UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT WETENSCHAPPEN OPLEIDING BIOLOGIE ACADEMIEJAAR 2010 – 2011 Aanmaak reporterconstructen en stabiele transgene lijnen bij de nematode Caenorhabditis elegans door Glenn VERMOTE Promotor: Prof. Dr. Bart P. Braeckman Scriptie voorgelegd tot het Begeleider: Sasha De Henau behalen van de graad van Onderzoeksgroep: Vanfleteren Lab – Verouderingsfysiologie, Master in Biologie Cellulaire fysiologie en Moleculaire evolutie
This document is posted to help you gain knowledge. Please leave a comment to let me know what you think about it! Share it to your friends and learn new things together.
Transcript
UNIVERSITEIT GENT
FACULTEIT WETENSCHAPPEN
OPLEIDING BIOLOGIE
ACADEMIEJAAR 2010 – 2011
Aanmaak reporterconstructen en stabiele transgene lijnen bij de
nematode Caenorhabditis elegans
door
Glenn VERMOTE
Promotor: Prof. Dr. Bart P. Braeckman Scriptie voorgelegd tot het
Begeleider: Sasha De Henau behalen van de graad van
Onderzoeksgroep: Vanfleteren Lab – Verouderingsfysiologie, Master in Biologie
Cellulaire fysiologie en Moleculaire evolutie
1
Inhoudstafel
1 Inleiding …………………………………………………………………………….. … 4
1.1 Geschiedenis ……………………………………………………………..……… … 4
1.2 Globines ……………………………………………………………….………… … 4
1.2.1 Verspreiding ……………………………………………………………… … 4
1.2.2 Types ……………………………………………………………………... … 5
1.2.3 Structuur en affiniteit …………………………………………………….. … 6
(GFP), … De voornaamste toepassingen houden onder meer controle van transformatie-
efficiëntie, analyse van genexpressie en eiwit-eiwit interactie studies in.
16
1.4.2 Groen fluorescent proteïne (GFP)
GFP is een autofluorescent proteïne, afkomstig van de kwal Aequorea Victoria. Excitatie
gebeurt door blauw licht (~480 nm), waarbij een groen emissielicht (~520 nm) vrijgesteld
wordt. De grote voordelen van GFP zijn de grote stabiliteit van het eiwit en het feit dat in vivo
analyse mogelijk is, wegens het niet schadelijke en niet invasieve karakter van GFP (Figuur 8)
(Chalfie et al. 1994).
Figuur 8: De werking van GFP bij een muis.
1.4.3 Reporterconstructen
Recombinante reporterconstructen zijn samengestelde DNA stukken. Dergelijke constructen
kunnen transcriptionele reporters vormen, waarbij een reportergen is aangebracht aan de
promotorregio van het eiwit van interesse. Dergelijke constructen heten transcriptionele
reporters. Wanneer dit construct vervolgens getransformeerd wordt in een cel of organisme,
wordt bij promotor-activatie het reportergen tot expressie gebracht wat visueel waarneembaar
is. In sommige gevallen, zoals bij het reportersysteem GFP, wordt ook het effectieve gen van
het eiwit van interesse in frame aan het construct toegevoegd. Dit omdat regulatorische
elementen kunnen aanwezig zijn in de intronen of 3’ flankerende sequentie. Zodoende wordt
bij expressie een chimeer eiwit gevormd bestaande uit het eiwit van interesse en de reporter.
Men spreekt in dit geval van een translationele reporter.
17
1.4.4 Aanmaak reporterconstructen
1.4.4.1 Algemeen
De aanmaak van een grote hoeveelheid reporterconstructen kan men samenvatten in 4
stappen: PCR fusie, klonering in een vector, transformatie in E. coli cellen en isolatie van de
reporterconstructen uit de E. coli cellen. De PCR fusie techniek is een snelle manier om twee
of meer stukjes DNA met elkaar te fusioneren tot één construct, in dit geval het targetgen en
het reportergen (Hobert, 2002). De laatste drie stappen dienen dan om het reporterconstruct in
grote getale te vermenigvuldigen.
1.4.4.2 PCR fusie
PCR is de afkorting van polymerase chain reaction, of in het Nederlands vertaald polymerase
kettingreactie. Het is een techniek die de amplificatie van een specifiek stuk DNA kan
bewerkstelligen. Het enige wat men nodig heeft zijn de nucleotide sequenties van de twee
omliggende stukjes DNA van het target DNA. Met die info kan men immers specifieke
primers maken die binden op deze omliggende stukjes DNA en door middel van inbouw van
dNTP’s aan de 3’ zijde van de primers, met behulp van het DNA polymerase enzym, de
targetgenen tussen de twee primers vermenigvuldigen. Het proces bestaat uit drie stappen, die
een aantal keer herhaald worden. De eerste stap is denaturatie van het dubbel strengig DNA
(dsDNA) tot enkel strengig DNA (ssDNA), dit gebeurt bij 95°C. Tijdens het tweede deel van
het proces wordt de temperatuur teruggebracht tot ongeveer 50°C, zodat de primers zich
kunnen vasthechten op de complementaire stukjes ssDNA. Deze fase heet annealing- of
aanhechtingfase. Ten slotte laat men de temperatuur opnieuw stijgen tot 72°C voor de
extensiefase, waarbij dNTP’s door polymerases worden ingebouwd aan de primers die
dusdanig als template dienen. Doordat beide strengen van het dsDNA worden gekopieerd in
één cyclus is er een exponentiële toename van het targetgen, vandaar ook de naam
kettingreactie aangezien elke cyclus voor extra beginproducten zorgt voor de volgende cyclus.
Zoals eerder vermeld kan men via de PCR fusie techniek één construct bekomen uit meerdere
stukjes DNA. Dit is mogelijk doordat de fragmenten een kleine overlappende regio (~24 bp)
bevatten. De overlappende regio wordt in de fragmenten ingebouwd door middel van primers,
wat inhoudt dat elke sequentie kan worden gefusioneerd met een reportergen om zodoende
een reporterconstruct te vormen. In ons geval wensen we drie stukjes DNA te fusioneren tot
één construct: de promotorregio van de globinegenen, de reporter GFP (gecombineerd met
18
een tweede purificatie-epitoop = LAP-tag) en de eiwitcoderende regio van de globinegenen.
