บทที่ 3 อุปกรณ์และวิธีการทดลอง การศึกษานี ้เป็นการศึกษาข ้าวพันธุ์พื ้นเมืองเหมยนองชนิดข ้าวเจ้า แบ่งออกเป็น 2 การ ทดลอง ได้แก่ การทดลองที่ 1 ประเมินลักษณะและความหลากหลายของประชากร และการทดลอง ที่ 2 ประเมินความต้านทานต่อการเข้าทาลายของแมลงบั ่วและผลผลิตในพื ้นที่ที่พบการระบาด การศึกษานี ้ใช้เมล็ดพันธุ์ข้าวพันธุ์พื ้นเมืองเหมยนองชนิดข ้าวเจ้า ซึ ่งได้จากยุ้งฉางของเกษตรกร บ้านแม่มิงค์ ต.ช่างเคิ ่ง อ.แม่แจ่ม จ.เชียงใหม่ จานวน 5 ประชากร (ภาพ 3.1.1) (ตาราง 3.1.1)
Welcome message from author
This document is posted to help you gain knowledge. Please leave a comment to let me know what you think about it! Share it to your friends and learn new things together.
Transcript
บทท 3 อปกรณและวธการทดลอง
การศกษานเปนการศกษาขาวพนธพนเมองเหมยนองชนดขาวเจา แบงออกเปน 2 การทดลอง ไดแก การทดลองท 1 ประเมนลกษณะและความหลากหลายของประชากร และการทดลองท 2 ประเมนความตานทานตอการเขาท าลายของแมลงบวและผลผลตในพนททพบการระบาด
การศกษานใชเมลดพนธขาวพนธพนเมองเหมยนองชนดขาวเจา ซงไดจากยงฉางของเกษตรกร บานแมมงค ต.ชางเคง อ.แมแจม จ.เชยงใหม จ านวน 5 ประชากร (ภาพ 3.1.1) (ตาราง 3.1.1)
14
ภาพ 3.1.1 แผนทแสดงแหลงทมาของเมลดพนธขาวพนธพนเมองเหมยนอง (บานแมมงค พกด : 18°33'17.70”N, 98°24'6.28”E) และพนทปลกทดสอบในแปลงเกษตรกร (บานทงหลวง พกด : 18°43'16.78"N, 98°34'4.54"E)
15
ตาราง 3.1.1 แหลงทมาของเมลดพนธขาวพนธพนเมองเหมยนองชนดขาวเจาจากเกษตรกร จ านวน 5 ประชากร ล าดบท แหลงทมา สญลกษณ
1 นายพชย รวมใจรกพฒนา MN21 2 นายจนทรทพย นยมพฒนารก MN22 3 นายจรนทร ล าน าไพร MN23 4 นางมาสา อวมสนอง MN24 5 นายซอเมฮา แจมศรรตน MN25
3.1 การประเมนลกษณะและความหลากหลายของประชากรขาว 3.1.1 การประเมนลกษณะเมลดพนธ
สมตวอยางเมลดขาวจากเกษตรกร เพอประเมนลกษณะทางสณฐานวทยา ตวอยางละ 100 เมลด จ านวน 3 ซ า น ามาวดความกวาง ความยาว ความหนา และน าหนก 100 เมลด เพอจ าแนกลกษณะรปรางเมลด โดยวดจากสดสวนความยาวเมลดและความกวางเมลด ตามวธของ Matsuo (1952) อางโดย Oka (1988) (ภาพ 3.1.1) บนทกการมหาง สยอดเมลด สเปลอกเมลด สเยอหมเมลด หลงจากนนน าเมลดพนธไปทดสอบการปนของเมลดขาวเหนยวดวยการยอมสแปงดวยสารละลายไอโอดน เพอประเมนความหลากหลายภายในประชากร
น าเมลดขาวเจาทผานการทดสอบดวยการยอมสแปงดวยสารละลายไอโอดน ปลกขยายพนธเพอเพมจ านวนเมลด ณ แปลงทดลองคณะเกษตรศาสตร มหาวทยาลยเชยงใหม
16
ภาพ 3.1.2 วธประเมนลกษณะรปรางเมลด โดยใชสดสวนความยาวเมลดและความกวางเมลด ตามวธของ Matsuo (1952)
3.1.2 การทดสอบรนลก การประเมนลกษณะในกระถางทดลอง สมประชากรขาวแตละตวอยาง ปลกทดสอบในรนลกในกระถางทดลองขนาดเสนผาศนยกลาง
