รายงานผลการวิจัยlibrae.mju.ac.th/goverment/20111119104834_librae/File... · 2015. 8. 4. · ผู้ร่วมโครงการ นางนลินี

รายงานผลการวจย

เรอง

การตอบสนองของยนโปรตนตอบสนองตออณหภมสงในพชพลงงานททนรอน

Response of Heat Shock Protein Gene in some Heat-Tolerance Fuel Crops

โดย

แสงทอง พงษเจรญกต และคณะ

มหาวทยาลยแมโจ

2556

รหสโครงการวจย มจ.1-55-029

รายงานผลงานวจย

เรอง การตอบสนองของยนโปรตนตอบสนองตออณหภมสงในพชพลงงานททนรอน

Response of Heat Shock Protein Gene in some Heat-Tolerance Fuel Crops

ไดรบการจดสรรงบประมาณวจย: ประจ าป 2555

จ านวนเงน 341,000 บาท

หวหนาโครงการ นางสาวแสงทอง พงษเจรญกต

ผรวมโครงการ นางนลน รงเรองศร นางสาวชอทพา สกลสงหาโรจน นางวรศรา สวรรณ

งานวจยเสรจสนสมบรณ

27 ธนวาคม 2556

สารบญเรอง

หนา สารตาราง ข สารบญภาพ ค บทคดยอ 1 Abstract 2 กตตกรรมประกาศ 3 ค าน า 4 วตถประสงคของการวจย 5 ประโยชนทคาดวาจะไดรบ 5 การตรวจเอกสาร 6 อปกรณและวธการ 11 ผลการวจย 20 สรปและวจารณผลการวจย 36 เอกสารอางอง 38 ภาคผนวก ภาคผนวก ก 41 ภาคผนวก ข 48

ข

สารบญตาราง

หนา

ตารางท 1 ล าดบดเอนเอของไพรเมอรทใชในเทคนค RT-PCR 19 ตารางท 2 ล าดบดเอนเอและขนาดของผลผลตทไดจาก PCR ของไพรเมอร ส าหรบยน hsf ตางๆ

24

ตารางท 3 ผลการวเคราะห motif ของโปรตนดวยการเปรยบเทยบล าดบ กรดอะมโนทไดจากการแปลรหสยน ScHSF6 และ ScHSF10 ท แยกไดกบฐานขอมลโปรตน Pfam

33

ค

สารบญภาพ

หนา ภาพท 1 กลไกการตอบสนองตออณหภมของพช ทโปรตน HSFs เปน ตวกลางในการตอบสนองตออณหภมของพช

8

ภาพท 2 โครงสรางของโปรตน HSFs จาก Arabidopsis (AtHsfA2) 8 ภาพท 3 ความสมพนธทาง phylogenetics ของโปรตน HSFs จากขาว มะเขอเทศ และ Arabidopsis

9

ภาพท 4 แผนทของพลาสมด pGEM-T easy (Promega) 16 ภาพท 5 ผลการท า 1% agarose gel electrophoresis ของดเอนเอในจโนมท ไดจากการสกดดวยชดสกด GF-1 (vivantis)

20

ภาพท 6 ผลการท า agarosegel electrophoresis ทไดจากการเปรยบเทยบ ระหวางการสกดโดยใชชด Genomic DNA Purification Kit กบวธ mCTAB ของดเอนเอในจโนมจากออยพนธตางๆ

21

ภาพท 7 ผลการท า 1% agarose gel electrophoresis ของผลผลต PCR ของ ยน ScHS56 จากดเอนเอในจโนมของออยพนธตางๆ เปรยบเทยบ ระหวางการสกดโดยวธ mCTAB กบ ชด Genomic DNA Purification Kit

22

ภาพท 8 ผลการท า 1% agarose gel electrophoresis ของผลผลต PCR ของ ยน ScHSF6 จากดเอนเอในจโนมของออยพนธตางๆ เปรยบเทยบ ระหวางการสกดโดยวธ mCTAB กบ ชด Genomic DNA Purification Kit

23

ภาพท 9 ผลการท า 1% agarose gel electrophoresis ของผลผลต PCR ของ ยน ScHSF5 จากดเอนเอในจโนม ของ ออยพนธตางๆ

25

ภาพท 10 ผลการท า 1%agarose gel electrophoresis ของผลผลต PCR ของ ยน ScHSF6 จากดเอนเอในจโนมของออยพนธตางๆ

26

ภาพท 11 ผลการท า 1% agarose gel electrophoresis ของผลผลต PCR ของ ยน ScHSF10 จากดเอนเอในจโนมของออยพนธตางๆ

26

ภาพท 12 ผลการท า 1% agarose gel electrophoresis ของไพรเมอร PTSo00731 จากออยพนธตางๆ

27

ง

หนา ภาพท 13 ผลการท า 1% agarose gel electrophoresis ของไพรเมอร PTSo00732 จากออยพนธตางๆ

27

ภาพท 14 ผลการท า 1% agarose gel electrophoresis ของไพรเมอร PTSo00733 และ 07334

28

ภาพท 15 ผลการเปรยบเทยบล าดบดเอนเอทไดจากไพรเมอร PTSo00732 (732) และ ScHSF6 (Sc6)

29

ภาพท 16 ภาพ chromatogram ของผลการหาล าดบดเอนเอทไดจากไพร- เมอร ScHSF6 จากออยพนธสพรรณบร 50

30

ภาพท 17 ผลการเปรยบเทยบยน ScHSF6 จากออย 3 พนธ จ านวน 11 โคลน

32

ภาพท 18 ผลการเปรยบเทยบยน ScHSF10 จากออย 3 พนธ จ านวน 5 โคลน

33

ภาพท 19 ผลการท า 1% agarose gel electrophoresis ของผลผลต RT-PCR ของยน ScHSF10 และ actin จาก cDNA ออยพนธสพรรณบร 50

34

ภาพท 20 ผลการท า 1% agarose gel electrophoresis ของผลผลต RT-PCR ของยน ScHSF6 และ actin จาก cDNA ออยพนธสพรรณบร 50

35

การตอบสนองของยนโปรตนตอบสนองตออณหภมสงในพชพลงงานททนรอน

Response of heat shock protein gene in some heat-tolerance fuel crops

แสงทอง พงษเจรญกต นลน รงเรองศร ชอทพา สกลสงหาโรจน วรศรา สวรรณ

Saengtong Pongjaroenkit Nalinee Roongruangsree Chotipa Sakulsingharoj

Warissara Suwan

คณะวทยาศาสตร มหาวทยาลยแมโจ อ าเภอสนทราย จงหวดเชยงใหม 50290

------------------------------------------------------------------------------------------------------------

บทคดยอ

โปรตนควบคมการถอดรหสทตอบสนองตออณหภมสง (heat stress transcription factors; HSFs) มบทบาทส าคญในการตอบสนองตออณหภมสงของพช แบงไดเปน 3 กลมตามโครงสรางของโปรตน คอ กลม A, B และ C โปรตน HSFs กลม A เกยวของกบการตอบสนองตออณหภมทเพมขนของพช ในงานวจยนจงแยกบางสวนของยน hsf จากออยดวยเทคนค polymerase chain reaction (PCR) พบวาโคลนได 2 ยน ไดแกยน ScHSF6 และยน ScHSF10 จากการวเคราะหล าดบดเอนเอทแยกไดจากออย 3 สายพนธ พบวาทงสองยนนอยในกลม A ยน ScHSF6 และ ScHSF10 มความเหมอนของล าดบดเอนเอและโปรตนสง คอ มากกวา 97 และ 95 เปอรเซนต ตามล าดบ พบวาการเปลยนแปลงกรดอะมโนในยน ScHSF6 และ ScHSF10 ทแยกได ไมนาจะสงผลกระทบตอการท างานของโปรตน HSFs สวนการศกษาการแสดงออกของยน พบวายน ScHSF6 แสดงออกเพมขนทอณหภมสง 42 และ 45 องศาเซลเซยส และลดลงทอณหภม 48 องศาเซลเซยส ในขณะทยน ScHSF10 พบวาแสดงออกคงททอณหภม 28, 37, 42, 45 และ 48 องศาเซลเซยส ดงนนคาดวายน ScHSF6 ทมความหลากหลายและการแสดงออกเพมขนทอณหภมสงนาจะมบทบาทเกยวของกบการตอบสนองตออณหภมทเพมขนในออย

ค าส าคญ: ออย, การโคลนยน, โปรตนตอบสนองตอความรอน

2

ABSTRACT

Heat stress transcription factors (HSFs) are important proteins involved in plant response to heat stress. The HSFs are classified into 3 classes (class A, B and C) according to their protein structures. The HSFs of class A are responsible for elevated temperature. In this study, the partial coding sequences of hsf genes were isolated from sugarcane by polymerase chain reaction (PCR). Two class A hsf genes, ScHSF6 and ScHSF10, were isolated from three sugarcane varieties. The nucleotide and amino acid sequence comparisons revealed very high identity within ScHSF6 and ScHSF10 that were more than 97% and 95%, respectively. In addition, the changes of amino acids did not affect the motifs of proteins. Gene expression of ScHSF6 was increased at 42 and 45 C and declined at 48. The expression of ScHSF10 was constantly at 28, 37, 42, 45 and 48 C. Therefore ScHSF6 which was multiple forms and increasing of gene expression may response to high temperature.

Keywords: Sugarcane (Saccharum L.), Gene cloning, Heat stress transcription factor.

3

กตตกรรมประกาศ

โครงการวจยเรอง การตอบสนองของยนโปรตนตอบสนองตออณหภมสงในพชพลงงานท

ทนรอน(Response of heat shock protein gene in some heat-tolerance fuel crops) ไดส าเรจลลวง

โดยไดรบทนอดหนนการวจยจากส านกวจยและสงเสรมวชาการการเกษตร มหาวทยาลยแมโจ

ประจ าปงบประมาณ 2555

ขอขอบคณศนยวจยและพฒนาออยและน าตาล สถาบนวจยและพฒนา

มหาวทยาลยเกษตรศาสตร ก าแพงแสน ทอนเคราะหออยพนธ ก าแพงแสน 01-12 และก าแพงแสน

94-13 และอาจารยสภกตร ปญญา คณะผลตกรรมการเกษตร มหาวทยาลยแมโจ ทอนเคราะหออย

พนธ สพรรณบร 50 พนธลาวสะดง (เบอร 1) พนธขอนแกน 3 (เบอร 9) พนธขอนแกน 80 (เบอร

19) และพนธ K92 (เบอร 21)

ขอขอบคณนางสาวจนทรเพญ สะระ และนางสาวกนกวรรณ จนทรเพญ ทมสวนรวมใน

การด าเนนการวจยของโครงการน

ผวจย

4

ค ำน ำ

ปญหาภาวะโลกรอนมผลกระทบตอการเจรญเตบโตของพช โดยทหากอณหภม

ของโลกยงเพมขน ดงทมการท านายวา อณหภมของโลกจะเพมขนเฉลย 4 องศาเซลเซยส ในป คศ.

