การเปรียบวิธีการตรวจหา Prostate Specific ...forensic.sc.su.ac.th/seminar/seminari52/51312329.doc · Web viewการเปร ยบว

การเปรยบวธการตรวจหา Prostate Specific Antigen ในวตถพยานกรณขมขนกระทำาชำาเราระหวาง Rapid One Step

Immunochromatographic Assay และ ELISA Comparable between Rapid One Step

Immunochromatographic Assay and ELISA in the Detection of Prostate Specific Antigen in Vaginal

Specimen of Raped Womenผใหสมมนา นางสาว สธาทพย ออนละมาย

วนทใหสมมนา วนเสารท 22 สงหาคม 2552 หอง 4-201 เวลา 09.00-12.00 น.

วชา 510701 สมมนานตวทยาศาสตร 1 ภาคตน ปการศกษา 2552

บทคดยอ

ในประเทศไทยอาชญากรรมการขมขนช ำาเราไมมประจกษพยาน ดงนนการตรวจพสจนทางนตวทยาศาสตรจงมความสำาคญ โดยเฉพาะอยางยงในการตรวจหาต วอสจ (sperm) และน ำาอสจ (semen) ในชองคลอดของผ เส ยหาย ในประเทศไทยใชการทดสอบ Acid phosphatase ตรวจหานำาอสจ และมตรวจหานำาอสจโดยใชวธการตรวจหา Prostate Specific Antigen (PSA) ซงเปนการตรวจสอบยนยนทเปนวธการททำาไดงายและคาใชจายไมสงไมเหมอนการทดสอบดวย ELISA งานวจยนมวตถประสงคในการเปรยบเทยบวธการทดสอบระหวาง rapid one step immunochromatographic assay และ ELISA ทใชในการตรวจหา Prostate Specific Antigen (PSA) ในวตถพยานทไดจากชองคลอดของผทถกขมขน หรอผเสยหายจำานวน 100 ตวอยาง ผลการทดสอบทไดจากงานวจยครงนคอ Sensitivity (ความไวในการตรวจพบสาร) ของ rapid one step immunochromatographic assay = 85 % และ ELISA = 83 % , Specificity (ความเฉพาะ ในการตรวจพ บสาร ) ของ rapid one step immunochromatographic assay = 85% แ ล ะ ELISA = 85% ,Accuracy (ความแมนยำาในการตรวจพบสาร) ของ rapid one step immunochromatographic assay = 89 % แ ล ะ ELISA = 89 % , Positive predictive value (การทดสอบใหผลบวกและพบอสจ) ของ rapid one step immunochromatographic assay = 89 % และ ELISA = 89 % Negative predictive value (การทดสอบใหผลลบและไมพบอสจ) ของ rapid one step immunochromatographic assay = 79 % และ ELISA = 77 % โดยท Positive predictive value และ Negative

predictive value เปนคาทไดจากการนำาการทดสอบพรอมกบ gold standard (การดดวยกลองจลทรรศน) สงเกตวาผลการทดสอบทใหคาทแตกตางกนคอ Sensitivity และ Negative predictive value ด งน น จ งสร ป ได ว าก ารทดสอบ rapid one step immunochromatographic assay สามารถนำามาใชไดกบงานบรการประจำาในการตรวจสงสงตรวจหรอวตถพยานในกรณถกขมขนกระทำาชำาเราไดอยางเหมาะสม

Keyword: Rape ,Prostate specific antigen ,Semen detection เอกสารอางอง- Vichan Peonim MD ,Thamrong Chirachariyavej MD ,Kalayanee Atamasirikul MSc , Jate Talthip MD: Department of Pathology, Faculty of Medicine, Ramathibodi Hospital, Mahidol University, Bangkok; J Med Assoc Thai 2007; 90 (12): 2624-9

...............................................

(อ. ธงชย เตโชวศาล)อาจารยทปรกษา

ความเปนมาและปญหา

การขมขนกระทำาชำาเราในสงคมไทยทกวนนเปนอาชญากรรมทมลกษณะคดทขาดประจกษพยานทพบเหนผกระทำาผด ดงนนการพสจนหลกฐานทางชววทยาในทางนตวทยาศาสตรจงมความสำาคญทเหมาะทจะใชสบหาผกระทำาความผด โดยเฉพาะอยางยงเทคนคการสบสวนวตถพยานอยางเชน ตวอสจ (sperm) และนำาอสจ (semen) ในชองคลอดของผเสยหาย การตรวจหา sperm จากกลองจลทรรศน ท ก ำาหนดใหเป นมาตรฐานอยางด ( gold standard ) การตรวจหา semen สามารถตรวจหาไดจากสารชวเคมทเปนส ว น ป ร ะก อ บ ใ น semen ต ว อ ย า ง เ ช น กา รต รว จ ห า เอ น ไ ซ ม Acid phosphatase test เปนเอนไซมทผลตจากตอม prostate ซงจะทดสอบยนยนผลดวยวธการตรวจหา PSA (prostate specific antigen) ทไดจาก semen ของมนษย

