Page 1
118 วารสารวิชาการเกษตร ปีที่ 33 ฉบับที่ 2 พฤษภาคม - สิงหาคม 2558
เชื้อรา Aspergillus f lflavus สายพันธุ์ใหม่ที่ไม่สร้างสารพิษและศักยภาพการควบคุม
การเจริญเติบโตของเชื้อราที่สร้างสารพิษและยับยั้งสารแอฟลาทอกซินบี 1 ในข้าวโพด
Novel strains of Non-toxigenic Aspergillus flf lavus and their Potential to
Control Fungal Growth and Af lflatoxin B1 Production in Maize
อัจฉราพร ศรีจุดานุ1/ สุพี วนศิรากุล1/ มัทนา วานิชย์2/
Atcharaporn Srijudanu1/ Su-phi Wanasirakul1/ Mattana Wanich2/
ABSTRACT
Aspergillus spp. were isolated from soil and agricultural product of 25 provinces
across Thailand by soil dilution spread plate technique and agar plate method using
DG18 medium. The isolates were identified for morphological character using microscopy.
The Aspergillus spp. found in this study were A. flavus (602 isolates), A. tamarii (97
isolates) and A. nomius (20 isolates). Strains of A. flavus were preliminary screened for
aflatoxin production strains using coconut agar method. After 5 days of incubation in the
dark, plates were examined under UV light at 365 nm. Plate contained aflatoxin-producing
strains showed luminescent blue colour. One hundred and seven strains which did not
show blue colour were selected. The strains were re-checked for their ability to produce
aflatoxin using YES medium. Only 2 isolates did not produce aflatoxin. Two non-aflatoxin
producing strains (No. 400 and 561) were tested for antagonistic efficacy to control
aflatoxin-producing strains (A. flavus No. A39) by competition plate method. Strains No.
400 and 561 could suppress A39 strain which resulted to reduction of AFB1 contents for
100 and 99.1%, respectively. These two strains were genetically identified as A. flavus..
before being applied to maize for controlling aflatoxin-producing strains. Maize confined
1/ กองวิจัยและพัฒนาวิทยาการหลังการเก็บเกี่ยวและแปรรูปผลิตผลเกษตร กรมวิชาการเกษตร จตุจักร กทม. 109001/ Post-harvest and Processing Research and Development Division, Department of Agriculture, Chatuchak, Bangkok
10900 Thailand.2/ ศูนย์วิจัยพืชไร่ขอนแก่น สถาบันวิจัยพืชไร่และพืชทดแทนพลังงาน กรมวิชาการเกษตร จ.ขอนแก่น 400002/ Khon Kaen Field Crops Research Center, Field Crops and Energy Renewable Crops Research Institute, Department of
Agriculture, Khon Kaen province, 40000 Thailand.
Page 2
Thai Agricultural Research Journal Vol. 33 No. 2 May - August 2015 119
with A. flavus No. 400 and 561 contained
AFB1 concentrations lower than control
group for 83.92 and 97.43 %. The result
indicated that A. flavus No. 400 and 561
could be a novel strain of non-toxigenic
fungi found in Thai land to repress
aflatoxin-producing strain of A. flavus
resulting to low contamination of aflatoxin in
maize.
Key words: Aspergil lus f lavus non-
toxigenic strains, aflatoxin B1, biocontrol,
maize
บทคัดย่อ
แยกเชื้อราสกุล Aspergi l lus จาก
ตัวอย่างดินและผลิตผลเกษตร ในพื้นที่ 25
จังหวัดของประเทศไทย โดยใช้วิธี Soil dilution
spread plate technique และ Agar plate
method บนอาหารเลี้ยงเชื้อ Dichloran
Glycerol (DG 18) และจำแนกโดยใช้ลักษณะ
ทางสัณฐานวิทยาภายใต้ กล้ องจุ ลทรรศน์
สามารถแยกได้เชื้อรา Aspergillus flavus 602
ไอโซเลท (83.7%) A. tamarii 97 ไอโซเลท
(13.5%) A. nomius 20 ไอโซเลท (2.8%) เมื่อ
นำเชื้อรา A. flavus มาตรวจสอบการสร้างสาร
พิษเบื้องต้นบนอาหาร Coconut agar ในที่มืด 5
วัน เพื่อคัดแยกเชื้อราที่มีการสร้างสารแอฟลา
ทอกซินซึ่งจะเกิดการเรืองแสงสีฟ้าน้ำเงินภายใต้
แสงอัลตราไวโอเลตที่ช่วงคลื่น 365 นาโนเมตร
พบเชื้อรา A. flavus ที่ไม่มีการเรืองแสงจำนวน
123 ไอโซเลท นำเชื้อรามาทดสอบการสร้างพิษ
ในอาหารเหลว YES เพื่อยืนยันผลอีกครั้ ง
สามารถคัดเลือกได้เชื้อรา A. flavus จำนวน 2
ไอโซเลท (400 และ 561) เท่านั้นที่ไม่มีการสร้าง
สารพิษ นำเชื้อราทั้งสองไอโซเลทมาทดสอบ
การเป็นปฏิปักษ์โดยวิธี Competition plate
method บนอาหาร Potato dextrose agar
เป็นเวลา 7 วัน พบว่าเชื้อรามีการเจริญเติบโต
เร็วและสามารถยับยั้งการเจริญเติบโตของเชื้อรา
A. flavus สายพันธุ์ที่สร้างสารพิษ (A39) ได้
เมื่อนำมาทดสอบการเป็นปฏิปักษ์ โดยวิธี Dual
culture method ในอาหารเหลว YES เป็นเวลา
14 วนั พบวา่ A. flavus ไอโซเลท 400 และ 561
สามารถลดปริมาณสารพิษ ได้ 100 และ 99.1%
ตามลำดับ จากนั้นนำเชื้อราไปตรวจวิเคราะห์
ดีเอ็นเอ และจำแนกชนิดเชื้อราด้วยเทคนิค
ชวีโมเลกลุ เชือ้ราทัง้ 2 ไอโซเลตเปน็ A. flavus นำ
มาทดสอบประสิทธิภาพการเป็นปฏิปักษ์กับเชื้อ
