden ist es ebenfalls
wichtig, dass das noch verbliebene Enzym an der Oberfläche vor dem Nachweis entfernt wird, da
sonst verfälsche Ergebnisse auftreten (Vertommen et al. 2005, Brueckner et al. 2008, Donelli et al.
2009). Bei der Kontaktwinkelmessung wird der auftretende Winkel eines Wassertropfens auf einer
37 Einführung
festen Oberfläche bestimmt. Je kleiner der Winkel ist, desto hydrophiler ist die Oberfläche (ca. 0-
90°), ab 90° gilt der Feststoff als hydrophob und ab ca. 160° als superhydrophob, was auch als
Lotuseffekt bekannt ist. Enzymatisch behandelte PET-Oberflächen wurden unter anderem von Hsieh
und Yu 1992, Hsieh 1995, Yoon et al. 2002, Heumann et al. 2006, Donelli et al. 2009 und Lee und
Song 2010 mit dieser Methode analysiert. Bei der Steighöhenbestimmung wird die Wasseraufnahme
eines Textilstreifens, der mit einem Ende in eine Flüssigkeit getaucht ist, nach definierten
Zeitabständen in Zentimetern bestimmt. Eine hohe Steighöhe geht einher mit einer hydrophilen
Oberfläche des PET-Textils (Fischer-Colbrie et al. 2004, Alisch-Mark et al. 2006, Müller 2006). Eine
ähnliche Methode zum Nachweis der Hydrophilie ist der Tropfentest, bei dem der Zeitabstand von
der Aufbringung eines definierten Tropfens Flüssigkeit auf ein PET-Textil bis zur vollständigen
Aufnahme des Tropfen in das Textil gemessen wird (Heumann et al. 2006, Brueckner et al. 2008, Liu
et al. 2008). Das Verhältnis an Flüssigkeit, das ein trockenes PET-Textil maximal aufnehmen kann,
zum Textil wird als Flüssigkeitsaufnahmekapazität bezeichnet. Die Flüssigkeitsaufnahme hingegen ist
die Menge an Wasser, welche eine trockene Faser oder Textil aus der Luft mit definierter
Feuchtigkeit absorbiert kann. Beide Methoden verdeutlichen Veränderungen in den
Absorptionseigenschaften von modifizierten PET-Textilien (Hsieh et al. 1996, Hsieh und Cram 1998,
Kim und Song 2006, Lee und Song 2010). Aufgrund der eingefügten hydrophilen funktionellen
Gruppen werden die Textilien verstärkt durch kationische oder reaktive Farbstoffe angefärbt. Die
Brillianz der Farbe kann durch eine Farbintensitätsmessung bestimmt werden und somit indirekt die
Hydrophilie nachweisen (Yoon et al. 2001, Alisch et al. 2004, O´Neill und Cavaco-Paulo 2004,
Brueckner et al. 2008, Eberl et al. 2009).
Die enzymatische Hydrolyse kann nicht nur durch die Modifikationen auf der Oberfläche
nachgewiesen werden, sondern auch freigesetzte Hydrolyseprodukte können mit verschiedensten
Methoden analysiert werden. Da diese wasserlöslichen Produkte Derivate der Terephthalsäure bzw.
Terephthalsäure direkt sind, können sie einfach im ultravioletten Wellenlängenbereich von 240-
255 nm spektrophotometrisch detektiert werden (Kellis et al. 2001, Alisch et al. 2004, O´Neill und
Cavaco-Paulo 2004). Da enthaltene Proteine die UV Messung beeinflussen, dient dieser Nachweis nur
zum Screening nach PET Aktivität. Terephthalsäure kann ebenfalls mittels Dünnschich-
chromatographie nachgewiesen werden (Fischer-Colbrie et al. 2004, Pütz 2006, Liebminger et al.
2007). Die Bestimmung der Konzentrationen der verschiedenen Hydrolyseprodukte; u. a. TPA, MHET
und BHET; freigesetzt aus PET-Textilien, Filmen, zyklischen PET-Trimeren und weiteren
Modellsubstraten kann per RP-HPLC (Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie)
erfolgen (Riegels et al. 2001, Hooker et al. 2003, Fischer-Colbrie et al. 2004, Vertommen et al. 2005,
Figueroa et al. 2006, Heumann et al. 2006, Eberl et al. 2008, Eberl et al. 2009, Ronkvist et al. 2009,
Chen et al. 2010). Terephthalsäure einzeln kann auch mittels Fluoreszenz-Spektroskopie detektiert
38 Einführung
werden, dazu erfolgt zunächst die Bildung von Hydroxyterephthalsäure (HTA), welche bei 329 nm
angeregt und bei 425 nm die freigesetzte Emissionsstrahlung gemessen wird (O´Neill und Cavaco-
Paulo 2004, Nimchua et al. 2007). Die freigesetzte TPA kann ebenfalls mittels Titration mit NaOH
nach der enzymatischen Hydrolyse nachgewiesen werden (Kim und Song 2008, Kim und Song 2010).
Für kinetische Studien zur Charakterisierung verschiedener PET-Hydrolasen erfolgte auch schon die
Anwendung eines pH-Staten um die Säurefreisetzung über einen längeren Zeitraum zu detektieren
(Ronkvist et al. 2009).
Bei den Untersuchungen mit den verschiedenen PET-Hydrolasen wurde eine Korrelation der
enzymatischen Abbaurate mit dem Temperaturunterschied zwischen der Glasübergangstemperatur
Tg (amorphe Bereiche) bzw. der Schmelztemperatur Tm (kristalline Bereiche) und der
Hydrolysetemperatur identifiziert. Da die Polymerketten in der Nähe dieser charakteristischen
Temperaturen deutlich mobiler sind, können sie schneller erreicht und hydrolysiert werden durch die
PET-Hydrolasen. Deshalb sollten die PET Hydrolysen nahe der Tg von amorphen PET erfolgen (Witt
et al. 1997, Marten et al. 2003, Marten et al. 2005).
1.4.4 PET-Hydrolasen
In den letzten Jahren wurden verschiedene Enzymgruppen für eine enzymatische Hydrolyse von PET
Substraten eingesetzt, mit unterschiedlichen Abbauraten als Folge. Die am häufigsten verwendeten
Enzyme gehören zur Gruppe der Cutin Hydrolasen (EC 3.1.1.74.), bekannt auch als Cutinasen
(Tabelle 5).
Die am häufigsten eingesetzten und somit am besten charakterisierten PET-Cutinasen sind die
rekombinant produzierten Wildformen oder bereits optimierten Mutanten isoliert aus den
Bakterienstämmen Pseudomonas mendocina (zuvor Pseudomonas putita), Thermobifida fusca und
den eukaryotischen Stämmen Fusarium solani und Thermomyces insolens. Bei den drei zuerst
genannten Enzymen handelt es sich definitiv um Cutinasen, da diese Enzyme nachgewiesene
hydrolytische Aktivität gegenüber dem Biopolyester Cutin zeigten (Sebastian et al. 1987, Kleeberg
et al. 2005, Purdy und Kolattukudy 1973, Purdy und Kolattukudy 1975). Die Cutinase aus T. insolens
wird von der ersten literarischen Erwähnung an als Cutinase bezeichnet, einen eindeutigen Nachweis
anhand von Daten sind die Autoren aber bisher schuldig geblieben (Sandal et al.1995, Andersen et al.
1999, Riegels et al. 2001, Hooker et al. 2003, Abo et al. 2004, Svendsen et al. 2005, Figueroa et al.
2006, Ronkvist et al. 2009). Trotz dieses fehlenden Nachweises wird für die nachfolgende Darstellung
in Übereinstimmung mit der Literatur weiterhin die Hydrolase als Cutinase bezeichnet.
39 Einführung
Tabelle 8: Vergleich der PET-Hydrolasen von F. solani (Carvalho et al. 1998, Carvalho et al. 1999, Ronkvist et al. 2009), T. insolens (Sandal et al. 1996, Ronkvist et al. 2009), P. mendocina (Bott et al. 2003, Ronkvist et al. 2009) und T. fusca (Kleeberg et al. 2005, Chen S et al. 2008).
Für den Einsatz von T. fusca KW3 zur Esteraseproduktion mussten zunächst Zellen in einem
Vollmedium, dem Czapek-Medium, angezogen werden, welche dann anschließend im
Enzymproduktionsmedium, dem Mineralsalzmedium (MSV-Medium), das gewünschte Enzym in
größeren Mengen synthetisierten. Damit die Zellen sich in der exponentiellen Phase beim
Überimpfen befanden, erfolgte die Aufnahme einer Wachstumskinetik des Actinomyceten
T. fusca KW3 im Komplexmedium. Dafür wurden drei 250 ml Czapek-Medien mit dem Actinomyceten
angeimpft und für 7 Tage bei 50°C und 150 rpm kultiviert. Täglich wurden 10 ml Probe genommen,
die Zellen von der Nährlösung abgetrennt, gewaschen und bei 105°C über Nacht getrocknet. Nach
dem Abkühlen der Filter im Exsikkator wurde ihr Gewicht bestimmt und die Trockenmasse aus der
Differenz der Filtergewichte und dem Volumen der Probe berechnet.
Abbildung 25: Wachstumskurve von T. fusca KW3 im Czapek-Medium bei 50°C und 150 rpm.
Die Wachstumskurve von T. fusca KW3 im Czapek-Medium wurde als Biotrockenmasse (mg/ml) über
die Zeit (Tage) dargestellt (Abbildung 25). In den ersten beiden Tagen erfolgte maximales
Zellwachstum in der exponentiellen Phase. Vom zweiten bis vierten Tag folgte die statische Phase,
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
0 1 2 3 4 5 6 7
Bio
tro
ck
en
ma
ss
e (
mg
/ml)
Kultivierungsdauer (d)
Ergebnisse und Diskussion 78
bei der die Neubildungsrate gleich der Absterberate aufgrund von gebildeten toxischen
Nebenprodukten und mangelnden Nährstoffen ist. In dieser Phase werden Sekundärprodukte, wie
unter anderem Antibiotika, gebildet. Als letzte Phase schloss sich die Absterbephase an, bei der
durch Zelllyse eine deutliche Abnahme der Biomasse erfolgt. Bei T. fusca KW3 im Czapek-Medium
konnte hingegen nur ein leichter Abfall der Biotrockenmasse registriert werden. Die Kultivierung der
Vorkultur für die spätere Enzymproduktion erfolgte, abgeleitet aus der oben dargestellten
Wachstumskurve, in 2 Tagen.
Für die Enzymproduktion im Minimalmedium ist es wichtig, möglichst wenig Saccharose aus dem
Czapek-Medium mit dem Inoculum in das Produktionsmedium einzutragen, da Glucose ein Hemmer
der Esteraseproduktion ist. Deshalb wurden die Zellen nach der sterilen Ernte und erfolgter
Zentrifugation in sterilem 25 mM Phosphatpuffer (pH 8) des gleichen Volumens aufgenommen.
3.1.2 Wachstum von T. fusca KW3 im MSV-Medium
3.1.2.1 Esterasebildung mit verschiedenen synthetischen und natürlichen Polyestern
Als Mediumzusatz für eine Esteraseproduktion wurden folgende Polyester-Oligomere und Polymere
im MSV-Medium eingesetzt (je 2 g/L): recyceltes PET-Granulat, eine PET-Oligomerpräparation, eine
zyklische PET-Oligomerpräparation, BHET, PBT-Fasern und Präparationen der natürlichen
Biopolyester Cutin und Suberin. Dazu wurden die MSV-Medien mit den im Czapek-Medium 2 Tage
vorkultivierten Zellen angeimpft. Die Kultivierung erfolgte über einen Zeitraum von 10 Tagen.
Anschließend wurden die Kulturüberstände gewonnen und Proben davon auf ein SDS Gel
aufgetragen und elektrophoretisch aufgetrennt. Darüber hinaus wurde eine Aktivitätsfärbung mit
Fast Red und 2-Naphtylacetat durchgeführt.
Sowohl unter Einsatz von PET-Fasern, recyceltem PET-Granulat, der PET-Oligomerpräparation und
PBT-Fasern konnte die Bildung einer ca. 52 kDa großen Esterase gelelektrophoretisch nachgewiesen
werden (Abbildung 26, Spur 1, 2, 3 und 6). Die zellfreien Überstände unter Verwendung der
zyklischen PET Oligomerpräparation bzw. BHET zeigten nur eine schwache bzw. keine Bande im SDS-
PAGE (Abbildung 26, Spur 4 und 5). Mit diesen Substraten wurde nur wenig bzw. keine Esterase
produziert. Hingegen konnte mit Cutin und Suberin als Substrat keine 52 kDa Esterase identifiziert
werden, aber dafür eine kleinere, ca. 29 kDa große Esterase, allerdings in verhältnismäßig großen
Mengen (Abbildung 26, Spur 7,8).
Ergebnisse und Diskussion 79
Abbildung 26: SDS-PAGE und Aktivitätsfärbung mit den Esterasen in den zellfreien Überständen des MSV-Mediums nach 10 tägiger Inkubation bei 50°C mit PET-Fasern (Spur 1), recyceltes PET-Granulat (Spur 2), einer PET-Oligomerpräparation (Spur 3), einer zyklischen PET-Oligomerpräparation (Spur 4), BHET (Spur 5), PBT-Fasern (Spur 6), einer Suberinpräparation (Spur 7) und einer Cutinpräparation (Spur 8).
Ausgehend von der Zielstellung der Arbeit, eine PET-Trimere abbauende Esterase zu identifizieren,
aufzureinigen und zu charakterisieren, stand die durch Kultivierung unter Verwendung der Substrate
PET-Fasern, recyceltes PET-Granulat und PET-Oligomerpräparation identifizierte 52 kDa große
Esterase zunächst im Mittelpunkt der nachfolgenden Untersuchung. Inwieweit die durch Induktion
mit der Suberin bzw. Cutinpräparation identifizierte 29 kDa große Esterase auch PET abbauen kann,
wird zu einem späteren Zeitpunkt untersucht.
Im nächsten Schritt wurden die gebildeten Esteraseaktivitäten mittels p-NPB Aktivitätsbestimmung
während 10-tägiger Kultivierung im MSV-Medium mit PBT-Fasern, PET-Fasern, recyceltem PET-
Granulat, einer PET-Oligomerpräparation, einer zyklischer PET-Oligomerpräparation bzw. BHET
untersucht. Die Entwicklung der bestimmten Aktivitäten ist in Abbildung 27 graphisch dargestellt und
die maximal produzierten Aktivitäten sind in Tabelle 12 zusammengefasst. Die höchste
Esteraseaktivität von 24 mU/ml wurde mit PET-Fasern als Additiv erreicht, wobei während der
10 Tage Kultivierung die Enzymaktivität stetig zunahm. Unter Einsatz von recyceltem PET-Granulat,
PBT-Fasern, einer PET-Oligomerpräparation, einer zyklischer PET-Oligomerpräparation und BHET
konnten ebenfalls Esteraseaktivitäten gemessen werden, aber diese waren im Vergleich zur
Enzymaktivität aus dem MSV-Medium mit PET-Fasern deutlich geringer.
Obwohl beim Einsatz von BHET als Mediumzusatz in der SDS-PAGE (Abbildung 26) keine 52 kDa
große Bande im zellfreien Überstand nachzuweisen war, wurde auch hier nach 3 Tagen Kultivierung
eine Esteraseaktivität gemessen, die mit 21 mU/ml nur etwas geringer war als bei Verwendung von
PET-Fasern als Induktor (24 mU/ml). Eine Erklärung, warum die Bande in der SDS-PAGE nach
10 Tagen Kultivierung mit BHET nicht nachzuweisen war, ist, dass zu diesem Zeitpunkt bereits keine
52 kDa Esterase
29 kDa Esterase
1 2 3 4 5 6 7 8
Ergebnisse und Diskussion 80
detektierbare Esterasemenge mehr vorlag. Wahrscheinlich erfolgte mit BHET nur eine Produktion bis
zum 3. Tag der Kultivierung und anschließend wurde das Enzym inaktiviert oder abgebaut, was auch
mit dem Kurvenverlauf in Abbildung 27 übereinstimmen würde.
Abbildung 27: Esteraseproduktion durch T. fusca KW3 mit recyceltem PET-Granulat, PET-Oligomerpräparation, zyklische PET-Oligomerpräparation, BHET, PBT und PET-Fasern über einen Zeitraum von 10 Tagen im MSV-Medium.
Tabelle 12: Esteraseproduktion durch T. fusca KW3 im MSV-Medium mit verschiedenen Additiven über einen Zeitraum von 10 Tagen.
Substrat
(2 g/L)
Kultivierungstag
mit der höchsten
Enzymaktivität
Enzymaktivität
(U/ml)
Proteinkonzentration
(mg/ml)
Spezifische
Enzymaktivität
(U/mg)
BHET 3 0,021 0,25 0,084
PET-Oligomer-
präparation
3 0,007 0,14 0,047
zyklische PET-
Oligomer-
präparation
3 0,003 0,18 0,018
PET-Fasern 10 0,024 0,17 0,142
PBT-Fasern 10 0,014 0,06 0,240
Für die Proteinaufreinigung ist ebenfalls die gebildete Gesamtproteinmenge im Vergleich zur
Esterasemenge von Interesse, um einen optimalen Zeitpunkt für die Ernte der Rohenzymlösung
0
0,005
0,01
0,015
0,02
0,025
0 1 2 3 4 5 6 7
En
zym
ak
tivit
ät
(U/m
l)
Kultivierungsdauer (d)
PET Oligomerpräparation zyklische PET Oligomerpräparation BHET
PBT Fasern PET Fasern recyceltes PET Granulat
Ergebnisse und Diskussion 81
festzulegen. Um diese Entwicklung genauer zu untersuchen, erfolgte während der Kultivierung von
T. fusca KW3 im MSV-Medium mit PET-Fasern zu verschiedenen Zeitpunkten eine Probenahme.
Diese Proben wurden anschließend per SDS-PAGE gelelektrophoretisch aufgetrennt und unspezifisch
mit Coomassie angefärbt. Zum Vergleich wurde diese Untersuchung ebenfalls mit einer Suberin-
präparation im MSV-Medium durchgeführt, um nochmals die Unterschiede zwischen den beiden
verwendeten Additiven und der daraus folgenden Enzymproduktion zu verdeutlichen.
3.1.2.2 Esterasebildung mit einer Suberinpräparation
T. fusca KW3 wurde in 5 Kolben mit 250 ml MSV-Medium mit Suberin als Additiv über einen Zeitraum
von 10 Tagen bei 50°C kultiviert. Der zellfreie Überstand von je einem Kolben wurde nach 0, 2, 4, 7
und 10 Tagen Kultivierung durch Zentrifugation gewonnen, die Esteraseaktivität und der
Proteingehalt mit den Standardbestimmungen gemessen und der Überstand gefriergetrocknet. In
Abbildung 28 sind die Esteraseaktivitäten (U/ml) und die maximalen spezifischen Esteraseaktivitäten
(U/mg) der zellfreien Kulturüberstände während des Zeitraums der Kultivierung graphisch
dargestellt.
Die maximale Esteraseaktivität (8,1 U/ml) und spezifische Esteraseaktivität (50,8 U/mg) wurden nach
48 Stunden Kultivierung gemessen, danach erfolgte eine Aktivitätsabnahme. Bis zum 7. Tag blieb die
Esteraseaktivität konstant auf einem Stand von 30 U/mg Protein, danach sank die Aktivität auf
0,03 U/ml und 0,289 U/mg ab.
Darüber hinaus wurden Proben der zellfeien Überstände mittels SDS-PAGE gelelektrophoretisch
aufgetrennt (Abbildung 29). Dafür wurden die Proben mit gleichen Volumenmengen auf das Gel
aufgetragen. Anhand des Gelphotos wird sichtbar, dass während der Kultivierung ein Protein mit ca.
29 kDa Größe gebildet wurde, dessen Konzentration bis zum 2. Tag anstieg und anschließend
während der weiteren Kultivierung stetig sank.
Ergebnisse und Diskussion 82
Abbildung 28: Bestimmung der Esteraseaktivitäten (◊) und der spezifischen Esteraseaktivitäten () während des
Wachstums im MSV-Medium unter Zugabe von Suberin.
Abbildung 29: SDS-PAGE der zellfreien Überstände nach Inkubation mit Suberin im MSV-Medium, links Coomassie-gefärbtes Gel; rechts Gel mit Aktivitätsfärbung mit Fast Red. Spur 1, 7: Roti
®-Mark SDS Proteinstandard; Spur 2:
Nullwert; Spur 3, 8: zellfreier Überstand nach 2 Tagen Kultivierung; Spur 4: zellfreier Überstand nach 4 Tagen Kultivierung; Spur 5: zellfreier Überstand nach 7 Tagen Kultivierung; Spur 6: zellfreier Überstand nach 10 Tagen Kultivierung.