PSA ไ ด ถ ก ก ล า ว ไ ว ใ น ป 1971 โ ด ย Hara ใ น ร ป แ บ บ ข อ ง Y-seminoprotein ตอมาในป 1973 เรยก E1 และ 1978 เรยก protein P30 เน อ ง จา ก เป นส า ร จ ำา พว ก glycoprotein น ำา ห น กป ร ะ ม า ณ 30 kilodalton PSA เปนการทดสอบเบองตนของการตรวจมะเรงตอมลกหมาก (Prostate cancer) โดยตรวจหาระดบ PSA ในซร ม (serum) ตอมาวธการตรวจ PSA ใน semen มการพฒนามาจนเปนรปแบบของ quantitative ด วยวธการของ ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) และในขณะเดยวกนวธการตรวจ PSA ไดถกพฒนาขนอกคร งจนเปน rapid test kit ซงเปนวธการแบบ semi-quantitative คณสมบตทชดทดสอบทไดพฒนาขนมาใหมในครงนคอ การทดสอบใชเวลาเรวขน วธการตรวจสอบงายขน คาใชจายไมสงมาก และใชกนอยางกวางขวางในประเทศสหรฐอเมรกา ยโรป ญปน และ จน ฯลฯ ซงประเทศเหลานใชการทดสอบ PSA ใน semen เพอใชทดสอบยนยน ท ผ านมาการว เครา ะห PSA เป นแบบ quantitative analysis ดวยวธการวเคราะหของ ELISA ซ งการวเคราะหวธน ราคาสง อปกรณราคาแพง และจำาเปนตองมผเช ยวชาญพเศษ ตอมาวธการนไดถกพฒนาใหใชงานงายมากขน การวเคราะหมราคาไมสง ไมใชอปกรณทยงยาก และไมตองมผเช ยวชาญพเศษ วธการแบบใหมน เรยกวา “Rapid one step immunochromatographic assay” เปนวธการวเคราะหแบบ semi-quantitative

การวเคราะห PSA ของ rapid one step test kit ใน serum, plasma, whole blood และ semen จะใช colloidal gold enhance immunoassay โดยบรเวณ test นนม mouse anti-human PSA Mc antibody ท เป น nitrocellulose membrane โดยปฏ ก ร ยาท เก ดข นร ะ ห ว า ง ส า ร ช ว เ ค ม ท ไ ด จ า ก semen ก บ Antibody colloidal gold conjugate ซ ง ส า ร ท ผ ส ม ก น น จ ะ เ ค ล อ น ท ผ า น ไ ป บ น membrane chromatographic และทำาปฏก รยากนใน membrane นน ถาในสงสงตรวจพบ PSA กจะเกดสารประกอบกบ specific antibody- PSA-color conjugate ขนบน membrane ทบรเวณ test ทำาใหเกดแถบส ซงการตรวจวเคราะหแบบนใชสารตวอยาง 100 µl ( 3 หยด) ใสในหลมตวอยางและอานผลทเวลา 10 นาท ถาเหนแถบสขนแตบรเวณตวควบคม (control) ผลคอ negative (ไมพบ PSA) แตถาเหนแถบสขน 2 แถบ นนคอ ขนทบรเวณ test และ บรเวณ control ผลคอ positive ซง cut off ของ PSA คอ 4 ng/ml

ถาวธการตรวจหา PSA ดวยวธ ELISA = 0.5 ng/ml ในประเทศไทยวธการแบบ rapid test kit ยงไมนยมใชในงานบรการประจำา ซงทางทมงานผทำาวจยเชอวา rapid kit test ทวเคราะหแบบ semi-quantitative สามารถนำามาชวยในงานทางดานสบสวนคดขมขนทมปรมาณมากมาย จดประสงคในการทำาวจยครงนเพอพสจนเปรยบเทยบคณภาพความแมนยำาระหวาง rapid one step prostate specific antigen test kit ดวย ELISA test สรปสงทเปนประโยชนของวธการแบบนเพอทใหเหมาะสมในการนำามาใชอยางกวางขวางในงานบรการประจำา

Rapid test kit ELISA

ทบทวนวรรณกรรม

อาชญากรรมทางเพศ (sex crime) เปนความผดทเก ยวกบเพศมบญญตไวในประมวลอาญา ภาค 2 ลกษณะ 9 ตงแต มาตรา 276-287 ลกษณะ 11 มาตรา 317-319 เกยวกบความผดตอเสรภาพ และในลหโทษมาตรา 388

บทบาทของแพทยในคดทางเพศ ซงตองไดรบการยนยอมจากผเสยหาย ตรวจสภาพจต และสตปญญาของผเสยหายและทำาการซกประวต

การตรวจรางกายทวไปซงแพทยเปนผกระทำาการตรวจ คอ1. ดสภาพการเจรญเตบโตของรางกาย2. ดสภาพของเสอผา เครองแตงกายวามรองรอยการฉกขาด รองรอย

