บทที่ 4 ผลการวิจัย - PSRUrdi/files/res_che2553/... · 4.5 โดยมีสมการเส้นตรงเป็น y = 94448x – 15586 รูป

33

บทท 4

ผลการวจย

4.1 การหาสภาวะทเหมาะสมส าหรบวเคราะหหาปรมาณกรดไซรนจก ท าการหาอตราสวนของ เฟสเคลอนท ทเหมาะสม โดยทดลองฉดสารละลายมาตรฐาน ผสม

ของ vanilic acid, caffeic acid และ syringic acid เขาเครอง HPLC แยกสารโดยใชคอลมน ชนด C-8

(150 x 4.6 mm, 5 m) ศกษาความยาวคลนทใหสญญาณดทสดพบวาความยาวคลนทใหคาการ

ดดกลนแสงสงสดคอท 280 nm ศกษาอตราการไหลในชวง 0.5 – 1.0 mL/min พบวาถาใชอตราการ

ไหลต าจะท าใหใชเวลาในการวเคราะหนานและถาใชอตราการไหลสง จะท าใหเกดความดนกลบ

(back pressure) สงซงเปนผลเสยตออายการใชงานของคอลมน ในการทดลองนจงใชอตราการไหลท

0.7 mL/min และชนดของ mobile phase ทศกษาไดแก methanol และ acetonitrile ในอตราสวนตาง

ๆ กน ดงตาราง 4.1 โครมาโทแกรมการแยกสารละลายมาตรฐานแสดงดงรป 4.1 - 4.3

ตาราง 4.1 ผลการแยกกรดไซรนจกเมอใชอตราสวนของเฟสเคลอนทตางกน

Mobile phase Retention time

(min)

ผลการแยก

20% methanol - แยกไดไมด (รป 4.1)

20% methanol+0.2% acetic acid - แยกไดไมด

30% methanol - แยกไดไมด





5% acetonitrile - แยกไดไมด

10%acetonitrile - แยกไดไมด (รป 4.2)

5%acetonitrile + 0.2% acetic acid 44.630 แยกสารไดด พคแคบ (รป 4.3)

5%acetonitrile + 0.5% acetic acid - แยกไดไมด


10%acetonitrile + 0.2% acetic acid 45.436 แยกสารได พคกวาง


34

รป 4.1 โครมาโทแกรมของสารมาตรฐานเขมขน 20 mg/L เมอใช mobile phase เปน 20%methanol

รป 4.2 โครมาโทแกรมของสารมาตรฐานเขมขน 20 mg/L เมอใช mobile phase เปน 10% acetonitrile

รป 4.3 โครมาโทแกรมของสารมาตรฐานเขมขน 40 mg/L เมอใช mobile phase เปน 5 % acetonitrile +

0.2% acetic acid

vanil

ic

syrin

gic

caffe

ic

35

4.2 การสรางกราฟมาตรฐานของกรดไซรนจก

ท าการสรางกราฟมาตรฐานโดยฉดสารละลายมาตรฐาน ผสมทความเขมขนตางๆ โดยใชคอลมน ชนด

C-8 ความยาวคลน 280 nm อตราการไหล 0.7 mL/min และใช mobile phase เปน 5 % acetonitrile +

0.2 % acetic acid ไดพคแยกออกจากกน 3 พค ไดแก vanilic acid, caffeic acid และ syringic acid

ตามล าดบ ดงตวอยางโครมาโทแกรมรป 4.4

รป 4.4 โครมาโทแกรมของสารละลายมาตรฐานความเขมขน (ก) 5.00 mg/L (ข) 10.00 mg/L และ

(ค) 20.00 mg/L

(ค)

(ก)

(ข)

syrin

gic

syrin

gic

syrin

gic

36

จากการทดลองพบวา กรดไซรนจก ถกแยกไดดโดยใชคอลมน C-8 และใชmobile phase เปน

5 % acetonitrile + 0.2 % acetic acid พคทไดมลกษณะสงแหลม และสมมาตร คา retention time