Om dergelijke fusie te bekomen gebeurt het proces in 3 stappen: PCR 1, PCR 2 en PCR 3.
Deze eerste stap omvat de synthese van de drie primaire PCR-producten. Tijdens PCR 1
worden de twee targetsequenties (promotor+5’ flankerende sequentie en gen+3’ flankerende
sequentie) geamplificeerd uit genomisch DNA van C. elegans. In parallel wordt de gfp
coderende sequentie geamplificeerd uit de Fire vector pPD95.77
(www.ciwemb.edu/pages/firelab.html).
De 3’ primer voor de promotor targetsequentie evenals de 5’ primer voor de eiwitcoderende
targetsequentie bezitten een 24-nucleotide overlap met het 5’ uiteinde van het LAP-gen.
Doordat hier de coderende sequentie van het gen wordt gebruikt, moeten de primers zo zijn
opgebouwd dat het gfp gen in-frame wordt gefusioneerd met de targetsequenties. De andere
primers moeten geen sequentie bezitten die een overlap vertoont met de targetsequentie,
waardoor dit een algemene primer is die bij elke fusiereactie kan worden gebruikt.
Voor de synthese van de primers wordt de genomische sequentie van het targetgen uit
WormBase (www.wormbase.org) opgehaald. De sequentie van de primers wordt gebaseerd
op de uiteinden van deze fragmenten, waarbij de lengte ongeveer 24 bp groot moet zijn en een
nucleotide niet meer dan vier keer direct achter elkaar herhaald mag worden. Dit verzekert de
nodige specificiteit van de primers.
Figuur 9: Fusie PCR: Een voorbeeld van fusie PCR.
19
Tijdens PCR 2 gebeurt dan de fusie tussen twee van de drie fragmenten (Figuur 9). In ons
geval hebben we eerst de LAP-tag en de eiwitcoderende targetsequentie aan elkaar
gefusioneerd. De concentratie van de producten uit PCR 1 werd ruw geschat via agarose
gelelektroforese en eventueel verdund tot een 10-50 ng/µl. De primers die in deze PCR
gebruikt werden waren de 3’ primer van de LAP-tag en de 5’ primer van de eiwitcoderende
sequentie.
Via een derde PCR worden dan uiteindelijk de promotor targetsequentie met de overlap en het
product uit PCR 2 aan elkaar gefusioneerd en wordt het translationele reporterconstruct
gevormd. Voor een succesvolle fusie moeten nested primers worden gebruikt. Aangezien
tijdens PCR vaak ook atypische DNA fragmenten worden geamplificeerd kunnen we bij fusie
PCR de techniek van nested primers toepassen, waarbij de primers in een volgende stap een
net iets kleiner stukje DNA vermenigvuldigen dan in de voorgaande stap, maar nog steeds de
volledige gewenste DNA regio, zodoende dat het amplificeren van atypische DNA
fragmenten sterk wordt gereduceerd (Figuur 10).
Figuur 10: Fusie PCR: Het principe van nested primers.
1.4.4.3 Agarose gelelektroforese
Eens de reporterconstructen aangemaakt zijn kunnen deze via gelelektroforese geïsoleerd
worden tot één enkele band in de gel, gekleurd worden via Nijlblauwe kleuring, waarna dit
reporterconstruct-bandje wordt uitgesneden en de constructen uit de gel worden herwonnen
20
(Yang et al. 2000). Agarose gelelktroforese werkt op basis van een elektrisch veld, waardoor
nucleïnezuren en proteïnen in een gel gescheiden worden op basis van hun grootte. Om het
DNA te visualiseren wordt gebruik gemaakt van ethidiumbromide. Deze stof kan intercaleren
in dubbelstrengige fragmenten DNA en fluoresceert dan onder invloed van UV-licht.
Daarnaast kan via de moleculaire ladder de grootte en concentratie DNA ruw geschat worden
en zo een indicatie geven van de kwantiteit van het DNA.
1.4.4.4 Kloneren in een vector (BP recombinatie reactie)
Figuur 11: Klonering: De originele Gateway® methode, waarbij eerste drie vectoren (entry clones) worden
verkregen voor de drie verschillende delen van het construct om deze daarna via homologe recombinatie één plasmide te laten vormen met alle drie de delen van het reporterconstruct.
De originele Gateway®
methode om reporterconstructen te maken is eigenlijk niet via PCR
fusie en klonering, maar via gewone PCR van de verschillen delen van het construct om deze
dan via klonering in meerdere vectoren te laten recombineren tot één construct (Figuur 11)
(Hartley et al. 2000; MultiSite Gateway® Three-Fragment Vector Construction Kit, User
Manual). Echter blijkt deze methode niet te lukken voor onze constructen (persoonlijke
communicatie met begeleider). Hierdoor kiezen wij voor de variant van PCR fusie toe om
21
daarna het DNA fragmenten in één vector te kloneren, de Gateway® donorvector (pDONR™
vector). Dit gebeurt via de BP recombinatie reactie. Hierbij wordt via homologe recombinatie
een stuk DNA uit de vector vervangen door het gewenste construct. De klonering van de
reporterconstructen in vectoren is noodzakelijk om ze te kunnen inbrengen in andere
organismen zoals E. coli of C. elegans.
1.4.4.5 Transformatie bij E. coli
Eens de plasmiden met de reporterconstructen gemaakt zijn moeten deze getransformeerd
worden naar E. coli cellen om de plasmiden in grote getale te vermenigvuldigen. Dit gebeurt
via het proces van opname door gebruik te maken van competente cellen (E. coli type DH5
alpha) en deze opname stabiel te maken door hitteshock (MultiSite Gateway®
Three-Fragment
Vector Construction Kit, User Manual). Aangezien in de Gateway®
donorvector (pDONR™
vector) het gen voor kanamycine resistentie is ingebouwd kunnen op nutriënt agar platen
enkel die E. coli organismen overleven die intacte plasmiden hebben opgenomen.