การตอส การปรนเป อนบรเวณใด ถากรณสงสยวาเปนคราบอสจหรอคราบเลอดทใดตองนำาสงตรวจ

3. ดตามเนอตว4. ดตามรางกายทวไปวามบาดแผลชนดตางๆ ปรากฏบรเวณใด

การตรวจอวยวะสบพนธผเสยหายทเปนหญง1. ดบาดแผลปรากฏบรเวณใกลเคยงอวยวะสบพนธภายนอกทใดบาง2. บรเวณอวยวะสบพนธภายนอกและทวารหนก ทมคราบสงสยวาจะเปนคราบอสจ จะใชสำาล สะอาดพนปลายไม (swab) ชบนำากลนใหชนแลวนำาไปปายหรอเชดบรเวณทสงสย แลวสงทาง หองปฏบตการ3. ตรวจอวยวะสบพนธ ดบรเวณแคมเลกและเหยอพรมจารยเพอตรวจ

หาบาดแผลถลอก ฟกชำา มการบวมหรอมการฉกขาด ซงถามบาดแผลฉกขาดใหมๆ จะเหนคราบเลอดตดอยชดเจน

4. การตรวจภายในชองคลอด ดผนงภายในชองคลอดวามการฉกขาดหรอไม และภายในชองคลอดมของเหลวลกษณะคลายนำาอสจบางหรอไม ซงจะตองนำาไปตรวจ

การตรวจภายในชองคลอดอาจจะพบสงทเปนพยานหลกฐานอนๆ เชน อาจจะพบเศษดน เศษหญา เสนขนทมลกษณะตางไปจากผเสยหาย วตถอนทอาจเปนเครองกระตนความรสกทางเพศ

การตรวจรางกายผตองหา1. พนกงานสอบสวนมอ ำานาจตรวจไดตาม ป.วอาญา ม.132 เม อ

พนกงานสอบสวนขอรองให แพทย ผตรวจตวผตองหาเพอคนหาหลกฐานทางการแพทย แพทยยอมมสทธตรวจผตองหาได2. การตรวจสภาพจตจตใจและสตปญญาของผตองหา3. การตรวจรางกายทวไป

ดสภาพการเจรญเตบโตของรางกาย เพอพจารณาการใชกำาลงปลกปลำากระทำาชำาเราผเสยหายโดยทวไป ชายหญงทมรางกายอยในขนาดผใหญโดยเฉลยชายจะไมสามารถใชกำาลงเพอชำาเราหญงไดถาไมมการทำารายรวมดวย

ตรวจบาดแผลตามรางกายของผตองหา โดยเฉพาะรอยกด รอยขวน ซงเปนแผลฟกชำาหรอถลอก

ตรวจอวยวะผตองหา หาเยอบชองคลอด เยอบทวารหนก รองรอยอจจาระ นำาลาย เยอบกระพงแกม

การตรวจทางหองปฏบตการ1. ต ร ว จ ห า ต ำา แ ห น ง ข อ ง ค ร า บ ใ ช แ ส ง อ ล ต ร า ไ ว โ อ เ ล ต

(Ultraviolet lamp) ทำาการสองในหองมด

บรเวณชอง

2. การตรวจคราบอสจโดยหาตวอสจ, นำาอสจ3. การตรวจทางชวเคม หาสวนประกอบของนำาอสจ4. การตรวจเซลลของเยอบชองคลอด (ถาในกรณจากการรวม

ประเวณใหมๆ

ความเหนของแพทยในการสงเกตแยกหญงมการกระทำาชำาเราหรอรวมเพศหรอไม

ถามการรวมเพศจะตรวจพบวามหลกฐานของอวยวะเพศของผชาย ลวงลำาเขาไปในชอง คลอดของผเสยหาย เชน การฉกขาดของเยอพรมจารยใหมๆ ชดเจน หรอมการฉกขาดของผนงชองคลอดรวมกบการตรวจทางชวเคมพบสารเคมหรอการพบตวอสจ

ถากรณไมถกกระทำาชำาเราหรอไมมการกระทำาชำาเรา เชน ชองคลอดของผเสยหายมขนาดเลก (เชน เดก) เกนกวาทอวยวะเพศชายลวงลำาเขาไปได โดยไมทำาใหเกดบาดแผล และการตรวจอวยวะเพศของผเสยหายนน ไมมบาดแผลใดๆเลย

กรณอาจจะไมถกช ำาเรา เมอตรวจรางกายผเสยหายแลว ไมพบขอมลใดเลยทแสดงถงการรวมเพศ เชน ตรวจรางกายผเสยหายแลว ไมพบขอมลใดเลยทแสดงถงการรวมเพศ เชน ตรวจไมพบบาดแผลบรเวณอวยวะสบพนธไมพบตวอสจในชองคลอ ไมพบคราบอสจบรเวณใดๆเลย

การประมาณระยะเวลามการชำาเรา ถาพบมการฉกขาดของอวยวะสบพนธของผเสยหาย และมลมเลอด

เกาะอย หรอเลอดกำาลงไหลซมอย แสดงวามการชำาเราททำาใหเกดแผลนนจะเกดขนไมเกน 24 ชม. กอนทแพทยจะตรวจ

ถาพบวาการฉกขาดของอวยวะสบพนธของผเสยหายมคราบหนองเกดขน บางครงอาจมกลนเหมนแสดงวาการชำาเราททำาใหเกดแผลนนเกดขนเกนกวา 24 ชม. กอนแพทยตรวจ

ถาตรวจดวยกลองจลทรรศนพบตวอสจเคลอนไหวได แสดงวาการรวมเพศนาจะเกดขนภายใน 8 ชม.