Zusätzlich erfolgte die Kultivierung von T. fusca KW3 für die Bestimmung der Biotrockenmasse-
bildung im MSV-Medium mit Suberin in 2 L Erlenmeyerkolben mit 750 ml Medium. Die Kultivierung
wurde gestartet durch die Zugabe von 42 ml Inoculum und erfolgte bei 50°C mit 150 rpm im
Schüttelinkubator mit täglicher Probenahme von je 35 ml und anschließender Filtration. Das Filtrat
0
20
40
60
80
0
2
4
6
8
10
0 2 4 6 8 10
Sp
ezif
isch
e E
nzym
akti
vit
ät
(U/m
g)
En
zym
akti
vit
ät
(U/m
l)
Kultivierungsdauer (d)
66 kDa
43 kDa
29 kDa
20 kDa
14.5 kDa
200 kDa
119 kDa
1 2 3 4 5 6 7 8
Ergebnisse und Diskussion 83
wurde für die Esteraseaktivitätsbestimmung eingesetzt und der Filter mit demineralisiertem Wasser
gewaschen, über Nacht getrocknet und nach dem Abkühlen im Exikkator mit der Feinwaage
ausgewogen. Die von T. fusca KW3 gebildete Biotrockenmasse in mg/ml und die Esteraseaktivität in
U/ml wurden gegeneinander aufgetragen (Abbildung 30). Da das MSV-Medium mit den Zellen aus
der Vorkultur angeimpft wurde, lag zum Zeitpunkt 0 ein Trockengewicht an Zellen von 0,7 mg/ml vor.
Bis zum vierten Tag gab es eine Zunahme sowohl der Biomasse als auch der Esteraseaktivität. Ab
dem vierten bis zum neunten Tag nahm die Biotrockenmasse nicht weiter zu. Nach dem neunten Tag
war dann eine Abnahme der Biotrockenmasse zu verzeichnen. Bezüglich der Esteraseaktivität konnte
festgestellt werden, dass die Aktivität vom ersten bis vierten Tag stark anstieg und danach auf ein
Drittel der maximalen Aktivität abfiel. Vom fünften bis achten Tag blieb die Esteraseaktivität konstant
und sank bis zum elften Tag auf 1,3 U/ml ab.
Die Unterschiede im Verlauf der Enzymaktivitäten in Abbildung 28 und 30 sind zum Einen auf die
verschiedenen Größen der Kultivierungsansätze (250 und 750 ml) und zum Anderen auf die
natürlichen Unterschiede der Suberinpräparation zurückzuführen.
Abbildung 30: Biotrockenmasseproduktion () und Esteraseaktivität (◊) von T. fusca KW3 im MSV-Medium.
3.1.2.3 Esterasebildung mit PET-Fasern
Um den optimalen Zeitpunkt für die Gewinnung der 52 kDa Esterase Rohenzymlösung in Form des
zellfreien Überstandes zu ermitteln, wurde T. fusca KW3 in 5 Erlenmeyerkolben mit je 250 mL MSV-
Medium mit PET-Fasern bei 50°C kultiviert. Eine Kontrolle wurde sofort nach der Inokulation
abfiltriert und abzentrifugiert, um den zellfreien Überstand zu gewinnen. Diese Probe diente als
0
0,3
0,6
0,9
1,2
1,5
1,8
2,1
0
1
2
3
4
5
6
7
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Bio
tro
ck
en
ma
ss
e (
mg
/ml)
En
zym
ak
tivit
ät
(U/m
l)
Kultivierungsdauer (d)
Ergebnisse und Diskussion 84
Nullwert. Nach 2, 4, 8 und 10 Tagen wurden die zellfreien Überstände von je einem weiteren Kolben
geerntet und die Esteraseaktivität und der Proteingehalt bestimmt. Die Esteraseaktivität (mU/ml)
wurde gegen die Kultivierungsdauer (Tage) aufgetragen (Abbildung 31). Ab der Kultivierungsdauer
von 2 Tagen stieg die Esteraseaktivität bis zum 10. Tag auf 35 mU/ml bzw. die spezifische Aktivität
auf 673 mU/mg an.
Abbildung 31: Graphische Darstellung der Esteraseaktivität (◊) und der spezifischen Esteraseaktivität () gebildet während
der 10-tägigen Kultivierung im MSV-Medium mit PET-Fasern.
Darüber hinaus wurden Proben der zellfeien Überstände mittels SDS-PAGE gelelektrophoretisch
aufgetrennt (Abbildung 32).
Abbildung 32: SDS-PAGE der zellfreien Überstände nach Inkubation mit PET-Fasern im MSV-Medium, links Coomassie-gefärbtes Gel; rechts Gel mit Aktivitätsfärbung mit Fast Red. Spur 1 und 7: Roti
®-Mark SDS Proteinstandard; Spur 2:
Nullwert; Spur 3: zellfreier Überstand nach 2 Tagen Kultivierung; Spur 4: zellfreier Überstand nach 4 Tagen Kultivierung; Spur 5: zellfreier Überstand nach 8 Tagen Kultivierung; Spur 6, 8: zellfreier Überstand nach 10 Tagen Kultivierung.
0
100
200
300
400
500
600
700
800
0
5
10
15
20
25
30
35
40
0 2 4 6 8 10
Sp
ezif
isc
he
En
zym
ak
tivit
ät
(mU
/mg
)
En
zym
ak
tivit
ät
(mU
/ml)
Kultivierungsdauer (d)
1 2 3 4 5 6 7 8
200 kDa
119 kDa
66 kDa
43 kDa
29 kDa
20 kDa
14.5 kDa
Ergebnisse und Diskussion 85
Dafür wurden die Proben mit gleichen Volumenmengen auf das Gel aufgetragen. Anhand des
Gelphotos wurde sichtbar, dass bereits nach 2 Tagen Kultivierung ein Protein mit ca. 52 kDa Größe
gebildet wurde, dessen Konzentration bis zum 10. Tag stetig anstieg.
Der optimale Zeitpunkt für die Gewinnung des zellfreien Überstandes für die Aufreinigung der 52 kDa
PET-Esterase war demnach nach einer 10-tägigen Kultivierung im MSV-Medium mit PET-Fasern.
Die Biotrockenmassebestimmung zur Untersuchung der Wachstumskurve von T. fusca KW3 mit PET-
Fasern konnte nicht durchgeführt werden, da ein Teil der Biomasse an der Faseroberfläche anhaftete
und somit mit den Fasern bei der Filtration von den restlichen Zellen abgetrennt wurde. Somit
konnte keine Gesamtbiotrockenmasse bestimmt werden.
Anhand der bisherigen Versuche konnte folgendes festgestellt werden: Bei der Kultivierung von
T. fusca KW3 im MSV-Medium mit PET-Fasern wurde die Bildung einer 52 kDa großen Esterase
induziert (Abbildung 32). Erfolgte stattdessen die Kultivierung in Gegenwart von Suberin, wurde eine
29 kDa Esterase produziert (Abbildung 29).
Da die 52 kDa Esterase unter Zusatz von synthetischen Polyestern produziert wurde, war sie von
größerem Interesse für die weiteren Untersuchungen. Aus diesem Grund erfolgten alle
nachfolgenden Arbeiten mit der 52 kDa große Esterase, die mit den PET-Fasern als Substrat gebildet
wurde. Allerdings ergab sich daraus das Problem, dass die Produktion der Esterase mit den PET-
Fasern einen hohen Zeitaufwand für die Kultivierung beanspruchte, um genügend Rohenzymlösung
für eine Aufreinigung des Enzyms bereitzustellen. Aus diesem Grund wurde im Anschluss ein
weiteres Terephthalat-enthaltendes Substrat als möglicher Zusatz für die Produktion der gesuchten
Esterase getestet. Ebenfalls wurden zwei weitere Spezies der Gattung Thermobifida fusca in das
Esterase-Screening mit einbezogen, um zu testen, ob sich die Esteraseproduktion deutlich
unterscheidet von der von T. fusca KW3.
3.1.3 Esterasebildung bei T. fusca KW3 DSM 6013, T. fusca DSM 43792 und DSM 43793 mit PET-Fasern und Diethylterephthalat
Das Ziel dieser Untersuchung war es, einen Stamm und einen Zusatzstoff zu finden, mit dem eine
maximale Ausbeute an PET abbauender Esterase in der Rohenzymlösung erhalten wird. Neben PET-
Fasern wurde als weiteres Additiv Diethylterephthalat (DET), ebenfalls wie BHET ein Derivat der
Terephthalsäure, eingesetzt. Diese Substanz wurde dem MSV-Medium wie alle anderen bereits
getesteten Additive in einer Konzentration von 2 g/L zugesetzt. Neben T. fusca KW3 wurden zwei
weitere, vom DSMZ bezogene Stämme unter den gleichen Bedingungen kultiviert (T. fusca DSM
43792 und T. fusca DSM 43793). Bei der Kultivierung sollte die Esterasebildung von T. fusca KW3 mit
Ergebnisse und Diskussion 86
PET-Fasern und DET im MSV-Medium verglichen werden mit der Esterasebildung von
T. fusca DSM 43792 und DSM 43793 unter gleichen Bedingungen.
Für T. fusca KW3 erfolgte während der Kultivierung eine Probenahme zur Bestimmung der
Esteraseaktivitäten im Überstand (Abbildung 34). Darüber hinaus wurden Proben für die SDS-PAGE
und die Aktivitätsfärbung entnommen (Abbildung 33). Es ist ersichtlich, dass nach der Kultivierung
mit PET-Fasern sowohl bei Stamm T. fusca KW3 als auch bei den Stämmen T. fusca DSM 43792 und
DSM 43793 eine 52 kDa große Esterase gebildet wurde, die über die Aktivitätsfärbung mit Fast Red
genau auf dem Gel identifiziert werden konnte (rote Banden Spuren 2, 4, 6). Desweiteren konnte
gezeigt werden, dass nach Kultivierung mit DET bei allen drei untersuchten Stämmen eine 29 kDa
große Esterase produziert wurde, die ebenfalls über Aktivitätsfärbung mit Fast Red genau
identifiziert werden konnte (rote Banden Spuren 3, 5, 7). Damit konnte festgestellt werden, dass die
beiden Additive die Produktion zweier unterschiedlicher Esterasen induzieren: die PET-Fasern eine
52 kDa Esterase und DET eine 29 kDa Esterase. Somit waren die Stämme bei Anwesendheit von DET,
ebenso wie von Suberin und Cutin, nicht in der Lage, die 52 kDa Esterase zu synthetisieren.
Da sich die produzierten Mengen der 52 kDa Esterase bei allen drei Stämmen nicht unterscheiden,
wurde bei den weiteren Untersuchungen das Isolat aus der Stammsammlung, T. fusca KW3,
verwendet.
Abbildung 33: SDS-PAGE der Rohenzymlösungen nach Kultivierung mit unbehandelten PET-Fasern bzw. DET im MSV-
Medium, Gel gefärbt mit Coomassie- und mit Aktivitätsfärbung. Spur 1, 8: Low Molecular Weight Längenstandard; Spur 2: T. fusca DSM 43792 mit PET-Fasern kultiviert; Spur 3: T. fusca DSM 43792 mit DET kultiviert; Spur 4: T. fusca DSM 43793 mit PET-Fasern kultiviert; Spur 5: T. fusca DSM 43793 mit DET kultiviert; Spur 6: T. fusca KW3 DSM 6013 mit PET-Fasern kultiviert; Spur 7: T. fusca KW3 DSM 6013 mit DET kultiviert.
97 kDa 66 kDa 45 kDa 30 kDa 20.1 kDa 14.4 kDa
52 kDa
29 kDa
1 2 3 4 5 6 7 8
Ergebnisse und Diskussion 87
Abbildung 34: Esteraseproduktion durch T. fusca KW3 mit DET (◊) und PET-Fasern () über einen Zeitraum von 13 Tagen im MSV-Medium.
Beim Screening nach PET-Hydrolasen aus T. fusca zeigte sich, dass zunächst die Vorkultur im Czapek-
Medium nach zwei Tagen Wachstum die maximale Zelldichte mit noch exponentiellem Wachstum
vorwies. Die Zellen wurden steril zentrifugiert, in Puffer resuspendiert, um alle Reste an Glucose zu
entfernen, und damit das MSV-Medium angeimpft. Die Kultur im MSV-Medium wurde mit
verschiedenen Zusätzen kultiviert, um hydrolytische Enzyme zu produzieren. Während des
Wachstums war zu beobachten, dass mit Cutin, Suberin und DET die Produktion eines anderen
Enzyms erfolgte, als mit den synthetischen PET- und PBT-Fasern, PET-Granulat und der PET-
Oligomerpräparation. Mit den Monomeren TPA und Ethylenglycol erfolgte keine Enzymproduktion.
Die mit den Biopolyestern und erstaunlicherweise auch mit DET induzierte Hydrolase besaß p-NPB
Aktivität und wies im SDS-PAGE Gel eine molekulare Größe von 29 kDa auf. Desweiteren war die
maximale Produktion des Enzyms bei 50°C nach 2 Tagen mit Suberin erreicht und betrug 8,1 U/ml
und eine spezifische Aktivität von 50,8 U/mg. Mit den synthetischen Additiven bildete T. fusca KW3
hingegen eine andere, größere Hydrolase von ca. 52 kDa und mit p-NPB Aktivität. Für dieses Enzym
wurde die maximale Produktionsrate nach mindestens 10 Tagen Kultivierung mit 35 mU/ml bzw. die
spezifische Aktivität auf 673 mU/mg erreicht. Die Produktion erfolgte ebenfalls bei 50°C, jedoch
wurden deutlich geringere Mengen Enzym produziert im Vergleich zur 29 kDa Hydrolase (Verhältnis
1:230) mit einem 5fach höheren Zeitaufwand.
Diese Produktion zweier verschiedener Esterasen wurde nicht nur bei T. fusca KW3 festgestellt,
sondern auch mit den Stämmen aus der Stammsammlung des DSMZ, T. fusca DSM 43792 (ATCC
27730) und DSM 43793.
Fett et al. testeten bereits 1999 verschiedene Actinomyceten auf ihre Produktion von Cutin-
depolymerisierenden Enzymen (Fett et al. 1999). Von Thermomonospora alba NRRL B-16963T
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Ergebnisse und Diskussion 88
(NCIMB 10169); T. chromogena ATCC 43196T; T. curvata ATCC 19995T; T. formosensis ATCC 49059T;
T. fusca ATCC 27730T (DSM 43792), NRRL B-11456 und YX-5p; T. mesophila ATCC 27303T;
T. mesouviformis ATCC 27644T und T. sp. NRRL B-16962 produzierte nur der Referenzstamm
T. fusca ATCC 27730 im Trypton-Hefeextrakt-Medium Cutinase-Aktivität. Ebenso produzierte der
verwendete Stamm T. fusca KW3 im MSV-Medium mit Pepton bei Anwesenheit einer Suberin- oder
Cutin-Präparation Esteraseaktivität.
Mit verschiedenen Substanzen und cutin- bzw. lipidhaltigen Naturprodukten (1-Hexadecanol, ein
Rizinusöl, Maiskeimöl und Olivenöl) zeigte der Referenzstamm T. fusca ATCC 27730 keine Anregung
der Cutinaseproduktion und bei höheren Konzentrationen sogar eine Hemmung des
Bakterienwachstums (Fett et al. 1999). T. fusca KW3 produzierte mit den Monomeren
Terephthalsäure und Ethylenglycol ebenfalls keine Esteraseaktivität.
Hingegen konnte bei T. fusca ATCC 27730 mit Apfelcutin, Apfeltrester, Tomatenschalen, Kork und
Suberin aus Kartoffeln Cutinase-Aktivitäten nachgewiesen werden, welche mit den Tomatenschalen
am höchsten waren. T. fusca KW3 produzierte mit Apfelcutin und Suberin die höchsten
Esteraseaktivitäten, wobei die Aktivitäten mit Apfelcutin am Höchsten waren (Daten nicht
dargestellt). Geringere Esteraseaktivitäten wurden mit synthetischen PET- und PBT-Fasern, PET-
Granulat, der PET-Oligomerpräparation und DET bestimmt. Bei Untersuchungen zum biologischen
Abbau von aromatisch-aliphatischen Copolyestern mit den neu isolierten T. fusca K13g und K7a-3
erfolgten die Induktion und das Screening nach hydrolytischer Esteraseaktivität mit Polymerfilmen
aus 1,4-Butandiol, Terephthalsäure und Adipinsäure (Kleeberg et al. 1998). T. fusca K13g und K7a-3
zeigten bei 16S rDNA Sequenzvergleichen die höchsten Übereinstimmungen mit T. fusca DSM 43792T
(99,8% und 100%). Nachfolgend wurden weitere Studien zur Produktion dieser Copolyester-
abbauenden Hydrolase aus T. fusca DSM 43793 mit Ecoflex™-Pulver (BTA Copolyester, Partikelgröße
< 0,8 mm) als Induktor durchgeführt (Gouda et al. 2002). Die höchsten Aktivitäten der Hydrolase
wurden aufgrund des Austauschs von 5 g/L Pepton im MSV-Medium durch 1,87 g/L NH4Cl und 5 g/L
Pektin erzielt (von 1,5 UPCL-Film/mg und 0,8 U/mgProtein auf 1,8 UPCL-Film/mg und 6,0 U/mgProtein). Die
Actinomycetenisolate M5, M9 und Thermobifida fusca KW3b (jetzt KW3), alle isoliert aus Kompost,
wurden in einem Minimalmedium mit PET-Garn, DET oder einer Suberinpräparation aus
Kartoffelschalen (je 2 g/L) zur Enzymproduktion 8 Tage bei 45°C kultiviert (Alisch et al. 2004). Die
produzierte Enzymaktivität, bestimmt mit p-NPB, lag für alle Isolate mit PET-Fasern und DET als
Induktor während der 8 Tage bei maximal 40 mU/ml, ebenso für M5 und M9 mit der
Suberinpräparation. Die einzige Ausnahme war T. fusca KW3b, der nach 8 Tagen mit der
Suberinpräparation 120 mU/ml aufweisen konnte (Alisch et al. 2004).
Ergebnisse und Diskussion 89
Weiterhin konnte festgestellt werden, dass die Zugabe von Glucose zum Produktionsmedium bei
T. fusca ATCC 27730 und T. fusca KW3 eine stark hemmende Auswirkung auf die Enzymproduktion
besaß (Fett et al. 1999). Auch bei Gouda et al. 2002 erfolgte beim Einsatz von Glucose, Saccharose
oder Stärke anstatt Pektin keine Produktion der Hydrolase.
Weiterhin konnte kein signifikanter Einfluss des eingesetzten Inokulationsvolumens (1 bis 15 ml auf
80 ml Medium) auf die maximal produzierte Enzymaktivität (1,3 bis 1,7 UPCL-Film/mL) identifiziert
werden (Gouda et al. 2002). Bei der Untersuchung des Einflusses der freigesetzten BTA-Monomere
auf die Esteraseproduktion wurden die Natriumsalze der Adipinsäure und der Terephthalsäure und
1,4-Butandiol dem Kulturmedium vor der Inokulation beigesetzt. Bei einer Konzentration von
50,1 mg 1,4-Butandiol oder 68,0 mg Adipinsäure oder 50,4 mg Terephthalsäure zusätzlich zu 250 mg
BTA-Pulver wurden keine hydrolytischen Aktivitäten im Medium detektiert. Das bedeutet, dass diese
Konzentrationen sich auf eine weitere Enzymproduktion hemmend auswirken, nicht aber auf bereits
produziertes Enzym, welches die Monomere während eines Abbaus freisetzt. Beim Vergleich von
BTA-Filmen, -Pulver und -Nanopartikeln als Induktor zeigte sich, dass die Polymeroberfläche keinen
bedeutenden Einfluss auf die Enzymproduktion nach 48 Stunden hatte. Hingegen zeigte die Variation
der BTA-Pulver Konzentration im Produktionsmedium einen interessanten Einfluss auf die
produzierte Menge an hydrolytischem Enzym. Beim Scale-up der Produktion vom Schüttelkolben
zum 100 L Fermenter wurden stets Enzymaktivitäten um die 1,5 UPCL-Film/mL und spezifische
Aktivitäten von 4 bis 6 U/mgProtein nach 48 Stunden Inkubation erreicht. Die untersuchte Hydrolase
aus T. fusca DSM 43793 besaß ein Molekulargewicht von ca. 30 kDa (Gouda et al. 2002).