1.4.4.6 Plasmidenisolatie
Aangezien vaak ook E. coli cellen kunnen overleven op met kanamycine behandelde nutriënt
agar platen is het noodzakelijk dat we alvorens tot plasmidenisolatie over te gaan de kolonies
identificeren die wel degelijk een volledig plasmide bevatten. Dit gebeurt via de techniek
kolonie cracking, waarbij een aantal E. coli kolonies gelyseerd worden en via gelektroforese
onderzocht worden op de aanwezigheid van het plasmide (Barnes 1977). Eens de juiste
kolonies geïdentificeerd zijn kan men via een handige toolkit de correcte plasmiden met de
volledige reporterconstructen uit de E. coli stalen zuiveren en zo een concentraat bekomen
van de plasmiden met de gewenste reporterconstructen.
1.4.4.7 Restrictie digest en sequentie analyse
Om tenslotte absoluut zeker te zijn dat men de juiste reporterconstructen heeft bekomen, zijn
er twee controlemechanismen mogelijk. Ten eerste kan men een restrictie digest uitvoeren op
het concentraat. Hierbij maakt men gebruik van de wetenschap dat restrictie enzymen enkel
DNA knippen op specifieke plaatsen. Stel bijvoorbeeld een plasmide voor met een
reporterconstruct in verwerkt en waarvan men weet dat een welbepaald goed gekozen
restrictie enzym deze knipt op twee plaatsen (één maal binnen het construct, één maal
erbuiten), dan verwacht men twee fragmenten terug te vinden met een bepaalde lengte, dit kan
geverifieerd worden door het concentraat in een agarosegel te laten lopen. Wanneer echter het
22
construct niet correct is in de plasmide, dan zal het restrictie enzym ofwel niet kunnen
knippen in het construct waardoor slecht één fragment zal teruggevonden worden in de
agarosegel, ofwel zullen de lengtes van de twee fragmenten niet corresponderen met de
vooraf berekende lengtes die men zou moeten bekomen met het gegeven construct en het
gekozen restrictie enzym. Een andere optie die men kan gebruiken als controlemechanisme is
een PCR van een regio van het plasmide uitvoeren en vervolgens dit PCR product sequeneren.
Hierbij kijkt men dan of de nucleotiden die men verwacht van het correct reporterconstruct
Y75B7AL.1 en ZK637.13. De optimale omstandigheden voor het vermenigvuldigen van deze
DNA regio’s was echter niet bekend, zo wisten we de optimale annealingtemperatuur,
hoeveelheid magnesium of optimale primers niet waarbij de verschillende DNA fragmenten
moesten vermenigvuldigd worden. Standaard begonnen we dan ook met dezelfde
49
begincondities voor alle globinegenen. Deze waren 50°C en 54°C als annealingtemperatuur,
geen extra toegevoegd magnesium en att of externe primers (naast de primers met LAP-tag
overlap). Voor C29F5.7 werd wel (op aangeven van mijn begeleider) meteen extra
magnesium toegevoegd bij de eerste poging.
Figuur 13: PCR fusie: Voorbeeld van een bandenpatroon na PCR 1 voor de globinegenen C06H2.5, C09H10.8, C18C4.1 en C23H5.2, telkens de promotorregio en genregio (van links naar rechts).
De resultaten van PCR 1 waren uitstekend (Tabel 1, Figuur 13), voor bijna alle globinegenen
werden de promotorregio en de regio van het gen meteen goed vermenigvuldigd. Slechts voor
vier genregio’s moest PCR 1 worden overgedaan omdat het beoogde target niet correct
vermenigvuldigd bleek. Dit waren de genregio’s van C26C6.7, C52A11.2, R90.5 en
Y75B7AL.1. Echter bij een tweede poging bleken al twee van deze vier DNA regio’s nu wel
goed vermenigvuldigd te zijn en tijdens de derde PCR werd ook de genregio van Y75B7AL.1
correct vermenigvuldigd. Enkel voor de genregio van C52A11.2 was een vierde PCR
noodzakelijk. Echter om deze DNA regio’s goed te kunne vermenigvuldigen in PCR 1,
moesten de condities waaronder de PCR reacties verliepen bijsturen. Tijdens de tweede
poging om de genregio’s van de globinegenen C26C6.7, R90.5 en Y75B7AL.1 te
vermenigvuldigen voegden we extra magnesium toe aan de reactie, 2 l om exact te zijn. Ook
gebruikten we hier een andere annealingtemperatuur, nl. 47°C en 54°C. Voor C26C6.7 bleek
de combinatie 47°C met het extra magnesium een succes, terwijl voor R90.5 de 54°C en extra
magnesium bleek te werken. Voor Y75B7AL.1 echter was het opnieuw geen succes, maar
toen we bij een derde poging 2 l magnesium toevoegden en een annealingtemperatuur van
59°C gebruikten werd ook dit stukje DNA met succes vermenigvuldigd. Voor de genregio
van C52A11.2 verliep het zoekproces om de optimale omstandigheden te vinden wat anders,
50
daar begonnen we bij 50°C en 54°C en att primers, terwijl we bij de tweede poging 2 l extra
magnesium toevoegden en bij de derde poging overschakelden op externe primers. Het was
echter pas bij de vierde poging, waarbij we de combinatie van 2 l extra magnesium én
externe primers gebruikten, dat het DNA fragment correct werd vermenigvuldigd.
Tabel 1: PCR fusie: Aantal pogingen nodig om tot het beoogd resultaat te komen bij PCR 1 en de optimale condities hierbij. In het rood de veranderingen ten opzichte van de standaardcondities die tot een positief resultaat leiden.
R01E6.6, R11H6.3, R90.5, T06A1.3, Y15E3A.2, Y75B7AL.1 en ZK637.13. Ook bij deze
stap waren de optimale omstandigheden waarbij de reactie moest verlopen niet bekend.