ราที่สร้างสารพิษในเมล็ดข้าวโพด พบวา่สามารถ
ลดปรมิาณสารแอฟลาทอกซนิ บ ี1 ในข้าวโพดได้
83.92 และ 97.43% ผลการทดลองแสดงให้
เห็นว่า A. flavus ไอโซเลท 400 และ 561 ไม่
สร้างสารพิษเป็นเชื้อราสายพันธุ์ใหม่ที่พบใน
ประเทศไทย มีประสิทธิภาพในการเป็นปฏิปักษ์
กบัเชือ้ราทีส่รา้งสารพษิ ทำใหส้ารแอฟลาทอกซนิ
ลดลง สามารถใช้ควบคุมการปนเปื้อนของเชื้อรา
และสารพิษในข้าวโพดได้
Page 3
120 วารสารวิชาการเกษตร ปีที่ 33 ฉบับที่ 2 พฤษภาคม - สิงหาคม 2558
คำหลกั: Aspergillus flavus สายพนัธุท์ีไ่มส่รา้ง
สารพษิ, แอฟลาทอกซนิ บี 1, ข้าวโพด
คำนำ
ปัจจุบันประเทศไทยพบการปนเปื้อน
แอฟลาทอกซินในผลิตผลเกษตรหลายชนิด
แอฟลาทอกซินเป็นสารประกอบทุติยภูมิสร้าง
โดยเชื้อราสกุล Aspergillus เช่น Aspergillus
flavus และ A. parasiticus แอฟลาทอกซินที่
พบตามธรรมชาตมิอียู ่4 ชนดิ คอื แอฟลาทอกซนิ
บี 1 (AFB1) แอฟลาทอกซิน บี 2 (AFB
2)
แอฟลาทอกซนิ จ ี1 (AFG1) และแอฟลาทอกซนิ
จี 2 (AFG2) แต่แอฟลาทอกซิน บี 1 มีความ
สำคัญและก่อให้เกิดพิษรุนแรงทั้งในคนและสัตว์
โรคที่ตรวจพบในคน ได้แก่ โรคมะเร็งตับ โรคตับ
อักเสบ โรคตับแข็ง โรคสมองอักเสบ (IARC,
1993) แอฟลาทอกซินเป็นสารที่ก่อให้เกิดมะเร็ง
คณะกรรมาธกิารยโุรป (European Commission)
จึงมีข้อกำหนดระดับการปนเปื้อนสูงสุดของ
แอฟลาทอกซิน บี 1 ในอาหารบริโภค ได้ไม่เกิน
2 μg/kg (EU Regulation Commission,
2010) สำหรับประเทศไทยมีข้อกำหนดระดับการ
ปนเปือ้นสงูสดุ 20 μg/kg (กระทรวงสาธารณสขุ,
2529) เนื่องจากการปนเปื้อนสารพิษจากเชื้อรา
ในผลิตผลเกษตรหลังการเก็บเกี่ยวส่งผลกระทบ
ต่อสุขอนามัยของผู้บริโภคโดยตรง และถูกนำมา
ใช้เป็นเครื่องมือกีดกันทางการค้าทั้งในประเทศ
และระหว่างประเทศ เพื่อลดการใช้สารเคมี และ
แก้ปัญหาการปนเปื้อนสารพิษจากเชื้อรา จึง
พัฒนาวิธีการควบคุมแบบชีววิธี โดยการนำเชื้อ
รา A. flavus สายพันธุ์ที่ไม่สร้างสารพิษมา
ประยุกต์ใช้ควบคุมเชื้อราที่สร้างสารพิษในหลาย
ประเทศ (Cleveland et al., 2003)
มีการนำเชื้อราสกุล Aspergillus มาใช้
ประโยชน์ในการควบคุมเชื้อราที่สร้างสารพิษโดย
มีกลไกรบกวนการสร้างเอนไซม์ที่จำเป็นต่อ
กระบวนการสรา้งสารพษิ ในประเทศสหรฐัอเมรกิา
มีงานวิจัย พบวา่เชือ้รา A. flavus สายพนัธุ ์AF36
(NRRL18543) สามารถควบคุมเชื้อรา A. flavus
สายพันธุ์ที่สร้างสารพิษ (Atehnkeng et al.,
2008) และนำเชื้อรา A. flavus ที่ไม่สร้างสาร
พิษมาใช้ในการควบคุมเชื้อราที่สร้างสารพิษใน
พืชสําคัญทางเศรษฐกิจหลายชนิด ได้แก่ ฝ้าย
ถั่วลิสง ข้าวโพด มะเดื่อฝรั่ง และพิสตาชิโอ
เป็นต้น เชื้อรา A. flavus สายพันธุ์ที่ไม่สร้างสาร
พิษ เป็นเชื้อราที่มีการวิจัยมากที่สุด และมีการนํา
ไปใช้ควบคุมเชื้อรา A. flavus สายพันธุ์ที่สร้าง
สารพิษมากที่สุด เนื่องจากเป็นเชื้อจุลินทรีย์ที่
แสดงศักยภาพในการควบคุมดีที่สุด โดยเชื้อรา
A. f lavus สายพันธุ์ที่ ไม่สร้างสารพิษ เป็น
จุลินทรีย์ที่มีความเฉพาะเจาะจงสูงต่อเชื้อรา
เป้าหมาย ปลอดภัยต่อมนุษย์ สัตว์ ศัตรู
ธรรมชาติที่มีประโยชน์ และต่อสิ่งแวดล้อม ได้
ผ่านการทดสอบจาก US Environmental
Protection Agency ประเทศสหรัฐอเมริกาเป็น
ที่ยอมรับและนําไปใช้ในประเทศที่พัฒนาแล้ว
ประเทศไทย Ehrlich et al. 2006 พบ
เชื้อรา A. f lavus , A. nomius และ
A. psudotamarii สายพันธุ์ที่สร้างสารแอฟลา
ทอกซินในดินปลูกพืชไร่ แสดงว่าโอกาสปน
Page 4
Thai Agricultural Research Journal Vol. 33 No. 2 May - August 2015 121
เปื้อนเชื้อราและสารพิษในผลิตผลพืชไร่ของไทย
มีสูงแม้ว่าประเทศไทยจะพบเชื้อรา A. flavus
ชนิดที่เป็นโทษ อย่างไรก็ตามยังมีการค้นพบเชื้อ
รา A. flavus ที่เป็นประโยชน์ สามารถแย่ง
อาหารกับเชื้อราชนิดที่สร้างสารพิษ แต่ใน
ประเทศไทยยังไม่มีการใช้เชื้อรา A. flavus สาย
พันธุ์ไม่สร้างสารพษิในการยบัยัง้การสรา้งแอฟลา
ทอกซิน งานวิจัยครั้ งนี้มีวัตถุประสงค์ เพื่อ
คัดเลือกเชื้อรา A. flavus สายพันธุ์ที่ไม่สร้างสาร
พิษจากดิน และผลิตผลเกษตรของประเทศไทย
มีประสิทธิภาพในการยับยั้งการปนเปื้อนของเชื้อ
รา A. flavus และการสร้างแอฟลาทอกซินใน
ผลิตผลเกษตร
อุปกรณ์และวิธีการ
1. เก็บตัวอย่างดินและผลิตผลเกษตร และการ
คัดแยกเชื้อรา A. flavus
เก็บตัวอย่างดินและผลิตผลเกษตรใน
พื้นที่ 25 จังหวัดของประเทศไทย จำนวน 206
แปลง ๆ ละ 5 จุด นำมาแยกเชื้อด้วยวิธี Soil
dilution spread plate technique นำตัวอย่าง
ดินจากแหล่งต่าง ๆ มาเจือจางในน้ำกลั่นที่นึ่งฆ่า
เชื้อ หรือ 0.85% normal saline สเปรดลงบน
ผิวหน้าอาหารเลี้ยงเชื้อ DG18 บ่มไว้ที่อุณหภูมิ
ห้อง เป็นเวลา 7 วัน ทำการเก็บเมล็ดถั่วลิสง
ข้าวโพด เมล็ดธัญพืช และผลิตผลเกษตรจาก
แหล่งต่าง ๆ มาแยกเชื้อด้วยวิธี Agar plate
method โดยนำเมล็ดมาวางบนอาหารเลี้ยงเชื้อ
DG 18 เป็นเวลา 7 วัน คัดเลือกโคโลนีที่เป็น
สีเหลืองอมเขียว ซึ่งเป็นลักษณะของเชื้อรากลุ่ม
Aspergillus section Flavi หลังจากนั้นแยกเชื้อ
ราให้บริสุทธิ์ นำมาเลี้ยงบนอาหาร Malt
Extract Agar (MEA) และ Czapek’s Dox
Agar (CZA) ในหลอดทดลอง เก็บที่อุณหภูมิ
25 ํซ นาน 48 ชม.