2100 ซงเหตการณนอาจจะน าไปสการสญพนธของพชชนดตางๆ ทไมสามารถปรบตวใหเขากบ

อณหภมทเพมขนได โดยจากการวจยพบวาพชจะสามารถตอบสนองตออณหภมสงใน 2 รปแบบ

คอ การท างานของโปรตนตอบสนองตออณหภมสง (heat shock proteins; HSPs) โดยโปรตนหลก

ทตอบสนองตออณหภม คอ โปรตนควบคมการลอกรหสทตอบสนองตออณหภมสง (heat shock

transcription factors; HSFs) และการเพมหรอลดลงของเอนไซมตางๆ ทเกยวของกบการท างาน

และองคประกอบของเซลล ดงนนในการวจยนจะศกษายนของโปรตน HSFs ของพชพลงงานท

ทนตออณหภมสง คอ ออย เมอไดยน HSFs และทดสอบวายนดงกลาวท างานเพมขนทอณหภมสง

จะท าใหเขาใจถงกลไกการตอบสนองตออณหภมสงของพชพลงงาน และจากการวจยจ านวนมาก

ทพบวา HSFs นอกจากจะเกยวของกบอณหภม แลวยงมบทบาทในการตอบสนองตอความเครยด

ทางกายภาพ (abiotic stress) เชน ความเคมของดน ความแหงแลง ดงนนยน HSFs ทแยกไดอาจจะ

เปนยนของโปรตนทมบทบาทส าคญในการตอบสนองตอความเครยดทางกายภาพของพช

5

วตถประสงคของโครงการวจย

1. เพอศกษาและแยกยนโปรตนควบคมการถอดรหสทตอบสนองตออณหภมสง (heat

shock transcription factors; HSs) จากออย

2. เพอศกษาการแสดงออกของยน HSs ทแยกไดจากออยทอณหภมสง

ประโยชนทคาดวาจะไดรบ

1. ทราบกลไกการตอบสนองตออณหภมทสงขนของออย 2. แนวทางการตอบสนองตออณหภมของพช ตระกลหญา

3. ผลงานวจยทได สามารถเผยแพรในวารสารทางวชาการได

6

การตรวจเอกสาร

ภาวะโลกรอนเปนปญหาทรนแรงมากขน เนองจากการท าลายและใชทรพยากรธรรมชาต

ทไมมการควบคม ตลอดจนจ านวนประชากรทมากขน ท าใหโลกไมสามารถรองรบกบกจกรรม

ตางๆ เหลาน ซงนกวทยาศาสตรขององคกรอตนยมวทยาแหงองกฤษ หรอ MetOffice ท านายวา

โลกจะมอณหภมเฉลยเพมขน 4 องศาเซลเซยส ในป ค.ศ. 2100 โดยท าเปนแผนทโลกรอนแสดง

ถงผลกระทบทจะเกดขนกบพนทตางๆ บนโลก ไดแก ไฟปา พชผล แหลงน า ระดบน าทะเล สตว

น า ความแหงแลง แผนน าแขง พายหมนเขตรอน อณหภมสงอยางมาก และ สขภาพ จากแผนท

ประเทศทวทกภมภาคของโลกจะพบกบปญหาความแหงแลง และประเทศในเอเชยตะวนออก

เฉยงใตจะประสบปญหาพชผลโดยจะเกบเกยวผลผลตไดต ากวา 40 เปอรเซนต (ASTV ผจดการ

ออนไลน) และอกหนงปญหาของโลกคอการขาดแคลนพลงงาน เนองจากปรมาณการใชน ามน

ปโตรเลยมทเพมขน แตปรมาณของน ามนปโตรเลยมทก าลงจะหมดไป

ปจจบนประเทศตาง ๆ ไดใหความส าคญกบการพฒนาพลงงานทดแทน เพอลดสดสวนการ

พงพาน ามนปโตรเลยมทมแนวโนมวาราคาจะเพมขนอยางตอเนอง โดยพลงงานทดแทนททวโลก

ก าลงไดรบความสนใจ คอ เชอเพลงชวภาพ (Bio Fuel) ซงผลตไดจากผลตผลทางการเกษตร ท

ประกอบดวย 2 ประเภทหลก คอ เอทานอล และไบโอดเซล ทงนเอทานอลสวนมากผลตจากออย

และมนส าปะหลง สวนไบโอดเซลใชวตถดบจากปาลมน ามนเปนหลก นอกจากน ยงมพชประเภท

อน ๆ ทสามารถน ามาผลตเปนพลงงานชวภาพได อาท ขาวโพด ถวเหลอง ขาว ขาวฟาง ขาวบารเลย

ขาวสาล สบด า และเรพซด (Rapeseed) เปนตน ซงนโยบายพลงงานไมสงเสรมการใชพชอาหารมา

ผลตเอทานอล ท าใหพชทนาสนใจในการใชผลตเอทานอล คอ ออยและขาวฟางหวาน เนองจาก

หากใชขาวหรอมนส าปะหลงจะตองเปลยนแปงมาเปนน าตาลกอนเขาสการหมกเอทานอล สวน

ออยกบขาวฟางหวานนนจะไดน าตาลเขาสการหมกไดทนท นอกเหนอจากนนออยและขาวฟาง

หวานยงเปนพชเมองรอน ทสามารถเจรญเตบโตไดทอณหภมสง และแหงแลงไดด

ออย (Sugar-cane) มชอวทยาศาสตร คอ Saccharum officinarum Linn. GRAMINEAE (วกพ

เดย สารานกรมเสร) เปนพชอาหารและพชพลงงานทส าคญ มพนทปลก ในป 2549/2550 จ านวน

6.5 ลานไร มผลผลตออย 63.8 ลานตน (เรวต เลศฤทยโยธน)

7

การศกษากลไกการทนตออณหภมสงของพช มการศกษาจ านวนมากในมะเขอเทศและ

พชอะราบดอพซส (Arabidopsis) โดยทโปรตนทตอบสนองตออณหภมสง (heat shock

proteins; HSPs) หรอความรอนของพชนนนนเกยวของกบโปรตน 2 กลม ไดแก กลมแรกเปน

โปรตนควบคมการถอดรหสทตอบสนองตออณหภม (heat shock transcription factors;

HSFs/Hsf) ทจะท าหนาทไปจบกบบรเวณโปรโมเตอรของยนทเปนรหสของโปรตน HSP แลว

กระตนการสรางโปรตนเหลานน และกลมทสองเปนโปรตนอนๆ ทเกยวของกบเอนไซมหรอ

โปรตนโครงสรางทท าใหเซลลไมเสยหายจากความรอน ซงอาจจะไดจากการท างานของ HSFs

หรอจากสารอนๆ ดงแสดงในภาพท 1 ทพบวาโปรตน HSFs เปนโปรตนหลกทส าคญในกลไก

การตอบสนองตอความรอนของพช นอกจากจะเปนโปรตนทควบคมการสรางโปรตน HSPs

ชนดอนๆ แลว โปรตน HSFs ยงเปนโปรตนทตอบสนองตอความเครยดทางกายภาพ (abiotic

stress) ของพชดวยเชนกน (Sachin Kotak et. al. 2007, A. Wahid et. al. 2007 และ Eric Ruelland

and Alain Zachowski. 2010)

โปรตน HSFs ของพชพบวาจะมโครงสรางคลายคลงกน ตวอยางเชนโปรตน HSFs ของ

Arabidopsis (ATHsfA2) ดงภาพท 2 ทโครงสรางจะประกอบดวย 3 บรเวณหลก คอ บรเวณจบด

เอนเอ (DNA binding domain; DBD) ซงจะจบท heat stress element บนบรเวณโปรโมเตอรของ

ยน HSPs ตางๆ ทสนองตออณหภม บรเวณจบกบโปรตน HSFs อน (Hsf oligomerization) และ

บรเวณจบกบเอนไซม RNA polymerase (RNAPII) จากการศกษาเปรยบเทยบโปรตน HSFs จาก

ขาว มะเขอเทศ และ Arabidopsis พบวาสามารถแบงโปรตน HSFs จากพชตามโครงสราง

ออกเปน 3 กลม ไดแก Class A, B และ C (ดงภาพท 3) ซงมรายงานวาโปรตน HSFs class A ม

บทบาทในการตอบสนองตออณหภม เชน โปรตน HsfA1a ของมะเขอเทศ และโปรตน HsfA2

ของ Arabidopsis (P von Koskull-Döring, KD Scharf and L Nover. 2007)

8

ภาพท 1 กลไกการตอบสนองตออณหภมของพช ทโปรตน HSFs เปนตวกลางในการตอบสนองตอ

อณหภมของพช

ทมา Sachin Kotak et. al. 2007

ภาพท 2 โครงสรางของโปรตน HSFs จาก Arabidopsis (AtHsfA2)

ทมา P von Koskull-Döring, KD Scharf and L Nover. 2007

9

จากการศกษาโปรตน HsfA1a ของมะเขอเทศ พบวาเปนโปรตนหลก (master regulator)

ทท าใหมะเขอเทศตอบสนองตออณหภม จาการทดลองในมะเขอเทศทเพมการแสดงออก กบ

มะเขอเทศทกดการแสดงออกของยน HsfA1a พบวาในสภาวะปกตการเจรญเตบโตของมะเขอ

เทศทงสองประเภทไมมความแตกตางกน และเมอเพมอณหภมมะเขอเทศทกดการแสดงออก

ของยน HsfA1a จะไมสามารถเจรญเตบโตและใหผล ซงในมะเขอเทศมยน HSF จ านวน 15 ยน

และพบวายนเหลานนไมสามารถท าหนาทแทน HsfA1a ได แตใน Arabidopsis พบวาการก าจด

ยน HsfA1a และยน HsfA1b ไมกระทบตอการตอบสนองตออณหภมอยางชดเจน ดงนนอาจจะ

กลาวไดวาใน Arabidopsis ไมมโปรตนตอบสนองตออณหภมหลกเหมอนกบในมะเขอเทศ แต

อยางไรกตามการศกษาโดยการใหอณหภมสงอยางตอเนอง พบวาโปรตน HsfA2 มการท างาน

เพมขนและท าใหทงมะเขอเทศและ Arabidopsis ทนตออณหภมทสงขน (P von Koskull-Döring,

KD Scharf and L Nover. 2007)

ภาพท 3 ความสมพนธทาง phylogenetics ของโปรตน HSFs จากขาว มะเขอเทศ และ Arabidopsis

ทมา P von Koskull-Döring, KD Scharf and L Nover. 2007

10

การศกษา heat shock protein (HSPs) ในออยพบ small HSP ขนาด 17.2 และ 17.9 kDa

(Tiroli AO. and Ramos CH., 2007) แตยงไมพบรายงานการวจยของ HSFs จากออย และจากการ

สบคนฐานขอมลพบวามเพยงขอมลล าดบดเอนเอของยน hsf จากการศกษาจโนมของออย

(sugarcane transcription factor database) แตยงไมมการรายงานความแตกตางกนของยนในออย

พนธตางๆ ดงนนในการวจยนจงมวตถประสงคเพอแยกยนของโปรตน HSFs จากออยพนธทนยม

ปลกในประเทศไทย เพอใชเปนขอมลเบองตนทแสดงความสามารถในการตอบสนองตออณหภม

สงของออย ดงนนโครงการวจยจงมวตถประสงคเพอแยกยน HSFs class A และทดสอบการ

แสดงออกของยนดงกลาวในพชทอณหภมสง ซงจะท าใหเขาใจกลไกการตอบสนองตอความ

รอนของพชพลงงานททนรอน

11

อปกรณและวธการ

ตวอยางพนธออยทใชในการทดลอง ไดแก

ตวอยางพนธออยทใชในการทดลอง จ านวน 6 พนธ ไดแก พนธก าแพงแสน 01-12 ททนแลงไดด, ก าแพงแสน 94-13, สพรรณบร 50, ลาวสะดง (เบอร 1), ขอนแกน 3 (เบอร 9), ขอนแกน 80 (เบอร 19), พนธ K92 (เบอร 21)

วธการ

1. การศกษาวธการสกดดเอนเอในจโนมของออย (Genomic DNA)

ออยเปนพชทมเสนใยจ านวนมาก ในการวจยนจงศกษาวธการสกดดเอนเอในจโนม โดยจะทดลองวธการสกด 3 วธ เพอเปรยบเทยบประสทธภาพในการสกด และการน าไปใชในการเพมจ านวนของยน hsf

1.1 การสกดดเอนเอออยดวยวธ mCTAB 1. น าใบออยใสในโกรง แลวเตมไนโตรเจนเหลว จากนนบดใบล าไยใหละเอยด 2. เตมสารสะลาย mCTAB ซงม 1% (v/v) 2-mercaptoethanol ปรมาตร 500 ไมโครลตร

หรอปรบปรมาตรตามความเหมาะสมของปรมาณใบทบดได แลวผสมใหเขากนโดยใชเครอง vortex

3. น าไปบมทอณหภม 65 องศาเซลเซยส เปนเวลา 20 นาท โดยผสมใหเขากนทก 10 และ 20 นาท

4. ปนเหวยงทอณหภมหอง ทความเรว 12,000 รอบตอนาท เปนเวลา 5 นาท 5. ยายเอาสวนใสใสในหลอดใหม โดยหามเอาตะกอนออกมา จากนน เตมเอนไซม RNase

A ความเขมขน 10 ไมโครลตรตอมลลลตร ปรมาตร 1 ไมโครลตร บมทอณหภม 37 องศาเซลเซยส อยางนอยเปนเวลา 30 นาท

6. เตมคลอโรฟอรม ปรมาตร 500 ไมโครลตร หรอ 1 เทาของปรมาตรสารละลาย mCTAB แลวท าการ vortex เลกนอย

7. ปนเหวยงทอณหภมหอง ทความเรว 12,000 รอบตอนาท เปนเวลา 5 นาท

12

8. ยายชนน าดานบนใสในหลอดใหม (ท าซ าในขอท 6-7 จนกระทงชนของโปรตนเหลอนอยทสด) ซงการท าซ าท 2 ถายายชนน ามาปรมาตรเทาไหร ใหเตมคลอโรฟอรมในปรมาตรทเทากน

9. เตม 3 โมลาร Na-acetate, pH 5.2 ปรมาตร 1/10 เทา แลวเตมเอทานอลบรสทธเยน ปรมาตร 2 เทาของสารละลาย (จะสงเกตเหนตะกอนสขาวขน) แลวผสมใหเขากน

10. ปนเหวยงทอณหภม 4 องศาเซลเซยส ทความเรว 12,000 รอบตอนาท เปนเวลา 5 นาท 11. เทเอทานอลทง แลวเตมเอทานอลเยน ความเขมขน 75 เปอรเซนต เพอลางตะกอน (ลาง

ตะกอน จ านวน 2 ครง) 12. ปนเหวยงทอณหภม 4 องศาเซลเซยส ทความเรว 12,000 รอบตอนาท เปนเวลา 2 นาท 13. ตากตะกอนดเอนเอใหแหง แลวละลายดเอนเอกลบดวย 10 มลลโมลาร Tris-HCl, pH 8.0

ปรมาตร 30 ไมโครลตร (ถายงมความหนดของสารละลายมาก ใหเตมเพม)

1.2 การสกดดเอนเอดวยชดสกดส าเรจรป GF-1 (Vivantis) 1. น าใบออยประมาณ 30 มลลกรม มาบดใหละเอยดในไนโตรเจนเหลว 2. เตมบฟเฟอร PL ปรมาตร 280 ไมโครลตร ผสมใหเขากนดวยเครอง vortex ประมาณ 30

วนาท จากนนเตม Proteinase K ปรมาตร 20 ไมโครลตร ผสมใหเขากนดวยการกลบหลอดเบาๆ 3. น าไปบมทอณหภม 65 องศาเซลเซยส ขามคน 4. น าไปปนเหวยงทความเรว 12,000 รอบตอนาท เปนเวลา 5 นาท จากนนดดสวนใสทอย

ดานบนสดใสในหลอดไมโครทวขนาด 1.5 มลลลตร 5. เตมเอนไซม RNase A ปรมาตร 20 ไมโครลตร น าไปบมทอณหภม 37 องศาเซลเซยส เปน

เวลา 30 นาท 6. เตมบฟเฟอร PB ปรมาตร 2 เทา ผสมใหเขากนดวยการกลบหลอด แลวน าไปบมทอณหภม

65 องศาเซลเซยส เปนเวลา 10 นาท 7. โหลดลงคอลมนปรมาตร 900 ไมโครลตร แลวน าไปปนเหวยงทความเรว 12,000 รอบตอ

นาท เปนเวลา 1 นาท เทสวนใสทง 8. เตม Wash buffer ลงในคอลมนปรมาตร 750 ไมโครลตร แลวน าไปปนเหวยงทความเรว

12,000 รอบตอนาท เปนเวลา 1 นาท เทสวนใสทง ท าซ า 2 ครง เพราะเมมเบรนยงมสเขม 9. แลวน าไปปนเหวยงทความเรว 12,000 รอบตอนาท เปนเวลา 2 นาท เพอใหเมมเบรนแหง

13

10. จากนนยายคอลมนลงในหลอดไมโครทวขนาด 1.5 มลลลตร แลวเตม elution buffer ปรมาตร 50 ไมโครลตร บมไวทอณหภมหองประมาณ 10 นาท น าไปปนเหวยงทความเรว 12,000 รอบตอนาท เปนเวลา 1 นาท ท าซ า 2 รอบ เพอชะดเอนเอ

