This document is posted to help you gain knowledge. Please leave a comment to let me know what you think about it! Share it to your friends and learn new things together.
โมโนโซเดยมกลตาเมตในอาหาร (5 mg/100 g of b.w./day) จำานวน 10 ตว และกลมควบคมทไมไดรบโมโนโซเดยมกลตาเมต จำานวน 10 ตว เปนเวลา 30 วน หลงจากนนทำาการผาตดเอาตอมหมวกไต รงไข มาม ไต และตบของหนกลมควบคม มาสกด total RNA แลวสงเคราะห first strand cDNA โดยวธ reverse transcription (RT) และเพมจำานวน DNA ดวยวธ Polymerase Chain Reaction (PCR) โดยใช specific primers ของยน StAR เพอศกษาการแสดงออกของโปรตน StAR ในเนอเยอตาง ๆ โดยตรวจหา PCR product ขนาด 437 คเบส ของยน StAR
จากนนทำาการสกด total RNA จากตอมหมวกไตของหนทงสองกลมมาสงเคราะห first strand cDNA โดยวธ reverse transcription และเพมจำานวน DNA ดวยวธ Polymerase Chain Reaction โดยใช specific primers ของยน StAR แลววเคราะหระดบการแสดงออกของ StAR mRNA ดวยวธ agarose gel electrophoresis โดยตรวจหา PCR product ขนาด 437 คเบส ของยน StAR และทำาการเพมจำานวน DNA ของยน GAPDH (glyceraldehyde-3-phosphate dehydogenase) ขนาด 195 คเบส เพอใชเปน standard control เนองจากการเปรยบเทยบระดบการแสดงออกของยนจำาเปนตองมการปรบปรมาณของ standard control ซงกคอ ยน GAPDH ของกลมควบคม และกลมทดลองใหมขนาด และความเขมของแถบ PCR product ทเกดขนเทากน โดยการปรบปรมาณ
รปท 3 แสดงการแบงตอมหมวกไตสวนนอกตามลกษณะของเซลลเปน 3 สวน ไดแก zona glomerulosa, zona fasciculata, และ zona reticularis(ทมา : www.phych.upenn.edu/courses/psych127_Spring2002/adrenal.jpg)
ของ cDNA ทแปลรหสเปนโปรตน StAR ทเตรยมจาก testicular tissue ของคนไข lipoid CAH (Lin et al., 1995) พบการกลายพนธแบบ nonsense mutation ในลำาดบนวคลโอไทดของยนโปรตน StAR การศกษาดงกลาวชวยยนยนความสำาคญ และบทบาททจำาเปนอยางยงของโปรตน StAR ในการผลตสเตยรอยดกลไกก�รทำ�ง�นของโปรตน StAR
เมอมการกระตนของฮอรโมน โปรตนตนตอของโปรตน StAR ขนาด 37 kDa จะถกสงเคราะหอยางเรว และถกนำาเขาไป และประมวลผลโดยไมโตคอนเดรย ผาน N-terminal signal sequence ดวยการสรางการเชอมตอระหวางเยอหมภายใน และภายนอกของไมโตคอนเดรย (Stocco and Clark, 1996) ชวยในการขนสงโคเลสเตอรอลจากเยอหมชนนอกเขาสเยอหมชนในของไมโตคอนเดรยเพอการสงเคราะหเพรกนโนโลนท P450scc หลงจากการประมวลผล เยอหมจะแยกออกจากกน และไมมการขนสงโคเลสเตอรอลผานเยอหมเกดขนอก โดยปราศจากสงเคราะห และการประมวลผลของโปรตนตนตอของโปรตน StAR อยางไรกตาม จากรายงานของ Arakane et al. (1996) แสดงใหเหนวา แมจะมการตดกรดอะมโนทางปลายดาน N ของโปรตน StAR ออก 62 ตว กไมไดสงผลกระทบตอการผลตภณฑสเตยรอยดในเซลล COS-1 แสดงวาโปรตน StAR ถกนำาเขาไปในไมโตคอนเดรยเพยงสวนหนงเทานน อยางไรกตาม การตดกรดอะมโนทางปลาย C ออก 10 ตว จะสงผลในการลดผลตภณฑของสเตยรอยดลง 50% ขณะทการตดออกกรดอะมโนออก 28 ตว สงผลใหไมมการผลต
18
สเตยรอยดเกดขน (Arakane et al., 1996) ดวยเหตน ปลายดาน C ของโปรตน StAR มความสำาคญสงสดในการขนสงโคเลสเตอรอล