Weiterführend zu Fett et al. (1999) erfolgte die Erzeugung von Mutanten des Referenzstamms
T. fusca ATCC 27730 (T. fusca WSH04) mit einer höheren Cutinaseproduktion mittels Behandlung mit
Diethylsulfat (Du et al. 2007). Weiterhin wurde der Einfluss von Glucose, Saccharose, löslicher Stärke,
Ethanol und Natriumacetat auf die Cutinaseproduktion untersucht und es zeigte sich, dass mit dem
Zusatz von Ethanol und Natriumacetat ähnliche Zelltrockengewichte und Cutinaseaktivitäten erreicht
werden konnten, die spezifische Cutinaseaktivität aber höher beim Einsatz von Natriumacetat war.
Bei der Untersuchung des Einflusses der Natriumacetatkonzentration auf die gebildete Zellmasse und
Cutinaseaktivität zeigte sich, dass mit einer Konzentration von 7,5 g/L die höchsten Ergebnisse erzielt
wurden. Das beste Zellwachstum wurde mit pH 7,3 und die höchste Cutinaseproduktion mit pH 7,6
erreicht. Deshalb entwickelten Du et al. (2007) eine 2-Phasen pH-kontrollierte Kultivierung mit 20
Stunden bei pH 7,3 für eine maximale Biomasseproduktion und anschließend bei pH 7,6 nach 50
Stunden Kultivierung für eine maximale Cutinaseproduktion (Du et al. 2007).
Hu et al. (2010) isolierten von kompostierten Polyesterfilmen zwei Gruppen von Mikroorganismen,
Actinomyceten (vier Gattungen) und Bacillen (drei Gattungen). Von diesen Isolaten war nur
Thermobifida alba AHK119 in der Lage, den aliphatisch-aromatischen Copolyesterfilm (Apexa®, zuvor
Ergebnisse und Diskussion 90
Biomax® 4026 und 4027, ein Polyethylenterephthalat Copolymer aus Terephthalsäure, Ethylenglycol
und einer ungenannten Komponente) abzubauen, ebenso die Partikelgröße von Polymeren (PCL,
Bionolle™ EM-301 (Polybutylensuccinat-co-adipat (PBSA)), Ecoflex™) zu verringern und dabei
Terephthalsäure freizusetzen. Verantwortlich für den Abbau war eine Hydrolase von ca. 30 kDa
Größe (Hu et al. 2010). Bisher wurden allerdings nicht nur aus Thermobifida cutinolytische oder PET-
abbauende Enzyme identifiziert, sondern ebenfalls aus anderen Bakterienstämmen und auch Pilzen.
Aus einer phyllospherischen Bakterienkultur wurde 1987 von Sebastian et al. ein fluoreszierender
Pseudomonas putita ATCC 55613 (wurde umbenannt zu P. mendocina) Stamm isoliert. Das Isolat
produzierte eine extrazelluläre Cutinase während des Wachstums mit Cutin, aber nicht mit Cutin
Hydrolysaten im Vergleich zur eukaryotischen Produktion von Fusarium solani sp. pisi. Die während
der Hydrolyse freigesetzten Cutinmonomere wurden mittels Dünnschichtchromatographie
nachgewiesen (Sebastian et al. 1987). Bei der SDS-PAGE und der Gelfiltration zeigte das Enzym ein
Molekulargewicht von 30 kDa und eine monomere Form (Sebastian et al. 1988).
El-Bendary et al. haben 2010 die Oberflächenhydrolyse von PET-Textilien durch Lipasen aus den
Bacillus Isolaten 5W und 6C untersucht. Die Lipase aus dem Bacillus 5W Isolat wurde in größeren
Mengen als PET-oberflächenmodifizierendes Enzym mit 6% Baumwollsamenmehl und pH 7,5
produziert (90U/ml). Die beste Ausbeute wurde mit 25 ml Medium, 25 x 106 CFU/ml Inoculum und
24 Inkubation erzielt. Die Zugabe von Pepton zum Medium steigerte die Lipaseproduktion um 22,5%
(130,7 U/ml) (El-Bendary et al. 2010).
F. solani f. pisi produzierte während des Wachstums mit Cutin extrazelluläre Cutin-
depolymerisierende Enzyme, welche alle Gruppen von Cutinmonomeren freisetzten (Purdy und
Kolattukudy 1973). Aus dem extrazellulären Überstand wurden zwei Isoenzyme, eine Cutinase und
eine unspezifische Esterase (p-Nitrophenylpalmitat Hydrolase) mit einem Molekulargewicht von
22 kDa bzw. 52 kDa isoliert (Purdy und Kolattukudy 1975a).
Cutinhydrolysate im Medium hatten eine Produktion einer extrazellulären Cutinase bei einem in
Glucose-Medium gewachsenen F. solani f. sp. pisi zur Folge (Lin und Kolattukudy 1978). Die
Produktionsrate war abhängig von der Menge des Cutinhydrolysates, welches bis zu einer
Konzentration von 80 µg/ml zugegeben wurde, und bei dieser Konzentration erfolgte kein weiterer
Anstieg der Produktion. Bei Anwesenheit von Glucose erfolgte keine Cutinaseproduktion. Die
Induktion der Cutinase durch Cutinhydrolysate wurde nicht durch Actinomycin D (zytotoxisches
Antibiotika) inhibiert und durch Cordycepin (Antitumor, antifungales und antivirales Reagenz) sogar
noch erhöht. Durch die Zugabe von Cycloheximid mit dem Induktor oder bis zu 12 Stunden nach der
Zugabe des Induktors resultierte ein fast sofortiger Stillstand der Cutinaseproduktion. Ebenso
unterdrückte Deoxyglucose, ein Hemmer der Proteinglykosylierung, die Produktion der Cutinase mit
Cutinhydrolysaten. Die ω-Hydroxyfettsäuren waren deutlich effizienter bei der Induktion der
Ergebnisse und Diskussion 91
Cutinase als alle anderen noch polareren Säuren des Cutins. Experimente mit Derivaten und Analogas
der ω-Hydroxy-C16-Fettsäuren zeigten, dass eine freie Hydroxylgruppe an der ω-Position als ein
wichtiger Faktor für die Cutinaseinduzierende Aktivität zu sehen ist. Ebenfalls erfolgte mit n-
aliphatischen primären Alkoholen (C14 oder mehr) die Produktion der Cutinase, wobei n-C16 am
effizientesten induzierte. Das bedeutet, dass die Monomere als das chemische Signal agieren,
welches die extrazelluläre Hydrolase induziert (Lin und Kolattukudy 1978).
Ebenfalls wurden Cutinasen aus fünf verschiedenen phytopathogenen Pilzen und Bakterien,
F. roseum culmorum, F. roseum sambucinum, Ulocladium consortiale, Streptomyces scabies und
Helminthosporium sativum, mit einem Molekulargewicht von ca. 25 kDa isoliert. Eine Suspension mit
Sporen oder Mycelien einer 14 Tage alten Kultur wurde dafür in 100 ml eines Mineralmediums mit
pH 7,2 und 0,5 g Cutin gegeben (Lin und Kolattukudy 1980a).
Das F. solani pisi Isolat T-8 war in der Lage, mit Suberin aus Kartoffelschalen als einzige
Kohlenstoffquelle zu wachsen. Der extrazelluläre Überstand dieser Kulturen hydrolysierte p-
Nitrophenylbutyrat und radioaktiv markiertes Apfelcutin. Der Großteil der Esterase war an die
Suberin enthaltende Mycelmatte gebunden und konnte mit einer 0,4% Triton X-100 Lösung
ausgewaschen werden. Die Enzymlösung enthielt zwei Isoenzyme mit einem Molekulargewicht von
23 kDa. Desweiteren wurde festgestellt, dass F. solani pisi sehr ähnliche oder gleiche Polyesterasen
bildet für den Abbau von Cutin und Suberin, wenn diese als einzige Kohlenstoffquellen im Medium
vorhanden sind (Fernando et al. 1984).
Nimchua et al. (2007) verwendete für die Isolation von Mikroorganismen mit PET-hydrolysierenden
Enzymen sowohl Pflanzenproben, wie Blätter, Blüten, unterirdische Speicherorgane und Früchte, als
auch Bodenproben gesammelt an verschiedenen Stellen in Nord-Thailand. Die PCL abbauenden
Isolate und der F. solani f. sp. pisi wurden anschließend mit Mineralmedium kultiviert (Nimchua et al.
2007). Verschiedene Microfungi wurden von Pflanzenoberflächen und Bodenproben mittels PCL-
Mineralmedium-Platten isoliert. 22 der 115 Isolate zeigten Hofbildung, was auf eine Cutinaseaktivität
schließen ließ. Die Produktion der Cutinase im Mineralmedium mit Suberin aus Kartoffeln oder PET-
Fasern wurde mittels p-NPB Aktivitätsbestimmung nachgewiesen, wobei alle Isolate p-NPB Aktivität
zeigten. Das Isolat PBURU-B5 besaß die höchste p-NPB Aktivität mit PET-Fasern und wurde
identifiziert als F. solani (Nimchua et al. 2008).
Wang et al. (2008) untersuchten die Optimierung der Kulturbedingungen der Lipaseproduktion und
die Bereitstellung einer spezifischen Lipase für die PET-Hydrolyse aus Aspergillus oryzae CCUG. Die
unter Zusatz von Olivenöl produzierte Lipase konnte die Eigenschaften der PET-Textilien nicht
deutlich ändern, deshalb wurden Diethyl-p-phthalat (DP), BHET und PET-Fasern als Zusätze
verwendet. Mit BHET wurden die besten Produktionsraten erreicht und die extrazelluläre Lipase
hydrolysierte das PET Modellsubstrat DP (Wang et al. 2008).
Ergebnisse und Diskussion 92
Zur Identifikation neuer PET-modifizierender Mikroorganismen erfolgte ein Screening mit
Bodenproben von verschiedenen Mülldeponien und von einer Abwasserkompostierungsanlage als
Inoculum. Die gesuchten Mikroorganismen sollten mit PET als alleinige C-Quelle wachsen können.
Die Kultivierung erfolgte in einem Mineralsalzmedium mit Spurenelementen bei pH 7 (für Bakterien)
und pH 5 (für Pilze). Das Medium mit PET-Pulver (10 g/L) wurde mit einer Bodenprobe kultiviert.
Nach drei Wochen wurden die Kulturen auf Vollmedium ausgestrichen und Reinkulturen auf ihre
PET-Hydrolyse hin getestet. Es konnten 4 verschiedene bakterielle und 5 verschiedene eukaryotische
Isolate identifiziert werden. Da das Wachstum mit PET sehr langsam erfolgte, wurde zusätzlich Cutin
als Induktor getestet. Alle Pilze und 2 Bakterienisolate wuchsen mit Cutin als einzige C-Quelle und
produzierten eine Esteraseaktivität, hingegen zeigten mit Adipinsäure-bishexylamid als Induktor alle
bakteriellen Isolate extrazelluläre PET-Hydrolyseaktivität. Im Vollmedium mit Pepton, Hefeextrakt
und Glucose besaßen alle Isolate nur eine schwache p-NPA Aktivität (Fischer-Colbrie et al. 2004).
Mit 3PET (BETEB, 1 g/L) als Modellsubstrat isolierten Liebminger et al. (2007) Mikroorganismen, die
PET-abbauende Enzyme produzieren. Dabei wurde ein Penicillium citrinum Isolat identifiziert,
welches eine Polyesterase von 14.1 kDa zum PET Abbau produziert. Die höchsten Enzymausbeuten
konnten unter Zusatz von Cutin (1.2 g/L) erreicht werden (Liebminger et al. 2007).
Der Abbau von BHET/DET (in der Literatur wurde unter Zusatz von Diethylenglycolterephthalat
angegeben, was eine andere Beschreibung für BHET ist; in den Abbildungen ist allerdings DET
dargestellt, was sich durch die beiden endständigen Alkoholgruppen vom BHET unterscheidet; somit
ist keine eindeutige Zuordnung möglich) und PET-Fasern durch Mikroorganismen und Lipasen wurde
von Zhang et al. 2004 untersucht. Die isolierten Mikroorganismen aus Belebtschlamm wurden auf
ihre Fähigkeit hin, PET-Fasern oder BHET/DET zu hydrolysieren, getestet (Zhang et al. 2004, Zhang
et al. 2006).
Zusammenfassend ist aus den Tabellen 13 und 14 ersichtlich, dass bei den Bakterien und Pilzen je
maximal zwei verschiedene Polyesterspaltende Enzyme produziert wurden und diese in einem
Größenbereich von 14 bis 52 kDa lagen. Bei den Bakterien wurden meist hochpolymere natürliche
oder synthetische Verbindungen aus Zusatzstoffe eingesetzt, wohingegen deren Monomere oder
Hydrolysate ebenso wie Glucose oder andere Zucker eher eine hemmende Wirkung auf die
Enzymproduktion zeigten. Zusätzlich zu den Induktoren wurden noch weitere komplexe C-Quellen
für die Bildung der Biokatalysatoren benötigt und die Kultivierungsdauer lag zwischen 1 bis 10 Tagen
bis zum Erreichen der maximalen Enzymaktivität.
Ergebnisse und Diskussion 93
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Ergebnisse und Diskussion 95
Die verwendeten Induktoren bei den Pilzkultivierungen waren zum Teil Biopolyester, aber auch
Monomere oder Hydrolysate. Einige Pilze konnten sogar nur mit diesen Induktoren als einzige C-
Quelle wachsen. Dieser Unterschied macht deutlich sichtbar, dass die Bakterien nicht nur die Energie
in Form einer C-Quelle benötigen, sondern auch weitere wichtige Bausteine, wie z. B. Vitamine, die
sie selbst nicht synthetisieren können, Pilze hingegen sind dazu in der Lage. Die Hemmung der
Enzymproduktion bei den Bakterien durch die Abbauprodukte der enzymatischen Katalyse stellt
einen wichtigen Regulationsschritt im Stoffwechselweg dar und verhindert die Verschwendung von
Energiereserven. Die Kultivierungsdauer bei den Pilzkulturen war mit 4 bis 21 Tagen deutlich höher
als bei den Bakterien und begründet sich durch das langsamere Wachstum. Ein Vergleich der
gebildeten Aktivitäten ist nicht sehr sinnvoll, da für die Aktivitätsbestimmungen verschiedene
Substrate eingesetzt wurden. Interessanterweise bildete nicht nur T. fusca KW3 zusätzlich zu zwei
isomeren Cutinasen eine 52 kDa große Esterase, dieses Verhalten konnte ebenfalls bei F. solani f. pisi
identifiziert werden. Leider erfolgte keine weitere Studie dieser gebildeten Esterase zu dem
damaligen Zeitpunkt (Purdy und Kolattukudy 1975a, b).
3.2 Charakterisierung der PET-Hydrolasen aus T. fusca KW3
3.2.1 Aufreinigung
3.2.1.1 Aufreinigung der TfCa
Im Vergleich zu intrazellulären Enzymen, die durch Aufschluss mittels Ultraschall oder French Press in
großen Mengen gewonnen werden können und daraus Enzyme von Interesse über verschiedene
chromatographische Verfahren aufgereinigt werden, ist die Aufreinigung extrazellulärer Enzyme
komplizierter.
Die Enzymaufreinigung erfolgte bei Raumtemperatur. Nach Dialyse und Zentrifugation wurde die
Enzympräparation mit 100 mM Phosphatpuffer pH 8 auf 20 mM eingestellt. Dann erfolgte der
Auftrag der Enzymlösung auf eine selbstgepackte equilibrierte Phenylsepharose Säule. Unter den
gewählten Bedingungen band die TfCa an die Säulenmatrix. Durch die Erhöhung der Isopropanol
Konzentration von 0 auf 30% durch den in Abbildung 35 verzeichneten Stufengradienten erfolgte die
Elution des gebundenen aktiven Proteins bei 15 bis 25% Elutionspuffer B (Aufreinigungsschritt 2).
Aktive Fraktionen (p-NPB Aktivität) wurden vereinigt. Das enthaltene Isopropanol in der
Enzympräparation wurde mittels Rotationsverdampfers abgetrennt.
Ergebnisse und Diskussion 96
Abbildung 35: Elutionsprofil der Enzymlösung während des zweiten Aufreinigungsschritts (Phenylsepharose,
Säulenvolumen 25 ml, Puffer A: 20 mM Phosphatpuffer pH 8, Puffer B: 30% Isopropanol in 20 mM Phosphatpuffer pH 8). Dargestellt sind das Proteinprofil (grau), die Esteraseaktivität (schwarz) und der Gradient der Elution (gestrichelt).
Weitere Fremdproteine wurden durch eine Anionenaustauschchromatographie mit DEAE Sepharose
abgetrennt (Aufreinigungsschritt 3). Die TfCa band an die Matrix und eluierte nach dem Anlegen des
NaCl-Gradienten im Bereich von 20 bis 25% Puffer B (Abbildung 36). Aktive Fraktionen wurden
gesammelt (DEAE-Sepharose Pool) und gegen 20 mM Phosphatpuffer pH 8 dialysiert. Dann erfolgte
der Auftrag der Enzympräparation auf eine equilibrierte Octyl-Sepharose Säule (Aufreinigungsschritt
4). Die gebundene TfCa eluierte nach Anlegen eines linearen Isopropanol-Gradienten bis 30% in
20 mM Phosphatpuffer (Abbildung 37). Die aktiven Fraktionen von 10 bis 50% Puffer B wurden
vereinigt und das enthaltene Isopropanol durch Abdampfen entfernt.
Abbildung 36: Elutionsprofil der Enzymlösung während des dritten Aufreinigungsschritts (DEAE-Sepharose, Säulenvolumen
54 ml, Puffer A: 20 mM Phosphatpuffer pH 8, Puffer B: 1 M NaCl in 20 mM Phosphatpuffer pH 8). Dargestellt sind das Proteinprofil (grau), die Esteraseaktivität (schwarz) und der Gradient der Elution (gestrichelt).
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
0
300
600
900
1200
0 100 200 300 400
Es
tera
se
ak
tivit
ät
(U)
UV
(2
80
nm
)
Elutionsvolumen (ml)
10%
100%
30%
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
-50
50
150
250
350
450
0 200 400 600 800
Es
tera
se
ak
tivit
ät
(U)
UV
(2
80
nm
)
Elutionsvolumen (ml)
15%
50%
100%
Ergebnisse und Diskussion 97
Abbildung 37: Elutionsprofil der Enzymlösung während des vierten Aufreinigungsschritts (Octyl-Sepharose, Säulenvolumen
1 ml, Puffer A: 20 mM Phosphatpuffer pH 8, Puffer B: 30% Isopropanol in 20 mM Phosphatpuffer pH 8). Dargestellt sind das Proteinprofil (grau), die Esteraseaktivität (schwarz) und der Gradient der Elution (gestrichelt).
Als letzter chromatographischer Reinigungsschritt erfolgte der Auftrag auf eine selbstgepackte
Sephadex 200 (Größenausschlusschromatographie) und die Elution der Proteine nach ihrer Größe
mit einem 0,15 M NaCl in 20 mM Tris/HCl pH 8 Elutionspuffer (Abbildung 38). Die aktiven Fraktionen
wurden im Bereich von 60-80 ml identifiziert und vereinigt. Die Aufreinigung wurde mit einer SDS-
PAGE mit Coomassie Färbung dokumentiert (Abbildung 39).
Abbildung 38: Elutionsprofil der Enzymlösung während des fünften Aufreinigungsschritts (Sephadex 200, Säulenvolumen
110 ml, Puffer: 0,15 M NaCl in 20 mM Tris/HCl pH 8). Dargestellt sind das Proteinprofil (grau) und die Esteraseaktivität (schwarz).
0
5
10
15
20
25
0
50
100
150
0 5 10 15 20 25 30 35 40
Es
tera
se
ak
tivit
ät
(U)
UV
(2
80
nm
)
Elutionsvolumen (ml)
100%
0
10
20
30
40
50
0
5
10
15
20
25
30
35
0 20 40 60 80 100 120 140 160
Es
tera
se
ak
tivit
ät
(U)
UV
(2
80
nm
)
Elutionsvolumen (ml)
Ergebnisse und Diskussion 98
97 kDa 66 kDa 45 kDa 30 kDa 20.1 kDa 14.4 kDa
1 2 3 4 5 6
Abbildung 39: SDS-PAGE der Aufreinigung der TfCa aus T. fusca KW3. Spur 1: Enzymlösung nach der Dialyse; Spur 2: Enzymlösung nach der HIC 1; Spur 3: Enzymlösung nach der AIEX; Spur 4: Enzymlösung nach der HIC 2; Spur 5: Enzymlösung nach der SEC; Spur 6: Low Molecular Weight Längenstandard (Billig et al. 2010).