44 นาท คา retention time และ พนทใตพคของกรดไซรนจกทความเขมขนตาง ๆ แสดง ดงตาราง

4.2

ตาราง 4.2 คา retention time และ peak area ของกรดไซรนจกทความเขมขนตาง ๆ

ความเขมขน

(ppm)

Retention time*

(min)

พนทใตพค*

(peak area)

0.625

1.25

2.50

5.00

10.00

20.00

40.00

44.7895

44.7005

44.7085

44.7315

44.6000

44.6020

44.6135

59831.5

111504.0

243093.5

472007.5

900378.0

1797217.5

3803667.5

* เปนคาเฉลยทไดจากการทดลองซ า 3 ครง

น าพนทใตพคและความเขมขนของสารละลายมาตรฐานกรดไซรนจกมาสรางกราฟมาตรฐานได ดงรป

4.5 โดยมสมการเสนตรงเปน y = 94448x – 15586

รป 4.5 กราฟมาตรฐานของกรดไซรนจกเขมขน 0.625, 1.25, 2.5, 5, 10, 20 และ 40 mg/L

y = 94448x - 15586

R² = 0.999

0

500000

1000000

1500000

2000000

2500000

3000000

3500000

4000000

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45

พนท

ใตพค

( pea

k ar

ea )

ความเขมขน (mg/L)

37

4.3 การหาความเทยงและความแมนของเทคนค HPLC

ท าการตรวจสอบความเทยง (precision) ของเครอง HPLC ทใชโดยฉดสารละลายมาตรฐาน

กรดไซรนจกเขมขน 10 mg/L ซ า 6 ครงตรวจวดสญญาณทความยาวคลน 280 nm ใชอตราการไหล

ท 0.7 mL/min และใช mobile phase เปน 0.2% acetic acid ใน 5%acetonitrile ดงตาราง 4.3 น า

ความเขมขนทค านวณไดมาหาคาการเบยงเบนมาตรฐานสมพทธ

ตาราง 4.3ผลการวเคราะหสารมาตรฐานกรดไซรนจกเขมขน 10 mg/Lซ า 6 ครง

ครงท พนทใตพค

(peak area)

ความเขมขนทค านวณได, xi

(mg/L)

(xi-x)2

1

2

3

4

5

6

909891

889599

890072

932634

896059

893617

9.80

9.58

9.59

10.04

9.65

9.62

0.0081

0.0169

0.0144

0.1089

0.0036

0.0081

เฉลย(x) 951436 9.71 = 0.1600

จากตาราง 4.3 ค านวณคาเบยงเบนมาตรฐาน standard deviation (S.D.) ได 0.1789 คาการ

เบยงเบนมาตรฐานสมพทธ ได 1.84 %

ส าหรบการค านวณหาความแมน (accuracy) ของเทคนค HPLC ค านวณไดจากคาความ

ผดพลาดสมบรณและคาความผดพลาดสมพทธ โดยคาความผดพลาดสมบรณเทากบผลตาง

ระหวางความเขมขนจรงกบความเขมขนทไดจากการทดลอง สวนคาความผดพลาดสมพทธคอความ

สมพทธระหวางความผดพลาดทเกดขนกบคาจรง รายงานเปนเปอรเซนต จากขอมลในตาราง 4.3

สามารถค านวณคาความผดพลาดไดดงน

คาความผดพลาดสมบรณ = 10.00 mg/L – 9.71 mg/L = 0.29 mg/L

คาความผดพลาดสมพทธ = 10.00 mg/L – 9.71 mg/L = 3 %

9.71 mg/L

38

4.4 การหาคาขดจ ากดต าสดของการตรวจวด

ท าการวเคราะหหาสภาพไว (sensitivity) ของเครองมอทใชในรปของขดจ ากดต าสด ( Limit

of Detection : LOD ) โดยเลอกพนทใตพคของแบลงค (blank) ดงตาราง 4.4 มาค านวณ

ตารางท 4.4 สญญาณทไดจากการฉดแบลงค

ครงท พนทใตพค

(peak area)