สวนเทคนค PCR เปนการเพมขยายจำานวนสารพนธกรรมททำาไดงายโดยปฏกรยาในหลอดทดลอง (in vitro) และในเซลล (in situ) มหลกการพนฐานเลยนแบบธรรมชาตของขบวนการ DNA replication โดยใชปฏกรยาลกโซของเอนไซม DNA polymerase (in vivo DNA replication) ททำาใหมการเพมจำานวนอณของ DNA เปน 2 เทา ในทกๆ รอบของปฏกรยา ซงจะม 3 ขนตอนในแตละรอบ ไดแก
1. Denaturation เปนขนทมอณหภมสงประมาณ 90 0C – 95
26
0C ทำาให DNA แมพมพ(template) ทเปนเกลยวค (double stranded DNA) แยกออกจากกนเปนสองสาย (two single strand) และทำาหนาทเปนแมพมพในการเกด DNA replication
หนทไดรบโมโนโซเดยมกลตาเมตจะผสมโมโนโซเดยมกลตาเมตในอาหารในอตราสวน 5 mg/100 g of body weight/day เปนเวลา 30 วน และชงนำาหนกตว จากนนทำาการผาตดเอาตอมหมวกไตของหนทง 2 กลมมาสกด total RNA และเกบไวทอณหภม -70C จนกวาจะนำามาทำาการทดลองตอไป
แลว load ลงในชองใสสารตวอยาง (well) และใส DNA standard marker เพอเปนตวเปรยบเทยบขนาดดวย จายกระแสไฟทความตางศกยคงท 100 volt โดยใหดานทมสารตวอยางเปนขวลบ และสงเกตตำาแหนงส bromophenol blue วงไปจนเกอบถงขอบเจล จงปดเครองจายกระแสไฟ แลวนำาแผน agarose gel ไปยอมดวย ethidium bromide ประมาณ 30 นาท ดผลการทดลองภายใตแสง UV และบนทกผลโดยการถายภาพดวยกลองดจตอล
3.3 ก�รเพมจำ�นวนยน glyceraldehyde –3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) เพอใชเปน standard control ดวยวธ RT-PCR 3.3 A. การทำา Reverse Transcriptionนำา total RNA ทสกดไดมาใชเปน template ในการสงเคราะห first
strand cDNA จาก mRNA โดยใช Oligo (dT) primer และนำาไปใชในการเพมจำานวน DNA ดวยวธ PCR โดยใช specific primers ตอไป โดยเตรยมสวนผสมของสารละลายดงตอไปน (สำาหรบ 1 reaction )
RNA sample 1 ulAMV buffer 5 ul10 mM dNTPs mix 0.5 ulOligo ( dT ) primer 0.5 ul ( 1uM )25 mM MgSO4 1 ul ( 1mM )AMV reverse transcriptase 0.5 ul ( 0.1U/ ul )Add water to 25 ul
3.4 ก�รเพมจำ�นวนยน StAR โดยใช specific StAR primers ดวยวธ RT-PCRใช cDNA ทไดจากการทำา reverse transcription จากขอ 3.3. A มาใช
เปน template ในการเพมจำานวนยน StAR โดยใช specific StAR primers และเตรยมสวนผสมดงตอไปน
cDNA sample 5 ulMg-free buffer 2.5 ulBackward primer (B2) 0.5 ulForward primer (F2) 0.5 ul10 mM dNTPs 0.5 ul25 mM MgCl2 1 ulTaq DNA polymerase 0.5 ulAdd water to 25 ul
4.3 ก�รเพมจำ�นวนยน GAPDH เพอใชเปน standard control
เนองจากการเปรยบเทยบระดบการแสดงออกของยนนน จำาเปนตองมการปรบปรมาณของ standard control ซงกคอ ยน GAPDH ของกลมควบคม และกลมทดลองใหมขนาด และความเขมของแถบ PCR product ทเกดขนเทากนเสยกอน โดยการปรบปรมาณของ cDNA ทใชเปนตนแบบในการเพมปรมาณยน เมอไดปรมาณ cDNA ททำาใหขนาด และความเขมของแถบ PCR product ทเกดขนเทากนของทงสองกลม แลว จงใชปรมาณ cDNA นนในการเพมจำานวนของยน StAR
4.3 A. การทำา Reverse Transcriptionนำา total RNA ทสกดจากตอมหมวกไตทง 2 กลม มาใชเปน template