Wie aus der Abbildung 39 ersichtlich ist, konnte mit den fünf Reinigungsschritten die TfCa bis zur
elektrophoretischen Reinheit isoliert werden. Es erfolgte eine 7625 fache Aufreinigung der Esterase
mit einer Ausbeute von 7% der Ausgangsenzymlösung mit einer Aktivität von 36,6 U und einer
Proteinkonzentration von 0,012 mg (Tabelle 15). Die spezifische Aktivität konnte von 0,4 U/mg auf
3050 U/mg erhöht werden.
Tabelle 15: Aufreinigungstabelle der TfCa aus T. fusca KW3 (Billig et al. 2010).
Schritt Volumen
(ml)
Aktivität
(U)
Protein
(mg)
Spezifische Aktivität
(U/mg)
Ausbeute
(%)
Kulturüberstand 33 600 526 1212,7 0,4 100
Dialyse 7 655 325,7 808,7 0,4 61,9
HIC 1 844 258 22,2 11,6 49
AIEX 46 187,6 0,24 781,7 35,7
HIC 2 4,4 83,2 0,045 1848,9 15,8
SEC 3,6 36,6 0,012 3050 7
Aufreinigungsprotokolle für einige PET-Hydrolasen wurden bereits in den letzten Jahren
veröffentlicht. Die bereits erwähnte 29 kDa Cutinase (BTA Hydrolase 1, TfH) aus T. fusca DSM 43793
konnte durch Gouda et al. 2002 und Kleeberg et al. 2005 aufgereinigt werden. Zunächst erfolgte die
Konzentrierung und Aufreinigung mittels Ultrafiltration mit einer regenerierten
Zellulosetriacetatmembran (Ausschlussgröße 10 kDa). Dabei stieg die spezifische Aktivität 2,4 fach
mit einer Ausbeute von 60,8%. Die Verwendung einer Membran mit der Ausschlussgröße von 20 kDa
Ergebnisse und Diskussion 99
führte zu einem starken Verlust bei der Ausbeute. Bei der Verwendung einer Polysulfonmembran
(Ausschlussgröße 10 kDa) lag die Rückgewinnung des Proteins bei 99%, allerdings nur mit 34,5%
Ausbeute und somit konnte nur eine geringe Aufreinigung (Faktor 1,2) erzielt werden. Es wurde
spekuliert, dass das Enzym eine starke Hydrophobizität besitzt und somit an die Membran absorbiert
hat (Gouda et al. 2002).
Tabelle 16: Aufreinigungstabelle der TfH aus T. fusca DSM 43793 (Kleeberg et al. 2005).
Schritt Volumen
(ml)
Aktivität
(U)*
Protein
(mg)
Spezifische Aktivität
(U/mg)
Ausbeute
(%)
Kulturüberstand 1600 18133 5520 3.3 100
(NH4)2SO4 Fällung 107 6777 70 97 37
KIEX 42 4584 21 218 25
HIC 9,5 2521 7 360 14
*Bestimmt mit Tributyrin als Substrat, 1 Unit entspricht der Aktivität, die 1 µmol Ester in einer Minute spaltet.
Kleeberg et al. (2005) testeten weitere Konzentrierungsschritte. Mit einer 50%
Ammoniumsulfatfällung konnte die gesamte Menge an BTA-Hydrolase ausgefällt werden, allerdings
nur ein Bruchteil davon konnte durch Waschen mit 20 mM Citratpuffer (pH 4,4) oder 20 mM Tris/HCl
Puffer (pH 9,1) wieder resuspendiert werden. Anschließend wurde die Enzymlösung auf eine S-
Sepharose Säule (Uno, Kationenaustauschchromatographie, pH 4) aufgetragen und mit einem
Salzgradienten von 0 bis 1 M NaCl eluiert. Die noch vorhandenen Verunreinigungen wurden mit einer
Hydrophoben Interaktionschromatographie entfernt. Dazu wurde der aktive Enzympool auf eine
Phenylsepharose Säule, equilibriert mit 0,5 M Ammoniumsulfat, aufgetragen und mit einem
Gradienten von 0,5 auf 0 M Ammoniumsulfat und 0 auf 30% Isopropanol eluiert. Mit dieser 3-Schritt
Aufreinigung konnte eine Steigerung der spezifischen Aktivität um den Faktor 110 mit einer Ausbeute
von 14% der Ausgangsaktivität erreicht werden (Tabelle 16, Kleeberg et al. 2005).
Bei Chen S et al. (2008) erfolgte ebenfalls die Aufreinigung einer mit Cutin induzierten p-NPB
Hydrolase aus T. fusca. Nach der Kultivierung wurden die Zellen entfernt und mit 70% (w/v)
Ammoniumsulfat die Proteine aus der Lösung ausgefällt. Das Präzipitat, gewonnen durch
Zentrifugation, wurde in Puffer gelöst und über Nacht bei 4°C dialysiert. Anschließend erfolgte eine
erneute Ausfällung mit 20% (w/v) Ammoniumsulfat. Der Überstand wurde filtriert (0.22 µm) und auf
eine Phenyl Sepharose Säule geladen. Durch die lineare Erniedrigung der
Ammoniumsulfatkonzentration erfolgte die Elution der Proteine mit p-NBP Aktivität. Nach einer
erneuten Dialyse erfolgte der Auftrag auf eine DEAE-Sepharose Säule, die Elution mit einem linearen
Natriumchlorid Gradienten (0 bis 1 M) und eine weitere Dialyse. Die letztliche Enzympräparation
wurde nochmals konzentriert (Tabelle 17, Chen S et al. 2008).
Ergebnisse und Diskussion 100
Tabelle 17: Aufreinigungstabelle der Cutin-induzierten p-NPB Hydrolase aus T. fusca (Chen S et al. 2008).
Schritt Protein
(mg)
Aktivität
(U)
Spezifische Aktivität
(U/mg)
Aufreinigung
(fach)
Ausbeute
(%)
Kulturüberstand 234,9 12294,0 52,3 1,0 100
(NH4)2SO4 Fällung 46,4 5205,2 112,2 2,1 42,3
HIC 4,7 1521,2 320,3 6,1 12,4
AIEX 2,9 1140,9 398,6 7,6 9,3
Die Aufreinigung der Cutinase aus P. mendocina ATCC 55613 erfolgte zuerst mittels einer
fraktionellen Acetonfällung (75%), um die hochviskosen Verfärbungen vom Enzym abzutrennen. Die
Rückgewinnung des Enzyms lag bei 80%, welche auf eine DEAE Säule aufgetragen wurden. Die
Cutinase band bei diesem Reinigungsschritt nicht an die Säulenmatrix, die Verunreinigung hingegen
schon. Als weiterer Aufreinigungsschritt folgte eine weitere Anionenaustauschchromatographie mit
einer QAE-Sephadex Säule. Dabei konnte ein starker Verlust an hydrolytischer Aktivität während des
Reinigungsschritts verzeichnet werden, eventuell durch die Abtrennung einer weiteren enthaltenen
p-NPB Hydrolase (von 50% Ausbeute auf 9% Ausbeute, Tabelle 17). Die Cutinase zeichnete sich
weiterhin durch nicht vorhandene Bindungseigenschaften an SP-Sephadex, CM-Cellulose, Phenyl-
Sepharose und Octyl-Sepharose aus, womit keine HIC oder Kationische Ionenaustausch-
chromatographie durchgeführt werden konnte. Die letzten Verunreinigungen konnten mittels
Größenausschlusschromatographie abgetrennt werden (Sepharose 6B und Sephadex G-100). Durch
diese 5-Schritt Aufreinigung erfolgte eine 200 fache Aufreinigung der Cutinase mit einer Ausbeute
von 3% verbleibender Enzymaktivität (Tabelle 18, Sebastian et al. 1988)
Tabelle 18: Aufreinigungstabelle der Cutinase aus P. mendocina ATCC 55613 (Sebastian et al. 1988).
Schritt Aktivität
(U)
Protein
(mg)
Spezifische Aktivität
(U/mg)
Ausbeute
(%)
Kulturüberstand 249 450 7360 44 100
Aceton Fällung 182 000 2090 87 78
AIEX 1 121 200 460 262 50
AIEX 2 22 000 11 2650 9
SEC 1 14 500 4 3360 6
SEC 2 4 430 1,1 7030 3
In einem Patent der Firma Genencore (Gray et al. 1995) wurde die Aufreinigung zweier 30 kDa großer
mit Cutin induzierter Hydrolasen beschrieben, produziert durch den Stamm P. mendocina ATCC
53552. Beide Hydrolasen unterschieden sich aufgrund ihrer Fähigkeiten zur Hydrolyse von
Ergebnisse und Diskussion 101
verschiedenen p-NP-Estern. Nach der Kultivierung mit 0,3% Apfelcutin für 12-15 Stunden erfolgte die
Filtration des Überstandes (0,22 µm). Verbleibende Enzymaktivitäten auf den Cutinresten wurden
mittels Zentrifugation gewonnen und es ergab sich eine Ausbeute von 90%. Anschließend erfolgten
die Konzentrierung der Lösung mittels Ultrafiltration und eine Dialyse, wobei eine 80%ige Ausbeute
erreicht wurde. Es erfolgte der Auftrag der Lösung auf eine Octyl-Sepharose Säule und eine
Waschung mit einem Harnstoff enthaltenden Puffer. Die Elution erfolgte mit einem linearen
Gradienten mit 50% Isopropanol und zwei aktive Fraktionen mit unterschiedlichen p-NPB/p-NPC
Verhältnissen wurden identifiziert. In Fraktion 32 besaß die Lipase 1 (mit Cutinase Aktivität) ein p-
NPB/p-NPC Verhältnis von 4,6 und in Fraktion 51 die Lipase 2 (mit Cutinase Aktivität) ein p-NPB/p-
NPC Verhältnis von 1,4. Für eine Sequenzierung erfolgte eine weitere Aufreinigung der getrennten
Hydrolasen mittels Umkehrphasen Chromatographie, wobei Lipase 1 bei 35% des Elutionspuffers
eluierte und Lipase 2 bei 39% (Gray et al. 1995).
Die erste Aufreinigung von Polyesterasen aus Pilzen erfolgte 1975 durch die Gruppe von Purdy et al.
(Purdy und Kolattukudy 1975a). Dabei wurde das extrazelluläre Protein einer 12 Tage alten Kultur
von F. solani f. pisi, gewachsen mit Apfelcutin aus Golden Delicious als einzige C-Quelle, mit 40-50%
Ammoniumsulfat ausgefällt. Im Gegensatz dazu erfolgte 1973 bereits eine Kultivierung von F. solani
f. pisi mit Cutin, isoliert aus Red Delicious Äpfeln, als einzige C-Quelle und nach 12 Tagen erfolgte die
Fällung der aktiven Proteine mit 30% Ammoniumsulfat (Purdy und Kolattukudy 1973). Das
unterschiedliche Fällungsverhalten wurde mit den enthaltenen Phenol-Verunreinigungen beim Cutin
aus dem Golden Delicious begründet, welche mit dem aktiven Protein interagierten. Dabei hatten die
extrazellulären Überstände die gleiche Proteinzusammensetzung bei beiden Kultivierungen. Es
erfolgte eine Größenausschlusschromatographie mit Sephadex G-100, wobei die p-NPP Aktivität bei
einem MG Bereich von 50-60 kDa eluierte. In diesem Bereich war auch eine Cutinaseaktivität
vorhanden, die mit der p-NPP Aktivität überlappte. Da die Aktivitäten zu diesem Zeitpunkt nicht
sauber getrennt werden konnten, wurden sie vereinigt und auf eine QAE-Sephadex Säule
aufgetragen. Bei dem pH Wert von 9 banden Fremdproteine und auch das p-NPP aktive Enzym, die
Cutinase konnte damit von den anderen abgetrennt werden. Die Elution der Fremdproteine erfolgte
bei pH 8,3 und der p-NPP Aktivität bei pH 7. Die 2. SEC mit Sephadex G-100 zeigte für den
Cutinasepeak von der QAE-Sephadex ebenfalls nur einen Proteinpeak mit Cutinaseaktivität und eine
Verschiebung des Molekulargewichts um 40-60 kDa zu 22 kDa aufgrund der Abtrennung der
phenolischen Verunreinigungen. Bei der 2. SEC des Proteinpeaks mit p-NPP Aktiviät zeigten sich ein
Hauptpeak mit Aktivität und zwei kleine Peaks ohne Aktivität. Das MG der p-NPP Hydrolase war das
gleiche, wie bereits bei der ersten SEC, was bedeutet, dass die Phenole keinen Einfluss auf die Elution
der Hydrolase hatten. Bei der anschließenden Kontrolle der Reinheit der Proteine konnten bei der
Ergebnisse und Diskussion 102
Cutinase zwei sehr eng liegende, aber trennbare Banden identifiziert werden, welche nach dem
Ausschneiden beide Cutinaseaktivität besaßen. Somit handelte es sich bei der Cutinase um zwei sehr
ähnliche Isoenzyme, welche mittels Ionenaustauschchromatographie mit einer SE-Sephadex Säule
und einem linearen NaCl Gradienten getrennt werden konnten (Cutinase I und Cutinase II).
Die p-NPP Hydrolase hatte während der 34fachen Aufreinigung die meiste Aktivität bei dem QAE-
Sephadex Schritt verloren. Lediglich eine 6,5 fache Aufreinigung vom Überstand hatte die
Homogenität der Cutinasen zur Folge, da sie die direkte Antwort auf das Wachstum des Pilzes mit
Cutin als einzige C-Quelle in hoher Konzentration waren. Das Ausgangsmedium enthielt 33 g Cutin
und produziert wurden 48 mg Cutinase I und 20 mg Cutinase II nach der Aufreinigung (Purdy und
Kolattukudy 1975a).
Analog dazu wurden aus F. roseum culmorum mit derselben Kultivierung und Aufreinigung eine
Cutinase (MG 24,3 kDa) und eine p-NPP Hydrolase isoliert. Diese Cutinase ähnelte aufgrund ihrer
Aminosäurezusammensetzung eher der Cutinase I aus F. solani f. pisi (Soliday und Kolattukudy 1976).
Bei der Kultivierung der fünf Pilz- bzw. Bakterienkulturen F. roseum culmorum,
F. roseum sambucinum, Ulocladium consortiale, S. scabies und Helminthosporium sativum war die
spezifische Aktivität von F. roseum sambucinum 50fach höher im extrazellulären Überstand
gegenüber den anderen Kulturen. Die zuvor von Purdy und Kolattukudy 1975 entwickelte
Aufreinigungsmethode wurde erfolgreich auch für diese extrazellulären Enzyme angewandt. Nach
der Ammoniumsulfat-Fällung und der SEC mit Sephadex G-100 konnten auch zwei Peaks identifiziert
werden, wovon der vordere cutinolytische Aktivität besaß und der hintere p-NPP Aktivität. Diese
Beobachtungen wurden auch von Purdy und Kollatukudy 1975 und von Soliday und Kolattukudy 1976
gemacht.
Tabelle 19: Aufreinigungstabelle der Cutinasen und p-NPP Hydrolase aus F. solani f. pisi (Purdy und Kolattukudy 1975a).
Schritt Aktivität (%)
Cutinase
Aktivität (%)
p-NPP Hydrolase
Spezifische Aktivität
(104 dpm/µg)
Cutinase1
Spezifische Aktivität
(µmol/mg)
p-NPP Hydrolase2
Kulturüberstand 100 100 1.2 11
(NH4)2SO4 Fällung 67 40 2.0 12
SEC 1 61 26 4,1 17
AIEX 1 36 5 7,6 123
SEC 2 5 340
AIEX 2 30(I)
13(II)
7,8
1 Bestimmt mit Cutin als Substrat.
2 Bestimmt mit p-NPP als Substrat.
Ergebnisse und Diskussion 103
Die Mikroorganismen produzierten alle nur eine Cutinase mit einem Molekulargewicht von 24,3-
26,3 kDa im Vergleich zu F. solani f. pisi. Für die fünf Cutinasen ergab sich eine 6-16 fache
Aufreinigung mit 16-28% Ausbeute (Tabelle 20, Lin und Kolattukudy 1980a).
Tabelle 20: Aufreinigungstabelle der extrazellulären Cutinasen (Lin und Kolattukudy 1980a).
F. roseum sambucinum U. consortiale H. sativum S. scabies
Schritt Protein
(mg)
Spez. Aktivität
(103dpm/µg)
Protein
(mg)
Spez. Aktivität
(103dpm/µg)
Protein
(mg)
Spez. Aktivität
(103dpm/µg)
Protein
(mg)
Spez. Aktivität
(103dpm/µg)
Kulturüberstand 660 5 410 0,11 210 0,11 310 0,1
(NH4)2SO4 Fällung 449 6 148 0,18 69 0,13 102 0,13
SEC 1 233 7 77 0,3 46 0,4 60 0,35
AIEX 1 25 28 10 1,7 4 1 6 1,2
AIEX 2 20 31 7 1,8 3 1,2 4 1,2
Die spezifische Aktivität wurde mit Cutin als Substrat bestimmt.
Fernando et al. (1984) kultivierte einen F. solani pisi Stamm im Mineralmedium mit Suberin als
einzige C-Quelle. Im Mediumüberstand konnte nur eine geringe Menge an p-NPB Aktivität detektiert
werden. Daraufhin wurde die Myzelmatte mit 0,4% Triton X-100 in 0,2 M Natriumphosphatpuffer
gewaschen und es konnte eine 13 fach höhere Aktivität nachgewiesen werden. Das bedeutet, dass
nach der Kultivierung 93% der Gesamtaktivität am Myzel oder am Suberin gebunden vorlag. Beim
Auftrag auf die QAE-Sepharose wurden die farblichen Verunreinigungen gebunden, das aktive Enzym
jedoch eluierte direkt wieder. Bei pH 4,8 band das aktive Enzym anschließend an die SP-Sephadex C-
25 Säule, die vorhandenen Verunreinigungen wanderten durch die Säule durch. Die Elution mit
einem NaCl Gradienten ergab einen Elutionspeak, der nach Auftrag auf eine SP-Sephadex Säule 2
getrennte Peaks mit p-NPB und Cutinaseaktivität hervorbrachte. Dabei handelte es sich um 2
Isoenzyme mit einem Molekulargewicht von 23 kDa. Der Vergleich der Aminosäurezusammen-
setzung der Suberin- und Cutin-induzierten Cutinasen (Purdy und Kolattukudy 1975a) zeigte, dass
diese Isoenzyme sich lediglich aufgrund eines nicht detektierten Methionins unterschieden. Somit
besteht die Möglichkeit, dass die Cutin- und Suberin-induzierten Isoenzyme die gleichen sind
(Fernando et al. 1984).
Die PET-Hydrolase aus P. citrinium wurde aufgrund ihrer Aktivität gegenüber 3PET (BETEB)
aufgereinigt. Zunächst erfolgte eine fraktionelle Ultrafiltration mit den Ausschlussgrößen von 50 und
5 kDa. Die PET-Hydrolase wurde 67,9 fach bis zur elektrophoretischen Reinheit aufgereinigt, die
Ausbeute betrug 6% nach AIEX und SEC. Die spezifische Aktivität betrug am Ende 14,8 nkat/mg und
das Molekulargewicht wurde auf 14,1 kDa bestimmt. Somit ist diese PET-Hydrolase die kleinste
bekannte PET abbauende Hydrolase (Tabelle 21, Liebminger et al. 2007).
Ergebnisse und Diskussion 104
Tabelle 21: Aufreinigungstabelle der PET-Hydrolase aus P. citrinum (Liebminger et al. 2007).
Schritt Volumen
(ml)
Aktivität
(nkat)
Protein
(mg)
Spezifische Aktivität
(nkat/mg)
Ausbeute
(%)
Kulturüberstand 200,0 120,6 552,0 0,2 100
AIEX 40,0 22,4 19,8 1,1 18,6
Entsalzung 30,0 18,0 12,7 1,4 15,0
AIEX 9,0 9,1 2,2 4,1 7,5
SEC 2,0 7,3 0,49 14,8 6,0
Die Rohenzymlösungen mit den hydrolysierenden Enzymen von F. oxysporum LCH 1 und
F. solani f. sp. pisi wurden mittels Zentrifugation und Ausfällung gewonnen und es erfolgte mit ihnen
die Untersuchung der Hydrolyse von PET-Fasern (Nimchua et al. 2007).