Standaard begonnen we dan ook met dezelfde begincondities voor alle globinegenen. Deze
waren 48°C, 51°C, 54°C en 57°C (voor C06H2.5, C09H10.8, C18C4.1, C23H5.2, C29F5.7,
C52A11.2, F46C8.7, F56C4.3, R01E6.6, R11H6.3, T06A1.3 en Y15E3A.2) of 50°C en 55°C
(voor C26C6.7, C36E8.2, R90.5, Y75B7AL.1 en ZK637.13) als annealingtemperatuur, geen
extra toegevoegd magnesium en att of externe primers (naast de primers met LAP-tag
overlap). Voor C29F5.7 werd wel (op aangeven van mijn begeleider) meteen extra
magnesium toegevoegd bij de eerste poging en bij C29F5.7 en C52A11.2 werd het LAP-tag
meteen verdund tot 1/200 in de plaats van 1/100.
Figuur 14: PCR fusie: Voorbeeld van een bandenpatroon na PCR 2 met de gewenste banden omcirkeld voor de globinegenen C29F5.7, C52A11.2, R11H6.3, R90.5 en Y75B7AL.1, éénmaal met 54°C als annaelingtemperatuur, éénmaal met 50°C als annaelingtemperatuur en met extra magnesium en éénmaal met 54°C als annaelingstemperatuur en met extra magnesium (van links naar rechts).
PCR 2 bleek al heel wat moeilijker te zijn dan het simpele vermenigvuldigen bij PCR 1
(Tabel 3 en figuur 14). Van de 17 globinegenen werden er weliswaar meteen 11 goed
gekoppeld aan het LAP-tag en vermenigvuldigd en voor drie van de zes globinegenen
waarvoor de PCR niet meteen correct werd uitgevoerd (R11H6.3, T06A1.3 en ZK637.13)
waren maximaal vier pogingen nodig om het gewenste resultaat te bekomen. Echter voor
R90.5 en Y75B7AL.1 waren veel meer pogingen nodig om de optimale condities te vinden,
respectievelijk twaalf en tien. Voor T06A1.3 bleek tijdens de tweede poging al dat toevoeging
53
van magnesium het gewenste effect had. Bij R11H6.3 werden de DNA-fragmenten bij de
vierde poging correct vermenigvuldigd door gebruik van interne primers, terwijl voor het
ZK637.13 globinegen eveneens de vierde poging succesvol was, door toevoeging van extra
magnesium én het extra verdunnen van het gebruikte PCR 1 staal (van 1/200 naar 1/100).
Zoals al vermeld was er heel wat meer moeite nodig om de globinegenen R90.5 en
Y75B7AL.1 correct te vermenigvuldigen tijdens PCR 2. Voor Y75B7AL.1 veranderden we
de annaelingstemperatuur en voegden we extra magnesium toe. Zelfs het toevoegen van extra
DMSO (5% en 10%) en formamide (2.5% en 7.5%), alsook het verdunnen van het LAP-tag
staal tot 1/200 zorgden niet voor beterschap. Echter merkten we op dat voor Y75B7AL.1 PCR
1 al een probleem was geweest en maakten de bedenking dat het PCR 1 staal voor dit gen
toch niet goed genoeg was, waardoor we uiteindelijk besloten PCR 1 opnieuw te doen voor
Y75B7AL.1 en probeerden PCR 2 nogmaals met dit nieuwe staal, maar ook dat bleek niet de
oplossing. Het was pas toen we externe primers gebruikten in de plaats van de att primers dat
PCR 2 correct werd uitgevoerd voor het Y75B7AL.1 globinegen. Het vermenigvuldigen van
R90.5 tenslotte was ongeveer gelijkaardig aan het proces van Y75B7AL.1, in die zin dat we
ook daar na talloze pogingen PCR 1 eveneens opnieuw deden, aangezien ook PCR 1 voor dit
gen niet vlekkeloos was verlopen, en in tegenstelling tot Y75B7AL.1 werkte deze aanpak
voor R90.5 wel, want met dit nieuwe PCR 1 staal én het toevoegen van extra magnesium
tijdens de tweede poging was het resultaat positief. Voor C23H5.2 tenslotte werden door
tijdsgebrek slechts 3 pogingen ondernomen, allen zonder resultaat.
Tabel 3: PCR fusie: Aantal pogingen nodig om tot het beoogd resultaat te komen bij PCR 2 en de optimale condities hierbij. In het rood de veranderingen ten opzichte van de standaardcondities die tot een positief resultaat leiden.
Globinegen Aantal pogingen Optimale condities
C06H2.5 1 54°C, externe primers
C09H10.8 1 54°C, externe primers
C18C4.1 1 51°C, externe primers
C23H5.2 / /
C26C6.7 1 55°C, att primers
C29F5.7 1 54°C, externe primers, extra magnesium, LAP-tag 1/200
C36E8.2 1 55°C, att primers
54
C52A11.2 1 54°C, externe primers, LAP-tag 1/200
F46C8.7 1 48°C, externe primers
F56C4.3 1 51°C, externe primers
R01E6.6 1 51°C, externe primers
R11H6.3 4 56°C, interne primers, LAP-tag 1/200
R90.5 12 50°C, att1 primers, extra magnesium, LAP-tag 1/200
T06A1.3 2 48°C, externe primers, extra magnesium
Y15E3A.2 1 48°C, externe primers
Y75B7AL.1 10 54°C, externe primers, extra magnesium, LAP-tag 1/200
ZK637.13 4 55°C, att primers, extra magnesium
Idem zoals bij PCR 1, aangezien in een volgende stap soms niet alles meteen correct verliep
moesten we hierdoor af en toe teruggaan naar een vorige stap. In tabel 4 staan dan ook het
totale aantal pogingen voor PCR 2 en het aantal pogingen waarbij de uitkomst goed was.
Tabel 4: PCR fusie: Aantal pogingen en aantal geslaagde pogingen van PCR 2.