ในการสงเคราะห first strand cDNA จาก mRNA โดยใช Oligo (dT) primer เพอใชเปนตนแบบในการเพมปรมาณ DNA โดยเตรยมสวนผสมดงตอไปน (สำาหรบ 1 reaction )
38
RNA sample 1 ulAMV buffer 5 ul10 mM dNTPs mix 0.5 ulOligo ( dT ) primer 0.5 ul ( 1uM )25 mM MgSO4 1 ul ( 1mM )AMV reverse transcriptase 0.5 ul ( 0.1U/ ul )Add water to 25 ul
4.3 B การเพมจำานวน DNA ของยน GAPDH โดยวธ PCRทำาการปรบปรมาณของ cDNA ทใชเปนตนแบบในการเพมปรมาณ
DNA ของยน GAPDH ของทงสองกลม ใหสามารถเพมปรมาณยนไดขนาด และความเขมของแถบ PCR product ทเกดขนเทากนของทงสองกลม เพอใชเปนปรมาณ cDNA อางองในการเพมจำานวนของยน StAR โดยนำา cDNA ทไดจากการทำา reverse transcription มาเพมจำานวนดวย PCR โดยใช specific primers และเตรยมสวนผสมดงตอไปน (สำาหรบ 1 reaction)
cDNA X ulMg-free buffer 2.5 ulBackward primer (B1) 0.5 ulForward primer (F1) 0.5 ul10 mM dNTPs 0.5 ul
MgCl2 1 ulTaq DNA polymerase 0.5 ulAdd water to 25 ul
39
หลงจากนนนำาสวนผสมทเตรยมแลว ทงสอง tube เขาเครอง PCR โดยตงอณหภมตามขอ 3.3 B แลวตรวจหา PCR product ดวยวธ agarose gel electrophoresis
4. 4 ก�รเพมจำ�นวนยน StAR โดยใช specific StAR primers
ใช cDNA ทไดจากการทำา reverse transcription ตามปรมาณทไดจากขอ 4.3 B ของแตละกลม มาใชเปน template ในการเพมจำานวนยน StAR โดยใช specific StAR primers และเตรยมสวนผสมดงตอไปน
cDNA sample (ทงสองกลม)X ulMg-free buffer 2.5 ulBackward primer 0.5 ulForward primer 0.5 ul10 mM dNTPs 0.5 ul25 mM MgCl2 1 ulTaq DNA polymerase 0.5 ulAdd water to 25 ul
หลงจากนนนำาสวนผสมนนเขาเครอง PCR โดยตงอณหภมตามขอ 3.4 และตรวจหา PCR product ขนาด 437 bp ดวย agarose gel electro phoresis
40
บทท 4
ผลก�รวจย
1.ผลก�รศกษ�ก�รแสดงออกของยน StAR ในเนอเยอต�ง ๆ จากการสกด total RNA จากเนอเยอตาง ๆ ไดแก รงไข ตอมหมวก
รปท 13 แสดงผลการวเคราะหระดบการแสดงออกของยน StAR ในตอมหมวกไต
1 = PCR product ของยน StAR จากตอมหมวกไตของหนกลมควบคม
2 = PCR product ของยน StAR จากตอมหมวกไตของหนกลมทไดรบ MSG
บทท 5
49
สรป และวจ�รณผลก�รวจย
1. ก�รศกษ�ก�รแสดงออกของยน StAR ในเนอเยอต�ง ๆจากการศกษาการแสดงออกของยน StAR ในเนอเยอตาง ๆ ของหนปกต ไดแก รงไข ตอมหมวกไต
ตบ มาม และไต ดวยวธ Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) โดยสกด tota RNA จากเนอเยอตาง ๆ ดงกลาวมาใชเปน template ในการเพมปรมาณ DNA ของยน StAR โดยเรมจากการสงเคราะห cDNA สายแรกจาก total RNA ทสกดไดดวยวธ reverse transcription แลวจงนำาไปเพมปรมาณ DNA ดวยวธ PCR โดยใช specific StAR primer แลวตรวจสอบ PCR product ขนาด 437 คเบสของยน StAR พบแถบดเอนเอขนาด 437 คเบสจากทกเนอเยอดงกลาว แสดงวาในรงไข ตอมหมวกไต ตบ มาม และไต มการแสดงออกของยน StAR เมอเปรยบเทยบกบรายงานของ Bauer et al. (2000) และ Kusakabe et al. (2002) ทรายงานวาการแสดงออกของยน StAR จะพบในเนอเยอทมการสงเคราะหฮอรโมนสเตยรอยด (steroidogenic tissues) เชน รงไข อณฑะ และตอมหมวกไต นอกจากนจะพบการแสดงออกของยน StAR ไดบางในระบบทางเดนอาหาร มาม กลามเนอ และผวหนง แตการแสดงออกของยน StAR ทตบซงพบในการศกษาครงนยงไมปรากฏรายงาน