Die für die Aufreinigung der PET-Hydrolasen eingesetzten Methoden variierten bei der
Aufkonzentrierung des extrazellulären Überstandes, es kamen Ultrafiltration, verschiedene Fällungen
und die Gefriertrocknung zum Einsatz. Diese Schritte waren meist mit einem höheren Verlust an
aktivem Enzym verbunden, allerdings von Nöten für die weitere Aufreinigung, da das extrazelluläre
Enzym in einer zu hohen Verdünnung vorlag (Purdy und Kolattukudy 1973, Soliday und Kolattukudy
1976, Sebastian et al. 1988, Gouda et al. 2002, Kleeberg et al. 2005). Für die TfCa wurden auch
verschiedene Aufkonzentrierungsmethoden getestet mit dem Ergebnis, dass die
Aufreinigungsverluste mit der Gefriertrocknung am geringsten waren. Bei der anschließenden
chromatographischen Aufreinigung kamen meistens eine IEX oder SEC zum Einsatz, seltener eine HIC
aufgrund der stark hydrophoben Eigenschaften der PET-Hydrolasen und der daraus resultierenden
schlechten Rückgewinnung des Enzyms vom Säulenmaterial. Die Aufreinigung der hydrolytischen
Enzyme konnte mit einer 3 bis 5 Schritt Aufreinigungsmethode bis zur elektrophoretischen Reinheit
bewerkstelligt werden. Dabei lagen die Ausbeuten bei 3-30%, im Vergleich dazu lag die Ausbeute der
TfCa bei 7% (Billig et al. 2010).
Eine interessante Besonderheit konnte bei der Aufreinigung der Cutin-induzierten Hydrolasen aus
den Pilzen F. solani f. pisi, F. roseum culmorum, F. roseum sambucinum, U. consortiale und
H. sativum, aber auch beim Actinomyceten S. scabies identifiziert werden. Parallel zur Cutinase
produzierten diese Stämme mit Cutin als einzige C-Quelle ebenfalls eine Esterase, welche p-NPB und
p-NPP spalten konnte (Purdy und Kolattukudy 1975a, Lin und Kolattukudy 1980a). Ebenfalls besaß
diese p-NPP Esterase ein MG von 52 kDa (Purdy und Kolattukudy 1975a). Der Pilz F. solani f. pisi
unterschied sich zusätzlich von den anderen Kulturen, indem er zwei Isoenzyme während des
Wachstums mit Cutin bildete (Purdy und Kolattukudy 1975a). Bei allen weiteren Aufreinigungen von
PET-Hydrolasen wurde auf die Produktion einer zusätzlichen p-NPB oder p-NPP Esterase nicht
geachtet. Bei der Aufreinigung der Cutinase aus P. mendocina konnte beim ersten
Ergebnisse und Diskussion 105
Anionenaustauschschritt ein starker Verlust der p-NPB Aktivität verzeichnet werden, was mit einer
möglichen Abtrennung einer weiteren Esterase begründet wurde (Sebastian et al. 1988). Aufgrund
der bisherigen Ergebnisse scheint diese Annahme als sehr wahrscheinlich. Die Aufreinigungen der
TfH aus T. fusca DSM 43793 und der PET-Hydrolase aus P. citrinum erfolgte mit BTA bzw. 3PET
induzierten Kulturen und deshalb könnte die Produktion einer mitinduzierten Esterase nicht
stattgefunden haben oder in zu geringen Mengen für einen direkten Nachweis erfolgt sein (Kleeberg
et al. 2005, Liebminger et al. 2007). Fernando et al. (1984) kultivierte den Pilz F. solani f. pisi mit
Suberin als Induktor. Während der anschließenden Aufreinigung der Suberin-hydrolysierenden
Enzyme wurde keine zusätzliche Esterase detektiert bzw. nicht nach ihr gesucht.
Es wäre interessant, die beiden Esterasen TfCa und die eukaryotische Esterase in ihren Sequenzen
und katalytischen Zentren zu vergleichen und herauszufinden, warum die eukaryotische Esterase
unter Zusatz von Cutin produziert wird und ob die Produktion auch unter Zusatz eines synthetischen
Polyesters nachweisbar wäre. Weiterhin ob und wie sich die beiden Esterasen hinsichtlich ihrer PET-
Hydrolyseaktivität unterscheiden würden.
Eine weitere Besonderheit war ebenfalls die beobachtete Hydrophobie der PET-Hydrolasen
begründet durch ihre Affinität zu den abzubauenden hydrophoben Substraten. Diese Eigenschaft
wurde bei der Aufreinigung der TfCa ausgenutzt.
3.2.1.2 Aufreinigung der rekombinanten PET-Hydrolasen
Die TfCa und die Cutinasen TfCut1 und TfCut2 aus T. fusca KW3 wurden bereits erfolgreich kloniert
und mit Hilfe verschiedener E. coli Stämme exprimiert (Oeser et al. 2010, Chen S et al. 2008). Die
Hydrolaseproduktion erfolgte bei einer optimalen Kultivierungstemperatur von 18°C im 5 L
Fermenter. Bei der niedrigeren Temperatur erfolgte eine geringere Bildung an Einschlusskörpern der
produzierten Enzyme und somit stand mehr aktives Protein nach der Kultivierung für die
Aufreinigung zur Verfügung. Mit den optimierten Bedingungen erfolgte die rekombinante Produktion
der TfCa mit einer 4500fach höheren Aktivität gegenüber dem Wildtyp und die spezifische Aktivität
(U/mg) stieg um mehr als das 30fache (Oeser et al. 2010). Die rekombinante TfCa, gewonnen aus
dem löslichen Zellinhalt, wurde mittels Nickel-Affinitätschromatographie (Abbildung 40) und
Größenausschlusschromatographie (Abbildung 41) aufgereinigt. Es erfolgte eine Aufreinigung um das
Abbildung 40: Elutionsprofil der TfCa während des ersten Aufreinigungsschritts (HisTrap, Säulenvolumen 10 ml, Puffer A: 50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl; pH 8,0, Puffer B: 50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 250mM Imidazol, pH 8). Dargestellt sind das Proteinprofil (grau), die p-NPB Aktivität (schwarz) und der Gradient der Elution (gestrichelt).
Abbildung 41: Elutionsprofil der TfCa während des zweiten Aufreinigungsschritts (Sephadex 200 prep grade, Säulenvolumen 320 ml, Puffer: 0,15 M NaCl, 20 mM Phosphatpuffer pH 8). Dargestellt sind das Proteinprofil (grau), die p-NPB Aktivität (schwarz).
Ergebnisse und Diskussion 107
Abbildung 42: Elutionsprofil der TfCut2 während des ersten Aufreinigungsschritts (HisTrap, Säulenvolumen 10 ml, Puffer A: 50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl; pH 8,0, Puffer B: 50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 250 mM Imidazol, pH 8). Dargestellt sind das Proteinprofil (grau), die p-NPB Aktivität (schwarz) und der Gradient der Elution (gestrichelt).
Abbildung 43: Elutionsprofil der TfCut2 während des zweiten Aufreinigungsschritts (Sephadex 200 prep grade, Säulenvolumen 320 ml, Puffer: 0,15 M NaCl, 20 mM Phosphatpuffer pH 8). Dargestellt sind das Proteinprofil (grau), die p-NPB Aktivität (schwarz).
Ergebnisse und Diskussion 108
Abbildung 44: SDS-PAGE der Aufreinigung der rekombinant produzierten TfCa in E. coli (A) und der rekombinant produzierten TfCut2 in E. coli (B). Spur M: Low Molecular Weight Längenstandard; Spur 1, 4: Rohenzymlösung nach Zellaufschluss; Spur 2, 5: Enzymlösung nach Ni-Affinitätschromatographie; Spur 3, 6: Enzymlösung nach SEC.
Tabelle 22: Aufreinigungstabelle der rekombinanten TfCa.
Schritt Volumen
(ml)
Aktivität
(U)
Protein
(mg)
Spezifische Aktivität
(U/mg)
Ausbeute
(%)
Aufreinigung
(fach)
Zellfreier
Extrakt
196 4606 1535 3 100 1
HisTrap 44 2077 112 19 45 6
SEC 75 1538 44 35 33 12
Tabelle 23: Aufreinigungstabelle der rekombinanten TfCut2.
Schritt Volumen
(ml)
Aktivität
(U)
Protein
(mg)
Spezifische Aktivität
(U/mg)
Ausbeute
(%)
Aufreinigung
(fach)
Zellfreier
Extrakt
195 2477 1482 2 100 1
HisTrap 27 1183 54 22 26 7
SEC 50 895 35 26 19 9
Die TfH wurde durch Dresler et al. 2006 auch bereits rekombinant in E. coli TG1 mit dem Plasmid
pCYTEXP1-OmpA-bta1-His6 produziert, sekretiert und aufgereinigt. Im Vergleich mit der Wildtyp
Produktion konnte rekombinant extrazellulär eine 1,5-2fach höhere volumetrische Aktivität in den
Batch Kulturen und eine 20fach höhere in den Fed-Batch Kulturen erzielt werden (unter Glucose
Limitation). Die volumetrische Aktivität intrazellulär konnte sogar um das 50fache gesteigert werden
und somit stieg die Gesamtproduktion um mehr als das 100fache gegenüber dem Wildtyp. Aufgrund
des angehängten His6-Tags erfolgte die einfache Aufreinigung des periplasmatischen und
Ergebnisse und Diskussion 109
zytoplasmatischen (Einschlusskörper) Proteins in zwei Schritten. 57% Ausbeute konnte erzielt
werden und eine 30fache Aufreinigung mit einer spezifischen Aktivität von 445 U/mg wurde erreicht
(Tabelle 24). Zum Vergleich beim Wildtyp konnte nur 14% Ausbeute nachgewiesen werden (Dresler
et al. 2006).
Tabelle 24: Aufreinigungstabelle der rekombinanten periplasmatischen (pp-rTfH) und zytoplasmatischen (zp-rTfH) TfH (Dresler et al. 2006).
Schritt Aktivität
(103 U/L)
Protein
(mg/L)
Spezifische Aktivität
(U/mg)
Ausbeute
(%)
Aufreinigung
(fach)
pp-rTfH Extrakt 8,57 587 15 100 1
HisTrap 6,53 15 436 71 29
SEC 4,89 11 445 57 30
zp-rTfH Extrakt 26,52 2570 10,3 100 1
Hitzebehandlung 22,52 1470 15,3 85 1,5
Ultraschall- und
Hitzebehandlung
28,89 1410 20,5 109* 2
* Rohextrakt nach Ultraschall und Zentrifugation.
In weiterführenden Studien erfolgte nach einer Codon-Optimierung die erfolgreiche rekombinante
Produktion der TfH mit B. megaterium WH323. Bei einer pH-kontrollierten Batchkultivierung konnte
eine weitere Steigerung auf 16,1 mg/L rTfH erzielt werden. Nach der Induktion durch Xylose erfolgte
ein starker Anstieg der rTfH Produktion für 4 Stunden. Beim Vergleich der produzierten Mengen an
rTfH mittels B. megaterium und E. coli (Dresler et al. 2006) konnte für die Batchkultivierung mit LB
Medium und Hochzelldichten-Kultivierung mit synthetischem Medium ähnliche Ergebnisse erzielt
werden (Tabelle 25). Beide zeigten eine 50-100fach höhere Produktion gegenüber dem Wildtyp
(Yang et al. 2007).
Tabelle 25: Expression der rekombinanten TfH in E. coli und B. megaterium (Yang et al. 2007).
Kultivierung Medium
B. megaterium WH323
U/g U/L
E. coli TG 1
U/g U/L
Batch LB 2651 7953 4000 8000
Batch Definiert 116 886 770 7300
Hochzelldichten-
Kultivierung
Definiert 187 6098 76/227* 5500/12000*
* abhängig von der Induktionsphase (Temperaturänderung)
Ergebnisse und Diskussion 110
Die Aufreinigung der rTfH erfolgte ebenfalls mittels Ni-Affinitätschromatographie. Die Protokolle
einiger Proteinaufreinigungen verschiedener Kultivierungsansätze sind in der nachfolgenden Tabelle
zusammengefasst (Yang et al. 2007).
Tabelle 26: Übersicht zur Affinitätsaufreinigung der His6-Tag rTfH produziert durch B. megaterium WH323-pYYBm9 gewachsen in einer LB-Batch Kultivierung und Hochzelldichten-Kultivierung (HZDK) mit A5 Medium. I:ohne
Vorhbehandlung; II: 50°C für 10 min; III: 18 Stunden Dialyse bei 4°C (Yang et al. 2007).
Kultivierung Aktivität
(U)
Protein
(µg)
Spezifische Aktivität
(U/mg)
Ausbeute
(%)
Aufreinigung
(fach)
LB-I Extrakt
HisTrap
37
20
238
41
157
494
100
54
1,0
3,2
LB-II Extrakt
HisTrap
35
17
213
37
162
471
100
50
1,0
2,9
LB-III Extrakt
HisTrap
23
13
147
42
159
310
100
55
1,0
1,9
HZDK-I Extrakt
HisTrap
49
25
203
83
240
307
100
52
1,0
1,3
HZDK-II Extrakt
HisTrap
47
23
221
63
213
367
100
49
1,0
1,7
HZDK-III Extrakt
HisTrap
29
10
161
45
178
215
100
34
1,0
1,2
Die gleichen Cutinasen wurden 2008 von Chen S et al. 2008 als Cutinase 1 und Cutinase 2 aus T. fusca
WSH03-11 nach vorherigen Vermehrungs- und Modifikationsschritten in den pET20b(+) Vektor
kloniert und anschließend in E. coli Rossetta (DE3) pLysS einzeln transformiert (Chen J et al. 2008).
Das Wachstum der transformierten Klone erfolgte unter Zusatz von Ampicillin und Chloramphenicol
und bei einer Zelldichte von 1,5 (OD600) erfolgte die Induktion mit IPTG. Nach 16 Stunden Expression
erfolgte die Zellernte, Konzentrierung des Kulturüberstand, Dialyse und Ni-Affinitätschromatographie
(Chen S et al. 2008).
Die p-NPB Aktivität im Kulturüberstand der transformierten E. coli Zellen mit dem Plasmid pET20b-
Cutinase 2 lag bei 180 U/ml, und damit um das 782fache höher als bei den untransformierten Zellen
und um das 9,5fache höher als bei den Cutin-induzierten Zellen von T. fusca. Die p-NPB Aktivität im
Kulturüberstand der transformierten E. coli Zellen mit dem pET20b-Cutinase 1 Vektor lag bei
69 U/ml, und damit um das 300fache höher als bei den untransformierten Zellen und um das
3,6fache höher als in den Cutin-induzierten T. fusca Zellen. Die rekombinanten Enzyme wurden bis
zur homogenen Reinheit mit einem Schritt mittels Ni-Affinitätschromatographie aufgereinigt und
Ergebnisse und Diskussion 111
besaßen eine spezifische Aktivität von 458 U/mg (Cutinase 2) und 223 U/mg (Cutinase 1) (Chen S
et al. 2008, Chen J et al. 2008).
Sinsereekul et al. (2010) konstruierten einen transkonjuganten S. rimosus R7 mit dem Vektor pIJ-BTA,
der das Gen für eine Ecoflex® Filme-abbauende Hydrolase enthielt. Das Gen wurde aus dem Isolat
Thermobifida sp. BCC23166 gewonnen, isoliert aus einer Probe von einer Deponie. Es erfolgte die
Ligation des Gens in den pIJ8600 Vektor und der Transfer in S. rimosus R7 mittels intergenetischer
Konjugation. Dieses entwickelte Expressionssystem zeichnete sich durch die Produktion des
gesamten nativen Proteins aus dem unmodifizierten Gen ohne Codon Optimierung und Modifikation
durch Fusionsproteine aus. Allerdings war zum damaligen Zeitpunkt die anfängliche Ausbeute aus
der Expression geringer (0,058 mg/L) verglichen mit den Expressionssystemen in E. coli oder
B. megaterium. Das produzierte rekombinante Enzym (mit His6Tag) wurde anschließend bis zu einer
95% Reinheit mittels einer Ein-Schritt Aufreinigung durch eine Ni-Affinitätschromatographie
aufgereinigt. Dabei betrug das Kulturvolumen am Beginn 500 ml und die Ausbeute nach der
Reinigung 82,5% (Sinsereekul et al. 2010).
In neuesten Studien wurde eine thermoaktive Hydrolase Est119 aus Thermobifida alba AHK119
rekombinant ebenfalls in E. coli produziert. Dazu wurde das isolierte Gen der Hydrolase ohne die
Signalsequenz in den Vektor pQE80L kloniert, mit den Vektor pQE80L-est119 als Produkt. Das
rekombinante Protein mit einem N-terminalen His6Tag konnte erfolgreich mit dem E. coli Rosetta-
gami B (DE3) nach der Zugabe von IPTG produziert werden. Die rekombinante 29 kDa Cutinase
konnte um das 2,3fache mittels einer Ein-Schritt Aufreinigung mit der Ni-Affinitätschromatographie
Säule aus dem zellfreien E. coli Extrakt gewonnen werden (Spezifische Aktivität 1.37 U/mg, Hu et al.
2010).
Die Cutinasen aus P. mendocina ATCC 53552 wurden nach der Identifikation der Gene einzeln in das
Plasmid pSNtacII kloniert und rekombinant in E. coli JM101 exprimiert. 74% der Aktivität der
Hydrolase 1 lagen nach der Kultivierung extrazellulär vor, 17% Aktivität in den Zellen, 2% im
periplasmatischen Raum und 7% an der Cytoplasmamembran. Die Aufreinigung der Hydrolasen
erfolgte mittels Octyl-Sepharose analog zur bereits erläuterten Aufreinigung der Wildtyp Enzyme. Die
Cutinase 1 zeigte eine p-NPB Aktivität von 3750 U/mg Protein, bestand aus 259 Aminosäuren ohne
Signalsequenz und zeigte ein p-NPB/p-NPC Verhältnis von 7 (Cutinase 2 besaß ein Verhältnis von 1)
(Gray et al. 1995).
Für die präparative Produktion der F. solani Cutinase erfolgte die Kultivierung von E. coli WK6 Zellen,
welche das Plasmid pMa/c5-CUF enthielten. Bei einer optischen Dichte von 410 erfolgte die
Induktion mit IPTG über 6 bis 12 Stunden (Carvalho et al. 1999). Aufschlussmethoden der Cutinase
waren kombinierte Methoden wie z.B. osmotischer Schock und Präzipitation der Verunreinigungen
mit verdünnter Essigsäure. Anschließend erfolgte die Aufreinigung mittels Kationenaustauscher, wie
Ergebnisse und Diskussion 112
SP-Sephadex oder in zwei Anionenaustauschschritten, z.B. mit DEAE-Cellulose und MonoQ- oder Q-
Sepharose HP. Die endgültige Ausbeute der Aufreinigung lag bei 51% und der Aufreinigungsfaktor bei
10. Die Aufreinigung der Cutinase, produziert durch Hefezellen, verlief ähnlich wie mit den
Bakterienzellen, allerdings folgte am Schluss eine Affinitätschromatographie mit einer Con-A
Sepharose-4B Säule zur Entfernung der glykosylierten Fraktionen (Carvalho et al. 1999). Neuere
Aufreinigungsmethoden sind die Umkehrmyzellen Extraktion und das wässrige Zwei-Phasen System
als Alternative für die Säurepräzipitation, Filtration, Zentrifugation oder Dialyse (Carvalho et al.
1999). Mit der Umkehrmyzellen Extraktion konnten Ausbeuten von 5-50% erreicht werden mit
Aufreinigungsfaktoren von 1,2 bis 10,2. Bei der direkten Extraktion der Cutinase aus dem Zellextrakt
mit Zellbruchstücken der E. coli Zellen lag die Ausbeute bei optimalen Bedingungen bei 54,4%
(Carvalho et al. 1999). Beim wässrigen Zwei-Phasen System lagen die Ausbeuten immer sehr hoch,
meist über 90%. Bei einer Ein-Schritt Aufreinigung der Cutinase aus E. coli Zelltrümmern lagen die
Ausbeute bei 91% und der Aufreinigungsfaktor bei 4,1, bei einem Zeitaufwand von nur 20 min
(Carvalho et al. 1999). Die Cutinase aus F. solani pisi wurde in B. subtilis Zellen mit dem Vektor
pBSMuL3 während des Wachstums im Medium mit Kanamycin produziert. Die Proteine des
Kulturüberstands wurden mit Ammoniumsulfat ausgefällt, zentrifugiert, resuspendiert und dialysiert.
Nach einer erneuten Präzipitation der verunreinigenden Proteine mit Ammoniumsulfat erfolgte die
Filtration der Lösung und der Auftrag auf eine Phenyl HP-Sepharose Fast Flow Säule. Die Elution der
Cutinase erfolgte mit einem linearen Gradienten von 20% auf 0% Ammoniumsulfat im Elutionspuffer.
Die Fraktionen mit p-NPB Aktivität wurden anschließend auf eine CM-Sepharose Säule aufgetragen
und mit einem linearen Gradienten von 0 bis 1 M Natriumchlorid eluiert (Chen S et al. 2008).