2. จำแนกเชื้อรากลุ่ม Aspergillus section
Flavi โดยสัณฐานวิทยา
ทดสอบลักษณะการเจริญของเชื้อราบน
อาหาร CZA นำมาจำแนกลักษณะทางสัณฐาน
วิทยาใต้กล้องจุลทรรศน์เพื่อบ่งชี้ชนิด โดยเปรียบ
เทียบกับคู่มือการจำแนกเชื้อรา Klich (2002)
และเชื้อมาตรฐาน 2 ชนิด ได้แก่ A. oryzae
(TISTR3019) จากสถาบันวิจัยและพัฒนา
วิทยาศาสตร์ ประเทศไทย และ A. flavus สาย
พันธุ์ที่สร้างสารพิษ (A39) จากกองวิจัยและ
พัฒนาวิทยาการหลังการเก็บเกี่ยว และแปรรูป
ผลิตผลเกษตร กรมวิชาการเกษตร ทดสอบชนิด
ของเชือ้ราบนอาหารคดัเลอืก (Selective medium)
Aspergillus flavus and parasiticus Agar
(AFPA) บ่มที่อุณหภูมิ 30 ํซ เป็นเวลา 7 วัน
แยกและจำแนกชนิดเชื้อรา A. flavus และ A.
parasiticus ตามวิธีการของ Pitt et al., (1983)
3. ทดสอบการสรา้งสารพษิของเชือ้รา A. flavus
ที่คัดเลือกได้
3.1 ทดสอบการสร้างสารพิษบนอาหาร
Coconut Agar (CCA) เตรียมสารแขวนลอย
สปอร์ของเชื้อรา Aspergillus ในน้ำกลั่นผสม
0.05%Tween 80 ปริมาณสปอร์ 108 สปอร์/มล.
Page 5
122 วารสารวิชาการเกษตร ปีที่ 33 ฉบับที่ 2 พฤษภาคม - สิงหาคม 2558
หยดสปอร์ลงบนอาหาร CCA บ่มที่อุณหภูมิ
30 ํซ ในที่มืดเป็นเวลา 5 วัน หลังจากนั้นนำจาน
เลี้ยงเชื้อรามาส่องภายใต้แสงอัลตราไวโอเลตที่
ช่วงคลื่น 365 นาโนเมตร ถ้าเชื้อรามีการสร้าง
สารพิษจะมีการเรืองแสงสีฟ้าน้ำเงินบนอาหาร
เปรียบเทียบกับชุดควบคุม (เชื้อรา A. flavus
สายพันธุ์ที่สร้างสารพิษ A39) ทดสอบเชื้อรา
ไอโซเลทละ 2 ซ้ำ
3.2 ทดสอบการสร้างสารพิษในอาหาร
เหลว Yeast Extract Sucrose (YES) นำ
สารละลายสปอร์ของเชื้อรา A. flavus ไอโซเลท
ที่ไม่สร้างสารพิษ ที่คัดเลือกจากข้อ 3.1 แต่ละ
ไอโซเลทปริมาตร 5 ไมโครลิตร มาเลี้ยงใน
อาหารเหลว YES ปริมาตร 9 มล. เป็นเวลา 14
วัน นำส่วนของอาหารเหลวมาตรวจสอบปริมาณ
สารแอฟลาทอกซนิ โดยชดุทดสอบ DOA-aflatoxin
ELISA Test Kit (Chinaphuti et al., 2002)
เปรียบเทียบกับชุดควบคุม (เชื้อรา A. flavus
สายพันธุ์ที่สร้างสารพิษ A39) กรรมวิธีละ 2 ซ้ำ
4. ประสิทธิภาพของเชื้อรา A. flavus สาย
พันธุ์ที่ไม่สร้างสารพิษในการยับยั้งการเจริญของ
เชื้อราสายพันธุ์ที่สร้างสารพิษและยับยั้งการ
สร้างสารแอฟลาทอกซินในระดับห้องปฏิบัติการ
4.1 ทดสอบการเป็นปฏิปักษ์ โดยวิธี
Competition plate method นำเชือ้ราไอโซเลท
ที่ไม่สร้างสารพิษที่คัดเลือกได้จากข้อ 3.2 แต่ละ
ไอโซเลทมาเลีย้งบน อาหาร PDA ประมาณ 4-5 วนั
หลังจากนั้นใช้ Cork Borer ขนาดเส้นผ่าน
ศูนย์กลาง 4 มม. ตัดชิ้นวุ้นที่มี เส้นใยของ
เชื้อรามาวางในจานทดสอบที่มีชิ้นเส้นใยของ
เชื้อรา A. flavus สายพันธุ์ที่สร้างสารพิษ (A39)
อยู่ด้วย โดยวางทั้งหมด 4 ตำแหน่ง บ่มจาน
ทดสอบไว้ที่อุณหภูมิ 30 ํซ เป็นเวลา 7 วัน วดั
เสน้ผา่นศนูยก์ลางของโคโลน ีA. flavus ที่สร้าง
สารพิษเปรียบเทียบกับชุดควบคุมที่ ไม่ได้ใส่