2.ก�รศกษ�ก�รเปลยนแปลงระดบก�รแสดงออกของยน StAR ในตอมหมวกไตทมผลม�จ�กก�รกระตนของโมโนโซเดยมกลต�เมต
จากการศกษาการแสดงออกของยน StAR ในเนอเยอตอมหมวกไตของหนกลมทไดรบโมโนโซเดยม กลตาเมตในอาหารเปรยบเทยบกบกลมควบคมทไมไดรบโมโนโซเดยมกลตาเมตในอาหารดวยวธ Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) โดยสกด total RNA จากเนอเยอตอมหมวกไตของหนทงสองกลมมาใชเปน
50
template ในการเพมปรมาณ DNA ของยน StAR โดยเรมจากการสงเคราะห cDNA สายแรกจาก total RNA ทสกดไดดวยวธ reverse transcription แลวจงนำาไปเพมปรมาณ DNA ดวยวธ PCR โดยใช specific StAR primer แลวตรวจสอบ PCR product ขนาด 437 คเบสของยน StAR พบแถบดเอนเอขนาด 437 คเบสของกลมทไดรบโมโนโซเดยมกลตาเมตในอาหารมขนาด และความเขมของแถบขนาดใหญกวากลมควบคม แสดงวาแสดงวาโมโนโซเดยมกลตาเมตมผลตอการแสดงออกของยน StAR ในตอมหมวกไตในลกษณะการกระตนใหมการแสดงออกเพมขน ซงอาจเปนผลโดยตรงของโมโนโซเดยมตอตอมหมวกไต หรอเปนผลโดยออมผานการกระตนของฮอรโมนจากตอมใตสมอง จากรายงานของ Reinhart et al. (1999) ทกลาวถงปจจยตาง ๆ ทมผลตอการแสดงออกของยน StAR ทำาใหมการแสดงออกเพมขนโดยกระตนใหมการถอดรหสของดเอนเอเพมขนไดแก LH GH IGF-1 FSH ACTH และ Ca 2+ สวนปจจยทลดระดบการแสดงออกของยน StAR ไดแก LPS Heat shock TGF PGF2 TNF AMP และ IF นอกจากน รายงานของ Wang and Stocco (1999) ยงกลาวถงปจจยทกระตนการแสดงออกของยน StAR คอ กรดอะแรชโดนก (arachidonic acid) ผาน cAMP pathway สวน Achermann et al. (2002) กลาววา SF-1 กระตนการแสดงออกของยน StAR เชนกน
จากการศกษาผลของโมโนโซเดยมกลตาเมตตอการแสดงออกของยน StAR ในตอมหมวกไตในครงน ซงพบวาโมโนโซเดยมกลตาเมตนน มผลตอการเพมขนของยน StAR ในตอมหมวกไต แตกยงไมสามารถสรปไดวาการแสดงออกของยน StAR ทเพมขนน เกดจากผลของโมโนโซเดยมกลตาเมตโดยตรง หรอเปนผลโดยออม แตการเพมขนของการแสดงออกของยน StAR นาจะเกยวของกบการตอบสนองตอภาวะแรงกดดนทเกดจากโมโนโซเดยมกลตาเมตโดยผานการสรางฮอรโมนสเตยรอยดซงเปนฮอรโมนทตอบสนองตอแรง กดดนตาง ๆ ทเกดขนกบรางกาย
51
หากพจารณาระดบการแสดงออกของยน StAR ทเพมขนนในแงของการรกษาสมดลของรางกาย (homeostasis) ยอมแปลผลไดวาผลของโมโนโซเดยมกลตาเมตทมตอตอมหมวกไตนนจะเปนไปในรปแบบของการเพมการทำางานของตอมหมวกไตใหทำางานไดดขน หรอทำางานมากขนในการสรางฮอรโมน สเตยรอยด และนาจะชวยทำาใหรางกายสามารถรกษาสมดลไดดขน แตหากพจารณาในแงของการทำางานทเพมขนของตอมหมวกไตยอมหมายถงภาวะทรางกายอยภายใตแรงกดดนมากขน จงมการแสดงออกของยน StAR เพมมากขนเพอลดแรงกดดนจากโมโนโซเดยมกลตาเมตทไดรบเขาไปในรางกาย นนคอโมโนโซเดยมกลตาเมตมผลตอรางกายในแงลบ และเปนผลเสยตอสขภาพ ดงนนการรบประทานอาหารทมโมโนโซเดยมกลตาเมตเปนสวนประกอบมากเกนไปยอมสงผลรายตอรางกาย จงมรายงานการศกษาเกยวกบพษภยของโมโนโซเดยมกลตาเมตเผยแพรอยมากมายจากอดตจนถงปจจบน
เอกส�รอ�งอง
Achermann JC, Ozisik G, Ito M, Orun UA, Harmanci K, Gurakan B Jameson JL. 2002. Gonodal