Die Cutinase aus T. insolens wurde in A. niger mit dem Vektor pA2L79 rekombinant produziert. Nach
der Produktion erfolgte die Gewinnung der intrazellulären Cutinase mittels Zentrifugation und
Ultrafiltration. Mit dem Überstand erfolgte eine Ammoniumsulfatfällung. Das Präzipitat mit der
Cutinase wurde mittels Zentrifugation gewonnen, in Wasser gelöst und mit Essigsäure auf pH 6
eingestellt. Zur Entfernung der enthaltenen Proteasen passierte die Lösung eine Bacitracin-Agarose
Säule und die eluierten aktiven Fraktionen wurden auf eine Kationenaustausch SP-Sepharose HP
Säule aufgetragen. Die Cutinase wurde mit einem linearen Salzgradienten eluiert (Sandal et al. 1996).
Bisher wurden verschiedenste bekannte Systeme für die rekombinante Expression von Hydrolasen
und deren Aufreinigung zusammengefasst. Bei der Wahl des jeweiligen Expressionssystems besteht
keine Möglichkeit zur Diskussion, da die Auswahl nach dem „try and error“ Verfahren abläuft und
jedes der Systeme seine spezifischen Vor- und Nachteile aufweist. Eines ist allerdings für alle
rekombinanten Produktionen zu empfehlen, die Verwendung eines His6Tags für eine deutlich
einfachere und spezifischere Aufreinigung des rekombinanten Proteins, wie es auch für die beiden in
diesem Abschnitt beschriebenen Hydrolasen aus T. fusca KW3, produziert mittels E. coli, erfolgte.
Ergebnisse und Diskussion 113
Dadurch sind Ausbeuten von über 50% keine Seltenheit. In dieser Hinsicht sollte die Aufreinigung der
beiden rekombinanten Hydrolasen aus T. fusca KW3 noch weiter optimiert werden, damit eine
Steigerung der Ausbeute erfolgen kann.
3.2.2 pI der TfCa
Der bestimmte pI der TfCa lag bei 4,8 (theoretischer Wert 4,79).
Abbildung 45: PhastGel der Bestimmung des isoelektrischen Punktes der TfCa. (linkes Gel PhastGel IEF 3-9, rechtes Gel PhastGel IEF 4-6,5) Spur 1: 26,7 ng TfCa; Spur 2: 66,7 ng TfCa; Spur 3: 133 ng TfCa; Spur 4: 26,7 ng TfCa; Spur 5: 53,4 ng TfCa; Spur 6: Kalibrierungskit für die pI Bestimmung, Breiter pI Bereich (pH 3-10, GE Healthcare).
3.2.3 Molare Masse der TfCa
Die Molekulargewichtsbestimmung erfolgte mit einer SDS-PAGE mit der partiell aufgereinigten
Enzymlösung und des Roti®-Mark SDS Proteinstandards (Fa. Carl Roth GmbH).
St 1 2 3
9.30
8.65
8.458.15
7.35
6.85
6.55
5.85
5.20
4.55
St 4 5
6.85
6.55
5.85
5.20
4.55
Ergebnisse und Diskussion 114
Abbildung 46: Laufstrecken der Proteine des Roti®-Mark SDS Proteinstandards (Fa. Carl Roth GmbH) aufgetragen gegen den
Logarithmus ihres Molekulargewichtes.
Nach erfolgter elektrophoretischer Auftrennung wurden die Laufstrecken der Proteine des Standards
bestimmt und gegen den Logarithmus ihres Molekulargewichts aufgetragen (Abbildung 46). Für die
untersuchte TfCa ergab sich daraus ein exaktes Molekulargewicht von 52,4 kDa, was mit dem
theoretischen MG von 52,94 kDa gut übereinstimmt.
3.2.4 Temperatur- und pH-Stabilität der TfCa
Für die Bestimmung der Stabilität der TfCa bei verschiedenen pH-Werten wurde die Esterase in
100 mM Puffern mit pH-Werten von 3 bis 11 für 7 Tage inkubiert und die Esteraseaktivitäten zu
verschiedenen Zeiten mit p-NPB als Substrat spektrophotometrisch bestimmt. Ein Citrat-Phosphat-
Puffer wurde für pH 3 bis 7 verwendet, Phosphatpuffer für pH 8 und Glycin-NaOH Puffer für pH 9 bis
11. Die Inkubationen erfolgten bei Raumtemperatur.
Bei der Inkubation der TfCa bei verschiedenen pH-Werten wurde festgestellt, dass die Esterase hohe
Stabilität im alkalischen Bereich auch über einen längeren Zeitraum besitzt (Abbildung 47). Nach 7
Tagen Inkubation konnte bei pH 9 und 10 noch eine relative Aktivität von 85% nachgewiesen werden.
Aber auch bei pH 5 und 11 zeigte die TfCa nach 7 Tagen Inkubation noch eine relative Aktivität von
22% und 16%. Das bedeutet, dass die Esterase bei kürzeren Inkubationen, wie zum Beispiel nach 24
Stunden (Abbildung 48), im pH-Bereich von 5 bis 11 noch eine relative Aktivität von 40% bis 100%
besitzt und somit einen breiten Einsatzbereich vorweisen kann.
y = -0,089x + 2,037
R² = 0,993
1
1,2
1,4
1,6
1,8
2
2 4 6 8 10
lg M
W
Laufstrecke (cm)
Ergebnisse und Diskussion 115
Abbildung 47: Esteraseaktivitäten der TfCa über einen Zeitraum von 7 Tagen bei Inkubation in unterschiedlichen pH-
Werten von 4 bis 11 bestimmt mit p-NPB als Substrat.
Abbildung 48: Esteraseaktivitäten der TfCa nach 24 Stunden Inkubation in verschiedenen pH-Werten von 3 bis 11 bestimmt
mit p-NPB als Substrat.
Für die Stabilitätsuntersuchung der TfCa bei verschiedenen Temperaturen wurde die Esterase in
100 mM Phosphatpuffer pH 8 bei den Temperaturen 40°C, 50°C und 55°C für 7 Tage inkubiert. Die
Esteraseaktivitäten wurden mit p-NPB als Substrat spektrophotometrisch bestimmt.
0
20
40
60
80
100
0 1 2 3 4 5 6 7
Rela
tive A
ktiv
ität (%
)
Inkubationszeit (d)
pH 4 pH 5 pH 6 pH 7 pH 8 pH 9 pH 10 pH 11
0
20
40
60
80
100
3 4 5 6 7 8 9 10 11
Rela
tive A
ktiv
ität (%
)
pH
Ergebnisse und Diskussion 116
Abbildung 49: Esteraseaktivitäten der TfCa über einen Zeitraum von 7 Tagen bei Inkubation bei 40°C, 50°C und 55°C bestimmt mit p-NPB als Substrat (Billig et al. 2010).
Abbildung 50: Esteraseaktivitäten der TfCa nach 24 Stunden Inkubation bei 30°C, 40°C, 50°C und 55°C bestimmt mit p-NPB als Substrat.
Die TfCa besitzt ebenfalls eine hohe Stabilität bei Temperaturen von 40 bis 50°C, (Abbildung 49).
Nach 7 Tagen Inkubation bei diesen Temperaturen war noch eine relative Aktivität zwischen 93 und
100% nachweisbar. Bei 40°C erfolgte über diesen Zeitraum keine Verminderung der Aktivität, die
Aktivität blieb über den gesamten Zeitraum konstant. Bei 55°C hingegen konnte nach 24 Stunden
0
20
40
60
80
100
0 1 2 3 4 5 6 7
Rela
tive A
ktiv
ität (%
)
Inkubationszeit (d)
40°C 50°C 55°C
0
20
40
60
80
100
30 35 40 45 50 55
Rela
tive A
ktiv
ität (%
)
Temperatur (°C)
Ergebnisse und Diskussion 117
Inkubation lediglich 1% Restaktivität detektiert werden (Abbildung 50). Bei höheren Temperaturen
erfolgte die Inaktivierung der Esterase in einem noch kürzeren Zeitraum.
3.2.5 Wirkung von Inhibitoren auf die TfCa
Um eine Einordnung der TfCa in der Enzymgruppe der Hydrolasen durchzuführen, wurde die
Stabilität des Enzyms gegenüber verschiedener spezifischer und unspezifischer Inhibitoren
untersucht. Die Inhibitoren, welche eingesetzt wurden, waren EDTA, PMSF, TPCK und DTT. Sie
wurden nach Anweisung in Puffer, Isopropanol oder Ethanol gelöst. Die eingesetzten
Konzentrationen der Inhibitoren lagen bei 0,1 mM, 1 mM und 10 mM. Für die Untersuchung wurde
die TfCa in 25 mM Phosphatpuffer pH 8 mit dem Inhibitor für 15 min bei 30°C inkubiert und die
verbleibende Esteraseaktivität mit p-NPB als Substrat spektrophotometrisch gemessen (Tabelle 27).
Die Inhibitoren EDTA und DTT zeigten mit verschiedenen Konzentrationen keine Hemmung der
Esteraseaktivität. Hingegen zeigte sich mit den spezifischen Esterasehemmern PMSF und TPCK eine
deutliche Erniedrigung der Aktivität ab einer Konzentration des Inhibitors von 1 mM. Mit 10 mM
Inhibitor war die verbleibende Esteraseaktivität mit PMSF 35% und mit TPCK konnte keine
verbleibende Aktivität bestimmt werden.
Tabelle 27: Übersicht über die verbleibenden Esteraseaktivitäten nach der Inkubation der TfCa mit verschiedenen Inhibitoren.
Abbildung 51: Lineweaver-Burk Darstellung für die enzymkatalysierte Hydrolyse der CTR durch die TfCa. Mit Hilfe der doppeltreziproken graphischen Darstellung konnten die Geschwindigkeitskonstanten Vmax und Km bestimmt werden.
3.2.7 Optimale Temperatur und optimaler pH-Wert der CTR-Hydrolyse durch die TfCa
Für die Anwendung der Esterase zum Abbau von zyklischen PET-Trimeren wurde die optimale
Temperatur und der optimale pH-Wert der CTR Hydrolse bestimmt. Dazu erfolgte der Ansatz
mehrerer Reaktionen mit verschiedenen pH-Werten des Puffers und die Inkubation bei
verschiedenen Temperaturen, um deren Einfluss auf die Abbaurate zu bestimmen.
Die TfCa besitzt ein Temperaturoptimum für den Abbau von zyklischen PET-Trimeren bei 60°C und
ein pH-Optimum bei pH 6 (Abbildung 52).
Abbildung 52: pH und Temperaturoptimum der TfCa beim Abbau von zyklischen PET-Trimeren, bestimmt per RP HPLC (Billig et al. 2010).
Ergebnisse und Diskussion 120
3.2.8 Cutinaseaktivität der TfCa
Um zu testen, ob die aufgereinigte TfCa auch in der Lage ist, Cutin abzubauen, wurden je 1 U, 2 U
und 4 U der TfCa mit Cutin inkubiert. Die nachfolgenden Chromatogramme zeigen die
gaschromatographischen Analysen der verschiedenen Ansätze (Abbildung 53-56).
Abbildung 53: Gaschromatographische Analyse des Blindwerts (ohne Enzym) der Cutinhydrolyse.
Abbildung 54: Gaschromatographische Analyse des Ansatzes mit 1 U TfCa der Cutinhydrolyse.
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22
Analysezeit (min)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Rela
tive A
bundan
z
9.73
2.81
8.19
5.27
19.84 12.25 14.08 6.37 16.05 17.63 22.93
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22
Analysezeit (min)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100 9.74
7.19 2.76
8.19
5.29 12.86 20.08 16.05 18.34 23.11 21.71
Rela
tive A
bundan
z
Ergebnisse und Diskussion 121
Abbildung 55: Gaschromatographische Analyse des Ansatzes mit 2 U TfCa der Cutinhydrolyse.
Abbildung 56: Gaschromatographische Analyse des Ansatzes mit 4 U TfCa der Cutinhydrolyse.
Die Analysechromatogramme der enzymatischen Cutinhydrolyse zeigen, dass das partiell
aufgereinigte Enzym nicht in der Lage war, das Biopolymer zu hydrolysieren. Damit gehört dieses
Enzym nicht zur Gruppe der Cutinasen.
3.2.9 PCL-Abbau durch die TfCa
Nach 24 Stunden zeigte die Platte mit der TfCa keine Hofbildung, die Platten mit den Enzymlösungen
aus dem Suberin- und Cutin MSV-Medium jedoch eine deutliche Hofbildung (Abbildung 57). Das
bedeutet, dass die TfCa keine Cutinase sondern eine Carboxylesterase ist, da sie weder Cutin noch
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22
Analysezeit (min)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Rela
tive A
bundan
z
2.75
9.75
14.45
7.20 19.31
5.29 12.25 16.06 23.09 20.64
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22
Analysezeit (min)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Rela
tive A
bundan
z
9.75
7.20
2.78
8.20
3.67 5.32 12.25
19.81 13.97 16.06 22.67
Ergebnisse und Diskussion 122
PCL hydrolysierte. Die mit den Cutin- und Suberinpräparationen inkubierten PCL-Platten zeigten eine
deutliche Hofbildung, was bedeutet, dass diese Enzyme wahrscheinlich Cutinasen sind.
Abbildung 57: PCL-Agarplatten nach 24 stündiger Inkubation mit TfCa (linkes Photo), mit dem Kulturüberstand des Suberin-MSV-Mediums (mittleres Photo) und mit Kulturüberstand des Cutin-MSV-Mediums (rechtes Photo).
3.2.10 N-terminale Sequenz der TfCa
Die eindeutige Identifizierung der Esterase erfolgte über die Bestimmung der Protein und DNA
Sequenz. Hilfreich dabei war die Publikation von Lykidis et al. (2007), welche die komplett
identifizierte genomische Sequenz von T. fusca XY enthält.
Es wurden die ersten 10 Aminosäure-Reste der TfCa ansequenziert. In Tabelle 29 ist die detektierte
N-terminale Sequenz dargestellt. An Position 3 und 5 können entweder Lysin oder Isoleucin stehen.
Tabelle 29: Identifizierte N-terminale Sequenz der TfCa aus T. fusca KW3.
Aminosäure-Rest 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Aminosäure M E I/K V I/K R T G S G
Das zu dieser N-terminalen Sequenz mittels Datenbank-Recherche ermittelte identische Protein ist
eine Carboxylesterase (EC 3.1.1.-) mit der Bezeichnung Tfu_2427. Es besitzt eine berechnete Größe
von 52,8 kDa und eine für Hydrolasen typische katalytische Triade aus den Aminosäuren Serin,
Glutamat und Histidin. Ebenfalls ist die Region des Serins hochkonserviert und besitzt das
Sequenzmotiv GESAG. Die Lokalisation des Gens im Genom und die Sequenz einschließlich der
katalytischen Triade sind in den Abbildungen 58 und 59 dargestellt.
Abbildung 58: Lokalisation des Tfu_2427 Gens im Genom von T. fusca YX (Quelle: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/).
Abbildung 59: Proteinsequenz von Tfu_2427 aus T. fusca YX, die Aminosäuren des aktiven Zentrums und das GXSXG Motiv sind gelb markiert. Die ersten 10 Aminosäuren am N-Terminus, anhand derer die Identifikation erfolgte, sind unterstrichen (Billig et al. 2010).
3.2.11 MALDI-TOF Sequenzierung der TfCa
Die durch die N-terminale Sequenzierung erhaltene Sequenz stammt von dem Actinomyceten
T. fusca YX, einem sehr nahen Verwandten des T. fusca KW3. Da es aber auch bei Organismen der
gleichen Spezies kleine Unterschiede in einer Proteinsequenz geben kann, wurde mit der isolierten
TfCa eine MALDI-TOF Analyse durchgeführt, um die genaue Proteinsequenz zu bestimmen.
Das Ergebnis war eine 93,5% Übereinstimmung mit der bereits bekannten Sequenz und dem
aufgereinigten Protein. Bis auf zwei Bruchstücke konnte die gesamte Enzymsequenz der TfCa
identifiziert werden. Das bedeutet, dass es sich bei dem aufgereinigten Protein definitiv um eine
Carboxylesterase handelt, welche mindestens zu 93,5% mit der Sequenz des Proteins Tfu_2427 aus
T. fusca YX übereinstimmt.
Für eine vollständige Sequenzidentifikation erfolgte parallel eine Sequenzierung des TfCa Gens
mittels abgeleiteter Primer (Oeser et al. 2010). Bei dieser Sequenzierung konnte die gesamte
Sequenz des TfCa Gens identifiziert werden und somit die gesamte Proteinsequenz abgeleitet
werden. Beim Vergleich der Sequenz der TfCa mit der Tfu_2427 wurde festgestellt, dass die Proteine
bis auf 2 Aminosäuren übereinstimmen. Diese beiden unterschiedlichen Aminosäuren wurden zuvor
mit der MALDI TOF/TOF Analyse nicht identifiziert, da beide Unterschiede sich im gleichen
Proteinfragment befanden und sich somit die Differenzen der Massen ausglichen. An Position 335 bei
der TfCa steht anstelle eines Glycins ein Serin und an Position 340 steht ein Alanin anstelle eines
Threonins (Abbildung 60). Somit ergibt sich eine 99,6% Übereinstimmung zwischen den beiden
Abbildung 60: Proteinsequenz der TfCa aus T. fusca KW3, die Aminosäuren des aktiven Zentrums und das GXSXG Motiv sind gelb markiert, die identifizierten Unterschiede zu Tfu_2427 aus T. fusca YX sind rot markiert (Billig et al. 2010).
Mit der Sequenz der Carboxylesterase TfCa wurde ein Alignment mit den vier ähnlichsten Enzymen
aus einer Enzymdatenbank (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) protein database;
http://www.genome.jp/kegg/) erstellt. Es sind alles ebenfalls Hydrolasen mit ähnlichen Sequenzen.
Die Enzyme stammen aus Arthrobacter FB24 (art), Streptomyces coelicolor (sco), Frankia alni (fal)
und Saccharopolyspora erythraea (sen). Es ist ersichtlich, dass besonders um die Bereiche der
Aminosäuren der katalytischen Triade die Enzyme viele Übereinstimmungen besitzen. In der
nachfolgenden Abbildung ist das Alignment der 5 Hydrolasen dargestellt. Die grau unterlegten
Sequenzen treten bei mindestens drei der fünf Enzyme auf. Die Aminosäuren der katalytischen
412 LDDEIG--RPLLGDPAPAGFEVLSAQLRRAWTSFAASGDPGWPEFGTDWRLARSWNVP-L sen
479 EMVTDPYPATRALWD-GVPL------------ tfu
486 GVVYDPRSWERDLWE-GVR------------- art
471 HTAYGPLDPEYDLWKADVTVPRGTRPRRLVRR sco
575 VVTAYPEERSRLIWQ-DHSFP----PLLLHAP fal
469 EVVSDPAGESRRIWR-EHA------------- sen
Abbildung 61: Alignment der Carboxylesterase TfCa aus T. fusca KW3 (tfu), der Carboxylesterase Arth_3983 aus Arthrobacter FB24 (art), der Carboxylesterase SCO6127 aus Streptomyces coelicolor (sco), der putativen Carboxylesterase FRAAL0556 aus Frankia alni (fal) und der putativen p-Nitrobenzylesterase SACE_2933 aus Saccharopolyspora erythraea (sen) (Billig et al. 2010).
Ergebnisse und Diskussion 126
3.2.12 Homologie-Modeling der TfCa und Vergleich der Struktur mit anderen Hydrolasen
Mit der Proteinsequenz der TfCa wurde mit dem Programm PyMOL eine Modellierung der
Proteinstruktur, unter der Nutzung der thermostabilen Carboxylesterase aus
Geobacillus stearothermophilus (PDB Code 2OGS resp. 2OGT) als Template, vorgenommen
(Abbildung 62, 63) (Liu et al. 2007, Bennett-Lovsey et al 2008). Das aktive Zentrum der
Carboxylesterase mit der katalytischen Triade wurde blau gekennzeichnet.
Abbildung 62: Tertiärstruktur der Carboxylesterase TfCa aus T. fusca KW3. Rot sind die α-Helices gekennzeichnet und gelb die β-Faltblattstrukturen. Die grünen Bereiche sind Sequenzen ohne eine spezielle Sekundärstruktur. Die drei blau gekennzeichneten Aminosäuren sind die katalytische Triade (Billig et al. 2010).