A. flavus สายพันธุ์ที่ไม่สร้างสารพิษ ทำการ
ทดสอบกรรมวิธีละ 3 ซ้ำ คำนวณเปอร์เซ็นต์
ยับยั้งการเจริญของเชื้อรา (Percent inhibition
of colony growth, PIRG) โดยใช้สูตร
(R
1 - R
2)
PIRG = x 100
R
1
เมื่อ R1 คือ ค่าเฉลี่ยรัศมีของเชื้อรา
A. flavus สายพันธุ์ที่สร้างสารพิษในจานเลี้ยง
เชื้อที่ไม่มีเชื้อราสายพันธุ์ที่ไม่สร้างสารพิษ และ
R2 คือ ค่าเฉลี่ยรัศมีของเชื้อรา A. flavus สาย
พันธุ์ที่สร้างสารพิษในจานเลี้ยงเชื้อที่มีเชื้อราสาย
พันธุ์ที่ไม่สร้างสารพิษ
4.2 ทดสอบประสิทธิภาพยับยั้งการ
สร้างสารแอฟลาทอกซินโดยวิธี Dual culture
method นำเชื้อราที่คัดเลือกไปเลี้ยงในอาหาร
เหลว YES พร้อมกับเชื้อรา A. flavus สายพันธุ์
ที่สร้างสารพิษ (A39) เป็นเวลา 14 วัน นำสาร
สกัดที่อยู่ในอาหารเหลวมาทดสอบปริมาณสาร
แอฟลาทอกซินโดยวิธี ELISA เปรียบเทียบกับชุด
ควบคมุ ทดสอบกรรมวธิลีะ 2 ซำ้ คำนวณปรมิาณ
สารแอฟลาทอกซินบี 1 ที่ลดลงโดยใช้สูตร
Page 6
Thai Agricultural Research Journal Vol. 33 No. 2 May - August 2015 123
เปอร์ เซ็นต์การยับยั้ งการสร้างสารพิษ (%
Reduction) ดังนี้
(C - T)
% Reduction = x 100
C
เมื่อ C คือ ปริมาณสารพิษของเชื้อราใน
ชุดควบคุม และ T คือ ปริมาณสารพิษของเชื้อ
ราในชุดทดสอบ
5. จำแนกเชื้อราโดยเทคนิคอณูพันธุศาสตร์
5.1 การสกดัดเีอน็เอ นำสารละลายสปอร ์
ของเชื้อราที่คัดเลือกแต่ละไอโซเลทมาเตรียมเชื้อ
บริสุทธิ์โดยเลี้ยงบนอาหาร Malt Extract Agar
(MEA) ย้ายโคโลนีเดี่ยวของเชื้อรามาเลี้ยงใน
อาหาร Malt Extract Broth (MEB) ปริมาตร
250 มล. ในขวดลูกชมพู่ขนาด 500 มล. เขย่า
ความเร็ว 100 รอบ/นาที ที่อุณหภูมิ 25 ํซ เป็น
เวลานาน 72 ชม. นำเส้นใยเชื้อราบริสุทธิ์
น้ำหนัก 1 ก. ไปสกัด DNA ด้วยชุดน้ำยา
DNeasy® Plant Mini Kit (QIAGEN, USA)
5.2 การจัดลำดับยีน และการวิเคราะห์
ลำดับเบส ส่งดีเอ็นเอเชื้อรา Aspergillus ไป
วิเคราะห์หาลำดับเบสที่ศูนย์พันธุวิศวกรรมและ
เทคโนโลยีชีวภาพแห่งชาติ เพื่อการจำแนกและ
บ่งชี้ชนิดเชื้อราในระดับชีวโมเลกุล โดยเพิ่ม
ปริมาณดีเอ็นเอ นำมาจัดลำดับยีนไรโบโซมอล
บริเวณ internal transcribed spacer region
(ITSrDNA) ของเชื้อรา Aspergillus ด้วยเทคนิค
Polymerase Chain Reaction (PCR) ใช้
universal primer ITS1F (5¢’-TCCGTAGGTG
AACCTGCGG-3¢ ) ITS5F (5’¢ -GGAAGT
AAAAGTCGTAACAAGG-3¢) และ ITS4R (5’¢-
TCCTCCGCTTATTGATATGC-3¢) ตามวิธีของ
White et al . (1990) การทดสอบจะมียีน
ต้นแบบของ A. flavus (A39) และ A. oryzae
(TISTR3019) เป็นยีนเปรียบเทียบ
6. ประสิทธิภาพการยับยั้งการสร้างสารแอฟลา
ทอกซินบี 1 ในเมล็ดข้าวโพดในระดับห้อง
ปฏิบัติการ
นำเมล็ดข้าวโพดที่ไม่ผ่านการฆ่าเชื้อ
100 ก. ใส่ในขวดแก้วฝาเกลียวขนาด 10 มล.
เติมสารละลายสปอร์เชื้อรา A. flavus สายพันธุ์
ที่ไม่สร้างสารพิษปริมาณเชื้อ 108 สปอร์/มล.