xi-x (xi-x)2

1

2

575

442

212

79

44944

6241

3

4

5

6

7

8

9

10

395

416

308

205

360

443

320

166

32

53

-55

-158

-3

80

-43

-197

1024

2809

3025

24964

9

6400

1849

38809

เฉลย(x) 363 130074

จากตาราง 4.4 ค านวณคาเบยงเบนมาตรฐาน Standard deviation (S.D.) ไดเทากบ 120.22

3SD = 3 x 120.22 = 360.66 ดงนนLOD = 3SD + X = 723.66

น าคาพนทใตพคทค านวณไวมาแปลงเปนความเขมขนโดยเทยบจากกราฟมาตรฐาน พบวาขดจ ากด

ต าสดทสามารถตรวจวดปรมาณกรดไซรนจกได เทากบ 0.17 mg/L

39

4.5 ผลการวเคราะหหาปรมาณกรดไซรนจกในตวอยางดอกดาวเรอง

4.5.1 การเกบตวอยางและการเตรยมตวอยาง

งานวจยในครงนใช ดอกดาวเรองอเมรกน ( Tagetes erecta L.) ซงปลกโดย กลมผผลตไม

ดอกไมประดบ บานคลองวดไร อ าเภอบางระก า จงหวดพษณโลก โดยดอกดาวเรองทไดจะน ามา

แยกกลบดอกออกจากกนและผงใหแหง 2 สปดาหจนไดน าหนกคงท ดงรป 4.6 กลบดอกดาวเรอง

แหงทไดจะน ามาสกดดวยเอทานอลและน าโดยใชเทคนคการสกด 2 เทคนค ไดแก การสกดดวย

เทคนคไมโครเวฟเปรยบเทยบกบเทคนคอลตราโซนค

รป 4.6 การเตรยมตวอยางดอกดาวเรอง

4.5.2 การสกดดอกดาวเรองดวยเทคนคไมโครเวฟ

น ากลบดอกดาวเรองแหงหนก 47.15 g ใสในภาชนะขนาด 1000 mL เตมตวท าละลาย

ปรมาณ 800 mL จากนนน าไปใหความรอนดวยไมโครเวฟ โดยใชก าลงไฟฟา 140 watt เปนเวลา 15

นาท ดงรปท 4.7 (ก) แลวกรองกากดวยผาขาวบางระเหยเอาตวท าละลายออกโดยใชเครองระเหย

ภายใตความดน

40

4.5.3 การสกดดอกดาวเรองดวยเทคนคอลตราโซนค

น าตวอยางกลบดอกดาวเรองแหงหนก 47.15 g ใสในภาชนะขนาด 1000 mL เตมตวท า

ละลาย 800 mL และสกดดวยเครองอลตราโซนคเปนเวลา 1 ชวโมง ดงรปท 4.7 (ข) กรองกากดวย

ผาขาวบาง ระเหยเอาตวท าละลายออกโดยใชเครองระเหยภายใตความดน

(ก) (ข)

รป 4.7 การสกดดอกดาวเรอง; (ก) สกดดวยไมโครเวฟ และ (ข) สกดดวยอลตราโซนค

4.5.4 การหาปรมาณกรดไซรนจกจากดอกดาวเรองดวยเทคนค HPLC

สารสกดดอกดาวเรองแหงและสดทสกดดวยเทคนคไมโครเวฟและ การใชคลนอลตราโซนค

โดยสกดดวยตวท าละลายทตางกน ไดแก การใชน า และ เอทานอล 95 % หลงท าใหแหงโดยใช

เครองระเหยภายใตความดนสญญากาศ จะไดสารสกดหยาบมกลนหอมคลายน าผง มสน าตาลเขม

สารสกดหยาบทไดปรมาณ 0.02 g ถกน ามาละลายและปรบปรมาตรดวยเอทานอล ในขวดวด

ปรมาตรขนาด 10 mL กรองผานเมมเบรนขนาด 0.45 ไมครอน กอนน าไปวเคราะหหาปรมาณกรด

ไซรนจกดวยเทคนค HPLC ดงรป 4.8

(ก) (ข) (ค)