1.3 การสกดดเอนเอดวยชดสกดส าเรจรป โดยใชชด Genomic DNA Purification Kit (Thermo scientific) มขนตอนดงน

1. ฉกใบออยใหมขนาดประมาณ 1X5 cm2 ใสในโกรงเตม liquid nitrogen บดใบออยจนละเอยดเปนผงคลายแปง

2. เตม 400 ไมโครลตร ของ lysis solution ผสมใหละลาย แลวเตม 300 ไมโครลตร ของ 10 mM Tris-HCl, pH 8.0 ดดทงหมดใสในหลอดขนาด 1.5 มลลลตร

3. บมในอางน า (water bath) 65 องศาเซลเซยส นาน 20 นาท พลกหลอดทกๆ 10 นาท 4. ครบเวลาเตม 600 ไมโครลตร ของโคลโรฟอรม ผสมดวยการ vortex 2-3 ครง แลวน าไป

ปนเหวยงทความเรวรอบ 12,000 รอบตอนาท นาน 5 นาท 5. ดดสวนใสดานบนใสในหลอด ใหม เตม 800 ไมโครลตร precipitation* ผสมดวยการ

กลบหลอด (inversion) นาน 1-2 นาท แลวปนเหวยง 12,000 รอบตอนาท นาน 5 นาท * โดยท precipitation เตรยมจาก sterile deionized water ปรมาตร 720 ไมโครลตร ผสม

กบ 10X concentrated precipitation solution ปรมาตร 80 ไมโครลตร ตอ 1 ตวอยาง 6. เท supernatant ทง ละลายตะกอนกลบดวย 100 ไมโครลตร ของ 1.2 M NaCl จนตะกอน

ละลายหมด 7. เตม 1 มลลลตร ice-cold absolute ethanol พลกหลอด บมหลอดท -20 องศาเซลเซยส

ขามคน 8. น าหลอดมาปนเหวยงทความเรว 12,000 รอบตอนาท นาน 5 นาท เท absolute ethanol ทง 9. ลางดวย 1 มลลลตร ice-cold 70% ethanol น าไปปนเหวยง 12,000 รอบตอนาท นาน 5

นาท เท 70% ethanol ทง 10. ท าการลางตะกอนซ า (ขอ 9) อก 1 รอบ 11. ตากตะกอนจนแหง ละลายดเอนเอดวย 50 ไมโครลตร ของ 10 mM Tris-HCl, pH 8.0

14

2. การออกแบบไพรเมอรส าหรบยน heat shock transcription factor (hsf)

การออกแบบไพรเมอรจะสบคนล าดบดเอนเอของยน hsf ของออยจากฐานขอมล transcription factors จากขาว ขาวฟาง ขาวโพด และออย (http://grassius.org/grasstfdb.html) และฐานขอมลของออย (http://planttfdb.cbi.edu.cn/xiehe/web/index.php?sp=so) ล าดบดเอนเอของยน hsf เหลานน ามาใชในการออกแบบไพรเมอรส าหรบการแยกยน hsf ตอไป โดยการออกแบบไพรเมอรดวยโปรแกรม Primer 3 (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/)

3. การแยกยนดวยเทคนค Polymerase chain reaction (PCR)

การแยกยน hsf ดวยเทคนค PCR ดวยใชดเอนเอในจโนมของออยทสกดได จากชดส าเรจรป genomic DNA purification (Thermo Scientific) เปนแมพมพ และใชไพรเมอรทออกแบบส าหรบยน hsf ตางๆ ทออกแบบในตารางท 1 ซงในปฏกรยา PCR ปรมาตร 25 ไมโครลตร ประกอบดวย 1X GeNei Red Dye PCR Master Mix (Merck) ดเอนเอของจโนมประมาณ 100-500 นาโนกรม และไพรเมอร (forward และ reverse) อยางละ 0.5 ไมโครโมลาร จากนนใชสภาวะ PCR ดงน 94 องศาเซลเซยส นาน 5 นาท (pre-denature) จากนนตามดวย 40 รอบของ 94 องศาเซลเซยส นาน 45 วนาท 50 องศาเซลเซยส นาน 30 วนาท 72 องศาเซลเซยส นาน 30 หรอ 60 หรอ 90 วนาท ตามขนาดของยนทตองการแยก โดยหากขนาดประมาณ 500 คเบส ใชเวลา 30 วนาท ขนาดประมาณ 1,000 คเบส ใชเวลา 60 วนาท และหากมขนาดมากกวา 1,000 คเบส ใชเวลา 90 วนาท จากนนตามดวย 72 องศาเซลเซยส นาน 5 นาท (post-extension) เมอปฏกรยาเสรจสน เกบทผลผลตของการท า PCR ทอณหภม -20 องศาเซลเซยส จนกวาจะวเคราะหดวยการท า 1% agarose gel electrophoresis ทยอมเจลดวยส SYBR Safe (Invitrogen) ทเมอใหรงส UV กบเจล แถบดเอนเอจะเรองแสง จากนนบนทกภาพผลการวเคราะห

4. การแยกบรสทธชนดเอนเอ

ยน hsf ทเพมจ านวนไดจากเทคนค PCR น ามาแยกบรสทธดวยชด PureLink® Quick Gel Extraction kit (Invitrogen) ทมขนตอนดงน

1. น าผลผลตทไดจากการท า PCR มาแยกขนาดดวยการท า 1% agarose gel electrophoresis โดยใชกระแสไฟฟา 100 โวลต นาน 30 นาท จากนนน าเจลไปดแถบดเอนเอดวยแสง UV

2. ตดเจลบรเวณทมชนดเอนเอทตองการใสในหลอดทดลองสะอาด ชงน าหนก เตม Gel Solubilization Buffer (L3) ปรมาตร 3 เทาของน าหนกเจล

3. บมหลอดท 50 องศาเซลเซยส นาน 10 นาท กลบหลอดทกๆ 3 นาท

15

4. น าสารละลายทได ในขอ 3 ใสใน Quick Gel Extraction Column 5. น า column ไปปนเหวยงท 12,000 รอบตอนาท 1 นาท เทน าทอยในสวนลางของ column

ทง 6. เตม 500 ไมโครลตร ของ Wash Buffer (W1) ลงใน Column 7. น า column ไปปนเหวยงท 12,000 รอบตอนาท นาน 1 นาท เทน าทอยในสวนลางของ

column ทง 8. ปนเหวยง column เปลาอกครงท 12,000 รอบตอนาท นาน 2 นาท 9. ยาย column ดานบนใสในหลอด microtube ใหม เตม 30 ไมโครลตร ของ Elution Buffer

(E5) ลงใน column บมไว 5 นาท 10. น าไปปนเหวยง 12,000 รอบตอนาท นาน 1 นาท ไดเปนชะครงท 1 (Elute 1) ท าการชะ

ครงท 2 ไดเปน ชะครงท 2 (Elute 2) 11. วเคราะหดเอนเอทไดจากแยกบรสทธ (ชะครงท 1 และ 2) ดวยการท า 1% agarose gel

electrophoresis

5. การเชอมยน hsf กบดเอนเอพาหะ

ยน hsf ทเพมจ านวนจากเทคนค PCR ทไดจากแยกบรสทธ จะน ามาโคลนเขากบดเอนเอพาหะ โดยใชชดพลาสมด pGEM-T easy (Promega) ดงภาพท 4 โดยเชอมตอชนยน hsf ทไดจากการแยกบรสทธกบพลาสมด ดวยเอนไซม T4 DNA ligase (NEB BioLAB) บมทอณหภม 4 องศาเซลเซยส นานขามคน จากนนน าดเอนเอทไดจากการเชอมตอไปถายฝากดเอนเอสายผสมเขาแบคทเรย E. coli DH5 ดวยการท า transformation จากนนคดเลอกโคโลนทมดเอนเอสายผสมดวยสของโคโลน (Blue/white colony selection)

6. การท า Transformation

ดเอนเอทไดจากการเชอมตอนนจะตองน ามาถายฝากเขาเซลลเจาบาน คอ เซลลแบคทเรย E. coli DH5 เพอใหเพมจ านวนภายในเซลล ซงมขนตอนดงน

1. น าดเอนเอสายผสมทไดจากการเชอม 10 ไมโครลตร ใสในหลอดทม competent cell ปรมาตร 200 ไมโครลตร บมไวบนน าแขง 20 นาท

2. เอาอาหารแขง LB agar ทมแอมพซลน 100 ไมโครกรม/มลลลตร รอใหแหง จากนนทาสาร X-gal และ IPTG อยางละ 40 ไมโครลตร บนอาหารเกลยใหทว จนแหง

3. น าหลอดจากขอ 1 บมใน water bath อณหภม 42 องศาเซลเซยส นาน 1 นาท

16

4. เมอครบเวลา น าไปบมในน าแขงทนท แลวเตมอาหารเหลว (LB Broth ธรรมดา) ปรมาตร 800 ไมโครลตร บม และเขยาหลอดท 37องศาเซลเซยส นาน 40-90 นาท

5. ปนเชอ 12,000 รอบตอนาท นาน 1 นาท ดดสวนใสดานบนทง ใหเหลอประมาณ 200 ไมโครลตร ปเปตขนลงเพอใหตะกอนละลาย จากนนน าไปเกลยบนอาหารแขง LB ทเตรยมในขอ 2 รอ ใหแหง

6. น าจานเพาะเลยง ไปบมท 37 องศาเซลเซยส ขามคน สงเกตสของโคโลน ซงโคโลนสขาวจะเปนโคโลนทมดเอนเอสายผสม สวนโคโลนสฟาจะเปนโคโลนทมพลาสมด pGEM-T easy

ภาพท 4 แผนทของพลาสมด pGEM-T easy (Promega)

7. การคดเลอกดเอนเอสายผสมจากขนาด (Rapid size screening)

เมอไดโคโลนแลว จะน าโคโลนสขาวมาคดเลอกดวยขนาด โดยหากเปนดเอนเอสายผสมจะตองเคลอนทในเจลไดชากวาดเอนเอทไดจากโคโลนสฟา ซงการคดเลอกจะมขนตอน ดงน

1. เตรยมอาหารเหลว LB ทมยาปฎชวนะแอมพซลน ไมโครกรม/มลลลตร ปรมาตร 5 มลลลตร

2. น าปากคบไปเผา แลวคบไมจมฟนไปจม โคโลนสขาว แลวน าไมจมฟนไปใสในอาหารเหลว LB ทมยาปฏชวนะแอมพซลน ทเตรยมไว

3. น าไปเขยา 150 รอบตอนาท ทอณหภม 37องศาเซลเซยส เปนเวลา 16-18 ชวโมง 4. ดดเชอมา 100 ไมโครลตร น าไปปนเหวยงท 12,000 รอบตอนาท นาน 1 นาท ทงสวนน า

17

5. เตม 50 ไมโครลตร Lysis buffer (5 mM EDTA,10%w/v sucrose, 0.25%w/v SDS, 100 mM NaOH, 60 mM KCl, 0.05%w/v bromophenol blue) ผสมดวยการ Vortex

6. บมท 37 องศาเซลเซยส นาน 5 นาท 7. ครบเวลาบมน าแขง 5 นาท ปน 12,000 รอบตอนาท นาน 1 นาท 8. ดดของเหลว 20 ไมโครลตร ไปวเคราะหดวยการท า 1% agarose gel electrophoresis ดวย

กระแสไฟฟา 100 โวลต นาน 60 นาท

8. การสกดดเอนเอสายผสมดวยวธการ CTAB Mini Plasmid Preparation

1. ดดเชอทเลยงไวทผานการท า Rapid size screening วานาจะเปนดเอนเอสายผสมปรมาตร 1.5 มลลลตร ใสหลอด 1.5 มลลลตร จากนนน าไปปนเหวยงทความเรว 12,000 รอบตอนาท เปนเวลา 1 นาท ทงสวนใส ท าซ าเชนน 3 ครง

2. เตม STET Buffer ปรมาตร 500 ไมโครลตร และเตม Iysozyme ความเขมขน 1 มลลกรม/มลลลตร ปรมาตร 40 ไมโครลตร แลวน าไป vortex เพอผสมตะกอนเซลล

3. บมทอณหภมหองเปนเวลา 10 นาท และบมท 95 องศาเซลเซยส เปนเวลา 1 นาท 4. น าไปปนเหวยงทความเรว 12,000 รอบตอนาท เปนเวลา 15 นาท จากนนยายสวนใสไป

ไวในหลอดใหม (ทงหลอดเกา) 5. เตม 5% CTAB ปรมาตร 20 ไมโครลตร พลกหลอดไปมาเพอผสม แลวบมทอณหภมหอง

เปนเวลา 5 นาท 6. น าไปปนเหวยงทความเรว 12,000 รอบตอนาท เปนเวลา 15 นาท ทงสวนน า 7. เตม 1.2 M NaCl ปรมาตร 500 ไมโครลตร และเตม RNase ความเขมขน 10 มลลกรม/

มลลลตร ปรมาตร 5 ไมโครลตร แลวบมทอณหภม 37 องศาเซลเซยส เปนเวลา 30 นาท 8. เตมโคลโรฟอรม 1 ปรมาตร ( 510 ไมโครลตร) ผสม แลวน าไปปนเหวยงทความเรว

12,000 รอบตอนาท เปนเวลา 5 นาท ดดสวนบนไวหลอดใหม (400 ไมโครลตร) ทงหลอดเกา 9. เตม 3 M โซเดยมอะซเตต pH 5.6 0.1 ปรมาตร (40 ไมโครลตร) และเตม 95% เอทานอล 2

ปรมาตร (880 ไมโครลตร) 10. บมทอณหภม -20 องศาเซลเซยส ขามคน 11. น าไปปนเหวยงทความเรว 12,000 รอบตอนาท เปนเวลา 20 นาท ทงสวนน า ระวงอยาให

ตะกอนดเอนเอหลด 12. เตม 70% เอทานอล ปรมาตร 1 มลลลตร แลวน าไปปนเหวยงทความเรว 12,000 รอบตอ

นาท เปนเวลา 5 นาท ทงสวนน า ท าเชนน 2 ครง เพอลางตะกอนดเอนเอ

18

13. ตงทงไวใหตะกอนแหง และละลายดเอนเอทสกดไดดวย 10 mM Tris-HCl pH 8.0 ปรมาตร 30 ไมโครลตร