Globinegen Promoteregio
Aantal Geslaagd
C06H2.5 1 1
C09H10.8 1 1
C18C4.1 2 2
C23H5.2 3 0
C26C6.7 1 1
C29F5.7 5 3
C36E8.2 2 2
C52A11.2 2 2
F46C8.7 4 2
55
F56C4.3 1 1
R01E6.6 1 1
R11H6.3 7 2
R90.5 20 2
T06A1.3 2 1
Y15E3A.2 1 1
Y75B7AL.1 16 2
ZK637.13 4 1
4.1.1.4 PCR 3
De laatste stap van de PCR fusie is PCR 3, tijdens deze stap koppelden en vermenigvuldigden
we de promotorregio van de globinegenen die we bekomen waren tijdens PCR 1 met het
eindproduct van RCR 2, zijnde de combinatie van de LAP-tag met de genregio’s van de
globinegenen. Nog steeds werkten we met de oorspronkelijke globinegenen: C06H2.5,
R11H6.3, R90.5, T06A1.3, Y15E3A.2, Y75B7AL.1 en ZK637.13, alleen C23H5.2 waarvoor
we geen positief PCR 2 staal konden maken werd weggelaten tijdens PCR 3. Maar eveneens
voor de vier globinegenen C18C4.9, F19H6.2, F21A3.6 en Y58A7A.6 voerden we PCR 3 uit
op PCR 2 stalen die mij werden aangereikt door mijn begeleider. Eveneens waren de optimale
omstandigheden bij deze niet bekend. Standaard begonnen we dan ook met dezelfde
begincondities voor alle globinegenen. Deze waren 48°C, 51°C, 54°C en 57°C (voor
C06H2.5, C09H10.8, C18C4.1, C29F5.7, F46C8.7, F56C4.3, R01E6.6, T06A1.3 en
Y15E3A.2), 51°C en 54°C (voor C26C6.7, C36E8.2, R90.5 en ZK637.13) of 52°C, 55°C,
58°C en 61°C (voor C52A11.2, R11H6.3 en Y75B7AL.1) als annealingtemperatuur, geen
extra toegevoegd magnesium en att of interne primers (naast de primers met LAP-tag
overlap). Voor C29F5.7 werd wel (op aangeven van mijn begeleider) meteen extra
magnesium toegevoegd bij de eerste poging en bij C29F5.7 en C52A11.2 werd het LAP-tag
meteen verdund tot 1/200 in de plaats van 1/100. En voor de drie extra globinegenen die mij
werden gegeven door mijn begeleider waren de standaardcondities 45°C, 48°C, 51°C, 54°C,
57°C en 60°C, Pfu Hotstart polymerase en geen extra magnesium voor C18C4.9; 52°C en
56
54°C en geen extra magnesium voor F19H6.2 en 47°C, 50°C, 53°C en 56°C met extra
magnesium toegevoegd voor F21A3.6 en Y58A7A.6.
Figuur 15: PCR fusie: Voorbeeld van een bandenpatroon na PCR 3 met de gewenste banden omcirkeld voor de globinegenen C29F5.7, C52A11.2, R11H6.3, R90.5 en Y75B7AL.1, éénmaal met 49°C, éénmaal met 52°C en éénmaal met 55°C als annaelingtemperatuur (van links naar rechts).
PCR 3 bleek een even grote uitdaging als PCR 2, aangezien van de 19 globinegen er slechts
voor 8 meteen een positief resultaat werd gevonden (Tabel 5 en figuur 15). Voor de rest werd
net zoals bij PCR 2 gezocht naar de optimale condities en uiteindelijk werden deze wel
gevonden. Alleen voor C18C4.1 en T06A1.3 werden slechts vier en twee pogingen,
respectievelijk, ondernomen die allen negatief bleken.
Tabel 5: PCR fusie: Aantal pogingen nodig om tot het beoogd resultaat te komen bij PCR 3 en de optimale condities hierbij. In het rood de veranderingen ten opzichte van de standaardcondities die tot een positief resultaat leiden.
Eens we een geslaagd PCR 3 product verkregen hadden, probeerden we dit in grote getale aan
te maken door PCR 3 in de exact dezelfde omstandigheden opnieuw uit te voeren, maar dan in
grotere hoeveelheid. Nadat we deze PCR 3 producten verkregen hadden moesten we deze nog
bewerken alvorens ze te kunnen kloneren in de donorvectoren. Hiervoor dampten we de
stalen uit om de concentratie aan constructen te verhogen, vervolgens lieten we ze op een
agarosegel lopen om de banden met de juiste grootte uit te snijden en de constructen terug te
bekomen via gelextractie. Dit alles werd tenslotte gecontroleerd door middel van Nanodrop
analyse en gelektroforese.
60
De eerste poging voor de globinegenen C26C6.7 en ZK637.13 bleek geslaagd (Tabel 8).
Tabel 8: PCR fusie: Controle op eindproduct na gelextractie deel I.
Globinegen Nanodrop Gelelektroforese
C26C6.7 12,73 ng/l OK
ZK637.13 11,12 ng/l OK
Echter tijdens de tweede poging voor de genen C26C6.7, F19H6.2 en Y58A7A.6 moet er iets
misgelopen zijn want na de gelextractie werd telkens tijdens de controle via Nanodrop en
gelelektroforese niet het gewenste resultaat bekomen (Tabel 9).
Tabel 9: PCR fusie: Controle op eindproduct na gelextractie deel II.
Globinegen Nanodrop Gelelektroforese
C26C6.7 0,92 ng/l Niet OK
F19H6.2 1,24 ng/l Niet OK
Y58A7A.6 1,39 ng/ l Niet OK
De derde poging met de genen C26C6.7, C36E8.2, F19H6.2, F21A3.6 en Y58A7A.6 bleek
wel terug een succes. Voor zowel C26C6.7, C36E8.2 en F21A3.6 waren de controles positief
(Tabel 10).
Tabel 10: PCR fusie: Controle op eindproduct na gelextractie deel III.