Abbildung 63: Ausschnitt aus der Tertiärstruktur der Carboxylesterase TfCa aus T. fusca KW3. Rot sind die α-Helices gekennzeichnet und gelb die β-Faltblattstrukturen. Die grünen Bereiche sind Sequenzen ohne eine spezielle Sekundärstruktur. Die drei blau gekennzeichneten Aminosäuren sind die katalytische Triade.
Zum Vergleich wurden weitere PET-Hydrolasen modelliert. Die modellierte Struktur der Cutinasen
Tfu_0882 aus T. fusca YX ,basierend auf der Lipase von S. exfoliates (SeL), wurde mit dem SWISS-
Model Homologie Modeling Web Server konstruiert (Abbildung 64d) und Tfu_0883, basierend auf
der Lipase von S. exfoliates (SeL, PDB-ID: 1JFR), wurde mit PHYRE erstellt (Abbildung 64e) (Lykidis
et al. 2007, Chen S et al 2008). Von den Sequenzen der Cutinasen von F. solani sp. pisi und
P. mendocina aus der NCBI Protein Data Base und der Sequenz der Cutinase von H. insolens,
modelliert mit dem Wurst Protein Threading Server, wurde mittels PyMOL ein Strukturbild erstellt
(Abbildung 64c, f, b). Die katalytischen Aminosäure-Reste sind blau dargestellt.
Ergebnisse und Diskussion 127
Abbildung 64: Homologie-Modelle der Carboxylesterase TfCa aus T. fusca KW3 (a) verglichen mit verschiedenen PET-Cutinasen. Die Strukturen der Cutinasen aus H. insolens (b), F. solani sp. pisi (c), der Cutinasen Tfu_0882 (d) und Tfu_0883 (e) aus T. fusca KW3 und der Cutinase aus P. mendocina (f) sind dargestellt (Billig et al. 2010).
c
Ergebnisse und Diskussion 128
3.2.13 Vergleich der TfCa mit bekannten PET-Hydrolasen
Die TfCa unterscheidet sich deutlich von allen anderen bisher bekannten und bereits näher
charakterisierten PET-Hydrolasen nicht nur durch Ihre höhere Größe, sondern auch durch die
Tatsache, dass es sich um eine Carboxylesterase und nicht um eine Cutinase handelt. In der
nachstehenden Tabelle sind die Eigenschaften der TfCa aus T. fusca KW3 verglichen mit den
Cutinasen aus T. fusca DSM 43793 und einem weiteren T. fusca Isolat dargestellt (Kleeberg et al.
2005, Chen S et al. 2008). Diese beiden Cutinasen unterscheiden sich hinsichtlich ihrer Produktion,
die Erstere wurde als Wildtypenzym durch T. fusca DSM 43793 produziert, die Zweite hingegen
rekombinant in E. coli.
Tabelle 30: Vergleich der Eigenschaften der TfCa mit Cutinasen aus T. fusca.
TfCa aus T. fusca KW3 Cutinase aus T. fusca DSM 43793
Die optimale Temperatur für die CTR Hydrolyse durch die TfCa lag bei 60°C und der optimale pH Wert
bei 60°C war pH 6. Nach 24 Stunden Inkubation lagen die Restaktivitäten bei pH 5 bis 11 bei 40-100%
und somit stabil in einem breiten pH Bereich. Bei einem Inkubationszeitraum von 7 Tagen bei pH 9
Ergebnisse und Diskussion 129
und 10 lag die Restaktivität bei 85%, bei den pH Werten 5 und 11 lag sie bei 22% und 16%. Bei
erhöhten Temperaturen (40-50°C) war nach 7 Tagen Inkubation noch 93-100% Restaktivität
nachweisbar. Mit 55°C konnte nach 24 Stunden Inkubation nur noch 1% Restaktivität detektiert
werden. Bei der Ermittlung der Substratspezifität mit p-NPEstern zeigte sich, dass die TfCa Aktivität
gegenüber kurz- und mittelkettigen Substraten (C2 bis C8) besaß, hingegen nicht gegenüber
langkettigen (C16) Substraten. Die Inhibitoren PMSF und TPCK reduzierten die hydrolytische Aktivität
der TfCa, was bedeutet, dass ein Serin und ein Histidin Bestandteil der katalytischen Triade sind.
Durch DTT und EDTA erfolgte keine Inhibition der Esterase, somit sind keine essentiellen
Disulfidbrücken im Enzym enthalten und es benötigt auch keine Metallionen als Cofaktoren. Somit
handelt es sich bei dem aufgereinigten Enzym um eine Serin Hydrolase, welche allerdings kein Cutin
oder PCL hydrolysieren kann und somit nicht zur Gruppe der Cutinasen zählt, wie die meisten PET-
Hydrolasen. Bei der Sequenzbestimmung der Esterase stellte sich heraus, dass es sich um eine
Carboxylesterase mit 42% Übereinstimmung mit der Carboxylesterase Arth_3983 aus
Arthrobacter FB24, 42% Übereinstimmung mit der Carboxylesterase SCO6127 aus S. coelicolor, 43%
Übereinstimmung mit der putativen Carboxylesterase FRAAL0556 aus F. alni und 42%
Übereinstimmung mit der putativen p-Nitrobenzylesterase SACE_2933 aus S. erythraea handelt. Das
katalytische Zentrum der TfCa besteht aus Ser185, Glu319, His415, wobei das Serin in das für
Hydrolasen typische G-E-S-A-G Motiv eingebettet ist.
Durch eine Codon Optimierung, der Klonierung in den pET-20b(+) Vektor mit einer N-terminalen pelB
Signalsequenz und einem C-terminalen His6-Tag und einer anschließenden Transformation in E. coli
BL21(DE3) erfolgte die Erstellung eines rekombinanten Wirtes für die Überexpression der
Carboxylesterase TfCa aus T. fusca KW3 (Oeser et al. 2010). Die rekombinant produzierte TfCa war in
der Lage PET-Nanopartikel mit einer Rate von 7 nmol/ml freigesetzte TPA bei 24 Stunden Inkubation
bei 50°C und 0,01 mg TfCa zu hydrolysieren.
Bei der TfH Cutinase aus T. fusca DSM 43793 lag das Temperaturoptimum 10-15°C über der
maximalen Wachstumstemperatur des Mikroorganismus, was untypisch für extrazelluläre Enzyme
ist, hingegen für Lipasen, Xylanasen oder PHB-Depolymerasen schon beschrieben wurde.
Anscheinend gibt es laut Kleeberg et al. (2005) einen Überlagerungseffekt bezüglich der
Enzymaktivität und dem zu hydrolysierenden Substrat. Mit höher molekularen Substraten, wie BTA,
welches erst bei höheren Temperaturen aufgrund der höheren Beweglichkeit der Polymerketten
besser abbaubar ist, konnte ein höheres Temperaturmaximum bestimmt werden als mit
niedermolekularen Substraten, wie Ölen oder Fetten. Der schnelle Verlust an Aktivität bei 70°C ist
auf die Denaturierung der Hydrolase zurückzuführen. Das aufgereinigte Enzym verlor nach 30 min bei
70°C 85% seiner Aktivität, wohingegen die Hydrolase in der Enzymrohlösung 60% Restaktivität nach
Ergebnisse und Diskussion 130
einer Woche Lagerung bei Raumtemperatur aufwies und bei 70°C nach einer Stunde fast die gesamte
hydrolytische Aktivität verloren ging. Das pH Maximum lag bei pH 6-6,5, verlagerte sich aber bei
geringeren Ionenstärken in Richtung der neutralen pH Werte. Die BTA Hydrolase spaltete Triacetin,
Tributyrin und Tricaproin mit einer ähnlichen Aktivität, hingegen mit den längerkettigen Substraten
Tricaprylin, Tricaprin, Trilaurin und Triolein sank die hydrolytische Aktivität mit zunehmender
Kettenlänge. Des Weiteren konnte die TfH auch eine Vielzahl an Polyestern (PCL,
Poly(trimethylenbrassylat) (SP3/13), Bionolle, Polyesteramid Bayer TIR 1874) hydrolysieren, jedoch
nicht das natürliche Polymer Poly(3-hydroxybutyrat) (PHB).
Das Enzym besteht aus 261 Aminosäuren und wurde als Serin Hydrolase klassifiziert, welche
Esterasen, Lipasen und Cutinasen beinhaltet. Sie besaß eine 65% Ähnlichkeit zu einer Triacylglycerin
Lipase aus Streptomyces albus G26 und eine 62% Ähnlichkeit zu einer Triacylglycerin Acylhydrolase
aus Streptomyces sp. M1127. Das Serin des katalytischen Zentrums war in dem hochkonservierten
Motiv G-H-S-M-G, an der Position 132 im Enzym, eingebettet. Der Anteil an hydrophoben
Aminosäuren (Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Met, Phe, Trp) war mit 42% hoch im Vergleich zu anderen Serin
Hydrolasen, worauf die Probleme bei der Aufreinigung zurück zu führen waren.
Obwohl die TfH aufgrund der Sequenzübereinstimmungen und der Substratspezifität zu den Lipasen
eingeordnet werden könnten, zeigten sie aber auch deutliche Unterschiede im Vergleich zur
Pseudomonas sp. Lipase (PsL) und Aspergillus oryzae Lipase (AoL) bei der Film und Nanopartikel
Hydrolyse. Die Lipasen hydrolysierten nur 40% der Esterbindungen, da sie nur die Oberfläche des
unlöslichen Substrates angreifen. Auch bei weiterer Enzymzugabe gab es keine weitere Hydrolyse,
was bedeutete, dass das Enzym nicht inaktiviert war. Die Hydrolyse stoppte, als das Substrat
komplett in wasserlösliche Zwischenprodukte umgesetzt war und somit die Lipasen keine
hydrophoben Oberflächen für ihre Konformationsänderung zur Verfügung hatten. Somit wurden die
verbleibenden Esterbindungen der Intermediate nicht hydrolysiert. Die TfH hingegen hydrolysierte
100% der Esterbindungen des Polymerfilms und der Nanopartikeln und zeigte somit keine
Grenzflächenaktivierung. Aufgrund der hydrolytischen Aktivität der TfH gegenüber Apfelcutin und
PCL konnte sie zur Gruppe der Cutinasen gezählt werden (Gouda et al. 2002, Kleeberg et al. 2005).
Die TfH wurde durch Dresler et al. 2006 rekombinant in E. coli TG1 mit dem Plasmid pCYTEXP1-
OmpA-bta1-His6 produziert, sekretiert und aufgrereinigt. Dabei erfolgte allerdings keine weitere
Charakterisierung der Cutinase (Dresler et al. 2006).
Nach einer Codon Optimierung wurde das tfh Gen in einen offenen Leserahmen mit der DNA
Sequenz für das N-terminale Signalpeptid der Bacillus megaterium Lipase A und einem C-terminalen
His6-Tag kloniert und unter einem Xylose induzierbaren Promotor rekombinant in
Bacillus megaterium WH323 produziert. Auch hier erfolgte keine weitere Charakterisierung der
rekombinanten Hydrolase (Yang et al. 2007).
Ergebnisse und Diskussion 131
Die BTA-Hydrolase aus Thermobifida sp. BCC23166, isoliert aus Proben einer Deponie, wurde durch
Transkonjugation in den Produktionsstamm Streptomyces rimosus R7 mit pIJ-BTA verfügbar
(Sinsereekul et al. 2010). Diese aufgereinigte Hydrolase zeigte einen optimalen Temperaturbereich
von 50-55°C und einen optimalen pH im milden bis basischen Bereich, bestimmt mittels p-NPP als
Substrat. Die rTfH besaß die höchste Aktivität mit kurzkettigen p-Nitrophenylestern, aber auch mit
lankettigen Substraten konnten hydrolytische Aktivitäten nachgewiesen werden, was mit den bereits
referierten Aktivitäten übereinstimmt (Kleeberg et al. 2005). Unter Anwendung der
Oberflächenplasmonresonanztechnik zur Untersuchung der Hydrolyse von Polyestern zeigte sich,
dass die rTfH eine unterschiedliche Bevorzugung von aliphatischen und aliphatisch-aromatischen
Polyestern besitzt und zwar in der Reihenfolge PCL>Ecoflex®>PHB. Diese Unterschiede kommen laut
Sinsereekul et al. (2010) aufgrund unterschiedlicher Bindungseigenschaften der Polyester an das
Enzym und aufgrund verschiedener physikalischer Eigenschaften (Kristallinität) zustande. Aufgrund
unterschiedlicher Filmherstellung und Analysetechniken war in diesem Fall auch ein Abbau von PHB
durch die rTfH nachweisbar. Im Vergleich zur Lipase aus T. lanuginosus zeigte die Hydrolase höhere
Spezifität und Abbauraten gegenüber aliphatisch-aromatischen Copolyestern, analog zu den Studien
von Eberl et al. (2008) (Sinsereekul et al. 2010).
Die 29 kDa Cutinase aus T. fusca WSH03-11 (Chen S et al. 2008, Chen J et al. 2008) zeigte deutliche
Übereinstimmungen mit 2 Enzymen, Tfu_0883 und Tfu_0882, identifiziert im T. fusca YX (Lykidis
et al. 2007). Die Enzyme wurden als Triacylglycerin Lipasen in der genomischen Datenbank
bezeichnet, enthalten eine hochkonservierte Sequenz (GXSXG) und gehören der α/β Hydrolase
Familie an. Für eine weitere Charakterisierung erfolgte die rekombinante Expression der beiden Gene
in E. coli BL21 Rossetta (DE3) PlysS mit dem Vektor pET-20b(+) mit einem C-terminalen His6-Tag und
dem PelB Signalpeptid. Die Cutinasen 1 und 2 hydrolysierten Triolein und p-NPB bei einer optimalen
Temperatur von 60°C und einem optimalen pH von 8. Bei den Thermostabilitätsuntersuchungen
zeigten die beiden Hydrolasen Restaktivitäten von 80% nach 160 Stunden bei 40°C und 50% nach 40
Stunden bei 60°C. Die beiden Isoenzyme waren auch in der Lage, Cutin zu hydrolysieren, womit sie
der Gruppe der Cutinasen zuzuordnen sind. Durch den Inhibitor PMSF, der an das aktive Serin der
katalytischen Triade bindet, erfolgte eine Verminderung der katalytischen Aktivität der Cutinasen.
Zusätzliche Mutationstudien bestätigten, dass die beiden Cutinasen Serin Hydrolasen sind, da beim
Austausch des Serins an der Posititon 188 (Cutinase 1) und 170 (Cutinase 2) keine katalytische
Aktivität mehr zu verzeichnen war (Chen S et al. 2008, Chen J et al. 2008).
Die molaren Massen der Isoenzyme, bestimmt mit der SDS-PAGE, waren 29 kDa, die berechneten
Werte lagen bei 29,220 kDa (Cutinase 1) und 28,997 kDa (Cutinase 2). Das native Molekulargewicht
lag bei 32 kDa, bestimmt per Größenausschlusschromatographie, und bestätigte, dass die Cutinasen
in Lösung monomere Enzyme sind. Bei der Studie der Substratspezifität der Cutinasen zeigten beide
Ergebnisse und Diskussion 132
eine höhere Aktivität mit kurzkettigen p-NPEstern, hydrolysieren aber auch langkettige Ester (C16-
C18). Dabei zeichnete sich Cutinase 2 durch eine höhere Hydrolyserate gegenüber Cutinase 1 aus, was
allerdings bei der Hydrolyse von Triolein nicht bestätigt wurde. Somit zeigten sich der 7%-
Sequenzunterschied auch in der hydrolytischen Aktivität der Isoenzyme. Diese Beobachtungen
bestätigten sich auch bei der Untersuchung der CTR-Hydrolyse, bei der die Cutinase 2 deutlich mehr
zyklische Trimere hydrolysierte. Das lässt die Annahme zu, dass die Sequenzunterschiede im Bereich
des aktiven Zentrums oder dessen Umgebung die katalytischen Aktivitäten beeinflussen. Beide
Cutinasen zeigten keine Grenzflächenaktivierung und besitzen keinen Deckel. Ebenfalls benötigen sie
keine Metallionen als Cofaktoren für ihre hydrolytische Aktivität, nachgewiesen mit dem Inhibitor
EDTA. Bei der Untersuchung des Einflusses verschiedener Lösungsvermittler wurde festgestellt, dass
Triton X-100, Tween 20 und TDOC (in Konzentrationen von 1 mM und 10 mM) keine
Aktivitätsänderungen zur Folge hatten, SDS hingegen inhibierte die Cutinasen. In den organischen
Lösungsmitteln Methanol, Ethanol, Aceton, n-Hexan und Dimethylsulfoxid (DMSO) sind die
Isoenzyme stabil, weniger hingegen in Isopropanol und Butanol, was eine breite Anwendung in der
organischen Synthese eröffnet (Chen et al. 2010, Chen J et al. 2008).
Bei der Suche nach Polymer-abbauenden Isolaten wurde eine thermostabile Hydrolase aus
Thermobifida alba AHK119 identifiziert, deren Gensequenz mit spezifischen Primern kompatibel zur
G-X-S-X-G Consensussequenz (903 bp) amplifiziert wurde (Hu et al. 2010). Die Aminosäuresequenz
bestehend aus 300 AS wurde Est119 benannt und gehört zur Familie der Serin Hydrolasen. Est119
besaß 84% Übereinstimmung mit der Triacylglycerin Lipase (TfH) aus T. fusca DSM 43793 (Kleeberg
et al. 2005), 63% Übereinstimmung mit der Lipase aus S. coelicolor A3(2) M145 (Valdez et al. 1999),
62% Übereinstimmung mit der Lipase aus S. albus G (Cruz et al. 1994) und 61% Übereinstimmung mit
der Lipase aus S. exfoliatus M11 (Wei et al. 1988). Die hoch konservierte Sequenz mit dem aktiven
Serin wurde mit G-H-S-M-G in der Hydrolase identifiziert, die katalytischen Aminosäuren sind Ser129,
His207 und Asp175. Eine N-terminale Signalsequenz von 34 Aminosäuren konnte ebenfalls
identifiziert werden, welche zwischen den Aminosäuren 34 und 35 posttranslational abgeschnitten
wird. Somit besaß das aktive verbleibende Enzym 266 Aminosäuren, eine Größe von 30 kDa
(rechnerisch 29,76 kDa) und lag in Suspension als monomeres Enzym vor. Die optimale Temperatur
für die Hydrolyse von p-NPB lag bei 50°C und der optimale pH Wert bei 6. Bei 50°C und pH 6 erfolgte
die Untersuchung der Substratspezifität der Hydrolase mit p-NP Estern. Mit der steigenden
Kettenlänge von C2-C6 stieg auch die Hydrolyserate an, fiel aber ab C8 stark ab. Aufgrund der
Sequenzübereinstimmungen der Est119 mit der Lipase aus S. exfoliatus M11 ordneten Hu et al.
(2010) sie ebenfalls in die Gruppe III der lipolytischen Enzyme ein.
Ergebnisse und Diskussion 133
Tabelle 31: Vergleich der PET-Hydrolasen aus F. solani FsC (Carvalho et al. 1998, Carvalho et al. 1999, Ronkvist et al. 2009), T. insolens HiC (Sandal et al. 1996, Ronkvist et al. 2009), P. mendocina PmC (Bott et al. 2003, Ronkvist et al. 2009), T. fusca
TfH/Cutinase 2 (Kleeberg et al. 2005, Chen S et al. 2008, Chen J et al. 2008) und TfCa (Zimmermann und Billig 2011).
Für eine bessere Übersicht über die katalytischen Eigenschaften der PET hydrolysierenden Enzyme
und der Esterase aus F. solani f. pisi (FsE) erfolgte die Gegenüberstellung ihrer kinetischen Parameter
bei der p-NP Ester Hydrolyse in Tabelle 32.
Es ist ersichtlich, dass die höchste Reaktionsgeschwindigkeit die P. mendocina Cutinase mit p-NP-
Caprylat aufwies (Gray et al. 1995). Desweiteren zeigten die TfCa und die Cutinase von F. solani
(Purdy und Kolattukudy 1973) ähnliche maximale Geschwindigkeiten gegenüber p-NP-Butyrat bzw. p-
NP-Caproat. Die niedrigsten Geschwindigkeiten wurden mit den drei hydrolytischen Enzymen aus
F. solani durch Purdy und Kolattukudy (1975b) bestimmt. Die beiden Cutinasen zeigten ihre
maximalen Geschwindigkeiten mit p-NP-Acetat als Substrat und die unspezifische Esterase mit p-NP-
Butyrat, analog zur TfCa, aber 4000fach geringer. Die geringsten Km Werte je Enzym sind
hervorgehoben, ebenso die höchsten Vmax Werte. Die geringsten Km Werte zeigten die TfCa mit p-NP-
Butyrat und die Pseudomonas mendocina Cutinase mit p-NP-Laurat. Dabei wird deutlich, dass die
PET-Hydrolasen ihre höchste Affinität gegenüber kurz- und mittelkettigen Estern (C4-C10) besitzen, die
FsE hingegen im langkettigen Bereich. Des Weiteren ist ersichtlich, dass die TfCa die höchste Affinität
gegenüber den p-NP Estern besaß.