9. การวเคราะหล าดบดเอนเอ

ยน hsf ทเพมจ านวนได น าไปแยกบรสทธและโคลน แลวน าไปหาล าดบดเอนเอทบรษท 1st Base (Malaysia) หากยนมขนาดมากกวา 0.5 กโลเบส จะหาล าดบดเอนเอ 2 ทศทาง แลวน าผลการหาล าดบดเอนเอ จะน ามาสรางสาย contiguous sequence และแปลเปนล าดบกรดอะมโนดวยโปรแกรม BioEdit จากนนน าล าดบดเอนเอและล าดบกรดอะมโนทไดมาเปรยบเทยบกนดวยโปรแกรม ClustalX และ GeneDoc การเปรยบเทยบกบขอมลในฐานขอมล GenBank ดวยโปรแกรม BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) นอกจากนล าดบกรดอะมโนน าไปวเคราะหบรเวณ motif ของโปรตนดวยการเปรยบเทยบกบฐานขอมลโปรตน Pfam (http://pfam.sanger.ac.uk/search) (Marco et al., 2012)

10. การศกษาการแสดงออกของยนจากใบออยดวยเทคนค RT-PCR การแสดงออกของยน ScHSF6 และ ScHSF10 โดยการขดหนอของออยพนธสพรรณบร 50

น ามาเลยงในน าทอณหภม 28 องศาเซลเซยส แลวตดใบเกบไวท -20 องศาเซลเซยส เพอในการศกษาการแสดงออก จากนนน าหนอเดยวกนมาเพาะเลยงทอณหภม 37, 42, 45 และ 48 องศาเซลเซยส นาน 24 ชวโมง ในตทใหแสง ในการทดลองนจะใชหนอออยเดยวกน ในแตละอณหภมจะเพาะเลยงออยใหกลบมาในสภาพปกตกอนจะน าไปเลยงทอณหภมอนๆ เชน เมอเลยงทอณหภม 42 องศาเซลเซยส 24 ชวโมง ตดใบ เพาะเลยงหนอออยทอณหภมหอง 4-5 วน เพอใหออยกลบสสภาวะปกต จากนนจงเลยงท 45 องศาเซลเซยส เมอครบก าหนดเวลาจะตดใบออย ลางดวยน าใหสะอาดแลว เกบใบออยท -20 องศาเซลเซยส ทนท เพอในการศกษาการแสดงออก จากนนน าใบออยทเตรยมไวมาสกด total RNA ดวยน ายา TriZol reagent (Invitrogen) แลวน า total RNA มาก าจดดเอนเอในจโนม (genomic DNA) ดวยชดส าเรจรป Thermo Scientific RapidOut DNA Removal Kit (Thermo Scientific) น า total RNA ทเตรยมได มาใชในการท า reverse transcription ดวยชดส าเรจรป RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Scientific) แลวน าใชท า PCR ซงในปฏกรยา PCR ปรมาตร 25 ไมโครลตร ประกอบดวย 1X GeNei Red Dye PCR Master Mix (Merck) ดเอนเอของจโนมประมาณ 100-500 นาโนกรม และไพรเมอร (forward และ reverse) อยางละ 0.5 ไมโครโมลาร และไพรเมอรทใชในการทดลองน แสดงในตารางท 1 โดยสภาวะทใช 94 องศาเซลเซยส นาน 30 วนาท 50 องศาเซลเซยส นาน 30 วนาท 72 องศาเซลเซยส นาน 30 วนาท จ านวน 28 รอบ ตอไป จากนนวเคราะหการเพมจ านวนดวยการท า 1% agarose gel

19

electrophoresis แลวน าปรมาณของยนทเพมมาเปรยบเทยบการแสดงออกเทยบกบการแสดงของยน actin ทออกแบบจากยน actin ของขาว โดยการแสดงอกของยน actin เปนตวควบคมภายใน เนองจากเปนยนทมการแสดงคงท และแสดงออกในเนอเยอทกชนด ทเตรยมวธการเดยวกน

ตารางท 1 ล าดบดเอนเอของไพรเมอรทใชในเทคนค RT-PCR

ยน ล าดบดเอนเอของไพรเมอร (5 ไป 3) ขนาดของผลผลต (bp)

ScHSF5 Forward; CCACATCGCGGCCACTTGTT 517 Reverse; AGCGCGGCAGTGAAGGGATT

ScHSF6 Forward1; CCAGCTCGTCCCACACATC 471 Reverse; CCGCCAAAGGATCCCAGTG

actin (ABO47313)

Forward; TGATGCGCCCAGGGCTGTCT 276 Reverse; CGATTGGCCTTGGGGTTGAG

20

ผลการวจย

1. การศกษาวธการสกดดเอนเอในจโนมของออย (Genomic DNA)

การสกดดเอนเอในจโนมจากใบออยจะเปรยบเทยบวธการสกด 3 วธ คอ วธการ mCTAB ชดส าเรจรป GF-1 (Vivantis) และ ชดส าเรจรป Genomic DNA Purification Kit (Thermo scientific) จากนนวเคราะหปรมาณของดเอนเอทสกดไดดวย 1% agarose gel electrophoresis ดวยกระแส 100 โวลต นาน 60 นาท จากนนน าไปใชเปนดเอนเอแมพมพในการเพมจ านวนดเอนเอดวยเทคนค PCR เพอวเคราะหคณภาพของดเอนเอทสกดวาสามารถใชในการท า PCR

การสกดดเอนเอในจโนมของออยดวยชดสกด ส าเรจรป GF-1 (Vivantis) เมอน าดเอนเอทสกดไดมาวเคราะหดวย 1% agarose gel electrophoresis พบวาไดดเอนเอปรมาณนอย ดงภาพท 5

ภาพท 5 ผลการท า 1% agarose gel electrophoresis ของดเอนเอในจโนมทไดจากการสกดดวยชดสกด GF-1 (vivantis) จากนนน าดเอนเอของออยทสกดไดดวยชดสกด GF-1 (vivantis) มาเพมปรมาณดวยเทคนค PCR ดวยไพรเมอร PTSo00732, PTSo00733 และ PTSo00734 หลงจากไดผล PCR แลวจงน าผลทไดไปตรวจสอบดวย 1% agarose gel electrophoresis พบวาไมสามารถเพมปรมาณดเอนเอไดทง 3 ไพรเมอร (ไมแสดงขอมล)

เมอท าการเปรยบเทยบวธการสกดระหวางการใชชด Genomic DNA Purification Kit (Thermo scientific) กบใชวธ mCTAB น าดเอนเอทสกดไดมาวเคราะหดวย 1% agarose gel electrophoresis ผลของการเปรยบเทยบวธการสกดดเอนเอในจโนม (genomic DNA) ของออย

21

ไดผลการทดลอง ดงภาพท 6 พบวา ดเอนเอทสกดไดจากทงสองวธมการแตกหกของดเอนเอ สงเกตจากแถบสวางทไดจะมการไลยาวลงมาดานลางเปนปน แตหากพจารณาจากปรมาณ จะเหนไดวาการสกดโดยใชชดส าเรจรป จะไดดเอนเอปรมาณมากกวาการใชวธการ mCTAB

ภาพท 6 ผลการท า agarosegel electrophoresis ทไดจากการเปรยบเทยบระหวางการสกดโดยใชชด Genomic DNA Purification Kit กบวธ mCTAB ของดเอนเอในจโนมจากออยพนธตางๆ เลนท M คอ 1Kb Plus DNA Ladder จ านวน 3 ไมโครลตร และผสมดเอนเอตวอยางทไดจากการสกด ปรมาตร 2 ไมโครลตร กบ 6X loadind dye ปรมาตร 1 ไมโครลตร การสกดโดยใชชด Genomic DNA Purification Kit เลนท 1 คอ ลาวสะดง เลนท 2 คอ ขอนแกน 3 เลนท 3 คอ ขอนแกน 80 เลนท 4 คอ K92 เลนท 5 คอ สพรรณบร 50 เลนท 6 คอ ก าแพงแสน 01-12 เลนท 7 คอ ก าแพงแสน 49-13 การสกดโดยใช mCTAB เลนท 8 คอ ลาวสะดง เลนท 9 คอ ขอนแกน 3 เลนท 10 คอ ขอนแกน 80 เลนท 11 คอ K92 เลนท 12 คอ สพรรณบร 50 เลนท 13 คอ ก าแพงแสน 01-12 เลนท 14 คอ ก าแพงแสน 49-13

จากนนวเคราะหคณภาพของดเอนเอในจโนมทสกดได โดยเลอกตวอยางดเอนเอในจโนมทไดจากการสกดทง 2 วธ ดวยชด Genomic DNA Purification Kit (Thermo scientific) ทงหมด 5 พนธ คอ สพรรณบร 50, ก าแพงแสน 01-12, ก าแพงแสน 94-13, ลาวสะดง และ ขอนแกน 80 และวธ mCTAB ทงหมด 7 พนธ คอ สพรรณบร 50, ก าแพงแสน 01-12, ก าแพงแสน94-13, ลาวสะดง, ขอนแกน 3, ขอนแกน 80, และพนธ K92 มาท า PCR ดวยไพรเมอร 2 ค คอ ScHSF5 และ ScHSF6 เมอน าผลการท า PCR มาวเคราะหดวยการท า 1% agarose gel electrophoresis ใชกระแส 100 โวลต

22

นาน 30 นาท พบวาสามารถเพมจ านวนดเอนเอ ไดจากไพรเมอร จ านวน 2 ค ไดแก ScHSF5, ScHSF6 ดงภาพท 7 และ 8

ภาพท 7 ผลการท า 1% agarose gel electrophoresis ของผลผลต PCR ของยน ScHSF5 จากดเอนเอในจโนมจากออยพนธตางๆ เปรยบเทยบระหวางการสกดโดยวธ mCTAB (เลน 1-8) กบ ชด Genomic DNA Purification Kit (เลน 9-14) เลนท M คอ 1Kb Plus DNA Ladder เลนท 1 คอ ลาวสะดง เลนท 2 คอ ขอนแกน 3 เลนท 3 คอ ขอนแกน 80 เลนท 4 คอ K92 เลนท 5 คอ สพรรณบร 50 เลนท 6 คอ ก าแพงแสน 01-12 เลนท 7 คอ ก าแพงแสน 49-13 เลนท 8 คอ น า (ตวควบคม) เลนท 9 คอ ลาวสะดง เลนท 10 คอ ขอนแกน 80 เลนท 11 คอ ก าแพงแสน 01-12 เลนท 12 คอ ก าแพงแสน 94-13 เลนท 13 คอ สพรรณบร 50 เลนท 14 คอ น า (ตวควบคม)

จากการเพมจ านวนดเอนเอ พบวาดเอนเอในจโนมทสกดไดจากชดส าเรจรป Genomic DNA Purification Kit (Thermo scientific) จะสามารถเพมจ านวนดเอนเอไดดกวาการสกดดวยวธการ mCTAB ในขณะทดเอนเอทสกดดวยชดสกด GF-1 (Vivantis) นนนอกจากจะไดดเอนเอปรมาณนอยแลว ยงไมสามารถเพมจ านวนดเอนเอดวยเทคนค PCR ได

ดงนนจากผลการวเคราะหปรมาณและคณภาพของดเอนเอในจโนมทไดจากวธการสกด ทง 3 วธ สามารถสรปไดวาการสกดดวยชดส าเรจรป Genomic DNA Purification Kit (Thermo scientific) นนใหปรมาณและคณภาพดเอนเอในจโนมดกวาวธการสกดอน ท าใหในการทดลองสวนตอไปจะใชดเอนเอในจโนมทไดจากการสกดดวยชดส าเรจรป Genomic DNA Purification Kit (Thermo scientific)

23

ภาพท 8 ผลการท า 1% agarose gel electrophoresis ของผลผลต PCR ของยน ScHSF6 จากดเอนเอในจโนมของออยพนธตางๆ เปรยบเทยบระหวางการสกดโดยวธ mCTAB (เลน 1-8) กบ ชด Genomic DNA Purification Kit (เลน 9-14) เลนท M คอ 1 Kb Plus DNA Ladder เลนท 1 คอ ลาวสะดง เลนท 2 คอ ขอนแกน 3 เลนท 3 คอ ขอนแกน 80 เลนท 4 คอ K92 เลนท 5 คอ สพรรณบร 50 เลนท 6 คอ ก าแพงแสน 01-12 เลนท 7 คอ ก าแพงแสน 94-13 เลนท 8 คอ น า (ตวควบคม) เลนท 9 คอ ลาวสะดง เลนท 10 คอ ขอนแกน 80 เลนท 11 คอ ก าแพงแสน 01-12 เลนท 12 คอ ก าแพงแสน 49-13 เลนท 13 คอ สพรรณบร 50 เลนท 14 คอ น า (ตวควบคม)

2. การออกแบบไพรเมอรเพอใชในการแยกยน hsf

ยน hsf ของออยไดจากฐานขอมล transcription factors จากขาว ขาวฟาง ขาวโพด และออย ทรายงานจ านวน 12 ยน ไดแก ScHSF1, ScHSF2, ScHSF5, ScHSF6, ScHSF7, ScHSF10, ScHSF11, ScHSF12, ScHSF13, ScHSF15, ScHSF16, ScHSF18 และฐานขอมลของออย จ านวน 4 ยน ไดแก PTSo00731, PTSo00732, PTSo00733 และ PTSo00734 ล าดบดเอนเอของยน hsf เหลานน ามาใชในการออกแบบไพรเมอรส าหรบการแยกยน hsf ดวยการเพมจ านวนดวยเทคนค PCR โดยล าดบดเอนเของไพรเมอรและขนาดของชนดเอนเอทคาดวาจะได แสดงในตารางท 2