Globinegen Nanodrop Gelelektroforese
C26C6.7 10,01 ng/l OK
C36E8.2 9,22 ng/l OK
F19H6.2 7,79 ng/l Niet OK
F21A3.6 5,13 ng/l OK
Y58A7A.6 4,37 ng/l Niet OK
61
Een vierde en uiteindelijk vijfde gelextractie voor respectievelijk de globinegenen C06H2.5,
C09H10.8, F56C4.3 en R01E6.6 en de globinegenen C06H2.5, C18C4.9 en F19H6.2 waren
eveneens succesvol (Tabel 11 en 12).
Tabel 11: PCR fusie: Controle op eindproduct na gelextractie deel IV.
Globinegen Nanodrop Gelelektroforese
C06H2.5 5,53 ng/l OK
C09H10.8 5,07 ng/l OK
F56C4.3 6,29 ng/l OK
R01E6.6 8,61 ng/l OK
Tabel 12: PCR fusie: Controle op eindproduct na gelextractie deel V.
Globinegen Nanodrop Gelelektroforese
C06H2.5 13,08 ng/l Niet OK
C18C4.9 15,23 ng/l Niet OK
F19H6.2 12,78 ng/l OK
Alles samen hadden we dus voor negen globinegenen een zuiver en geconcentreerd staal van
plasmiden, deze negen waren C06H2.5, C09H10.8, C26C6.7, C36E8.2, F19H6.2, F21A3.6,
F56C4.3, R01E6.6 en ZK637.13.
4.1.2 Klonering
Alvorens de constructen te kunnen transformeren naar E. coli cellen, dienden we deze te
kloneren in een donorvector (pDONR™ vector) via de BP recombinatie reactie. Bierbij werd
via recombinatie een stuk DNA uit de vector vervangen door het gewenste construct.
Deze stap hebben we een aantal keer gedaan voor verschillende globinegenen. De eerste keer
was dit van C26C6.7 en ZK637.13. De tweede keer voor C26C6.7, C36E8.2 en F21A3.6. Een
derde maal voerden we de klonering uit voor de genen C06H2.5, C09H10.8, F56C4.3 en
R01E6.6. Tenslotte deden we ook nog een vierde klonering voor C06H2.5 alleen. Wegens
tijdsgebrek werd met het F19H6.2 staal geen klonering uitgevoerd.
62
Deze stap werd uitgevoerd zonder controle, resultaten in verband met succes of mislukking
tijdens deze stap zijn hier dus niet voor handen.
4.1.3 Transformatie
Na de klonering konden we de constructen transformeren naar de E. coli cellen. Transformatie
van de intacte plasmiden in E. coli cellen gebeurde via het proces van opname door gebruik te
maken van competente cellen (E. coli type DH5 alpha) en deze opname stabiel te maken door
hitteshock.
De constructen van de globinegenen die getransformeerd werden waren, net zoals bij de
kloneringstap, deze van C26C6.7 en ZK637.13 tijdens de eerste transformatie, C26C6.7,
C36E8.2 en F21A3.6 tijdens een volgende transformatie, C06H2.5, C09H10.8, F56C4.3 en
R01E6.6 tijdens de derde transformatie en C06H2.5 nogmaals met een vierde en laatste
transformatie.
Aangezien de donorvector waarin de constructen werden gekloneerd een gen bevatte dat de E.
coli cellen immuun maakte voor het antibioticum kanamycine en we dit antibioticum hadden
aangebracht op de agar plaatjes wisten we dat de kolonies die effectief groeiden op deze
ondergrond de donorvector hadden opgenomen. Na elke transformatie werden kolonies
gevormd en konden we er dus van uitgaan dat de donorvector was opgenomen tijdens de
transformatie, behalve van C06H2.5, waarbij in beide gevallen geen kolonies werden
gevormd.
4.1.4 Plasmidenisolatie
Nu de plasmiden vermenigvuldigd waren in de E. coli cellen moesten we deze intact terug uit
de E. coli cellen zien te krijgen. Dit gebeurde door middel van plasmidenisolatie volgens de
miniprepmethode.
Maar vooraleer deze procedure te kunnen doorlopen, moesten de E. coli kolonies geselecteerd
worden waarin ook het correcte construct aanwezig was. Dit werd gedaan aan de hand van de
methode colony cracking. Hierbij werden enkele E. coli cellen van 32 kolonies per gen
gelyseerd en via gelelektroforese werden de kolonies uitgekozen die het meest waarschijnlijk
het correcte construct opgenomen hadden aan de hand van hun bandenpatroon. Aangezien de
63
kans groter was dat een kolonie het plasmide had, werden dus de kolonies uitgekozen
waarvan de band op de gel afweek van de rest (Figuur 16).
Figuur 16: Plasmidenisolatie: Voorbeeld van een colony cracking voor C36E8.2 waar men een extra band kan zien voor twee van de kolonies.
Figuur 17: Plasmidenisolatie: Voorbeeld van een restrictie enzym test voor C06E4.7, C09H10.8, F49E2.4, F56C4.3 en R01E6.6, waarbij het verwachte bandenpatroon werd aangeduid door middel van de rode cirkels.
64
Tijdens de eerste colony cracking werden volgende kolonies geselecteerd: 13 en 14 van
C26C6.7 en 24 en 25 van ZK637.13. Ook werd colony cracking uitgevoerd op een aantal
kolonies van R102.9 en F19H6.2. Deze kolonies werden mij aangereikt door mij begeleider.
Van deze genen werden de volgende kolonies geselecteerd voor de plasmidenisolatie: 3 en 6
van R102.9 en 10 en 13 van F19H6.2. Op deze kolonies werd dus de eerste plasmidenisolatie
uitgevoerd. Als controle op deze stap werd een Nanodrop analyse uitgevoerd op de stalen en
werd eveneens een restrictie enzym test (RE test) gedaan. De Nanodrop analyse werd
uitgevoerd om te zien of de concentratie aan DNA in het staal voldoende hoog was om mee
verder te werken. Aangezien we 100ng nodig zouden hebben bij de volgende stappen en we
na de plasmidenisolatie ongeveer 200l verkregen moest dus een concentratie van minstens
0.5 ng/l bekomen worden bij de Nanodrop analyse. Bij de restrictie enzym test werden de
stalen met de verwachte plasmiden bewerkt met een restrictie enzym dat de plasmiden knipte.