ถาของเหลวในชองคลอดไมพบตวอสจแตพบสารเคมเพยงอยางเดยวแสดงวามการรวมเพศเกดขนภายใน 3 วนกอนการตรวจ

การพบตวอสจ ในชองคลอดจ ำานวนนอย และเป นตวอสจ ไม เคลอนไหวแลวแสดงวาการรวมเพศเกดขนภายใน 7 วนกอนการตรวจ

ความเปนไปไดในการตรวจพบอสจหลงจากการหลง อสจมชวต 6-12 ชม. ตวอสจ 24 ชม.- 7 วน

นำาอสจ Acid phosphatase [1]

o 24 ชม. ++++o 48 ชม.+++o 72 ชม.++

Prostate specific antigen (PSA ห ร อ P30) เ ป น glycoprotein ทผลตจากตอม prostatic[2] ซ งพบใน seminal fluid, prostatic fluid, male และ female urine สวน breast milk และ breast tumor จะพบ PSA ไดนอยมาก [3] ยนของ PSA อยท long arm ข อ ง chromosome 19 autosome PSA ค ว บ ค ม โ ด ย ฮ อ ร โ ม น androgen[4] ซงโดยปกตนน PSA ใชเปนตวบงชมะเรงตอมลกหมากหรอมเซลลทมการเจรญเตบโตทผดปกตของ prostatic หนาททผลตตวอสจ คอ ลกอณฑะ ภ า พ Prostate gland

ตวอสจ (spermatozoa) ประกอบดวยโครงสรางหลกไดแกสวนหวและหาง ซงมความสำาคญในการนำาสารพนธกรรม โดยสวนหวของอสจประกอบดวยสวนนวเคลยสทมเยอหมทบางและบรเวณ 2/3 ทางดานบนของหวนนพบสารทปกคมอยคลายหมวกเรยกวา acrosome ซงประกอบดวยเอนไซมตางๆ เชน hyalurodase เป นต น เพ อใช ในการยอยเปล อกไขน น เอง สวน flagellum ของตวอสจประกอบดวยสวน middle piece และสวนหางโดยพบวาโครงสรางของ flagellum มลกษณะคลาย cilia ซงสวน middle piece ประกอบไปดวย microtubules ทเรยกวา axoneme โดยการเคลอนไหวของ microtubule จะทำาใหเกดการเคลอนไหวของหางดวย พบวาในสวน middle piece นม mitocondria อยเปนจำานวนมาก และทำาหนาทการผลต ATP เพอเปนพลงงานผลตใหแก mitrotubules นอกจากนสวนทยาวทสดของตวอสจ เรยกวา chif piece และสวนปลายสดของมนเรยกวา end pice[5] การสรางต วอสจสรางจากเซลล ต นก ำา เน ดท อย ภายใน seminiferous tubule ซงเรยกวา spermatogonium เซลลตนกำาเนดนจะมโครโมโซมเทากบ 2n เซลลนจะมการ differentirate ไปเปน primary spermatocyte จากน นก แบงต วแบบ meiosis และมการลดจ ำานวนโครโมโซมเหลอ 1n กลายเปน secondary spermatocyte จากระยะนจะมการแบงตวเพมจำานวนแบบ mitosis กลายเปน spermatid และแกตวไปเปน spermatozoa ตอไปในทสด[6]

โครงสรางอสจ การ

แบงตวของอสจ

Sperm (ตวอสจ) Semen (น ำ4าอสจ)

นำาอสจ (semen หรอ seminal fluid) เปนของเหลวทมสวนผสมระหวางตวอสจและสารคดหลงจากตอมตางๆ ปรมาณของนำาอสจทหลงแตละครงประมาณ 3-5 ลกบาศกเซนตเมตร pH ของนำาอสจประมาณ 7.35-7.5 โดยมฤทธ เป นด างเล กน อย มสขาวข น กล นคาว เหน ยวขน เม อท งไว ประมาณ 10-15 นาท จะหายเหนยว ใน 1 ลกบาศกเซนตเมตร มตวอสจประมาณ 20-100 ลานตว

-Normosperia คอ ภาวะมจำานวนอสจปกต-Oligospermia คอ ภาวะมจำานวนอสจนอยกวาปกต

-Azoospermia คอ ภาวะทไมมอสจในนำาเชอเลย พบในคนททำาหมนแลว[5]

การสรางนำาอสจ นำาอสจประกอบดวยของประกอบสำาคญ 2 สวน1. สวนทเปนเซลล คอ ตวอสจ (spermatozoa) 2. สวนทเปนของเหลว คอ พลาสมา (seminal plasma)