24

ตารางท 2 ล าดบดเอนเอและขนาดของผลผลตทไดจาก PCR ของไพรเมอรส าหรบยน hsf ตางๆ


ScHSF1 Forward; TGCGACGATTTCCTCCGGTG 538 Reverse; TCCGAGGCTCCGATTCTCC

ScHSF2 Forward; GCCCACCTCCATTGCCACAA 1,023 Reverse; TTCGGGAGGGAGGGGCAACTAT

ScHSF5 Forward; CCACATCGCGGCCACTTGTT 517 Reverse; AGCGCGGCAGTGAAGGGATT

ScHSF6 Forward; AGAGCCAGAGGTGGCGTTATAGTTG 835 Reverse; CCGCCAAAGGATCCCAGTG

ScHSF7 Forward; CAGCTCCAGGTGCGGAAGAA 1,774 Reverse; CATGCAGAAGGTCCTCCCAG

ScHSF710 Forward; GTTGTTGTGCTTAAAGAGGC 435 Reverse; AAATATCCTAGATCGCCGAC

ScHSF11 Forward; CTGGAAGCTACGGTTTCGCC 565 Reverse; ACCTTCCGGCGGTGTATGTC

ScHSF12 Forward; CTCATCGCAGGCCTCGCAGC 367 Reverse; TGCCGGAGGAAGGTGGAGAA

ScHSF13 Forward; GTAGTCGCCGTTGCTCTCGT 1,010 Reverse; TCTATCTCTTCCCGCGCCGA

ScHSF15 Forward; GCATCACCCGTCATGGAGGT 502 Reverse; CCCCTGACTGCTGCTGATGA

ScHSF16 Forward; GCCTCCGGCTTTTCGATCGA 1,369 Reverse; CTGCTGCCAAAAGCCATCGT

ScHSF718 Forward; GAGAGGTAGGTAGCCGGAGCTA 912 Reverse; GTTCTCGCTGGTCAGCTGGT

PTSo00731 Forward; ATGGATGTGCTCCATGACG 942 Reverse; CTACATCTTCATATCATCGTGACC

25


PTSo00732 Forward; ATGGAAGCACAGCCAAGAAAAT 652 Reverse; CTACTCATAGTGCTCCACAAACTGC

PTSo00733 Forward; ATGGAGGCGGGCGG 517 Reverse; TCACCGATCCTCCAAAAAGAT

PTSo00734 Forward; CGGGAACAGCTTCGTGGTGT 746 Reverse; AATACTTCTCACCAGTGCATAGCTG

3. การแยกยนดวยเทคนค polymerase chain reaction (PCR)

น าตวอยางดเอนเอในจโนมมาเพมจ านวนดวยไพรเมอรทออกแบบส าหรบยน hsf ตางๆ นน เมอเพมจ านวนดวยเทคนค PCR แลว น ามาวเคราะหดวยเทคนค 1% agarose gel electrophoresis พบวาไพรเมอรส าหรบยน ScHSF1, ScHSF2, ScHSF7, ScHSF11, ScHSF12, ScHSF13, ScHSF15, ScHSF16, ScHSF18 ไมพบการเพมจ านวนของดเอนเอ (ไมแสดงขอมล) สวนไพรเมอรส าหรบยน ScHSF5, ScHSF6 และ ScHSF10 สามารถเพมจ านวนได ดงภาพท 9, 10 และ 11

ภาพท 9 ผลการท า 1% agarose gel electrophoresis ของผลผลต PCR ของยน ScHSF5 จากดเอนเอในจโนม ของ ออยพนธตางๆ เลนท M คอ GeneRuler 1Kb Plus DNA Ladder เลนท 1 คอ ก าแพงแสน 01-12 เลนท 2 คอ ก าแพงแสน 49-13 เลนท 3 คอ สพรรณบร 50 เลนท 4 คอ ลาวสะดง เลนท 5 คอ ขอนแกน 3 เลนท 6 คอ ขอนแกน 80 เลนท 7 คอ K92 เลนท 8 คอ น า (ตวควบคม)

26

ภาพท 10 ผลการท า 1%agarose gel electrophoresis ของผลผลต PCR ของยน ScHSF6 จากดเอนเอในจโนมของออยพนธตางๆ เลนท M คอ GeneRuler 1Kb Plus DNA Ladder เลนท 1 คอ ก าแพงแสน 01-12 เลนท 2 คอ ก าแพงแสน 49-13 เลนท 3 คอ สพรรณบร 50 เลนท 4 คอ ลาวสะดง เลนท 5 คอ ขอนแกน 3 เลนท 6 คอ ขอนแกน 80 เลนท 7 คอ K92 เลนท 8 คอ น า (ตวควบคม)

ภาพท 11 ผลการท า 1% agarose gel electrophoresis ของผลผลต PCR ของยน ScHSF10 จากดเอนเอในจโนมของออยพนธตางๆ เลนท M คอ GeneRuler 1Kb Plus DNA Ladder เลนท 1 คอ ก าแพงแสน 01-12 เลนท 2 คอ ก าแพงแสน 49-13 เลนท 3 คอ สพรรณบร 50 เลนท 4 คอ ลาวสะดง เลนท 5 คอ ขอนแกน 3 เลนท 6 คอ ขอนแกน 80 เลนท 7 คอ K92 เลนท 8 คอ น า (ตวควบคม)

27

ส าหรบส าหรบยน PTSo00731 - PTSo00734 จงไดออกแบบไพรเมอรส าหรบยนทง 4 จากนนใชในการเพมจ านวนยนจากดเอนเอในจโนมของออย จ านวน 7 สายพนธดวยเทคนค PCR พบวาออยทกพนธ มยน PTSo00731 และยน PTSo00732 ดงภาพท 12 และ 13 แตพบยน PTSo00733 ในออยบางสายพนธ และไมพบยน PTSo00734 ดงภาพท 14

ภาพท 12 ผลการท า 1% agarose gel electrophoresis ของไพรเมอร PTSo00731 จากออยพนธตางๆ โดยชอง M คอดเอนเอมาตรฐาน เลนท 1 คอ ก าแพงแสน 01-12 เลนท 2 ก าแพงแสน 94-13 เลนท 3 คอ ขอนแกน 3 เลนท 4 คอ ขอนแกน 80 เลนท 5 คอ K92 เลนท 6 คอ ลาวสะดง เลนท คอ สพรรณบร 50 และ เลนท 8 คอ น า (ตวควบคม)

ภาพท 13 ผลการท า 1% agarose gel electrophoresis ของไพรเมอร PTSo00732 จากออยพนธตางๆ เลนท M คอ GeneRuler 1Kb Plus DNA Ladder เลนท 1 คอ ก าแพงแสน 01-12 เลนท 2 คอ ก าแพงแสน 49-13 เลนท 3 คอ สพรรณบร 50 เลนท 4 คอ ลาวสะดง เลนท 5 คอ ขอนแกน 3 เลนท 6 คอ ขอนแกน 80 เลนท 7 คอ K92 เลนท 8 คอ น า (ตวควบคม)

28

ภาพท 14 ผลการท า 1% agarose gel electrophoresis ของไพรเมอร PTSo00733 (เลนท 1-8) และ

07334 (เลนท 9-16) โดยชอง M คอดเอนเอมาตรฐาน เลนท 1 และ 9 คอกแพงแสน 01-12 เลนท 2

และ 10 คอก าแพงแสน 94-13 เลนท 3 และ 11 คอขอนแกน 3 เลนท 4 และ 12 คอ ขอนแกน 80 เลน

ท 5 และ 13 คอ K92 เลนท 6และ 14 คอ ลาวสะดง เลนท 7 และ 15 คอ สพรรณบร 50 และ เลนท 8

และ 16 คอ น า (ตวควบคม)

จากการแยกยน hsf ของออยดวยเทคนค PCR พบวาเพมจ านวนไดชนดเอนเอไดจากไพรเมอร ของยน 4 ยน ไดแก ยน ScHSF5, ScHSF6 ScHSF10, PTSo00731, PTSo00732 และ PTSo00733 ซงชนดเอนเอเหลานจะน ามาแยกบรสทธแลวสงไปอานล าดบดเอนเอตอไปเพอวเคราะหวาเปนยน hsf ตอไป 4. การวเคราะหล าดบดเอนเอของชนดเอนเอทไดจากการท า PCR

ชนดเอนเอทไดจากการเพมจ านวนดเอนเอดวยไพรเมอรทง 6 ยน (ScHSF5, ScHSF6 ScHSF10, PTSo00731, PTSo00732 และ PTSo00733) เพอแยกบรสทธ เมอน าไปหาล าดบดเอนเอ พบวาไมสามารถหาล าดบไดจากชนดเอนเอของไพรเมอร PTSo00731 และไพรเมอร PTSo00733 (ไมแสดงขอมล) สามารถหาล าดบดเอนเอของชนดเอนเอจากไพรเมอร ScHSF5 จากออยพนธก าแพงแสน 94-13 ทมความยาว 388 คเบส และชนดเอนเอจากไพรเมอร ScHSF5 จากออยพนธสพรรณบร 50 นนหาไดเพยง 330 คเบส เมอน าไปเปรยบเทยบกบขอมลในฐานขอมล GenBank ดวยการท า BLAST พบวาเหมอนกบ retrotransposon ของจโนมออย (Saccharum hybrid cultivar

29

R570 isolate RLG_scDEL_5.1 retrotransposon, accession number JN800047.1) แตไมเหมอนยน hsf

ล าดบดเอนเอจากไพรเมอร ScHSF6 จากออยพนธก าแพงแสน 94-13 ความยาว 719 คเบส ผลการ BLAST พบวาเหมอนกบยน hsf ของขาวโพด (Zea mays clone UT1392 HSF transcription factor mRNA, accession number HQ858724) และล าดบดเอนเอจากไพรเมอร ScHSF10 จากออยพนธสพรรณบร 50 ความยาว 437 คเบส ผลการ BLAST พบวาเหมอนกบยนพบวาเหมอนกบยน hsf ของขาวโพด (Zea mays heat shock factor protein HSF30, accession number NM_001153656) เหมอนกบยน hsf

ล าดบดเอนเอทไดจากไพรเมอร PTSo00732 นนสามารถหาไดจากออย 4 พนธ ไดแก ก าแพงแสน 01-12, ก าแพงแสน 94-13, พนธ K92 เมอน าไปเปรยบเทยบกบฐานขอมล พบวาเหมอนกบ ยน hsf ของขาวโพด (Zea mays clone UT1392 HSF transcription factor mRNA, accession number HQ858724) และจากการเปรยบเทยบล าดบดเอนเอของดเอนเอทไดจากไพรเมอร PTSo00732 และ ScHSF6 พบวามล าดบดเอนเอเหมอนกน ดงภาพท 15 แสดงวาดเอนเอทไดจากไพรเมอร ScHSF6 นนเหมอนกบดเอนเอทไดจากไพรเมอร PTSo00732 ดงนนจงเลอกศกษาเฉพาะยน ScHSF6 ในการทดลองตอไป

ภาพท 15 ผลการเปรยบเทยบล าดบดเอนเอทไดจากไพรเมอร PTSo00732 (732) และ ScHSF6 (Sc6)

นอกจากนผลการหาล าดบดเอนเอของยน ScHF6 จากออยพนธสพรรณบร 50 พบวาสวนแรกมล าดบดเอนเอแตกตางกน เปนบรเวณทชดวยลกศรในภาพท 16 และสวนหลงมล าดบดเอนเอแบบเดยว แสดงใหเหนวายน hsf นจะมจ านวนมากกวา 1 ล าดบในจโนมของออยพนธน และเนองจากออยเปนพชทมโครโมโซมหลายชด (polyploidy) ซงแตละชดนาจะมยน ScHSF6 ทแตกตางกนดานหนงของยน นอกจากนผลล าดบดเอนเอของยน ScHSF6 และScHSF10 ของออยพนธอนๆ แสดงผลเชนเดยวกน

30

ภาพท 16 ภาพ chromatogram ของผลการหาล าดบดเอนเอทไดจากไพรเมอร ScHSF6 จากออยพนธสพรรณบร 50

การวเคราะหล าดบดเอนเอพบวาสามารถแยกยน hsf ของออย จ านวน 2 ยน ไดแก ScHSF6 และ ScHSF10 ซงชนยนทงสองนจะน ามาโคลนเขาดเอนเอพาหะ เพอแยกล าดบดเอนเอทผสมกนออก เพอแสดงใหเหนวายนทงสองนมมากกวา 1 ล าดบ นนเนองมาจากออยเปนพชทมโครโมโซมหลายชด (polyploidy)

5. การโคลนยน ScHSF6 และ ScHSF10

เนองจากออยเปนพชทมโครโมโซมหลายชด (polyploidy) จงคาดวายน ScHSF6 และ ScHSF10 นาจะมจ านวนมากกวา 1 แบบในออยแตละสายพนธ ท าใหเมอโคลนชนดเอนเอ ไดโคลนทมดเอนเอสายผสมของยน ScHSF6 จ านวน 23 โคลน ยน ScHSF10 จ านวน 10 โคลน ซงน าไปคดเลอกดเอนเอสายผสมทแตกตางกนดวยการตดดวยเอนไซมตดจ าเพาะ HincII, PvuII และ KpnI เพอสงไปหาล าดบดเอนเอ

โดยพบวาจากโคลน ScHSF6 จ านวน 23 โคลน เปนโคลนทมดเอนเอสายผสมของยน ScHSF6 ทแตกตางกน 11 โคลน ซงไดมาจากออย จ านวน 3 พนธ ไดแก พนธลาวสะดง จ านวน 4 โคลน พนธขอนแกน 3 จ านวน 4 โคลน และพนธขอนแกน 80 จ านวน 3 โคลน

สวนโคลน ScHSF10 จ านวน 7 โคลน พบวาเปนโคลนทมดเอนเอสายผสมของยน ScHSF10 ทแตกตางกน 5 โคลน จากออย จ านวน 3 พนธ ไดแก พนธลาวสะดง จ านวน 3 โคลน พนธขอนแกน 3 จ านวน 1 โคลน และก าแพงแสน 01-12 จ านวน 1 โคลน ซงจากล าดบดเอนเอและจ านวนโคลนแสดงใหเหนวายน ScHSF6 นนจะมจ านวนแบบมากกวายน ScHSF10

31

6. การวเคราะหล าดบดเอนเอของยน ScHSF6 และ ScHSF10 ทไดจากการโคลน

น าล าดบดเอนเอของยนทโคลนไดมาเปรยบเทยบกน ซงผลการเปรยบเทยบล าดบดเอนเอของยน ScHSF6 ทแยกได (ภาพท 17a) จากออยพนธเดยวกนมล าดบ ดเอนเอทแตกตางกน และมความเหมอนกนกบยนเดยวกนจากออยพนธอน โดยยน ScHSF6 ทแยกไดจากออย 3 พนธ จ านวน 11 โคลน มความเหมอนกน 97-99 เปอรเซนต พบล าดบดเอนเอทแตกตาง 29 ต าแหนง ซงอยในสวนของยน 20 ต าแหนง โดย มเพยง 9 ต าแหนงเทานนทมผลเปลยนแปลงกรดอะมโน และในสวนของการเปรยบเทยบล าดบกรดอะมโน (ภาพท 17b) พบความเหมอนของโปรตนเปน 95-100 เปอรเซนต