ปริมาตร 4 มล. พร้อมกับเชื้อรา A. flavus ที่
สร้างสารพิษปริมาณเชื้อ 107 สปอร์/มล. ปรมิาตร
4 มล. วางแผนการทดลองแบบ Complete
Randomize Design (CRD) มี 6 กรรมวิธี ๆ
ละ 5 ซ้ำ ดังนี้
1. กรรมวธิคีวบคมุ (ไมใ่สเ่ชือ้ราปฏปิกัษ)์
2. กรรมวธิคีวบคมุ (ใสเ่ชือ้รา A. flavus
A39)
3. ใส่เชื้อราปฏิปักษ์ที่คัดเลือก A
4. ใส่เชื้อราปฏิปักษ์ที่คัดเลือก B
5. ใส่เชื้อราปฏิปักษ์ที่คัดเลือก A และ
A. flavus (A39)
6. ใส่เชื้อราปฏิปักษ์ที่คัดเลือก B และ
A. flavus (A39)
Page 7
124 วารสารวิชาการเกษตร ปีที่ 33 ฉบับที่ 2 พฤษภาคม - สิงหาคม 2558
บ่มเป็นเวลา 7 และ 14 วัน จากนั้นนำ
เมล็ดข้าวโพดมาตรวจปริมาณแอฟลาทอกซิน
บี 1 โดยวิธี ELISA
ผลการทดลองและวิจารณ์
1. เก็บตัวอย่างดินและผลิตผลเกษตร และ
การคัดแยกเชื้อรา A. flavus
เก็บตัวอย่างดิน และผลิตผลเกษตรใน
พืน้ที ่25 จงัหวดั ของภาคตะวนัออกออกเฉยีงเหนอื
คอื จ.นครราชสมีา ขอนแกน่ ชยัภมู ิอบุลราชธาน ี
ภาคเหนือ คือ จ.เชียงใหม่ เชียงราย แพร่ พะเยา
ลำปาง อุตรดิตถ์ และน่าน ภาคกลาง คือ
จ.เพชรบูรณ์ สุโขทัย พิษณุโลก กาญจนบุร ี
กำแพงเพชร นครปฐม กรงุเทพมหานคร และลพบุรี
ภาคตะวนัตก คอื จ.เพชรบรุ ีตาก ภาคตะวนัออก
คือ จ.จันทบุรี ตราด และภาคใต้ คือ จ.พัทลุง
ชุมพร ได้จำนวนตัวอย่างทัง้หมด 256 ตวัอยา่ง
แยกเชื้อรากลุ่ม Aspergillus section Flavi ได้
จำนวน 719 ไอโซเลท (isolates) สามารถแยกเชื้อ
ราได้ 3 ชนิด (species) คือ A. flavus จำนวน
602 ไอโซเลท (83.7 %) A. tamarii พบจำนวน
97 ไอโซเลท (13.5 %) A. nomius จำนวน 20
ไอโซเลท (2.8 %) แต่ไม่พบ A. parasiticus
(Table 1)
2. การจำแนกเชื้อรากลุ่ม Aspergil lus
section Flavi โดยสัณฐานวิทยา
A. oryzae (TISTR3019) สายพันธุ์
เปรียบเทียบลักษณะทางสัณฐานวิทยา ซึ่ ง
โคนิเดียล เฮด (conidial head) มีสีีขาวครีม สี
น้ำตาลมะกอก ลักษณะผิวโคโลนีฟูคล้ายปุยสำลี
ไม่สร้างสเคลอโรเทียม (sclerotium) บนอาหาร
CZA และไม่สร้าง pigment สีส้มเหลืองภายใต้
โคโลนีบนอาหาร AFPA สร้างเวซิเคิล (vesicle)
รูปร่าง pyriform การจัดเรียงตัวของ sterigma
แบบชั้นเดียว (uniseriate) ขณะที่เชื้อรา A.
flavus และ A. nomius มีลักษณะ sclerotium
สีขาวหรือดำบนอาหาร CZA และสร้าง
pigment สีส้มเหลืองภายใต้โคโลนีบนอาหาร
AFPA รูปร่างของโคนิเดีย (conidia) ทรงกลมถึง
รูปไข่ ผิวไม่เรียบ conidial head เป็นสีเหลือง
ปนเขียว เชื้อรา A. flavus สร้าง vesicle รูปร่าง
globose การจัดเรียงตัวของ sterigma เป็น
แบบสองชั้น (biseriate) ในขณะที่เชื้อรา A.
nomius มีลักษณะของ vesicle รูปร่าง
pyriform การจัดเรียงตัวของ sterigma แบบ
uniseriate ลักษณะสัณฐานของเชื้อรา A.
tamarii รูปร่าง conidia ทรงกลมถึงรูปไข่ ผิวไม่
เรียบสีของ conidial head สีน้ำตาล สีส้ม หรือ
สีเขียว ผิวของโคโลนีฟู สีเขียว vesicle รูปร่าง
globose หรือ pyriform การจัดเรียงตัวของ
ster igma เรียงตัวแบบ uniser iate หรือ
biseriate ส่วนใหญ่ไม่สร้าง sclerotium แต่
สร้าง pigment สีส้มน้ำตาลภายใต้โคโลนีบน
อาหาร AFPA (Figure 1)
3. ทดสอบการสรา้งสารพษิของเชือ้รา A. flavus
ที่คัดเลือกได้
การเรืองแสงสีฟ้าน้ำเงินภายใต้แสง
อัลตราไวโอเลต เมื่อทดสอบบนอาหาร CCA
Page 8
Thai Agricultural Research Journal Vol. 33 No. 2 May - August 2015 125
Table 1 Details of Aspergillus section Flavi isolates obtained from soil samples and
agricultural products from different sources in Thailand.
Region Province SampleNo. of tested
samples
Fungal isolates (%)
A.
f lavus
A.
tamarii
A.
nomiusNorth
east
Nakhon
Ratchasima
maize fif ield 10
Khon Kaen peanut fif ield 10Chaiyaphum maize f ield 4 11.7 0.8 0.0Nakhon
Ratchasima
maize kernel 6 (84) (6) (0)
Ubon
Ratchathani
dried chili 30
North Chiang Mai maize fif ield 10Chiang Rai maize fif ield 10Phrae maize and chili fif ield 25Phayao cantaloupe fif ield 3 27.3 4.2 2.1Lampang maize fif ield 6 (196) (30) (15)Uttaradit maize f ield 10Nan maize fif ield 10
Center Phetchabun maize, eggplant and chili f ield 13Sukhothai maize fif ield 5Phitsanulok maize fif ield 3Kanchanaburi maize, peanut, amaryllis and
chili fif ield
41
Kamphaeng Phet maize fif ield 5 32.1 3.6 0.7
Nakhon Pathom maize fif ield 4 (231) (26) (5)Bangkok seed 10Kamphaeng Phet dried chili 1
Loburi dried chili 1West Phetchaburi maize f ield 4 3.3 1.4 0.0
Tak maize fif ield 2 (24) (10) (0)
East Chanthaburi maize fif ield 10 4.3 2.9 0.0Trat maize field 10 (31) (21) (0)
South Puttalung maize and peanut fif ield 11 5.0 0.6 0.0Chumphon dried chili 2 (36) (4) (0)
Total 256 83.7(602) 13.5(97) 2.8(20)
* In the ( ) indicated the total isolates of Aspergillus spp.