อวยวะทเกยวของกบการสรางนำาอสจ อณฑะ (testis) Epididymis Vas deferens Seminal vesicle เ ป น ต อ ม ท ส ร า ง น ำา ค ด ห ล ง

(seminal plasma) ซงเปนแหลงทถกหลงออกไปและจะมปรมาตรประมาณ 70% ของนำาอสจทงหมดทถกหลงออกมาของเหลวจาก seminal vesicle

Prostate gland (ตอมลกหมาก) เปนตอมขนาดใหญททำาหนาทสรางนำาคดหลง (seminal plasma) และขบของเหลวประมาณ 20 % ของนำาอสจทหลงออกมา [6] ม 1 ตอมลกษณะคลายลกเกาลด อยชดดานลางกระเพาะปสสาวะของเหลวทหลงลกษณะคลายนม เปนดางซงเปนคณสมบตทจะชวยลดความเปนกรดของของเหลวจากตอม seminal vesicle และนำาเมอกในชองคลอด พบวาในคนแกตอมนมกโตหรอเกดเนองอกไดงาย ทำาใหไปเบยดทอปสสาวะทำาใหเกดการอดตนและตดเชอได ตองทำาการผาตดเอาตอมลกทงไป เรยกการผาตดดงกลาววา prostatectomy ตอมลกหมากยงหลงสารทชวยในการหลอมละลาย (liquefying agent) และหลงเอนไซม acid phoaphatase เอนไซมสามารถใชในการวเคราะหตอมลกหมากโต (prostatic hypertrophy) [5]

จากการศกษางานวจยหวเร อง PSA ทำาใหทราบวานอกจากม PSA ทใชตรวจหาอสจแล วยงม Sg (Semenogelin) เป นโปรตนขนาดใหญใน

seminal plasma ท ม า จ า ก seminal vesicles ซ ง Sg ท ำา ใ ห น ำาอสจ(semen) เกดการแขงตวและรกษาสภาพของตวอสจขณะทออกนอกรางกายขณะมเพศสมพนธกอนทจะกลายเปนของเหลวโดยมโปรตน 52 kDa เปนตวควบคม กระบวนการแขงตวนนหลงจากนน 20 นาท เกดการเอานำาออกกลายเปนของเหลวใสโดย PSA เปนตวทำาให Sg แยกแตกออกแลวไปรวมก บต วอ น Sg ใช ไม ได ในน ำาอสจท เสยสภาพ และยงเป น polyclonal antibody จะทำาใหเกด multiple reaction ตอนนไดพฒนา ELISA kit ใช MHS-5 เปน monoclonal ไมพบใน fluid อนพบทเย อบ seminal vesicle[7]

ในทางภมคมกนไดมการพฒนาวธการตรวจ PSA โดยวธทใชตรวจ PSA เ ช น Ouchterlony double diffusion, crossover electrophoresis, rocket immunoelectrophoresis, radial immuno diffusion และ ELISAโดยปรมาณทหา PSA โดย ELISA สามารถตรวจหา PSA ไดนอยกวา 4 ng/ml ซงกอนหนานไดใชวธการ anti specific membrane ตรวจหา PSA ใน serum เพอวนจฉยมะเรงตอมลกหมากหรอการเจรญเตบโตของ postatic ทผดปกต โดยคาทบงชความผดปกต คอ PSA > 4 ng/ml[2]

ปฏก รยาการใชแอนตเจนหรอแอนตบอดท ต ดฉลากดวยเอนไซม (Enzyme immunoassay-EIA)Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) หลกการของวธนค อ แอนตเจนหรอแอนตบอดเกาะอยบน solid phase เชน cellulose, polyacrylamind, nylon, polystyrene, polyvinyl ห ร อ polypropylene solid phase เหลานอาจอยในรปของ tube bead หรอ microplate และปฏกรยาในแตละขนตอนจะตองมการแยกเอาสารสวนเกนทไมไดทำาปฏกรยาออกไป จงเปนวธทมความไวและความจำาเพาะสง เอนไซมทนยมใชในวธการ ELISA คอ Horseradish peroxidase (substate ท น ย ม ค อ O-phenylene diamine ใ ห ส น ำา ต า ล ), alkaline phosphatase (substrate ทนยมคอ p-nitrophenyl phosphate ใหสเหลอง) เปนตน สำาหรบวธการ ELISA แบงไดหลายวธคอ

- Indirect method เปนวธการวธสำาหรบตรวจหาแอนตบอดตางๆ มหลกการคอ แอนตบอดจะทำาปฏกรยากบแอนตเจนทตดอยก บพนผวของ solid phase แ ละ ใช anti-human immunoglobulin ซ ง ต ด ฉ ล า ก

(conjugate) ดวยเอนไซม (enzyme-labelled detector antibody) ห ร อ อ า จ ใ ช anti-human immunoglobulin ท ไ ม ไ ด ต ด ฉ ล า ก เ ป น detector antibody แลวตามดวย enzyme-labeled anti-detector antibody เขาทำาปฏกรยากบแอนตบอดทต องการตรวจหานนการยอย substrate จะมากนอยเพยงใดขนอยกบประมาณของ Antibody ในสงสงตรวจ