รป 4.8 การเตรยมตวอยางส าหรบวเคราะหดวยเทคนค HPLC (ก) สารสกดหยาบ (ข) การกรองสาร

ตวอยางผานเมมเบรน และ (ค) ตวอยางทกรองแลวบรรจในขวด vial

41

ผลการวเคราะหหาปรมาณกรดไซรนจกในตวอยางสารสกดจากดอกดาวเรองทสกดดวยเทคนค

ตาง ๆ แสดงในตาราง 4.5 จากผลการทดลองพบวาการสกดดวยไมโครเวฟควรใชน าเปนตวท า

ละลายเนองจากไดปรมาณกรดไซรนจกมากกวาการใชเอทานอลเปนตวท าละลายและพลงงานจาก

คลนไมโครเวฟมผลโดยตรงตอการสนของโมเลกลของน า จงท าใหการสกดดวยน าไดปรมาณกรด

ไซรนจกทดกวา สวนการสกดโดยใชอลตราโซนคควรใชเอทานอล 95 % เปนตวท าละลายเนองจาก

ใหปรมาณกรดไซรนจกมากกวาการใชน าเปนตวท าละลาย การสกดดอกดาวเรองแหงใหปรมาณ

กรดไซรนจกมากกวาและท าไดสะดวกกวา

ตาราง 4.5 ผลการวเคราะหหาปรมาณกรดไซรนจกในตวอยางสารสกดจากดอกดาวเรอง

เทคนค

การสกด

ตวอยาง ปรมาณสารสกดหยาบ

ในเอทานอล 10 mL

พนทใตพค

ปรมาณกรดไซรนจก

(mg/100g crude) (mg/100g sample)

ไมโครเวฟ ดาวเรองสด

ในเอทานอล 95%

0.0206 g ไมพบ

ไมพบ

ไมพบ

ไมโครเวฟ ดาวเรองสด

ในน า

0.0240 g ไมพบ

ไมพบ

ไมพบ

ไมโครเวฟ ดาวเรองแหง


0.0222 g 158,959

83.25 22.52

ไมโครเวฟ ดาวเรองแหง

ในน า

0.0263 g 389,082 162.91 35.78

อลตราโซนค ดาวเรองสด


0.0217 g ไมพบ

ไมพบ

ไมพบ

อลตราโซนค ดาวเรองสด

ในน า

0.0221 g 299,410

150.91 3.36

อลตราโซนค ดาวเรองแหง


0.0205 g 719,812

379.82 41.73

อลตราโซนค ดาวเรองแหง

ในน า

0.0205 g 149,346

85.18 13.72

โครมาโทแกรมสารสกดจากดอกดาวเรองสดและแหงทสกดดวยตวท าละลาย 2 ชนดไดแก

เอทานอล 95 % และน า โดยใชเทคนคการสกดตางกนแสดงดงรป 4.9 – 4.16 โดยกรดไซรนจกให

สญญาณเปนพคมลกษณะสมมาตรทเวลา 44 นาท

42

รป 4.9 โครมาโทแกรมจากดอกดาวเรองสด สกดดวยเอทานอล 95% โดยใชไมโครเวฟ

รป 4.10 โครมาโทแกรมจากดอกดาวเรองแหง สกดดวยเอทานอล 95% โดยใชไมโครเวฟ

43

รป 4.11 โครมาโทแกรมจากดอกดาวเรองสด สกดดวยน า โดยใชไมโครเวฟ

รป 4.12 โครมาโทแกรมจากดอกดาวเรองแหง สกดดวยน า โดยใชไมโครเวฟ

44

รป 4.13 โครมาโทแกรมจากดอกดาวเรองสด สกดดวยเอทานอล 95% โดยอลตราโซนค

รป 4.14 โครมาโทแกรมจากดอกดาวเรองแหง สกดดวยเอทานอล 95% โดยอลตราโซนค

45

รป 4.15 โครมาโทแกรมจากดอกดาวเรองสด สกดดวยน า โดยอลตราโซนค

รป 4.16 โครมาโทแกรมจากดอกดาวเรองแหง สกดดวยน า โดยอลตราโซนค

บทที่ 4 ผลการวิจัย - PSRUrdi/files/res_che2553/... · 4.5 โดยมีสมการเส้นตรงเป็น y = 94448x – 15586 รูป

Documents