สวนผลการเปรยบเทยบล าดบดเอนเอของยน ScHSF10 ทแยกได (ภาพท 18a) จากออยพนธเดยวกนมล าดบดเอนเอทแตกตางกน และมความเหมอนกนกบยนเดยวกนจากออยพนธอน โดยยน ScHSF10 ทแยกไดจากออย 3 พนธ จ านวน 5 โคลน มความเหมอนกน 97-99 เปอรเซนต ซงมล าดบดเอนเอแตกตางกน 12 ต าแหนง และมเพยง 3 ต าแหนงทมผลเปลยนแปลงกรดอะมโน และในสวนของการเปรยบเทยบล าดบกรดอะม-โน (ภาพท 18b) พบความเหมอนของโปรตนเปน 97-100 เปอรเซนต

จากผลการเปรยบเทยบล าดบดเอนเอแสดงใหเหนวายน ScHSF6 และ ScHSF10 จากออยพนธเดยวกนมล าดบดเอนเอแตกตางกน และยนทงสองมความเหมอนของล าดบกรดอะมโนทสง คาดวายน ScHSF6 และ ScHSF10 จากออยพนธอน กนาจะมลกษณะเดยวกนน

ผลการเปรยบเทยบกบฐานขอมล GenBank ดวยโปรแกรม blastx พบวายน ScHSF6 และ ScHSF10 มความเหมอนกบยน hsf ของขาวกลม A6a และ A2c ตามล าดบ สวนผลการวเคราะหบรเวณ motif ของโปรตนดวยการเปรยบเทยบกบฐานขอมลโปรตน Pfam ล าดบกรดอะมโนของยน ScHSF6 ของออยพนธลาวสะดง (เบอร 1) โคลนท 3 พบวาเปนบรเวณ leucine zipper ทเปนคณลกษณะส าคญของโปรตน transcription factor สวนล าดบกรดอะมโนของยน ScHSF10 ของออยก าแพงแสน 01-12 พบวาเปนบรเวณจบดเอนเอของโปรตน (DNA binding domain) กลม heat shock transcription factor (HSF) ดงแสดงในตารางท 3 และการเปลยนแปลงกรดอะมโนทพบในยนทงสอง ไมมผลกระทบตอบรเวณ motif ของทงสองโปรตน (ภาพท 17b และ 18b) แสดงใหเหนวาการเปลยนแปลงในยน ScHSF6 และ ScHSF10 ทแยกไดจากออยในงานวจยน ไมนาจะสงผลกระทบตอการท างานของโปรตน HSF ซงจะตองแยกยนทงสองใหไดยนทสมบรณ ซงอาจจะพบความแตกตางทมผลกระทบตอการท างานของโปรตน

32

ภาพท 17 ผลการเปรยบเทยบยน ScHSF6 จากออย 3 พนธ จ านวน 11 โคลน (a) ล าดบนวคลโอไทด (b) ล าดบกรดอะมโน โดยบรเวณแรเงา คอ บรเวณทล าดบนวคลโอไทดหรอล าดบกรดอะมโนทแตกตางกน * แสดงล าดบนวคลโอไทดทท าใหเกดการเปลยนแปลงกรดอะมโน สวนแถบแสดงบรเวณทเปน leucine zipper motif

33

ภาพท 18 ผลการเปรยบเทยบยน ScHSF10 จากออย 3 พนธ จ านวน 5 โคลน (a) ล าดบนวคลโอไทด (b) ล าดบกรดอะมโน โดยบรเวณแรเงา คอ บรเวณทล าดบนวคลโอไทดหรอล าดบกรดอะมโนทแตกตางกน * แสดงล าดบนวคลโอไทดทท าใหเกดการเปลยนแปลงกรดอะมโน สวนแถบแสดงบรเวณทเปน HSF DNA binding motif

ตารางท 3 ผลการวเคราะห motif ของโปรตนดวยการเปรยบเทยบล าดบกรดอะมโนทไดจากการแปลรหสยน ScHSF6 และ ScHSF10 ทแยกไดกบฐานขอมลโปรตน Pfam

Genes Family Description Alignment Bit score

E-value

start End ScHSF6-B1-3 HALZ Homeobox associated

leucine zipper 6 29 13 0.061

#HMM AENDSLQKEKEKLRAEVLSLKEKL

#MATCH +e +sL+++ ++Lraev +L+ ++

#SEQ SEVESLKRDRAALRAEVITLRQQY

ScHSF10-01-12 HSF-DNA-binding

HSF-DNA-binding Clan

98 145 46.1 4.1e-12

HMM FLKKLYEILEDEELKELISWSENGNSFVVLDEEEFAKKVLPKYFKHSN

#MATCH Fl+k+++++ed++++ ++sws+ gnsfvv+d++ fa+ +Lp+ Fkh+n

#SEQ FLTKTFDLVEDPATDAVVSWSRAGNSFVVWDPHVFADAMLPRLFKHNN

34

7. ผลการศกษาการแสดงออกของยน ScHSF6 และ ยน ScHSF10

การวเคราะหการแสดงออกของยน ScHSF6 และ ยน ScHSF10 จากใบออยทเพาะเลยงทอณหภม 28, 37, 42, 45, และ 48 องศาเซลเซยส เปนเวลา 24 ชวโมง ดวยเทคนค RT-PCR

ในการทดลอง RT-PCR หากมการปนเปอนของดเอนเอในจโนม จะเกดการเพมจ านวนใหผลเชนเดยวกบ RT-PCR จงท า PCR ดวย total RNA ทสกด ทไมผานการเปลยนเปน cDNA หากมการปนเปอนจะใหแถบดเอนเอ ผลการการท า PCR ของ total RNA ของยน actin (RNA actin) ดงภาพท 19 ไมพบแถบดเอนเอ แสดงถงการไมปนเปอนจากดเอนเอในจโนม

ภาพท 19 ผลการท า 1% agarose gel electrophoresis ของผลผลต RT-PCR ของยน ScHSF10 และ actin จาก cDNA ออยพนธสพรรณบร 50 เพาะเลยงทอณหภมตางๆ (ก) การทดลองครงท 1 (ข) การทดลองครงท 2 โดย เลนท 1 คอ อณหภม 28 องศาเซลเซยส เลนท 2 คอ อณหภม 37 องศาเซลเซยส เลนท 3 คอ อณหภม 42 องศาเซลเซยส เลนท 4 คอ อณหภม 45 องศาเซลเซยส เลนท 5 คอ อณหภม 48 องศาเซลเซยส

จากผลการท า RT-PCR ทงสองครง จะพบแถบดเอนเอของยน ScHSF10 พรอมกบแถบของยน actin โดยพบแถบยน ScHSF10 แสดงออกททกอณหภม คอ พบแถบดเอนเอทอณหภม 28 และ 37 องศาเซลเซยส ในการทดลองท 1 (ภาพท 19 ก) และพบแถบดเอนเอทอณหภม 42, 45 และ 48 องศาเซลเซยส ในการทดลองท 2 (ภาพท 18 ข) นอกจากนความเขมของแถบยน ScHSF10 และยน actin ทพบจะมความเขมทเทากน น าไปวเคราะหปรมาณของการแสดงออกของยน ScHSF10 ตอการแสดงออกของยน actin ทอณหภมเดยวกน ไดเปนคาการแสดงออกของยน จากนนเปรยบเทยบ

35

คาการแสดงออกทอณหภมนนกบคาการแสดงออกทอณหภม 28 องศาเซลเซยส ไดเปนระดบการแสดงออก ทพบวามคาเปน 1.0 ในทกอณหภม ผล RT-PCR ของยน ScHSF10 ของออยพนธสพรรณบร 50 แสดงออกททกอณหภม และแสดงออกเทากนในทกอณหภม

ภาพท 20 ผลการท า 1% agarose gel electrophoresis ของผลผลต RT-PCR ของยน ScHSF6 และ actin จาก cDNA ออยพนธสพรรณบร 50 เพาะเลยงทอณหภมตางๆ เลนท 1 คอ อณหภม 28 องศาเซลเซยส เลนท 2 คอ อณหภม 37 องศาเซลเซยส เลนท 3 คอ อณหภม 42 องศาเซลเซยส เลนท 4 คอ อณหภม 45 องศาเซลเซยส เลนท 5 คอ อณหภม 48 องศาเซลเซยส

สวนผล RT-PCR ของยน ScHSF6 นน พบวาแถบยน ScHSF6 ททกอณหภม แตจะเขมมากทอณหภม 42, 45 และ 48 องศาเซลเซยส แถบยน actin มความเขมใกลเคยงกนในทกอณหภม ยกเวนทอณหภม 48 องศาเซลเซยส (ภาพท 20) น าไปวเคราะหปรมาณของการแสดงออกของยน ScHSF6 ตอการแสดงออกของยน actin ทอณหภมเดยวกน ไดเปนคาการแสดงออกของยน จากนนเปรยบเทยบคาการแสดงออกทอณหภมนนกบคาการแสดงออกทอณหภม 28 องศาเซลเซยส ไดเปนระดบการแสดงออก ซงพบวามคา 1 ทอณหภม 28 และ 37 องศาเซลเซยส คา 1.1 ทอณหภม 42 และ45 องศาเซลเซยส และคา 1.2 ทอณหภม 48 องศาเซลเซยส (ภาพท 20) แสดงใหเหนวายน ScHSF6 ของออยพนธสพรรณบร 50 นนจะมการแสดงออกททกอณหภม และจะมการแสดงออกเพมขนเมออณหภมเพมสงขน

36

สรปและวจารณผลการวจย

การศกษาวธการสกดดเอนเอในจโนม 3 วธ พบวาชดส าเรจรป Genomic DNA Purification Kit (Thermo scientific) สามารถสกดดเอนเอไดปรมาณและสามารถเพมจ านวนดเอนเอไดดกวาการสกดดวยวธการ mCTAB ในขณะทดเอนเอทสกดดวยชดสกด GF-1 (Vivantis) นนจะดเอนเอปรมาณนอย ซงอาจจะเกดจากการทใบออยนนมลกษณะแขง เหนยว ท าใหน ายาของชดสกด Genomic DNA Purification Kit (Thermo scientific) มความเหมาะสมกบเซลลออยกวาวธการสกดอน

การออกแบบไพรเมอรเพอแยกยน hsf ดวยการเพมจ านวนดเอนเอ จ านวน 16 ยน พบวาสามารถเพมจ านวนได โดย 3 คไพรเมอร ไดแก ไพรเมอรของยน ScHSF5, ScHSF6 และ ScHSF10 การทแยกยนไดเพยง 2 ยน อาจจะเนองมาจากออยทใชในการวจยเปนพนธทใชในประเทศไทย ทอาจจะมความหลากหลายหรอแตกตางทางกบออยทใชในฐานขอมล ท าใหมล าดบดเอนเอแตกตางกน จนไพรเมอรทออกแบบไมสามารถใชในการแยกยนเหลานนได แตไมไดเปนการแสดงวาไมมยนดงกลาวในจโนมของออย นอกจากนจากการวเคราะหล าดบดเอนเอ พบวาเปนยน hsf จ านวน 2 ยน คอ ScHSF6 และ ScHSF10 ทแยกไดมจ านวนมากกวา 1 แบบ (isoforms) ในจโนมของออย ซงนาจะท าใหออยพนธหนงๆ มความหลากหลายของยน hsf ทจะสามารถตอบสนองตออณหภมไดหลากหลายไปดวย

การโคลนยนสามารถโคลนยน ScHSF6 จากออย 3 พนธ จ านวน 11 โคลน จากการเปรยบเทยบพบความเหมอนในล าดบดเอนเอและล าดบกรดอะมโน คดเปน 97-99 เปอรเซนต และ 95-100 เปอรเซนต ตามล าดบ และสามารถโคลนยน ScHSF10 จากออย 3 พนธ จากการเปรยบเทยบพบความเหมอนในล าดบดเอนเอและล าดบกรดอะมโน คดเปน 97-99 เปอรเซนต และ 97-100 เปอรเซนต ตามล าดบ ซงจากล าดบดเอนเอและจ านวนโคลนแสดงใหเหนวายน ScHSF6 นนนาจะมความหลากหลายมากกวายน ScHSF10

ผลการเปรยบเทยบกบยนในฐานขอมล GenBank พบวาเหมนกบยน HSF กลม A ดงนนยนทแยกไดนอาจจะเกยวของกบการตอบสนองของอณหภมทเพมขน ดงทพบในพช Arabidopsis (Ahuja et al., 2010)

ผลการเปรยบเทยบกบฐานขอมลโปรตน Pfam ของล าดบกรดอะมโนของยน ScHSF6 และยน ScHSF10 พบวาการเปลยนแปลงกรดอะมโนทพบในยนทงสอง ไมมผลกระทบตอบรเวณ motif ของทงสองโปรตน แสดงใหเหนวาการเปลยนแปลงในยน ScHSF6 และ ScHSF10 ทแยกไดจาก

37

ออยในงานวจยน ไมนาจะสงผลกระทบตอการท างานของโปรตน HSF ในงานวจยขนตอไปจะตองแยกยนทงสองใหไดยนทสมบรณซงอาจจะพบความแตกตางทอาจจะมผลกระทบตอการท างานของโปรตน

ผลการศกษาการแสดงออกของยนในออยพนธสพรรณบร 50 พบวายน ScHSF6 จะแสดงออกเพมขนทอณหภม 42 และ 45 องศาเซลเซยส จากนนลดลงทอณหภม 48 องศาเซลเซยส ในขณะทยน ScHSF10 แสดงออกคงททกอณหภม ขอมลนอาจจะบงบอกวายน ScHSF6 นาจะมสวนเกยวของกบการตอบสนองตออณหภมสงในออยมากกวายน ScHSF10

ดงนนคาดวายน ScHSF6 ทมความหลากหลายของล าดบดเอนเอและการแสดงออกเพมขนทอณหภมสงนาจะมบทบาทเกยวของกบการตอบสนองตออณหภมทเพมขนในออย

38

เอกสารอางอง

ASTV ผจดการออนไลน. 28 ตลาคม 2552. คลแผนทดกนชดๆ ทไหนเสยหายบาง เมออณหภม

โลกเพมขน 4 องศา. ขอมลออนไลนท

http://www.manager.co.th/Science/ViewNews.aspx?NewsID=9520000128833. (เขาถงเมอ

1 กนยายน 2553)

เรวต เลศฤทยโยธน. ออยพชพลงงาน. ศนยวจยและพฒนาออยและน าตาล. สถาบนและวจย

ก าแพงแสน. ขอมลออนไลนท

http://sugarcanecenter.rdi.kps.ku.ac.th/data/sugarcane_en.pdf (เขาถงเมอ 1 กนยายน 2553)

วกพเดย สารานกรมเสร. ออย. ขอมลออนไลนท

http://th.wikipedia.org/wiki/%E0%B8%AD%E0%B9%89%E0%B8%AD%E0%B8%A2

(เขาถงเมอ 1 กนยายน 2553)

ศนยวจยและพฒนาการเกษตรสพรรณบร.ออย. ระบบออนไลน. แหลงทมา http://sfcrc.suphanburi.info/cane_h.htm (30 กรกฎาคม 2556).