Page 9
126 วารสารวิชาการเกษตร ปีที่ 33 ฉบับที่ 2 พฤษภาคม - สิงหาคม 2558
พบว่าเชื้อ A. flavus (A39) สร้างสารพิษใน
ปริมาณมากจะแสดงลักษณะเรืองแสงสีฟ้า
น้ำเงินได้ชัดเจนในวันที่ 5 สอดคล้องกับผลการ
ทดสอบการสร้างสารพิษในอาหารเหลว พบว่ามี
ปริมาณสารแอฟลาทอกซิน บี 1 ในระดับ 7,960
นาโนกรัม/มล. ผลการทดสอบนี้สามารถแยกได้
เชื้อรา A. flavus ไอโซเลทที่ไม่มีการเรืองแสงได้
ทั้งหมด 123 ไอโซเลทเมื่อทดสอบการสร้างสาร
พิษในอาหารเหลว YES สามารถคัดเลือกได้เชื้อ
ราไอโซเลทที่สร้างแอฟลาทอกซิน บี 1 ในระดับ
0-690 นาโนกรัม/มล. ได้จำนวน 27 ไอโซเลท
และพบว่าเชื้อราเพียง 2 ไอโซเลท คือ 400 และ
Table 2 Selection of non-toxigenic A. flavus on coconut agar and Aflatoxin B1
production in Yeast Extraet Sucrose
Isolate CCA*Aflatoxin B
1 production
(ng/ml)Crop Location
36 + 0 Maize Phetchabun37 - 70 Maize Phetchabun41 + 60 Maize Phetchabun42 - 100 Maize Phetchabun44 - 650 Maize Phetchabun47 - 400 Maize Phetchabun48 - 80 Maize Phetchabun50 - 690 Maize Phetchabun51 - 120 Maize Phetchabun52 - 80 Maize Phetchabun335 - 170 Maize Phetchabun338 - 600 Maize Chiang mai343 - 630 Maize Sukhothai347 - 690 Maize Chiang mai373 - 30 Sugarcane Kanchanaburi374 - 30 Sugarcane Kanchanaburi378 - 160 Maize Kanchanaburi379 - 200 Maize Kanchanaburi380 - 160 Maize Kanchanaburi381 - 160 Maize Kanchanaburi398 - 20 Maize Kanchanaburi400 - 0 Maize Lampang477 - 300 Maize Chiang mai478 - 460 Maize Chiang mai484 - 300 Maize Chiang mai561 - 0 Maize Chunthaburi562 - 70 Maize Chunthaburi
A39 (cotrol) +++ 7,960 Dried bael Bangkok
* + = Slight green,* +++ = Blue, - = Dark
Page 10
Thai Agricultural Research Journal Vol. 33 No. 2 May - August 2015 127
561 ที่ ไม่พบการสร้างสารแอลฟลาทอกซิน
(0 นาโนกรัม/มล.) (Table 2)
4. ประสิทธิภาพของเชื้อรา A. flavus สาย
พันธุ์ที่ไม่สร้างสารพิษในการยับยั้งการเจริญของ
เชื้อราสายพันธุ์ที่สร้างสารพิษและยับยั้งการ
สร้างสารแอฟลาทอกซินในระดับห้องปฏิบัติการ
เชื้อรา A. flavus ไอโซเลท 400 และ
561 สามารถยับยั้งการเจริญของเส้นใยเชื้อรา
A. flavus (A39) ได้ 47.9 และ 46.5 % ตาม
ลำดับ เมื่อเปรียบเทียบกับกรรมวิธีควบคุม
A. flavus (A39) เพียงอย่างเดียว นอกจากนี้เชื้อ
รามีความสามารถในการยับยั้งและสร้างสาร
Figure 1 Colony and sporing structures of Aspergillus section Flavi in Thailand on CZA
and AFPA at 30 ํC after 7 days (A-C) A. oryzae TISTR 3019 (D-F) A. flavus (G-I)
A. tamarii (J-L) A. nomius
9
Figure 2 Colonyand sporing structures of Aspergillus section Flavi in Thailandon
CZA and AFPAat 30 C after 7 days (A-C) A. oryzae TISTR 3019 (D-F) A. flavus(G-I) A. tamarii (J-L) A. nomius
3. A. flavus
การทดสอบการเรืองแสงสีฟาน้ําเงินภายใตแสงอัลตราไวโอเลต พบวาเช้ือมาตรฐาน A. flavus สายพันธุที่สรางสารพิษ (A39) ที่สรางสารพิษในปริมาณมากจะแสดงลักษณะเรืองแสงไดเดนชัดในวันที่ 5 สอดคลองกับผลการทดสอบการสรางสารพิษในอาหารเหลวในระยะเวลาการสรางสารพิษ 14 วันจะมีปริมาณสารแอฟลาทอกซิน บี 1 ในระดับ 7,960 พีพีบีในขณะที่สามารถแยกไดเช้ือราA. flavus ไอโซเลทท่ีไมมีการเรืองแสงไดทั้งหมด123ไอโซเลทเม่ือทดสอบการสรางสารพิษในอาหารเหลว YES สามารถคัดเลือกไดเช้ือราไอโซเลทที่สรางแอฟลาทอกซิน บี 1 ในระดับ 0-690 พีพีบี (ng/ml) จํานวน 27 ไอโซเลท สวนเช้ือราไอโซเลทที่ไมมีการเรืองแสงที่สอดคลองกับผลการทดสอบการสรางแอฟลาทอกซิน บี 1 ในระดับ 0พีพีบีในครั้งนี้พบเพียง 2 ไอโซเลท คือ 400 และ 561 เทาน้ัน (Table 2) Table 2Selection of non-toxigenic A. flavuson coconut agar and Aflatoxin B1 production
Isolate CCA* Aflatoxin B1 production
(ng/ml) Crop Place
36 + 0 Maize Phetchabun
CZA AFPA (forward) AFPA (reverse)
ทุติยภูมิที่มีฤทธิ์ต่อเชื้อราสายพันธุ์ที่สร้างสารพิษ
เนื่องจาก มีการเกิดแนวใสยับยั้ง (clear zone)
(Figure 2) เมื่อนําเชื้อรามาทดสอบประสิทธิภาพ
ยับยั้งการสร้างสารแอฟลาทอกซินบี 1 ในอาหาร
เหลวพบว่า A. flavus (400) และ A. flavus
(561) สามารถยับยั้งการสร้างสารแอฟลา
ทอกซนิ บี 1 (100 %) และ 99.1 % ตามลำดับ
(Figure 3)
5. การจำแนกเชื้อราโดยเทคนิคอณูพันธุศาสตร์
การจำแนกชนิดเชื้อราโดยการเปรียบ
เทียบลำดับเบส ITSrDNA ของเชื้อรา
Aspergillus ซึ่งมีลำดับเบสประมาณ 500-600
A
D
G
J
B
E
H
K
C
A. oryzae
A. tamaril
A. flavas
A. nomius
F
I
L
CZA PFPA(front) AFPA(backside)
Page 11
128 วารสารวิชาการเกษตร ปีที่ 33 ฉบับที่ 2 พฤษภาคม - สิงหาคม 2558
คู่เบส พบว่าเชื้อราที่ไม่สร้างสารพิษทั้ง 2 ไอโซ
เลท คือ A. flavus 400 และ 561 และสายพันธุ์
สร้างสารพิษ A. flavus (A39) มีลำดับเบส
เหมือน (similarity) กับเชื้อรา A. flavus
ATCC9643 (Accession No. HQ026738) และ
ATCC20043 (Accession No. AY939782) ที่
พบในประเทศสหรัฐอเมริกาในระดับ 99-100 %
ขณะที่เชื้อราสายพันธุ์ A. oryzae TISTR3019
มีลำดับเบสเหมือนกับเชื้อรา A. parasiticus
(NRRL3386) ในระดับ 100 % (Table 3) ผล
การทดลองแสดงให้เห็นว่า A. flavus (400)
Figure 2 Efficacy of two non-toxigenic A. flavus isolate 400 and 561 inhibit on the growth
of A. flavus A39 (center) on PDA after 7 days incubation at 30° ํC.