Aangezien dit gedaan werd met een gekend restrictie enzym kon men vooraf voorspellen
welke en hoeveel banden men moest terugvinden bij gelelektroforese van de behandelde
stalen (Figuur 17). Het restrictie enzym dat we gebruiken was NotI en dit had voor de
volgende gelelektroforese resultaten moeten zorgen van de genen: Voor C26C6.7 hadden op
de gel twee banden zichtbaar moeten zijn, met groottes van 5067bp en 6362bp, voor C36E8.2
twee banden met groottes 2189bp en 4469bp, eveneens twee banden voor R102.9 met
groottes 3028bp en 6362bp en tenslotte voor ZK637.13 twee banden met groottes 2789bp en
5275bp. De resultaten van deze controles zijn te vinden in tabel 13. Enkel voor globinegen
R102.9 was de restrictie enzym test positief met twee correcte banden die werden
weergevonden op de gel.
Tabel 13: Plasmidenisolatie: Controle na eerste plasmidenisolatie deel I.
Globinegen Nanodrop RE-test
C26C6.7-13 28,54 ng/l Niet OK
C26C6.7-14 23,70 ng/l Niet OK
ZK637.13-24 19,10 ng/l Niet OK
ZK637.13-25 22,57 ng/l Niet OK
R102.9-3 31.03 ng/l OK
R102.9-6 26.79 ng/l OK
65
F19H6.2-10 25.05 ng/l Niet OK
R19-13 16,92 ng/l Niet OK
Aangezien er dus enkel een positieve uitkomst was voor globinegen R102.9 werd er voor de
drie overige globinegenen 2 nieuwe kolonies uitgekozen via het gelelektroforese resultaat van
de colony cracking. Voor het gen C26C6.7 werden dat kolonies 30 en 32, voor het gen
ZK637.13 kolonies 3 en 9 en tenslotte voor het gen F19H6.2 eveneens kolonies 3 en 9. Deze
keer werd de RE-test uitgevoerd met het restrictie enzym Eco RI. De verwachte aantal banden
en de bijbehorende groottes van deze bij een positief resultaat moesten de volgende zijn: voor
C26C6.7 werden acht banden verwacht met groottes 658bp, 671bp, 884bp, 1255bp, 1231bp,
1452bp, 2141bp en 3137bp (al zou dit in de praktijk waarschijnlijk vier banden zijn aangezien
sommige banden zo gelijkend zijn qua grootte dat ze als één band overkomen op de gel), voor
ZK637.13 werden drie banden verwacht met groottes 32bp, 1291bp en 5327bp) en als
resultaat van de RE-test van F19H6.2 werden slechts twee banden op de gel verwacht en dit
met groottes 3471bp en 4593bp. De resultaten hiervan zijn te vinden in tabel 14. Ook tijdens
deze tweede poging werd de RE-test voor één gen positief bevonden, de gel analyse van
F19H6.2 gaf het verwachte patroon.
Tabel 14: Plasmidenisolatie: Controle na eerste plasmidenisolatie deel II.
Globinegen Nanodrop RE-test
C26C6.7-30 5,89 ng/l Niet OK
C26C6.7-32 5,77 ng/l Niet OK
ZK637.13-3 6,12 ng/l Niet OK
ZK637.13-9 5,69 ng/l Niet OK
F19H6.2-3 5.25 ng/l OK
R19-9 4,72 ng/l Niet OK
Voor de genen C26C6.7 en ZK637.13 bleken dus geen enkele van de vier kolonies die we tot
nu toe hadden gecontroleerd het plasmide met het correcte construct te bevatten. En aangezien
we geen andere kandidaat-kolonies meer hadden uit de eerste colony cracking werd voor deze
twee genen een tweede colony cracking uitgevoerd op 32 nieuwe kolonies. Via het
66
bandenpatroon werden dan opnieuw 2 kolonies gekozen per gen om een plasmidenisolatie op
uit te voeren en deze vervolgens te controleren via Nanodrop en een RE test. Voor gen
C26C6.7 waren dit kolonies 37’ en 47’, terwijl kolonies 38 en 48’ gekozen werden voor
ZK637.13. En net zoals tijdens de vorige RE test werd het restrictie enzym Eco RI gebruikt,
hetzelfde patroon als bij de vorige test werd dus verwacht. De resultaten hiervan zijn te
vinden in tabel 15. Kolonie 38 die het plasmide met het construct van ZK637.13 in zich droeg
bleek het correcte RE patroon te vertonen en dus hoogstwaarschijnlijk het correcte construct
te bevatten.
Tabel 15: Plasmidenisolatie: Controle na eerste plasmidenisolatie deel III.
Globinegen Nanodrop RE-test
C26C6.7-37’ 12,37 ng/l Niet OK
C26C6.7-47’ 15,82 ng/l Niet OK
ZK637.13-38 11,33 ng/l OK
ZK637.13-48’ 8,71 ng/l Niet OK
Van de genen C26C6.7, ZK637.13, F19H6.2 en R102.9 waarmee we begonnen waren hadden
we na twee colony cracking’s en drie plasmidenisolaties en bijhorende Nanodrop en RE
analyses, kolonies van drie genen die het correcte construct bevatten, deze waren F19H6.2-3,
R102.9-3 en ZK637.13-38 (eveneens R102.9-6). Voor deze genen konden we nu overgaan tot
de tweede plasmidenisolatie. Deze isolatie was identiek aan de eerste, met het enige verschil
dat deze nu op grotere schaal gebeurde dan de eerste plasmidenisolatie. Een RE controle op
deze tweede plasmidenisolatie gebeurde niet meer, enkel een Nanodrop analyse, aangezien we
de concentratie aan DNA in de stalen later nog zouden nodig hebben. De resultaten hiervan
zijn te zien in tabel 16.
Tabel 16: Plasmidenisolatie: Nanodrop analyse na tweede plasmidenisolatie deel I.