A. Wahid, S. Gelani, M. Ashraf and M.R. Foolad. 2007. Review article. Heat tolerance in

plants: An overview. Environmental and Experimental Botany. 61(3); 199-223.

Ahuja Ishita, de Vos Ric C.H.,Bones Atle M., and Hall Robert D. 2010. Plant molecular stress responses face climate change. Trend in Plant Science.15 (12): 664–674.

Eric Ruelland and Alain Zachowski. 2010. Review article. How plants sense temperature.

Environmental and Experimental Botany. 69(3); 225-232.

Marco Punta, Penny C. Coggill, Ruth Y. Eberhardt, Jaina Mistry, John Tate, Chris Boursnell,

Ningze Pang, Kristoffer Forslund, Goran Ceric, Jody Clements, Andreas Heger, Liisa

Holm, Erik L. L. Sonnhammer, Sean R. Eddy, Alex Bateman1 and Robert D. Finn. The

Pfam protein families database. Nucleic Acids Research. (2012) Database Issue

40:D290-D301.

http://www.sciencedirect.com/science?_ob=ArticleURL&_udi=B6T66-4NWNCRY-2&_user=1750309&_coverDate=12/31/2007&_alid=1458091464&_rdoc=1&_fmt=high&_orig=search&_origin=search&_zone=rslt_list_item&_cdi=5022&_sort=r&_st=13&_docanchor=&view=c&_ct=5&_acct=C000054428&_version=1&_urlVersion=0&_userid=1750309&md5=715dff5da857635b95c46116852fd38b&searchtype=a

39

Mittal Dheeraj, Chakrabarti Sveta, Sarkar Anshuk, Singh Amanjot, and Grover Anil. 2009. Heat shock factor gene family in rice: Genomic organization and transcript expression profiling in response to high temperature, low temperature and oxidative stresses. Plant Physio and Biochem. 47 (9):785-795.

P von Koskull-Döring, KD Scharf and L Nover. 2007. Review article. The diversity of plant heat

stress transcription factors . Trend in Plant Science. 12 (10); 452-457.

Sachin Kotak, Jane Larkindale2, Ung Lee, Pascal von Koskull-Döring, Elizabeth Vierling and

Klaus-Dieter Scharf. 2007. Review article. Complexity of the heat stress response in plants.

Current Opinion in Plant Biology. 10(3); 310-316.

Tiroli AO. and Ramos CH. 2007. Biochemical and biophysical characterization of small heat shock proteins from sugarcane Involvement of a specific region located at the N-terminus with substrate specificity. The Inter Journal of Biochem & Cell Bio. 39: 818–831.

http://www.sciencedirect.com/science?_ob=ArticleURL&_udi=B6VS4-4NN1TXW-1&_user=1750309&_coverDate=06%2F30%2F2007&_alid=1458086818&_rdoc=1&_fmt=high&_orig=search&_origin=search&_zone=rslt_list_item&_cdi=6252&_sort=r&_st=13&_docanchor=&view=c&_ct=1&_acct=C000054428&_version=1&_urlVersion=0&_userid=1750309&md5=2982c70ac01fc282f5a664b69e1bd300&searchtype=a#aff2

40

ภาคผนวก

41

ภาคผนวก ก ล าดบดเอนเอ

ล าดบดเอนเอทไดจากการแยกบรสทธชนดเอนเอจากเทคนค PCR ของโครงการวจยน

>ยน SCHSF5 จากออยพนธก าแพงแสน 94-13 (SCHSF5_K94-13) AGTGAAGGGATTATATGATGGACTACAGTTGCAGTTGATGTCCAATACCTACCCTAATTTTCAGACGCT

TGTAAACCGCGCTATCGTGGTGGATAGCAAGCGCAAGGAAATGGATGCAAAGAGGAAGAGGTTACAGGG

ACAAGCCTCTAATAGCAACACCCGTCTGCGTACTGGTTTTCAGCAGAATACTCAGCAGAGGCCTCCCTC

TGGACAGTGGAATCGTGGTCAGGCCCCATTCCGTGGACAGTTTCCGCAACGTCCCCCATTCCAGCCACA

GAATAGCAACCAACGTCCACCGCAGCAGAATGGAAATCAAGCACAGCGTCAGGGTCCTTCCAATAACAC

TCCTATGAAGACTAGTGCTCCCAATACCCCCAACAAGTGGCCG

>ยน SCHSF5 จากออยพนธสพรรณบร 50 (SCHSF5_SB-50)

TGACGCTGTGCTTGATTTCCATTCTGCTGCGGTGGACGTTGGTTGCTATTCTGTGGCTGGAATGGGGGA

CGTTGCGGAAACTGTCCACGGAATGGGGCCTGACCACGATTCCACTGTCCAGAGGGAGGCCTCTGCTGA

GTATTCTGCTGAAAACCAGTACGCAGACGGGTGTTGCTATTAGAGGCTTGTCCCTGTAACCTCTTCCTC

TTTGCATCCATTTCCTTGCGCTTGCTATCCACCACAATAGCGCGGTTTACAAGCGTCTGAAAATTAGGG

TAGGTATTGGACATCATCTGCAACTGTAGTCCATCATATAATCCCTTCACTGCC

>ยน SCHSF6 จากออยพนธก าแพงแสน 94-13 (SCHSF6_K94-13-CONTIG) TATACACCACAGCCAGCATTTCAACTCAACTGCGAGTTAAACAACCTACTATTCCTATCCCTTATATAT

ATATACGAATTTCAGTTGGCAGAATCCTAATATGATGAAGCTATGAACAAGCCACTATTCCTCTCCTGC

TCCAGATCAAGCTATTCTTGCGCCTCTGGTCTACTCATAGTGCTCCACAAACTGCATCGGCTCCGCGAG

ATACGAGCAGTCATCATCCCAACCGCAGGGCCGTCCACTTAAGTCCTCGACGTCAAAGCCAGCCACGGT

CTTGTCTGCTTCTCGCCGGTCCATTTCAGCGCGTGGTATCGCGTCCAGCTCGTCCCACACATCATACCA

AATAACCTTCCATCTCCTGACCATTCAACTCAGGCCCAGGCTCCTGTTGTGCGGTTATGCCACCATCGC

TGCTCCCCGCAGAGACGCCAGCCGCCACTGTCGCAAATGCAGCTTCGGTGCTACTCCTCAGTGGCAAAT

CGCCGTGCCAGTGTTCTTCGTTTTCCATCAGCCGCTGTCTTTTGGAAGCGCCGCGTAGCTCTTTCTCCT

TGGCATAGTTGAGCAGGACCTGCTGAACGAAGGCTGGGTTGCTGAGCACCTTTGCGAAGAAGGCGATGG

CCCTCTGCTGGTTCCTCTCGTTGTTCAGGATCCTCTCCTCCAAGGCGACGAGTTGGGATTTGCAAATGC

TGTACTGCTGCCTTAGCGTGATGACTCAG

>ยน PTSo00732 จากออยพนธก าแพงแสน 01-12 (732_01_12_0732F)

GGAGAAAGAGCTACGCGGCGCTTCCAAAAGACAGCGGCTGATGGAAAACGAAGAACAATGGCACGGCGA

TTTGCCACTGAGGAGTAGCACCGAAGCTGCATTTGCGACAGTGGCGGCTGGCGTCTCTGCGGGGAGCAG

CGATGGTGGCATAACCGCAAAACAGGAGCCTGGGCCTGAGTTGAATGGTCAGGAGATGGAAGGTATTTG

GTATGATGTGTGGGACGAGCTGGACGCGATACCAAGCGCTGAAATGGACCGGCGAGAAGCAGACAAGGC

CGTGGCTGGCTTCGACGTCGAGGACTTAAGTGGACGGCCTTGCGGTTGGGATGATGACTGCTCGTATCT

CGCGGAGCCGATGCAGTTTGTGGAA

42

>ยน PTSo00732 จากออยพนธก าแพงแสน 94-13 (732_94_13_0732F)




GTATGATGTGTGGGACGAGCTGGACGCGATACCAGGCGCTGAAATGGACCGGCGAGAAGCAGACAAGGC


CGCGGAGCCGATGCAGTTT

>ยน PTSo00732 จากออยพนธ K92 (732_K92_0732F)




GTATGATGTGTGGGACGAGCTGGACGCGATACCAAGCGCTGAAATGGACCGGCGAGAAGCAGACAAGGC


CGCGGAGCCGATGCAGTTT

>ยน PTSo00732 จากออยพนธสพรรณบร 50 (732_SB_50_0732F)




GTATGATGTGTGGGACGAGCTGGACGCGATACCAGGCGCTGAAATGGACCGGCGAGAAGCAGACAAGGC

CGTGGCTGGCTTCGACGTCGAGGACTTAAGTGGACGACCTTGCGGTTGGGATGATGACTGCTCGTATCT

CGCGGAGCCGATGCAGTTTGTGG

ล าดบดเอนเอของดเอนเอทไดจากการโคลนของโครงการวจยน

>ยน SCHSF6 จากออยพนธลาวสะดง โคลนท 3 (SC6_1_3_CONTIG_RE)

AGAGCCAGAGGTGGCGTTATAGTTGAGCTCGATATGTTCTCAGAAGTCAGAGCTGACGCTATACACCAC

AGCCAGCATTTCAACTCAACTGCGAGTTAAACAACCTACTATTCCTATCCCTTATATATATATACGAAT

TTCAGTTGGCAGAATCCTAATATGATGAAGCTATGAACAAGCCACTATTCCTCTCCTGCTCCAGATCAA

GCTATTCTTGCGCCTCTGGTCTACTCATAGTGCTCCACAAACTGCATCGGCTCCGCGAGATACGAGCAG

TCATCATCCCAACCGCAAGGCCGTCCACTTAAGTCCTCGACGTCGAAGCCAGCCACGGCCTTGTCTGCT

TCTCGCCGGTCCATTTCAGCGCCTGGTATCGCGTCCAGCTCGTCCCACACATCATACCAAATACCTTCC

ATCTCCTGACCATTCAACTCAGGCCCAGGCTCCTGTTTTGCGGTTATGCCACCATCGCTGCTCCCCGCA

GAGACGCCAGCCGCCACTGTCGCAAATGCAGCTTCGGTGCTACTCCTCAGTGGCAAATCGCCGTGCCAT

TGTTCTTCGTCTTCCATCAGCCGCTGTCTTTTGGAAGCGCCGCGTAGCTCTTTCTCCTTGGCATAGTTG

AGCAGGACCTGCTGAACGAAGGCTGGGTTGCTGAGCACCTTTGTGAAGAAGGCGATGGCCCTCTGCTGG

TTCCTCTCGTTGTTCAGGATCCTCTCCTCCAAGGCGACGAGTTGGGATTTGCAAATGCTGTACTGCTGC

CTTAGCGTGATGACTTCAGCCCTGAGTGCTGCGCGGTCTCGTTTCAAGCTCTCAACCTCACTGGGATCC

TTTGGCGG

43

>ยน SCHSF6 จากออยพนธลาวสะดง โคลนท 5 (SC6_1_5_CONTIG)

AGAGCCAGAGGTGGCGTTATAGTTGAGTTCGATATGTTCTCAGAAGTCAGAGCTGACGCTATACACCAC

AGCCAGCATGTCAACTCAACTGCGAGTTAAACAACCTACTATTCCTATTCCTTATATATATACGAATTT

CAGTTGGCAGAATCCTAATATGATGAAGCTATGAGCAAGCCACTATTCCTCTCCTGCTCCAGATCAAGC

TATTCTTGCGCCTCTAGTCTACTCATAGTGCTCCACAAACTGCATCGGCTCCGCGAGATACGAGCAGTC

ATCGTCCCAACCGCAAGGCCGTCCACTTAAGTCCTCGACGTCGAAGCCAGCCACGGCCTTGTCTGCTTC

TAGCCGGTCCATTTCAGCGCTTGGTATCGCGTCCAGCTCGTCCCACACATCATACCAAATACCTTCCAT

CTCCTGACCATTCAACTCAGGCCCAGGCTCCTGTTTTGCGGTTATGCCACCATCGCTGCTCCCCGCAGA

GACGCCAGCCGCCACTGTCGCAAATGCAGCTTCGGTGCTACTCCTCAGTGGCAAATCACCGTGCCATTG

TTCTTCGTTTTCCATCAACCGCTGTCTTTTGGAAGCGCCGCGTAGCTCTTTCTCCTTGGCATAGTTGAG

CAGGACCTGCTGAACGAAGGCTGGGTTGCTGAGCACCTTTGCGAAGAAGGCGATGGCCCTCTGCTGGTT

CTTCTCGTTGTTCAGGATCCTCTCCTCCAAGGCGACGAGTTGGGATTTGCAAACGCTGTACTGCTGCCT

TAGCGTGATGACTTCAGCCCTGAGTGCTGCGCGGTCTCGTTTCAAGCTCTCAACCTCACTGGGATCCTT

TGGCGG

>ยน SCHSF6 จากออยพนธลาวสะดง โคลนท 6 (SC6_1_6_CONTIG)