Figure 3 Efficacy of two non-toxigenic A. flavus isolate 400 and 561 to reduce aflatoxin
production of A. flavus (A39) in YES medium after 14 days incubation
และ A. flavus (561) เป็น A. flavus ที่ไม่สร้าง
สารพิษจริง
6. ประสิทธิภาพการยับยั้งการสร้างสารแอฟลา
ทอกซินบี 1 ในเมล็ดข้าวโพดในระดับห้อง
ปฏิบัติการ
พบว่ากรรมวิธีใส่เชื้อราปฏิปักษ์ที่คัด
เลือก A. flavus (400) และ A. flavus (561)
เพียงอย่างเดียวระยะเวลา 7 วัน สามารถยับยั้ง
การสร้างสารแอฟลาทอกซิน บี 1 ในเมล็ดข้าว
โพดได้อย่างมีนัยสำคัญยิ่งเมื่อเปรียบเทียบกับไม่
11 ร า A. flavus(561) สามารถยับย้ังการยับย้ังการสรางสารแอฟลาทอกซิน บี 1 ทําใหปริมาณสารพิษลดลงจากชุดควบคุม99.1 เปอรเซ็นต (Figure 5) Control Isolate 400 Isolate 561
5. ผลการจําแนกชนิดโดยการเปรียบเทียบลําดับเบส ITSrDNA ของเช้ือรา Aspergillus ซึ่งมีลําดับเบสประมาณ 500-600 คูเบส พบวาเช้ือราที่ไมสรางสารพิษทั้ง 2ไอโซเลท คือ A. flavus(400)และ(561) และสายพันธุสรางสารพิษA. flavus(A39)มีลําดับเบสเหมือน (similarity) กับเช้ือราA. flavus
Figure 4 Characteristics of two non-toxigenic A. flavus on the growth of A. flavus A39 (center) onPDA, colonies grown at 30 Cafter7 days.
Figure 5Non-toxigenic performance in mixtures on YES media for 14 days
A39 A39 A39
400 400 561 561
400 400 561 561 400 400 561 561
11 ร า A. flavus(561) สามารถยับย้ังการยับย้ังการสรางสารแอฟลาทอกซิน บี 1 ทําใหปริมาณสารพิษลดลงจากชุดควบคุม99.1 เปอรเซ็นต (Figure 5) Control Isolate 400 Isolate 561
5. ผลการจําแนกชนิดโดยการเปรียบเทียบลําดับเบส ITSrDNA ของเช้ือรา Aspergillus ซึ่งมีลําดับเบสประมาณ 500-600 คูเบส พบวาเช้ือราท่ีไมสรางสารพิษทั้ง 2ไอโซเลท คือ A. flavus(400)และ(561) และสายพันธุสรางสารพิษA. flavus(A39)มีลําดับเบสเหมือน (similarity) กับเช้ือราA. flavus
Figure 4 Characteristics of two non-toxigenic A. flavus on the growth of A. flavus A39 (center) onPDA, colonies grown at 30 Cafter7 days.
Figure 5Non-toxigenic performance in mixtures on YES media for 14 days
A39 A39 A39
400 400 561 561
400 400 561 561 400 400 561 561
A39 A39
400 561
400 561
400 561
400 561
A39
100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0
% A
FB1
Redu
ctio
n
isolate 400 isolate 400 isolate 400 isolate 400 isolate 561
99.1 100
Page 12
Thai Agricultural Research Journal Vol. 33 No. 2 May - August 2015 129
Table 3 Molecular Identification of Aspergillus spp. based on rDNA sequences.
Species Isolate Reference strain* Similarity
A. flf lavus 561 ATCC9643, ATCC20043 99%A. flf lavus 400 ATCC9643, ATCC20043 99%A. flf lavus A39 ATCC9643, ATCC20043 100%A. parasiticus TISTR3019 NRRL3386 100%
* ATCC = The American Type Culture Collection, USA NRRL = The Northern Regional Research Center, USA
ใส่เชื้อราปฏิปักษ์ (กรรมวิธีควบคุม 1) สามารถ
ลดปริมาณแอฟลาทอกซิน บี 1 ในข้าวโพดที่เกิด
ตามธรรมชาติได้ถึง 83.92 และ 97.43 % ขณะ
ทีร่ะยะเวลา 14 วนั ปรมิาณสารแอฟลาทอกซนิ บ ี1
ลดลงเพียง 34.53 และ 43.69 % (Table 4)
ที่ระยะเวลา 7 วัน กรรมวิธี 6 ที่ใส่เชื้อ
ราปฏิปักษ์ A. flavus (561) และ A. flavus
(A39) มปีระสทิธภิาพการยบัยัง้สารพษิ 50.24 %
ดีกว่ากรรมวิธี 5 ที่ใส่เชื้อราปฏิปักษ์ A. flavus
(400) และ A. flavus (A39) ปริมาณแอฟลา
Table 4 Reduction of Aflatoxin B1 content in maize kernels at 7 and 14 days after
inoculation with toxigenic and non-toxigenic strain.