- Double antibody sandwich method เป นวธการตรวจหา

แอนตเจน โดยการเคลอบพนผว solid phase ดวยแอนตบอด แอนตเจนในสงสงตรวจทำาปฏกรยากบแอนตบอด หลงจากนนจะเตมแอนตบอดซ งตดฉลากดวยเอนไซม (enzyme-labelled detector antibody) แลวตามดวย enzyme-labelled anti-detector ลงไปใหทำาปฏกรยาอกขนหนง วธนแอนตเจนจะอยตรงกลางม antibody ประกบลางบน

Indirect method

Competitive method

- Competitive method วธการน ตรวจหาได ท งแอนตเจนหรอแอนตบอด ถาตองการหาแอนตบอดทำาได 2 วธคอ

1. เคลอบ solid phase ดวยแอนตเจน หลงจากนนจะเตมแอนตบอดทตดฉลากดวยเอนไซมปรมาณแนนอนลงไปพรอมกบสงสงตรวจซงคาดวาจะมแอนตบอดอยลงไป ใหแยงกนจบแอนตเจนทอยท solid phase

2. เคลอบ solid phase ดวยแอนตบอด หลงจากนนจะเตมแอนตเจนทตดฉลากดวยเอนไซมลงไป พรอมกบสงสงตรวจซงคาดวาจะมแอนตบอดอยลงไปใหแอนตบอดทงสองแยงกนจบกบแอนตเจนทตดฉลาก และมปรมาณจำากดทเตมลงไปนน ถาตองการหาแอนตเจนกทำาได 2 วธเชนกนคอ

- เคล อบ solid phase ดวยแอนตบอด หล งจากน นจะเต มแอนตเจนทตดฉลากดวยเอนไซมปรมาณแนนอนลงไปพรอมกบสงสงตรวจซ งคาดวาจะมแอนตเจนอยลงไป ใหแยงก นจบก บแอนตบอดทอยท solid phase- เคล อบ solid phase ดวยแอนตเจน หล งจากน นจะเต มแอนตบอดทตดฉลากดวยเอนไซมไปพรอมกบสงสงตรวจซงคาดวาจะมแอนตเจนอยลงไป โดยใหแอนตเจนทงสองแยงกนจบกบแอนตบอดทตดฉลากและมปรมาณจำากดทเตมลงไปนน

ปรมาณ substrate ทถกยอยจะเปนสดสวนกบปรมาณแอนตเจนหรอแอนตบอดในสงสงตรวจนนนอกจากน ยงมการดดแปลงวธการ ELISA ออกไปอก เชน การใชวธ Anti-IgM method เพอการตรวจหา specific IgM หรอ Inhibition method ในการตรวจหาแอนตเจนตางๆ เปนตน

เนองจากมความไวและความจำาเพาะสงมากทงยงไมมอนตรายจากสารทได จงเปนวธการทนยมใชกนอยางกวางขวางในการหาแอนตเจนและแอนตบอดชนดตาง ๆ เชน

- แอนตบอดตอเชอจลชพตางๆ เชน แอนตบอดตอ Rubella ไวรสตบอกเสบบ หรอ โรคตดตอเชอปรสตตางๆ เปนตน- Autoantibodies ช น ด ต า ง ๆ เ ช น anti DNA, antithyroglobin, Rheumatiod fector เปนตน

Double antibody sandwich method

- Oncofetal antigen เ ช น alpha-fetoprotein, carcinoembryonic antigen- แอนตเจนตอจลชพ เชน HBs Ag, Rotavirus เปนตน- ฮอรโมนและยาตางๆ

Dot or line immunoassayจากเทคนค ELISA ซงเปนการทดสอบในไมโครเพลท แตมขอ

จำากดในดานอปกรณ เคร องมอในการอานผลทำาใหมการพฒนาการเพอใหสามารถนำาหลกการดงกลาวมาใชทางระบาดวทยา หรอเพอความสะดวกในการนำาไปใชในภาคสนาม โดยการทำา ELISA บนกระดาษ ซ งเรยกวา Dot ELISA ความแตกตางของวธการด งกลาวค อ ตวกลางยดเกาะ (solid phase) เปลยนจากพนผวไมโครเพลทหรอเมด particle มาเปนกระดาษชนด nitrocellulose หรอ nylon ท ม ค ณสมบต ในการยดจ บ โปรต นหร อ immunoglobulin แทนและ substrate ท ใช จ ะ เป นชน ด insoluble substrate ซงเมอทำาปฏกรยาแลวจะเกดการตกตะกอนลงมาเกาะบนผวกระดาษและปรากฏสสำาหรบการอานผล หลกการดงกลาวในปจจบนพฒนาวธรวมกบหลกการดดซบ (chromatography) โดยเปลยนคอยจเกตจากเอนไซม มาเปนสารททำาใหเกดส เชน ผงทอง (colloidal gold) มชอเรยกจำาเพาะวา Immunochromatography ลกษณะผลตภณฑทดสอบโดยหลกการดงกลาวไดแก การตรวจวนจฉยการตดเชอ HIV, ไวรสตบอกเสบบ ทอยในรปของแถบกระดาษอานผล (strip)[8]