TGTTCTTCGTTTTCCATCAGCCGCTGTCTTTTGGAAGCGCCGCGTAGCTCTTTCTCCTTGGCATAGTTG


TTCCTCTCGTTGTTCAGGATCCTCTCCTCTAAGGCGACGAGTTGGGATTTGCAAATGCTGTACTGCTGC

CTTAGCGTGATGACTTCAGCCCTGAGTGCTGCGCGGTCTCGCTTCAAGCTCTCAACCTCACTGGGATCC

TTTGGCGG

>ยน SCHSF6 จากออยพนธลาวสะดง โคลนท 10 (SC6_1_10_CONTIG_RE)













TTTGGCGG

44

>ยน SCHSF6 จากออยพนธขอนแกน 3 โคลนท 3 (SC6_9_3_CONTIG)








GAGACGCCAGCCGCCACTGTCGCAAATGCAGCTTCGGTGCTACTCCTCAGTGGCAAGTCGCCGTGCCAT





TTTGGCGG




CAGTTGGCAGAATCCTAATATGATGGAGCTATGAGCAAGCCACTATTCCTCTCCTGCTCCAGATCAAGC


ATCATCCCAACCGCAAGGTCGTCCACTTAAGTCCTCGACGTCGAAGCCAGCCACGGCCTTGTCTGCTTC

TCGCCGGTCCATTTCAGCGCCTGGTATCGCGTCCAGCTCGTCCCACACATCATACCAAATACCTTCCAT


GACGCCAGCCGCCACTGTCGCAAATGCAGCTTCGGTGCTACTCCTCAGTGGCAAATCGCCGTGCCATTG

TTCTTCGTTTTCCATCAGCCGCTGTCTTTTGGAAGCGCCGCGTAGCTCTTTCTCCTTGGCATAGTTGAG

CAGGACCTGCTGAACGAAGGCTGGGTTGCTGAGCACCTTTGTGAAGAAGGCGATGGCCCTCTGCTGGTT

CCTCTCGTTGTTCAGGATCCTCTCCTCCAAGGCGACGAGTTGGGATTTGCAAATGCTGTACTGCTGCCT


TGGCGG



AGCCAGCATGTCAACTCAACTGCGAGTTAAACAACCTACTATTCCTATCCCTTATATATATACGAATTT

CAGTTGGCAGAATCCTAATATGATGAAGCTATGAACAAGCCACTATTCCTCTCCTGCTCCAGATCAAGC

TATTCTTGCGCCTCTAGTCTACTCATAGTGCTCCACAAACTGCATCGGCTCCACGAGATACGAGCAGTC

ATCATCCCAACCGCAAGGCCGTCCACTTAAGTCCTCGACGTCGAAGCCAGCCACGGCCTTGTCTGCTTC



GACGCCAGCCGCCACTGTCGCAAATGCAGCTTCGGTGCTACTCCCCAGTGGCAAATCGCCGTGCCATTG





TGGCGG

45



AGCCAGCATTTCAACTCAACTGCGGGTTAAACAACCTACTATTCCTATCCCTTATATATATACGAATTT

CAGTTGGCAGAATCCTAATATGATGAAGCTATGAACAAGCCACTATTCCTCTCCTGCTCCAGATCAAGC


ATCATCCCAACCGCAAGGCCGTCCACTTAAGTCCTCGACGTCGAAGCCAGCCACGGCCTTGTCTGCTTC



GACGCCAGCCGCCACTGTCGCAAATGCAGCTTCGGTGCTACTCCTCAGTGGCAAATCGCCGTGCCATTG



CTTCTCGTTGTTCAGGATCCTCTCCTCCAAGGCGACGAGTTGGGATTTGCAAATGCTGTACTGCTGCCT


TGGCGG


AGAGCCAGAGGTGGCGTTATAGTTGAGTTCGATATGTTCTCAGAAGTCAGAGCCGACGCTATACACCAC



TATTCTTGCGCCTCTAGTCTACTCATAGTGCTCCACAAACTGCATCGGCTCCGCGAGATACAAGCAGTC

ATCGTCCCGACCGCAAGGCCGTCCACTTAAGTCCTCGACGTCGAAGCCAGCCACGGCCTTGTCTGCTTC



GACGCCAGCCGCCACTGTCGCAAATGCAACTTCGGTGCTACTCCTCAGTGGCAAATCGCCGTGCCATTG



CTTCTCGTTGTTCAGGATCCTCTCCTCCAAGGCGACGAGTTGGGATTTGCAAATGCTGTACTGCTGCCT

TAGCGAGATGACTTCAGCCCTGAGTGCTGCGCGGTCTCGTTTCAAGCTCTCGACCTCACTGGGATCCTT

TGGCGG

>ยน SCHSF6 จากออยพนธขอนแกน 80 โคลนท 5 (SC6_19-5_CONTIG_RE)




GCTATTCTTGCGCCTCTAGTCTACTCATAGTGCTCCACAAACTGCATCGGCTCCGCGAGATACGAGCAG

TCATCGTCCCAACCGCAAGGCCGTCCACTTAAGTCCTCGACGTCGAAGCCAGCCACGGCCTTGTCTGCT

TCTAGCCGGTCCATTTCAGCGCTTGGTATCGCGTCCAGCTCGTCCCACACATCATACCAAATACCTTCC


GAGACGCCAGCCGCCACTGTCGCAAATGCAGCTTCGGTGCTACTCCTCAGTGGCAAATCACCGTGCCAT


AGCAGGACCTGCTGAACGAAGGCTGGGTTGCTGAGCACCTTTGCGAAGAAGGCGATGGCCCTCTGCTGG

TTCTTCTCGTTGTTCAGGATCCTCTCCTCCAAGGCGACGAGTTGGGATTTGCAAATGCTGTACTGCTGC


TTTGGCGG

46

>ยน SCHSF6 จากออยพนธขอนแกน 80 โคลนท 9 (SC6_19_9_CONTIG_RE)

AGAGCCAGAGGTGGCGTTATAGTTGAGCTCGATATGTTCTCAGAAGTCAGAGCTGACGCTATGCACCAC



TATTCTTGCGCCTCTAGTCTACTCATAGTGCTCCACAAACTGCATCGGCTCCGCGAGATACAAGCAGTC

ATCGTCCCAACCGCAAGGCCGTCCACTTAAGTCCTCGACGTCGAAGCCAGCCACGGCCTTGTCTGCTTC



GACGCCAGCCGCCACTGTCGCAAATGCAACTTCGGTGCTACTCCTCAGTGGCAAATCGCCGTGCCATTG





TGGCGG

>ยน SCHSF10 จากออยพนธลาวสะดง โคลนท 2 (SC10_1_2)

AAATATCCTAGATCGCCGACCCGAACACCCGATTCGCTCCTCGTCCGGCCGATTCGTGCTCCTAAATCG

CTCGAATCGAGTCCTTGCTTCGGGTTGCGTGCCGCAATCGGGGCGCTTGGCTCCCGCGAGCCGGGTTCT

TGGGCCTGGGCGGCGGCCATGGACCCGTCGGTGGCGCCGGGCATTGTCAAGGAGGAGCTCCTGGAGCAG

CACCAGCCGATGCAGGACGGTGTGGGTGGCGGCGGGGCTGCGCCGCGCCCGATGGAGGGGCTGCACGAG

GTCGGCCCCCCGCCGTTCCTCACCAAGACGTTCGACCTGGTGGAGGACCCGGCCACCGACGCCGTCGTC

TCCTGGAGCCGCGCCGGCAACAGCTTCGTCGTCTGGGACCCGCACGTCTTCGCCGACGCGATGCTCCCA

CGCCTCTTTAAGCACAACAAC



CTCGAATCGAGTTCTTGCTTCGGGTTGCGTGCCGCAATCGGGGCGCTTGGCTCCCGCGAGCCGGGTTCT

TGGGCCTGGGCGGCGGCCATGGACCCGTCGGTGGCACCGGGCATTGTCAAGGAGGAGCTCCTGGAGCAG


GTGGGTCCCCCGCCTTTCCTTACCAAGACCTTCGACCTGGTGGAGGACCCGGCCACCGACGCCGTCGTC

TCCTGGAGCCGCGCCGGCAACAGCTTCGTCGTCTGGGACCCGCACGTCTTCGCCGACGCGATGCTTCCA





TGGGCCTGGGCGGCGGCCATGGACCCGTCGGTGGCGCCGGGCATTGTCAAGGAGGAGCTCCTGGAGCAG



TCCTGGAGCCGCGCCGGCAACAGCTTCGTCGTCTGGGACCCGCACGTCTTCGCCGACGCGATGCTCCCA


47

>ยน SCHSF10 จากออยพนธขอนแกน 3 โคลนท 1 (SC10_9_1)



TGGGCCTGGGCGGCGGCCATTGTCCCGTCGGTGGCGCCGGGCATTGTCAAGGAGGAGCTTCTGGAGCAG



TCTTGGAGCCGCGCCGGCAACAGCTTCGTCGTCTGGGACCCGCACGTCTTCGCCGACGCGATGCTCCCA


>ยน SCHSF10 จากออยพนธก าแพงแสน 01-12 โคลนท 1 (SC10_12_1)



TGGGCCTGGGCGGCGGCCATGGGCCCGTCGGTGGCGCCGGGCATTGTCAAGGAGGAGCTCCTGGAGCAG



TCCTGGAGCCGCGCCGGCAACAGCTTCGTCGTCTGGGACCCGCACGTCTTCGCCGACGCGATGCTTCCA


48

ภาคผนวก ข ล าดบกรดอะมโน

ล าดบกรดอะมโนทไดจากแปลรหสล าดบดเอนเอของยน hsf ตางๆ ทแยกไดจากโครงการวจย

>ยน ScHSF6 จากออยพนธขอนแกน 80 โคลนท 5 (Sc6-19-5 aa)

PPKDPSEVESLKRDRAALRAEVITLRQQYSICKSQLVALEERILNNEKNQQRAIAFFAKVLSNPAFVQQ

VLLNYAKEKELRGASKRQRLMENEEQWHGDLPLRSSTEAAFATVAAGVSAGSSDGGITAKQEPGPELNG

QEMEGIWYDVWDELDAIPSAEMDRLEADKAVAGFDVEDLSGRPCGWDDDCSYLAEPMQFVEHYE


PPKDPSEVESLKRDRAALRAEVISLRQQYSICKSQLVALEERILNNEKNQQRAIAFFAKVLSNPAFVQQ

VLLNYAKEKELRGASKRQRLMENEEQWHGDLPLRSSTEVAFATVAAGVSAGSSDGGITAKQEPGPELNG

QEMEGIWYDVWDELDAIPSAEMDRLEADKAVAGFDVEDLSGRPCGRDDDCLYLAEPMQFVEHYE


PPKDPSEVESLKRDRAALRAEVITLRQQYSICKSQLVALEERILNNERNQQRAIAFFTKVLSNPAFVQQ

VLLNYAKEKELRGASKRQRLMENEEQWHGDLPLRSSTEVAFATVAAGVSAGSSDGGITAKQEPGPELNG

QEMEGIWYDVWDELDAIPSAEMDRLEADKAVAGFDVEDLSGRPCGWDDDCLYLAEPMQFVEHYE

>ยน ScHSF6 จากออยพนธลาวสะดง โคลนท 10 (Sc6-1-10 aa)



QEMEGIWYDVWDELDAIPGAEMDRREADKAVAGFDVEDLSGRPCGWDDDCSYLAEPMQFVEHYE

> ยน ScHSF6 จากออยพนธลาวสะดง โคลนท 3 (Sc6-1-3 aa)


VLLNYAKEKELRGASKRQRLMEDEEQWHGDLPLRSSTEAAFATVAAGVSAGSSDGGITAKQEPGPELNG


>ยน ScHSF6 จากออยพนธลาวสะดง โคลนท 5 (Sc6-1-5 aa)

PPKDPSEVESLKRDRAALRAEVITLRQQYSVCKSQLVALEERILNNEKNQQRAIAFFAKVLSNPAFVQQ


QEMEGIWYDVWDELDAIPSAEMDRLEADKAVAGFDVEDLSGRPCGWDDDCSYLAEPMQFVEHYE





49

> ยน ScHSF6 จากออยพนธขอนแกน 3 โคลนท 10 (Sc6-9-10 aa)

PPKDPSEVESLKRDRAALRAEVITLRQQYSICKSQLVALEERILNNEKNQQRAIAFFAKVLSNPAFVQQ













VLLNYAKEKELRGASKRQRLMENEEQWHGDLPLGSSTEAAFATVAAGVSAGSSDGGITAKQEPGPELNG

QEMEGIWYDVWDELDAIPGAEMDRREADKAVAGFDVEDLSGRPCGWDDDCSYLVEPMQFVEHYE


KYPRSPTRTPDSLLVRPIRAPKSLESSPCFGLRAAIGALGSREPGSWAWAAAMDPSVAPGIVKEELLEQ

HQPMQDGVGGGGAAPRPMEGLHEVGPPPFLTKTFDLVEDPATDAVVSWSRAGNSFVVWDPHVFADAMLP

RLFKHNN


KYPRSPTRTPDSLLVRPIRAPKSLESSSCFGLRAAIGALGSREPGSWAWAAAMDPSVAPGIVKEELLEQ


RLFKHNN


KYPRSPTRTPDSLLVRPIRAPKSLESSSCFGLRAAIGALGSREPGSWAWAAAMDPSVAPGIVKEELLEQ


RLFKHNN


KYPRSPTRTPDSLLVRPIRAPKSLESSSCFGLRAAIGALGSREPGSWAWAAAIVPSVAPGIVKEELLEQ


RLFKHNN

50

>ยน ScHSF10 จากออยพนธก าแพงแสน 01-12 โคลนท 1 (Sc10-12-1 aa)

KYPRSPTRTPDSLLVRPIRAPKSLESSSCFGLRAAIGALGSREPGSWAWAAAMGPSVAPGIVKEELLEQ


RLFKHNN

รายงานผลการวิจัยlibrae.mju.ac.th/goverment/20111119104834_librae/File... · 2015. 8. 4. · ผู้ร่วมโครงการ นางนลินี

Documents