Da es aber keinen direkten Zusammenhang zwischen der Hydrolyse von p-NP Estern und PET gibt, ist
die Tabelle 32 nicht aussagekräftig beim Vergleich der PET-Hydrolasen in Bezug auf die PET-
Hydrolyse. Um die kinetischen Daten für die PET-Hydrolyse, auch verschiedener Substrattypen,
vergleichen zu können, müssten die Enzyme unter gleichen Bedingungen bzw. optimalen
Hydrolysetemperaturen und pH-Werten eingesetzt werden. Für die FsC, PmC und HiC erfolgte das
Ergebnisse und Diskussion 138
bereits durch Ronkvist et al. (2009), mit der TfCa und den beiden Cutinasen aus T. fusca KW3 wurden
verschiedene Hydrolysestudien durchgeführt, welche im nächsten Kapitel zusammengefasst sind.
3.3 Hydrolyse von PET Substraten durch prokaryotische und eukaryotische Hydrolasen
Es erfolgte die Untersuchung der Hydrolyse von zyklischen PET-Trimeren, unbehandelten PET-Fasern
und einer APET-Folie durch die PET-Hydrolasen aus T. fusca KW3 und weiteren PET-Hydrolasen. Bei
den Enzymen handelte es sich um die rekombinant produzierten Cutinasen 1 und 2 aus T. fusca
WSH03-11 (Chen et al. 2010, Chen J et al. 2008), die Cutinasen aus F. solani sp. pisi (Chen et al. 2010,
Vertommen et al. 2005) und eine Cutinasepräparation von Novozymes (NS-29061, LN05012). Bis zu
diesem Zeitpunkt wurden die meisten Hydrolysestudien mit der Cutinase aus F. solani sp. pisi
durchgeführt, welche deshalb bei den folgenden Untersuchungen als Vergleich eingesetzt wurde.
Zur Abschätzung der Reinheit der Enzympräparationen wurden Aliquote auf ein SDS Gel aufgetrennt.
Abbildung 65: SDS-PAGE der für die Abbauuntersuchungen eingesetzten Hydrolasen, linkes Gel mit Aktivitätsfärbung, rechtes Gel Aktivitäts- und Coomassie-Färbung. Spur 1: Carboxylesterase TfCa aus T. fusca KW3; Spur 2: rekombinante Cutinase 1 von T. fusca WSH03-11 (Chen et al. 2010, Chen J et al. 2008); Spur 3: rekombinante Cutinase 2 von T. fusca WSH03-11 (Chen et al. 2010, Chen J et al. 2008); Spur 4: rekombinante Cutinase von F. solani pisi (Chen et al. 2010); Spur 5: Cutinase aus Fusarium solani sp. pisi (Vertommen et al. 2005); Spur 6: Cutinase von Novozymes. Zum Vergleich die Kulturüberstände verschiedener MSV-Medien, Spur 7: Cutin-induzierte Hydrolase aus T. fusca KW3; Spur 8: Suberin-induzierte Hydrolase aus T. fusca KW3; St
1: Spectra™ Multicolor Broad Range Protein Ladder (Fermentas); St
2:
PageRulerTM
Plus Prestained Protein Ladder (Fermentas).
Die Hydrolasen aus T. fusca (Billig et al. 2010, Chen et al. 2010, Chen J et al. 2008) (Spuren 1-3) sind
aufgrund der Aktivitätsfärbung eindeutig im Gel identifizierbar und die Enzympräparationen zeichnen
sich durch eine hohe Reinheit aus. Die rekombinante Cutinase von F. solani pisi (Chen et al 2010)
(Spur 4) zeigte keine Aktivität und auch keine Proteinbande auf dem Gel. Wahrscheinlich wurde zu
wenig Protein aufgetragen bzw. die Cutinase war nicht aktiv gegenüber dem Substrat der
Aktivitätsfärbung. Die Cutinase aus F. solani sp. pisi (Vertommen et al. 2005) zeigte ebenfalls keine
Aktivität, aber eine Proteinbande (Spur 5), was ebenfalls auf ein Inaktivität des Cutinase gegenüber
St1 1 2 3 4 5 6 St
2 7 8 St
1 1 2 3 4 5 6 St
2 7 8
260 kDa 135 kDa 95 kDa 72 kDa
52 kDa
42 kDa
34 kDa
26 kDa
17 kDa 10 kDa
250 kDa 130 kDa 95 kDa 72 kDa
55 kDa
36 kDa
28 kDa
17 kDa 11 kDa
Ergebnisse und Diskussion 139
2-Naphthylacetat hinweist. Beide Enzyme wiesen aber deutliche Aktivitäten mit p-NPB auf. Die
Cutinasepräparation von Novozymes wies eine deutliche Esteraseaktivität im Gel auf (Spur 6).
Aufgrund der detektierten Größe im Gel (ca. 20 kDa) handelt es sich vermutlich um eine Cutinase aus
T. insolens oder F. solani pisi. Zum Vergleich wurden ebenfalls die zellfreien Überstände aus Kulturen
mit Cutin-MSV und Suberin-MSV in Spur 7 und 8 aufgetragen, welche eine Esterase im Bereich von
28 kDa aufweisen, aber ebenfalls noch weitere Proteine.
Nach Auftrag der verschiedenen Enzympräparationen auf PCL Agarplatten wurde die bereits erfolgte
Einordung der PET-Hydrolasen in Cutinasen und Carboxylesterase bestätigt. Die Cutinasen waren in
der Lage, das Biopolymer Cutin abzubauen und ebenfalls PCL, wohingegen die Carboxylesterase diese
beiden Polymere nicht hydrolysierte. Alle Cutinasen zeigten eine Hofbildung auf den PLC-
Agarplatten, hingegen wies die TfCa, eine Carboxylesterase, keinen PCL-Abbau auf (Abbildung 66).
Die rekombinant produzierten TfCa, TfCut1 und TfCut2 aus T. fusca KW3 zeigten dasselbe
Abbauverhalten (Abbildung 66).
Abbildung 66: PCL Abbautest der für die Abbauuntersuchungen eingesetzten Hydrolasen (obere Reihe: Carboxylesterase TfCa aus T. fusca KW3 (links), rekombinante Cutinase 1 von T. fusca WSH03-11 (Mitte, Chen et al. 2010, Chen J et al. 2008), rekombinante Cutinase 2 von T. fusca WSH03-11 (rechts, Chen et al. 2010, Chen J et al. 2008); mittlere Reihe: rekombinante Cutinase von F. solani pisi (links, Chen et al 2010), Cutinase aus F. solani sp. pisi (Mitte, Vertommen et al. 2005), Cutinase von Novozymes (rechts); untere Reihe : rekombinant produzierten Hydrolasen aus T. fusca KW3: Carboxylesterase TfCa (links), Cutinase TfCut1 (Mitte), Cutinase TfCut2 (rechts).
Ergebnisse und Diskussion 140
3.3.1 Partielle Hydrolyse von APET-Filmen durch die PET-Hydrolasen
In den nachfolgenden Diagrammen ist die Bildung von Hydrolyseprodukten aus APET-Film durch die
PET-Hydrolasen dargestellt.
Abbildung 67: Detektierte Hydrolyseprodukte nach Inkubation des APET-Films mit TfCa aus T. fusca KW3.
Abbildung 68: Detektierte Hydrolyseprodukte nach Inkubation des APET-Films mit der Cutinase 2 aus T. fusca WSH03-11
von Chen et al. 2010 und Chen J et al. 2008.
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Inkubationszeit (h)
TPA MHET BHET EMT EBT Summe
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du
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Inkubationszeit (h)
TPA MHET BHET EMT EBT Summe
Ergebnisse und Diskussion 141
Abbildung 69: Detektierte Hydrolyseprodukte nach Inkubation des APET-Films mit der Cutinase aus F. solani pisi von
Vertommen et al. 2005.
Abbildung 70: Detektierte Hydrolyseprodukte nach Inkubation des APET-Films mit der Cutinase aus F. solani pisi von Chen
et al. 2010.
0
100
200
300
400
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0 10 20 30 40 50 60 70 80
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Inkubationszeit (h)
TPA MHET BHET EMT EBT Summe
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0 10 20 30 40 50 60 70 80
lös
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t)
Inkubationszeit (h)
TPA MHET BHET EMT EBT Summe
Ergebnisse und Diskussion 142
Abbildung 71: Detektierte Hydrolyseprodukte nach Inkubation des APET-Films mit der Cutinasepräparation von
Novozymes.
Während der drei Tage Inkubation setzte die Cutinase 2 aus T. fusca WSH03-11 die höchste Menge
an löslichen Hydrolyseprodukten vom APET-Film frei (Abbildung 69). Gegenüber der
Carboxylesterase TfCa aus T. fusca KW3 war dies das 475fache an löslichen Hydrolyseprodukten,
gegenüber den F. solani pisi Cutinasen FsC und FspC waren es das 24fache und 40fache und
gegenüber der eukaryotischen Cutinase-Präparation war es das 114fache an löslichen
Hydrolyseprodukten. Alle PET-Hydrolasen wurden mit der Aktivität von 4 U/ml eingesetzt.
Tabelle 33: Vergleich der freigesetzten Abbauprodukte der PET-Hydrolasen mit APET-Film.
Enzym Temperatur Hydrolyseprodukte (%)
TPA MHET BHET EMT EBT
TfCa 50°C 45 10 0,1 0 45
T. fusca Cutinase 22 60°C 57 42 0,5 0,01 0
FsC1 30°C 0 53 2 8 37
FspC2 30°C 21 78 0,4 0,4 0
Novozymes Cutinase Präparation 30°C 18 82 0 0 0
1 Vertommen et al. 2005
2 Chen et al. 2010
Mit 45% waren Terephthalsäure (TPA) und 1,2-Ethylen-bis-terephthalat (EBT) die
Haupthydrolyseprodukte der Carboxylesterase TfCa, bei der Cutinase FsC waren es mit 53% Mono(2-
Hydroxyethyl)Terephthalat (MHET) und 37% EBT. Die Cutinase setzte als einziges Enzym kein TPA
frei, hingegen aber die höchste Menge an 1,2-Ethylen-mono-terephthalat-mono(2-
hydroxyethylterephthalat) (EMT, 8%) verglichen mit den anderen PET-Hydrolasen. Die
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20
40
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0 10 20 30 40 50 60 70 80
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Inkubationszeit (h)
TPA MHET BHET EMT EBT Summe
Ergebnisse und Diskussion 143
Haupthydrolyseprodukte der Cutinase 2 aus T. fusca WSH03-11 waren mit 57% und 42% TPA und
MHET, ebenso bei FspC mit 78% MHET und 21% TPA. Es wurden nur geringste Mengen an Bis(2-
Hydroxyethylterephthalat) (BHET) freigesetzt. Die Hauptabbauprodukte der Cutinase-Präparation
von Novozymes war MHET mit 82% und TPA mit 18%. Es wurden keine weiteren Produkte detektiert
(Tabelle 33). Die Freisetzung der Hydrolyseprodukte erfolgte über den gesamten
Inkubationszeitraum.
Beim Vergleich der verschiedenen F. solani pisi Cutinase-Präparationen (Abbildung 68, 70), bei denen
jeweils 4 U/ml Esteraseaktivität zum APET-Filmabbau eingesetzt wurden, zeigte sich ein ähnliches
Abbauverhalten in Bezug auf Menge und Verteilung der Hauptabbauprodukte. MHET als
Hauptprodukt wurde mit 53% (Vertommen et al. 2005) und 57% (Chen et al. 2010) für die
eukaryotischen Cutinasen identifiziert. Alle weiteren Hydrolyseprodukte unterschieden sich
allerdings in der freigesetzten Menge bei den beiden Cutinasen. Diese Unterschiede könnten durch
Modifikationen bei der rekombinanten Expression entstanden sein, wie zum Beispiel bei der Codon-
Optimierung, beim Entfernen und Anfügen von Signalpeptiden, durch eine fehlende
posttranslationale Modifikation oder durch eine andere Faltung im Expressionswirt (Vertommen
et al. 2005, Chen et al. 2010, Chen S et al. 2008, Chen J et al. 2008). Von den zuvor für den Abbau von
APET-Film eingesetzten Hydrolasen zeigte die Cutinase 2 aus T. fusca WSH03-11 die höchste
Aktivität. Dies könnte auf die höhere Inkubationstemperatur von 60°C und der damit verbundenen
höheren Beweglichkeit der PET-Ketten auf der Filmoberfläche zurückgeführt werden (Marten et al.
2005). Die gleichen Beobachtungen machten auch Ronkvist et al. 2009, die eine modifizierte
Humicola (Thermomyces) insolens Cutinase bei 70°C mit PET-Filmen inkubierten und dabei die
höchste Aktivität verzeichneten im Vergleich zu einer Pseudomonas mendocina Cutinase bei 50°C
und einer Fusarium solani Cutinase bei 40°C (Ronkvist et al. 2009). Des Weiteren begünstigte die
Lage des aktiven Zentrums der Cutinase direkt an der Oberfläche des Enzyms ebenfalls die
Hydrolyseaktivität mit PET-Filmen (Abbildung 64d). Das aktive Zentrum der Carboxylesterase TfCa
liegt hingegen in einer Bindungstasche und ist somit schwerer zugänglich, besonders für größere
Substrate, wie den APET-Film (Abbildung 64a). Des Weiteren lag die Inkubationstemperatur der TfCa
mit APET-Film bei 50°C und somit 10°C geringer gegenüber der Cutinase, was eine niedrigere
Aktivität der Polymerketten zur Folge hat und somit die Hydrolyseaktivität des Enzyms beeinträchtigt
(Marten et al. 2005). Die eukaryotischen Cutinasen wurden aufgrund ihrer geringeren
Thermostabilität bei 30°C inkubiert, wobei die PET-Ketten des APET-Films noch weniger beweglich
waren und dadurch geringer mit dem aktiven Zentrum wechselwirken konnten.
Nach der Hydrolyse der APET-Filme durch die TfCa und die Cutinase FsC wurde die Oberfläche der
Filme rasterelektronenmikroskopisch analysiert (Abbildung 72). Im Vergleich zur unbehandelten
Kontrolle (A) wies die mit der Carboxylesterase behandelte Oberfläche kleine Löcher auf (B). Der
Ergebnisse und Diskussion 144
APET-Film, welcher von der eukaryotischen Cutinase angegriffen wurde, zeigte hingegen einen
großflächigen Abbau (C).
Abbildung 72: Rasterelektronenmikroskopische Analyse der enzymatisch behandelten APET-Film Oberflächen: Unbehandelte Kontrolle (A), Inkubation mit TfCa bei 50°C 74 h (B) und Inkubation mit Cutinase FsC bei 30°C 74 h (C).
Alle bisherigen Studien zur Oberflächenmodifikation durch Mikroorganismen oder Enzyme verglichen
die Oberflächenstrukturen nur mit einer Kontrolle bzw. einer alkalische Oberflächenhydrolyse der
Fasern oder Filme. Diese Hydrolysebehandlungen erfolgten hingegen mit zwei verschiedenen
Enzymen, deren Veränderungen auf der Oberfläche miteinander verglichen werden konnten und
deutliche Unterschiede untereinander, aber auch zu einer alkalischen Hydrolyse aufwiesen
(Abbildung 72, Yoon et al. 2002). Die Ausbildung verschiedener Oberflächenstrukturen, abhängig von
der Behandlung (enzymatisch oder chemisch), wurde bereits in anderen Studien dargelegt. Yoon
et al. wiesen als Erste nach, dass nach der Behandlung von PET-Fasern mit einer PET-Hydrolase die
Faseroberfläche signifikante Oberflächenmodifikationen aufwiesen, welche sich von denen bei einer
NaOH Behandlung deutlich unterschieden (Yoon et al. 2002). Auch Zhang et al. behandelten PET-
Fasern mit Mikroorganismen und einer Lipase und konnten mittels SEM eine deutliche
Oberflächenerosion im Vergleich zu unbehandelten Fasern nachweisen (Zhang et al. 2004). Ähnliche
Ergebnisse wurden auch von Kim und Song 2006 veröffentlicht, die die Oberflächenhydrolyse von
PET-Fasern mit einer Lipase und NaOH verglichen und unterschiedliche Oberflächenstrukturen
nachwiesen. Im Gegensatz dazu konnten bei weiteren Untersuchungen mit PET-Fasern beim
Vergleich der enzymatischen und basischen Hydrolyse bei der enzymatischen Behandlung keine
Veränderung der Oberflächenstruktur im Vergleich zur Kontrolle nachgewiesen werden (Eberl et al.
2008, Brueckner et al 2008). Diese Beobachtungen wurden auf eine besonders faserschonende und
minimale Oberflächenmodifikation zurückgeführt. Es könnte allerdings auch auf eine zu geringe
Inkubationszeit oder Enzymmenge hinweisen, womit die möglichen Auswirkungen der
enzymatischen Behandlung noch nicht für die Oberflächenanalyse sichtbar waren. Feuerhack et al.
wiesen, ähnlich zu allen anderen Autoren, ebenfalls eine leichte Oberflächenveränderung nach der
enzymatischen Hydrolyse der PET-Fasern durch eine Enzympräparation von T. fusca KW3 nach
(Feuerhack et al 2008).
A B C
Ergebnisse und Diskussion 145
Die Untersuchung der veränderten Oberflächenstrukturen von PET-Filmen erfolgte erstmals durch
Donelli et al. 2009 und Ronkvist et al. 2009. Dabei konnten Donelli et al. keine Veränderungen der
Oberflächenstruktur nach der enzymatischen Hydrolyse nachweisen, hingegen aber deutliche
Veränderungen nach der Hydrolyse mit NaOH (Donelli et al. 2009). Dabei handelte es sich allerdings
um einen PET-Film mit einer Kristallinität von 34,8%, welcher sich im Gegensatz zu amorphen PET-
Filmen für enzymatische Hydrolysen nicht eignet. Diese Tatsache bestätigte Ronkvist et al. bei der
enzymatischen Oberflächenhydrolyse eines gering-kristallinen PET-Films mit einer Kristallinität von
7,0% ± 0,5%. Während der verwendete kristalline PET-Film (35,0% ± 0,5%) kaum von den Enzymen
hydrolysiert wurde, konnten mit dem amorphen PET-Film deutliche Oberflächenveränderungen
mittels SEM nachgewiesen werden (Ronkvist et al. 2009). Bei einem zeitlichen Vergleich der
hydrolysierten Oberflächenstrukturen nach 12, 48 und 96 Stunden zeigte sich eine deutliche
Zunahme an porösen Strukturen. Die nachgewiesenen Strukturen gleichen allerdings nicht den
Oberflächenstrukturen aus der Abbildung 72 nach 74 Stunden Inkubation. Mögliche Erklärungen sind
zum Einen ein unterschiedliches Hydrolyseverhalten der verschiedenen Enzyme und zum Anderen
die Variationen bei den Inkubationstemperaturen (HiC bei 70°C (Ronkvist et al. 2009), TfCa bei 50°C
und FsC bei 30°C). Aus diesem Grund waren die Polymerketten des Films unterschiedlich mobil und
nur bei hohen Temperaturen besser hydrolysierbar (Marten et al. 2005).
Bei den Abbauuntersuchungen wurden neben den erwarteten PET Monomeren TPA, MHET und
BHET auch zwei weitere Abbauprodukte mittels RP-LC-MS detektiert. Bei den Produkten handelte es
sich um 1,2-Ethylen-mono-terephthalat-mono(2-hydroxyethylterephthalat) (EMT) und 1,2-Ethylen-
bis-terephthalat (EBT), zwei weitere Dimere des PET. Die Strukturen, die dazugehörigen molaren
Massen und die MS-Spektren der Hydrolyseprodukte sind nachstehend zusammengefasst.
Vertommen et al. hatten 2005 auch zwei unbekannte Hydrolyseprodukte detektiert, denen sie keine
Struktur zuordnen konnten und bezeichneten sie als Produkt A und B (Rt 18,1 und 18,7 min). Sie
vermuteten, dass es sich dabei um Dimere des PET handelte (Vertommen et al. 2005). Aufgrund der
übereinstimmenden Retentionszeiten handelt es sich bei den beiden unbekannten Dimeren
wahrscheinlich um die identifizierten Produkte EMT und EBT.
Ergebnisse und Diskussion 146
Abbildung 73: Chromatogramm der HPLC Analyse des enzymatischen APET Abbaus durch die TfCa.