วธการทดลองและอปกรณ

ในงานศกษาวจยนไดทำาการวเคราะหสงสงตรวจทไดสงทำาการพสจนท หองปฏบตการพยาธวทยา คณะแพทยศาสตร โรงพยาบาลรามาธบด มหาวทา

Immunochromatography

ลยมหดล ซงเปนสงสงตรวจทเกบจากชองคลอดในคดขมขนระหวางเดอนเมษายน-สงหาคม 2006 สงสงตรวจนนไดมาทำาการวเคราะหดวยวธการ rapid one step immunochromatographic เปรยบเทยบกบ ELISA วธทงสองนใชการดกลองตรวจหาตวอสจเปน gold standard

สงสงตรวจจำานวน 100 ตวอยาง คำานวณในสตร

N = ทระดบความเชอมน 96%

เมอ N = ขนาดจำานวนขอมลของสงสงตรวจจากชองคลอดในคดขมขนทพบตวอสจ

d = ความผดพลาดทยอมรบได (ผวจยเปนผก ำาหนดให d=0.05)

z = คาทไดจากตารางแจกแจงปกต= 1.96P = สดสวนประชากรของลกษณะทสนใจ

โดยท xi =

คาทคำานวณไดคอ N = 59 = ; = 0.05 หรอ 1- (alpha error

two-tailed) Z = Z0.975 = 1.96 [9]

มการศกษากอนหนานพบวา 67.5% ทพบตวอสจจากสงสงตรวจทเกบจากชองคลอด ดงนนจงใชตวอยางอยางนอยทสด 87 ตวอยาง ดงนนทางทมผวจยจงไดตดสนใจใชสงสงตรวจจำานวน 100 ตวอยาง มาทำาการวจยในครงน

Swab แบบ cotton นำามาเกบสงสงตรวจ vaginal swab และจากกระดาษกรองทมพนท 0.3 x 0.3 cm นำา cotton swab และกระดาษกรอง ใสในหลอดทดลองทมนำากลน (DW) 2 ml ป นเหวยง 3 นาท จากนนดดสารละลายทไดมา 100 µl แลวนำาไปทดสอบดวย rapid test kit และ ELISA โดยทผลการทดลองของ PSA ทง rapid one step immunochromatographic assay kit และ ELISA มาทำาการตรวจสอบหาตวอสจโดยการดกลอง (gold standard) โดยเปรยบเทยบ

sensitivity, accuracy, positive predictive value, negative predictive value ของ PSA ดงตาราง

ผลการทดลองผลการทดสอบของสงสงตรวจจากชองคลอดในคดขมขนจำานวน 100

ตวอยาง ทตรวจพบอสจจากกลองและตรวจหา PSA โดยวธการ rapid one step immunochromatographic assay kit และ ELISA ซงแสดงในตาราง 2x2 ในตารางท1 และ 2

ตารางท 1 เปรยบเทยบระหวาง rapid one step test kit กบการตรวจหา ตวอสจจากกลองจลทรรศน

ตารางท 2 ตารางเปรยบเทยบระหวาง ELISA กบการตรวจหาตวอสจจาก

กลองจลทรรศน

วจารณการทดลอง

ในงานดานทางนตวทยาศาสตรการตรวจหาอสจและนำาอสจจากสงสงตรวจจากชองคลอดเปนขนตอนทสำาคญสำาหรบการคนหาหลกฐานเพอดความสมพนธในคดขมขน ในการตรวจหาจากการดกลองจลทรรศนตรวจหาตวอสจ สวนการตรวจหานำาอสจสวนใหญกระทำาโดยการใชวธการตรวจหาสารชวเคมทผล ตจากสวนของ prostate gland โดยท Florence test, Barbeiro test, Choline test, Zinc test, LDH isoenzyme method, Ammonium molybdate test, Creatinine phosphokinase test และ acid phosphatase test เปนวธทใชในการตรวจหาสารชวเคมในนำาอสจ แตอยางไรกตามยงคงใชการทดสอบแบบ Acid phosphstase และเมอไมนานมานในประเทศทพฒนาแลวใชวธการทดสอบแบบ rapid one step PSA เพอการตรวจแยกใน seminal fluid ซงไดใชกนอยางกวางขวาและอยางทไดกลาวขางตนทางทมงานผวจยจงมจดประสงคทอยากใหกาตรวจแบบ rapid PSA test นำามาใชในงานประจำาทางนตวทยาศาสตรในประเทศไทย