30 เซนตเมตร กระถางละ 10 ตน จ านวน 3 กระถาง เปรยบเทยบกบพนธตรวจสอบสายพนธบรสทธ เหมยนอง6 (MN6) เหมยนอง 62 เอม (MN62M) และ กข 21 (RD21) ซงพนธเหมยนองทงหมดเปนพนธขาวชนดขาวเหนยว โดย MN6 ปลกทดสอบเพมเขามาในฤดนาป 2552 และ 2553 วางแผนการทดลองแบบ Complete Randomize Design (CRD) จ านวน 3 ซ า เมอถงระยะแตกกอ เกบตวอยางใบออนของแตละประชากรแยกตนจากตวอยางทปลกในกระถาง ตนละ 2 – 3 ใบ จ านวนประชากรละ 20 – 30 ตน พบใสถงกระดาษเกบตวอยาง ใสในภาชนะปดทม silica gel เปนตวดดความชน หลงจากแหงแลวเกบตวอยางใบในถงปดผนก เพอน าไปวเคราะหในระดบโมเลกลตอไป
เกบขอมลลกษณะอายออกดอก และในระยะเกบเกยวบนทกขอมลความสง หนอตอกอ รวงตอกอ ความยาวรวง ระแงตอรวง ดอกยอยตอรวง เมลดดและเมลดลบตอรวง
น าตวอยางใบขาวทแหงแลวแตละตวอยางตดเปนชนเลกๆ บดดวยไนโตรเจนเหลว จากนนน าไปสกดดเอนเอโดย extraction buffer แลวน าดเอนเอทไดมาตรวจสอบปรมาณและคณภาพ โดย
17
ใชวธ agarose gel electrophoresis น าดเอนเอทสกดไดมาเพมปรมาณดวยปฏกรยา Polymerase Chain Reaction (PCR) โดยใช microsatellite primers (ตาราง 3.1.2) จากนนน าผลตภณฑทไดจากการท า PCR ไปตรวจสอบดวย 4% agarose gel electrophoresis น าแผนเจลทได ยอมดวย ethidium bromide เพอน าไปดการเกดลายพมพ DNA ภายใตเครอง UV transilluminator แลวบนทกภาพ เพอน าไปวเคราะหลายพมพ DNA
18 ตาราง 3.1.2 Microsatellite markers 6 ต าแหนง ทใชในการประเมนความหลากหลายทางพนธกรรมในขาวพนธพนเมองเหมยนองชนดขาวเจา MN21 – MN25 ในระดบโมเลกล
Primers Chromosome no.
Repeat Motif
Forward Primer Reverse Primer Anneal Temperature
RM1 1 (AG)26 5’..GCGAAAACACAATGCAAAAA..3’ 3’..GCGTTGGTTGGACCTGAC..5’ 55°C
RM149 8 (AT)10 5’..GCTGACCAACGAACCTAGGCCG..3’ 3’..GTTGGAAGCCTTTCCTCGTAACACG..5’ 55°C
RM167 11 (GA)16 5’..GATCCAGCGTGAGGAACACGT..3’ 3’..AGTCCGACCACAAGGTGCGTTGTC..5’ 55°C
RM241 4 (CT)31 5’..GAGCCAAATAAGATCGCTGA..3’ 3’..TGCAAGCAGCAGATTTAGTG..5’ 55°C
RM253 6 (GA)25 5’..TCCTTCAAGAGTGCAAAACC..3’ 3’..GCATTGTCATGTCATGTCGAAGCC..5’ 55°C
RM261 4 C9(CT)8 5’..CTACTTCTCCCCTTGTGTCG..3’ 3’..TGTACCATCGCCAAATCTCC..5’ 55°C
19
การวเคราะหขอมล ลกษณะทางคณภาพ ประเมนความหลากหลายทงภายในและระหวางประชากร โดยใชคา
ดชนความหลากหลาย (Shannon-Weaver index; H’)
H’ = 1
lns
i
pi pi
โดยท S = จ านวนชนดความแตกตางทพบในลกษณะทบนทก Pi = สดสวนของชนดนนตอจ านวนทงหมด
หากคา H’ เทากบศนยแสดงวาทกตนในตวอยางเหมอนกนหมด และหากคา H’ มคาสงขนแสดงวามความหลากหลายสงขน