detemination and adrenal development are regulated by the orphan nuclear receptor steroidogenic factor-1, in a dose-de[pendent manner. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 84(4): 1829-1833.
52
Arakane F, Sugawara T, Nishino H, Liu Z, Holt HA, Pain D, Stocco DM, Miller WL & Strauss III JF.
1996. Steroidogenic acute regulatory protein (StAR) retains activity in the absence of its
mitochondrial import sequence: Implications for the mechanism of StAR action. Proceedings of the National Academy of Sciences. 93:13731–13736.
Bauer MP, Bridgham JT, Langenau DM, Johnson AL, Goetz FW. 2000. Conservation of steroidogenic
acute regulatory (StAR) protein structure and expression in vertebrates. Molecular and Cellular Endocrinology. 168:119–125.
Bakke JZ, Lawerence N, Bennett J, Robinson S, Bowers CY. 1978. Late endocrine effects of
administrating monosodium glutamate to neonatal rats. Neuroendocrinology. 26:220-228.
Burde RM, Scheinker B, Keyes J. 1971. Acute effect of monosodium glutamate on the arcuate
nucleus of hypothalamus in mice and rats.Nature. 233:58-60.Ferguson JJ. 1963. Protein synthesis and adrenocorticotropin responsiveness. Journal of Biological
Chemistry. 238:2754–2759.Garren LD, Ney RL, Davis WW. 1965. Studies on the role of protein synthesis in the regulation of
corticosterone production by ACTH in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 53:1443–1450.
Krueger RJ, Orme-Johnson NR. 1983. Acute adrenocorticotropic hormone stimulation of adrenal
corticosteroidogenesis. Journal of Biological Chemistry. 258:10159–10167.
53
Kusakabe M, Todo T, McQuillan J, Goetz F, Young G. Characterization and expression of
steroidogenic acute regulatory protein and MLN64 cDNAs in trout. Endoc. (in press).Larsen PJ, Mikkelsen JD, Jessop D, Lightman SL, Chowdrey HS. 1994.Neonatal monosodium
glutamate treatment alters both the activity and the sensitivity of the rat hypothalamo-pituitary-
adrenocortical axis. J Endocrinol.141(3):497-503.Lemke-Johnson N, Reynolds WA. 1974. Nature and extend of brain lesion in mice related to
ingestion of monosodium glutamate. J neuropath Exp Neuol. 33:74-97.Lin D, Sugawara T, Strauss III JF, Clark BJ, Stocco DM, Saenger P, Rogol A & Miller WL. 1995. Role
of steroidogenic acute regulatory protein in adrenal and gonadal steroidogenesis.
Science. 267:1828–1831.Magarinos AM, Estivariz F, Morado MI, De Nicola AF. 1988.Regulation of the central nervous system-
pituitary- adrenal axis in rats after neonatal treatment with monosodium glutamate. Neuroendocrinology. 48(2):105-11.