Globinegen Nanodrop
F19H6.2-3 1236,8 ng/l
R102.9-3 1169,7 ng/l
ZK637.13-38 1045,9 ng/l
67
Een derde colony cracking voor de genen C26C6.7, C36E8.2 en F21A3.6 werd eveneens
gedaan, hiervan werden net zoals bij de voorgaande keren enkele kolonies geselecteerd om
een plasmidenisolatie op uit te voeren: C26C6.7-2, C26C6.7-4, C36E8.2-4, C36E8.2-6,
F21A3.6-6 en F21A3.6-9. De resultaten van de Nanodrop analyse en RE controle (met
EcoRI) zijn terug te vinden in tabel 17. Voor alle drie de genen C26C6.7, C36E8.2 en
ZK637.13 werden geen positieve resultaten gevonden bij de RE test.
Tabel 17: Plasmidenisolatie: Controle na eerste plasmidenisolatie deel IV.
Globinegen Nanodrop RE-test
C26C6.7-2 16,77 ng/l Niet OK
C26C6.7-4 13,26 ng/l Niet OK
C36E8.2-4 14,24 ng/l Niet OK
C36E8.2-6 13,57 ng/l Niet OK
F21A3.6-6 17.25 ng/l Niet OK
F21A3.6-9 14,11 ng/l Niet OK
Een vierde colony cracking werd uitgevoerd voor de genen C09H10.8, F56C4.3 en R01E6.6.
Hiervan werden 8 kolonies uitgekozen om een eerste plasmidenisolatie op uit te voeren:
C09H10.8-2, C09H10.8-6, F56C4.3-1, F56C4.3-2, F56C4.3-11, R01E6.6-1, R01E6.6-2 en
R01E6.6-12. Ook kreeg ik voor het globinegen C06E4.7 drie kolonies van mijn begeleider om
plasmidenisolatie op uit te voeren: C06E4.7-1, C06E4.7-2 en C06E4.7-3. De resultaten van de
controles hierbij zijn te vinden in tabel 18. De RE-test werd ook hier gedaan met het restrictie
enzyme EcoRI. Uit de gelelektroforese analyse van de RE-test bleken alle 3 de kolonies van
C06E4.7 en F56C4.3 en één kolonie van R01E6.6 het correcte contruct in de plasmide te
bevatten.
Tabel 18: Plasmidenisolatie: Controle na eerste plasmidenisolatie deel V.
Globinegen Nanodrop RE-test
C06E4.7-1 43,03 ng/l OK
C06E4.7-2 42,77 ng/l OK
C06E4.7-3 40,36 ng/l OK
68
C09H10.8-2 19,40 ng/l Niet OK
C09H10.8-6 25,79 ng/l Niet OK
F56C4.3-1 43,11 ng/l OK
F56C4.3-2 54,08 ng/l OK
F56C4.3-11 45,69 ng/l OK
R01E6.6-1 66.55 ng/l Niet OK
R01E6.6-2 46.42 ng/l OK
R01E6.6-12 55,81 ng/l Niet OK
Voor de genen C06E4.7, F56C4.3 en R01E6.6 konden we nu dus een tweede
plasmidenisolatie uitvoeren om zo tot de plasmiden met de correcte contructen te komen, die
we later in de C. elegans organismen zouden transformeren. De kolonies waarop we deze
tweede plasmidenisolatie deden waren C06E4.7-3, F56C4.3-2 en R01E6.6-2. De resultaten
van hun Nanodrop analyse zijn te vinden in tabel 19.
Tabel 19: Plasmidenisolatie: Nanodrop analyse na tweede plasmidenisolatie deel II.
Globinegen Nanodrop
C06E4.7-3 1043,2 ng/l
F56C4.3-2 1319,8 ng/l
R01E6.6-2 1828,3 ng/l
Tot slot deden we nog een zesde poging tot plasmidenisolatie. Deze maal voor het gen
C09H10.8, waarvoor we de kolonies C09H10.8-15 en C09H10.8-18 gebruikten alsook voor
het globinegen F49E2.4, waarvan ik twee stalen van kolonies kregen van mijn begeleider:
F49E2.4-10 en F49E2.4-11. De resultaten van deze plasmidenisolatie zijn te vinden in tabel
20.
69
Tabel 20: Plasmidenisolatie: Controle na eerste plasmidenisolatie deel VI.
Globinegen Nanodrop RE-test
C09H10.8-15 33,64 ng/l Niet OK
C09H10.8-18 25,29 ng/l Niet OK
F49E2.4-10 24,11 ng/l Niet OK
F49E2.4-11 58,36 ng/l OK
Voor F49E2.4-11 konden we nu dus eveneens nog een tweede plasmidenisolatie uitvoeren.
De resultaten van deze Nanodrop analyse zijn te vinden in tabel 21.
Tabel 21: Plasmidenisolatie: Nanodrop analyse na tweede plasmidenisolatie deel III.
Globinegen Nanodrop
F49E2.4-11 887,0 ng/l
Als laatste stap moesten we een restrictie enzym digest uitvoeren op de stalen na de tweede
plasmidenisolatie. Dit om open plasmiden te bekomen die later zouden kunnen recombineren
met het DNA binnen in de C. elegans individuen. Aangezien we hiervoor 11.25 mg nodig
hadden per staal konden we alles berekenen via de resultaten van de Nanodrop analyse. Dit
deden we dus voor de globinegenen C06E4.7, F19H6.2, F49E2.4, F56C4.3, R01E6.6, R102.9
en ZK637.13, alsook voor de genen T22C1.2, W01C9.5 en Y17G7B.6 waarvan ik de stalen,
waarop de RE digest moest gebeuren, kreeg van mijn begeleider.
Alles samen voerden we geslaagde plasmidenisolaties uit voor de globinegenen C06E4.7,
F19H6.2, F49E2.4, F56C4.3, R01E6.6, R102.9 en ZK637.13. Voor de genen C09H10.8,
C26C6.7, C36E8.2 en F21A3.6 werd echter geen positief resultaat waargenomen.