ลกษณะทางปรมาณ น าขอมลทไดไปหาคาเฉลย (mean) สวนเบยงเบนมาตรฐาน (sd) และคาสมประสทธความแปรปรวน (CV, %) ลกษณะทางโมเลกล น าภาพถายลายพมพดเอนเอมาใหคะแนนการเกดแถบดเอนเอ โดยการตรวจนบแถบทปรากฏในน าหนกโมเลกล (molecular weight) เดยวกน ถาหากมแถบใหเปน 1 และไมมแถบใหเปน 0 แลวน าไปค านวณคา genetic parameters น าขอมลมาวเคราะหหาความสมพนธระหวางตวอยาง โดยวธ Cluster analysis ดวยโปรแกรม POPGENE 32 (Population Genetic Analysis) (Yeh, 1997) ค านวณระยะหางระหวางพนธกรรม (genetic distance) (Nei, 1972) และน าคาระยะหางระหวางพนธกรรมทไดมาสราง Dendrogram โดยวธการ UPGMA (Unweight Pair-Group Method Aritmetic Average) ดวยโปรแกรม MEGA 2 (Molecular Evolutionary Genetic Analysis, Version 2) (Kumar et al., 2001)
3.2 การประเมนความตานทานตอการเขาท าลายของแมลงบวในแปลงเกษตรกร 3.2.1 ผลผลตและองคประกอบผลผลต ในฤดนาป 2552 และฤดนาป 2553 ปลกทดสอบประชากรขาวพนธพนเมองเหมยนองชนด
ขาวเจา MN21 – MN25 และพนธตรวจสอบ MN62M และ RD21 ทแปลงเกษตรกรทมรายงานการระบาดของแมลงบว ทบานทงหลวง ต.แมวน อ.แมวาง จ.เชยงใหม (ภาพ 3.1.1) และในฤดนาป 2553 ปลกขยายพนธ เมลดทไดจากเกษตรกร บานแมมงค ต.ชางเคง อ.แมแจม จ.เชยงใหม และเมลดทไดจากการปลกทดลองทแปลงเกษตรในฤดนาป 2552 ทสาขาวชาพชไร คณะเกษตรศาสตร มหาวทยาลยเชยงใหม ซงไมมการระบาดของแมลงบว เพอใชในการทดลองในฤดนาป 2554 โดยในฤดนาป 2554 เพมพนธตรวจสอบอก 2 พนธ ไดแก เหมยนอง 6 (MN6) ซงเปนพนธขาวชนดขาวเหนยว และ บอชอม (BCM) พนธพนเมองชนดขาวเจาซงนยมปลกกอนทจะพบการเขาท าลายของ
20
แมลงบว ทงหมดทกแปลงวางแผนการทดลองแบบ Randomized Completed Block Design (RCBD) จ านวน 3 ซ า กรรมวธคอพนธขาวพนเมองเหมยนองขาวเจา 5 พนธและพนธตรวจสอบ 4 พนธ ปลกโดยวธปกด า ขนาดแปลงยอย 1.5x5 เมตร ระยะปลก 25x25 เซนตเมตร
3.2.2 เปอรเซนตการเขาท าลายของแมลงบว เมอถงระยะแตกกอ และระยะออกดอก (เมอ 60 และ 80 วนหลงปลกตามล าดบ) นบจ านวน
หนอทพบหลอดบวของแตละกอ และจ านวนหนอทงหมดของแตละกอ โดยนบประชากรละ 20 กอ จ านวน 3 ซ า แลวน ามาประเมนเปนเปอรเซนตการเขาท าลายของแมลงบว
เมอถงระยะสกแก สมวดความสงแปลงละ 16 ตน นบจ านวนตนตอกอและรวงตอกอจ านวน 10 กอ เกบเกยวขาวในพนท 1 ตารางเมตร บนทกขอมลผลผลตและองคประกอบผลผลต ไดแก ความยาวรวง ระแงตอรวง ดอกยอยตอรวง เมลดดตอรวง เมลดลบตอรวง ผลผลต
การวเคราะหขอมล เปอรเซนตการเขาท าลายของแมลงบว น าขอมลทไดมาค านวณหาเปอรเซนตการเขาท าลาย
ของแเมลงบวจากสตร เปอรเซนตการเขาท าลาย = {( Ti / Tt ) × ( Hi / Ht )} × 100
โดยท Ti = จ านวนหนอทพบหลอดบวของแตละกอ Tt = จ านวนหนอทงหมดของแตละกอ Hi = จ านวนกอทพบหลอดบว Ht = จ านวนกอทงหมด
ผลผลตและองคประกอบผลผลต ในระยะเกบเกยว เกบขอมลความสง หนอตอตน รวงตอกอ ความยาวรวง ระแงตอรวง ดอกยอยตอรวง เมลดดตอรวง เมลดลบตอรวง และผลผลต (กรม/ตารางเมตร) จากนนน าขอมลทไดมาวเคราะหความแปรปรวน (analysis of variance) ตามแผนการทดลองแบบ RCBD ใชคา Least Significant Difference (LSD) ทระดบความเชอมน 95% ในการเปรยบเทยบความแตกตาง และน าขอมลองคประกอบผลผลตทได มาวเคราะหหาความสมพนธ (correlation) กบผลผลต
Related Documents