Treatment
Aflatoxin B1 content (ug/kg)
7days after
inoculation *
Reduction
(%)
14 days after
inoculation **
Reduction
(%)
1. control (distilled water) 69.90 b -- 169.00 abc --
2. toxigenic A. f lflavus (A39) 120.30 c -- 246.70 c --
3. non-toxigenic A. flf lflavus (400) 16.50 a 83.92 112.80 ab 34.53
4. non-toxigenic A. flf lflavus (561) 7.90 a 97.43 97.90 a 43.69
5. non-toxigenic A. f lflavus (400) vs toxigenic
A. flf lflavus (A39)86.20 b 29.90 218.00 c 11.93
6. non-toxigenic A. flf lflavus (561) vs toxigenic
A. flf lflavus (A39)63.00 b 50.24 190.70 bc 23.29
C.V. (%) 42.6 37.1*Means in the same column followed by the same letter are not significantly different at 1% level by DMRT **Means in the same column followed by the same letter are not significantly different at 5% level by DMRT
Page 13
130 วารสารวิชาการเกษตร ปีที่ 33 ฉบับที่ 2 พฤษภาคม - สิงหาคม 2558
ทอกซนิ บ ี1 ในขา้วโพดลดเพยีง 29.9 % เทา่นัน้
ที่ระยะเวลา 14 วัน กรรมวิธีใส่เชื้อราปฏิปักษ์ A.
flavus (561) และ A. flavus (A39) และ
กรรมวิธีใส่เชื้อราปฏิปักษ์ที่คัดเลือก A. flavus
(400) และ A. flavus (A39) สามารถลดปริมาณ
สารแอฟลาทอกซนิ บ ี1 ได ้23.29 และ 11.93 %
ตามลำดับ (Table 4)
ประสทิธภิาพยบัยัง้การสรา้งแอฟลาทอกซนิ
บี 1 ของเชื้อราปฏิปักษ์ สายพันธุ์ที่ไปสร้างสาร
พิษมีประสิทธิภาพสูงเพียง 7 วัน หลังจากนั้น
ประสิทธิภาพลดลง
สรุปผลการทดลอง
สามารถคัดเลือกเชื้อรา A. flavus สาย
พันธุ์ที่ไม่สร้างสารพิษในประเทศไทย และมี
ประสิทธิภาพในการยับยั้งการเจริญของเชื้อรา
สายพันธุ์ที่สร้างสารพิษ และยับยั้งการสร้างแอฟ
ลาทอกซิน บี 1 ได้จำนวน 2 ไอโซเลท คือ A.
flavus (400) และ A. flavus (561) โดยเชื้อรา
A. flavus สายพันธุ์ที่ไม่สร้างสารพิษที่พบเป็น
เชื้อราที่แยกมาจากดินปลูกข้าวโพด พบว่า A.
flavus (400) และ A. flavus (561) สามารถ
ยับยั้งการเจริญของเส้นใยเชื้อรา A. flavus ที่
สร้างสารพิษ ได้ 47.9 และ 46.5 % และยับยั้ง
การสร้างแอฟลาทอกซินบี 1 ในอาหารเหลวได้
100 และ 99.1 % ตามลำดับ ในเมล็ดข้าวโพดที่
มีการปนเปื้อนสารแอฟลาทอกซินตามธรรมชาติ
เชื้อรา A. flavus (400) และ A. flavus (561)
สามารถลดสารพิษได้ 83.92 และ 97.43 %
ตามลำดับ เชื้อรา A. flavus (400) และ (561)
ไอโซเลทที่ไม่สร้างสารพิษมาทั้ง 2 สายพันธุ์มี
ศักยภาพในการควบคุมการเจริญของเชื้อรา และ
สามารถยบัยัง้การสรา้งสารแอฟลาทอกซนิได ้ ดงันัน้
สามารถนำไปพัฒนาต่อเป็นชีวภัณฑ์เพื่อใช้ในการ
ควบคุมเชื้อรา และสารแอฟลาทอกซินในข้าว
โพดต่อไป
คำขอบคุณ
ขอขอบคุณฝ่ายวิทยาศาสตร์ ชีวภาพ
สถาบันวิจัยและพัฒนาวิทยาศาสตร์ ซึ่งให้ความ
อนุเคราะห์ เชื้อรามาตรฐาน A. oryzae
TISTR3019
เอกสารอ้างอิง
กระทรวงสาธารณสุข. 2529. มาตรฐานอาหารที่
มีสารปนเปื้อน ใน: ราชกิจจานุเบกษา
ฉบับพิเศษ เล่มที่ 103 ฉบับที่ 98 ตอนที่
23. ลงวันที่ 16 กุมภาพันธ์ พ.ศ. 2529.
Atehnkeng, J., P.S. Ojiambo, M. Dornner,
T. Ikotun, R. A. Sikora, P.J. Cotty
and R. Bandyopadhyay. 2008.
Distribution and toxigenicity of
Aspergillus species isolated from
maize kernels from three agro-
ecological zones in Niger ia .
Internat ional Journal of Food
Microbiology 122: 74-84.
Chinaphuti, A., C. Trikarunasawat, A.
Wongurai and S. Kositcharoenkul.
2002. Production of In-house ELISA
Page 14
Thai Agricultural Research Journal Vol. 33 No. 2 May - August 2015 131
Test Kit for Detection of Aflatoxin
in Agricultural Commodities and
Their Validations. Kasetsart J. (Nat.
Sci.) 36: 179-186.
Cleveland, T. E. , P. F. Dowd, A. E.
Desjardins, D. Bhatnagar and
P. J. Cotty. 2003. United States
Department of Agriculture-
Agricultural Research Service
research on pre-harvest prevention
of mycotoxins and mycotoxigenic
fungi in U.S. crops. Pest
Management Science 59: 629-642.
Ehrl ich, K. C, K. Kobbeman, B. G.
Montalbano and P. J. Cotty. 2006.
Aflatoxin-producing Aspergillus
species from Thailand. International
Journal of Food Microbiology 114:
153–159.
European Union. 2010. Maximum levels
for certain contaminants in
foodstuffs. Commission Regulation
(EU) No165/2010. 26 february 2010.
International Agency for Research on
Cancer. 1993. Monographs on the
Evaluation of Carcinogenic Risks to
Humans; Some Naturally Occurring
Substances : Food Items and
Constituents, Heterocyclic Aromatic
Amines and Mycotoxine. Lyon,
France: IARC, 56: 245-395.
Klich M. A. 2002. Identification of common
Aspergillus species. Centraalbureau
voor Schimmel cultures, Utrecht,
Netherlands. 116 pages.
Pitt, J. I., A. Hocking and D. R. Glenn.
1983. An improved medium for the
detection of Aspergillus flavus and
Aspergillus parasiticus. Journal of
Applied Bacteriology 54: 109-114.
White, T. J., T. Bruns, S. Lee and J.
Taylor. 1990. Amplification and
direct sequencing of fungal
r ibosomal RNA genes for
phylogenetics. In: PCR Protocols: a
guide to methods and applications.
(Innis MA, Gelfand DH, Sninsky JJ,
White TJ, eds). Academic Press,
New York, USA: 315-322.