AJ, Breese GR, Kizer JS. 1977.Anlysis of the disruption in hypothalamic –pituitary regulation in rats
treatment neonatally with monosodium glutamate (MSG): evidence for involvement of tuberoinfundibular cholinergic and dopaminergic systems in neuroendocrine regulation. Endocrinology. 101:613-622.
Nemeroff CB, Lamartiniere CA, Mason GA, Squibb RE, Hong JS, Bondy SC. 1981. Marked reduction in
54
gonadal steroid hormone levels in rats treated neonatally with monosodium-L-glutamate: further evidence for disruption of hypothalamic-pituitary-gonadal axis regulation. Neuroendocrinology. 33:2265-267.
Olney J. 1969. Brain lesion, obesity and other disturbances in mice treated with monosodium
glutamate. Science. 164:719-721.Redding TW, Schally AV, Arimura A, Wakabayashi I. 1971. Effect of monosodium glutamate on some
endocrine function. Neuroendocrinology. 8:245-255.Reinhart AJ, Williams SC, Clark BJ, Stocco DM. 1999. SF-1(Steroidogenic Factor 1) and C/EBP
(CAAT Enhancer Binding Protein) cooperate to regulate the murine StAR (Steroidogenic
Acute Regulatory Protein) promoter. Molecular Endocrinology. 13:729–741.Rennert H, Chang YJ, Strauss III JF. 1993. Intracellular cholesterol dynamics in steroidogenic
cells: a contemporary view. In The Ovary. Pp.147–164. Eds EY Adashi and PCK Leung. Raven Press, New York
Rodriguez-Sierra JF, Sridaran R, Blake CA. 1971. Monosodium glutamate disruption of behavioral and
endocrine function in the female rat. Neuroendocrinology. 31:228-235.Skultetyova I, Kiss A, Jezova D. 1998. Neurotoxic lesion in duced by monosodium glutamate result in
increased adrenopituitary proopiomelanocortin gene expression and decressed corticosterone clearance in rats. Neuroendocrinology. 67:412-420.
Stocco DM. 2000. The role of the StAR protein in steroidogenesis: challenges for the future.
55
Journal of Endocrinology. 164:247–253Stocco MD, Clark B. 1996. Regulation of the acute production of steroids in steroidogenic cells.
Endocrine Reviews. 17 (3):221–244.Takasaki Y, Sekine S, Matsuzawa Y, Iwata S, Sasaoka M. 1979. Effects of parenteral and oral
administration of monosodium L-glutamate (MSG) on somatic growth in rats.
Toxicol Lett. 4:327-343.Trentini GP, Botticelli A, Botticelli CS. 1974. Effect of monosodium glutamate on the endocrine
glands and on the reproductive function of the rat. Fertil Steril. 25:478-483.Tschop M, Lahner H, Feldmeier H, Grasberger H, Morrison KM, Janssen OE, Attanasio AF,
Strasburger CJ. 2000. Effect of growth hormone replacement therapy on levels of cortisol and cortisol-binding globulin in hypopituitary adults. Eur J Endocrinol. 143(6):769-773.
Wang XJ, Stocco DM. 1999. At the Cutting Edge Cyclic AMP and arachidonic acid: a tale of two
pathways. Molecular and Cellular Endocrinology. 158:7–12Witthuhn BA, Quelle FW, Silvennoinen O. 1993. JAK2 associates with the erythropoietin receptor and
is tyrosine phosphorylated and activated following stimulation with erythropoietin.
Cell. 74:227-36.
56
ภ�คผนวก
1. การเตรยม tracking dye โดยผสมสาร ดงตอไปน bromophenol blue 0.025 gxylene cyanol 0.025 gsucrose 4 gadd water to 10 ml
2. การเตรยม TAE buffer pH 8.0 50X TAE buffer : 1000 ml ( pH 8.0 ) ประกอบไปดวยtris base 242 gglacial acetic acid 57.1ml0.5 M EDTA 100 ml
วธเตรยม 50X TAE buffer : 50 ml ดงนช ง tris base 12.1 g นำามาละลายนำาบางสวน หลงจากนนเตม EDTA (disodium salt dehydrate) จำานวน 0.93 g และ glacial acetic acid จำานวน 2.86 ml แลวปรบ pH ใหได 8.0 ดวย acitic acid หลงจากนน ปรบปรมาตรนำาใหครบ 50 ml