ในการวจยศกษาครงนเปนการแสดงผลการทดสอบวธการแบบ rapid one step test และ ELISA เพอตรวจหา PSA ซงทงสองวธนนเปรยบเทยบกบวธการแบบ gold standard นน คอการดอสจดวยกลองจลทรรศน คาทไดจาก rapid one step test kit และ ELISA คอ sensitivity 85 %และ 83%, specificity 85 %แ ล ะ 85 % , accuracy 85 % แ ล ะ 85%, positive predictive value 89% และ 89% , negative predictive value79 % และ 77% ผลการทดลองของวธทงสองนนเมอเปรยบเทยบแลวไมมความแตกตางกนยกเวนแต sensitivity และ negative predictive value ทสงเกตไดวาคาการคำานวณของ rapid kit ดกวา ELISA

ในการศกษาระดบสากลกอนนไดมการศกษา PSA rapid membrane test ซงผลทไดคอคา sensitivity คลายกบคาทไดจาก ELISA ทซง ณ ตอนนในหองปฏบตการทางนตวทยาศาสตรไดใชในการตรวจ PSA

ทมผวจยเชอวาการตรวจหา PSA ซงไดจากสงตรวจของเหยอในคดขมขน โดยวธการ rapid one step test kit เปนวธการทมประสทธภาพเมอดจากผลการเปรยบเทยบทงสองวธและวธการนมวธการทำาทงายไมจำาเปนตองใชผ

เชยวชาญ ราคาไมสง ซงทมงานผวจยอยากขอเสนอใหน ำามาใชในงานบรการประจำาทางนตวทยาศาสตรและเปนวธทใชยนยนในการสบสวน semen ได

สรปผลการทดลองการวจยครงนนำาตวอยางทไดจากชองคลอดของเหยอในคดขมขน 100

ตวอยาง นำาไปวเคราะหเปรยบเทยบวธการตรวจหา PSA ดวย rapid one step test kit และ ELISA ทสวนของพยาธวทยา คณะแพทยศาสตร รพ.รามาธบด ระหวาง เมษา-สงหาคม 2006 ผลการทดสอบ sensitivity และ negative predictive value ของ rapid one step test kit ดกวา ELISA นอกจากน rapid one step kit test การทดสอบรวดเรวและปลอดภย จากการคนควาครงทางทมผวจยเชอวา rapid one step test kit นำามาใชการตรวจ PSA ในชองคลอดในคดขมขนกระทำาชำาเราททำาในงานประจำาไดอยางเหมาะสม

เอกสารอางอง1. พ .ต .ต .นพ . พรชย สธคณ . เอกสารค ำาสอนรายวชา น ต เวชศาสตร เร อง

อาชญากรรมทางเพศ สถาบนนตเวชศาสตร. สำานกงานตำารวจแหงชาต2. Hochmeister M, Rudin O, Borer UV, Kratzer A, Gehrig CH, et al. Evaluation of prostate

specific antigen (PSA) membrane tests for the forensic identification of semen.3. B.C.M. Pang, B.K.K. Cheung. Identification of human semenogelin in membrane strip test

as an alternative method for thedetection of semen. Forensic Science International 169 (2007) 27-31

4. Sato I, Sagi M, Ishiwari A, Nishijima H, Ito E, Mukai T. Use of the “SEITEST” PSA card to identify the presence of prostate specific antigen in semen and male urine. Forensic Science International 2002; 127 :71-4

5. ผศ.บงอร ฉางทรพย. กายวภาคศาสตร สรปเนอหาเชงระบบเลม 2. สาขาวชาวทยาศาสตรทางการแพทย คณะวทยาศาสตรและเทคโนโลย มหาวทยาลยเฉลมพระเกยรต.หนา 445-468

6. เอกสารคำาสอนวชา MT 3252 การตรวจปสสาวะและสารนำาในรางกาย กลมวชาจลทรรศนคลนก คณะเทคนคการแพทย มหาวทยาลยหวเฉยวเฉลมพระเกยรต. หนา 44-51

7. Sato I, Yoshiike M, Yamasaki T, Yoshida K, Takano S, Mukai T, et al. A dot-blot-immunoassays for semen identification using a polyclonal antibody against semenogelin, a powerful seminal marker. Forensic Science International 2001; 122: 27-34

8. ศราวธ สทธรตน และทวพร พนธพาณชย, เอกสารคำาสอนวชา ภมคมกนวยาพนฐาน. คณะเทคนคการแพทย มหาวทยาลยหวเฉยวเฉลมพระเกยรต. หนา 148-152

9. กลยา วาณชยบญชา. การวเคราะหสถต: สถตสำาหรบการบรหารและวจย.พมพครงท 6. กรงเทพฯ . ภาควชาสถต คณะพาณชยศาสตรและการบญช จฬาลงกรณมหาวทยาลย. 2539

10. พนตำารวจโท กฤษฎา รมรวบทรพย. เอกสารประกอบคำาสอน เร องการตรวจวเคราะหดเอนเอในคดขมขนและวตถพยานทเกยวของ . คณะวทยาศาสตร สาขานตวทยาศาสตร มหาวทยาลยศลปกร

11. รองศาสตราจารย พพฒน ลกษมจรลกล. วทยาการระบาด. ภาคจลชววทยา คณะสาธารณสขศาสตร มหาวทยาลยมหดล. หนา 51-58